CN116240193A - 胆碱激酶突变体及其在胞磷胆碱生产中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了胆碱激酶突变体及其在胞磷胆碱生产中的应用。本发明通过对野生型胆碱激酶进行突变，获得了具有更高酶活性的突变体，并在此基础上通过融合可溶性表达标签有效提高了胆碱激酶的可溶性表达，从而有效提高了胞磷胆碱的生产效率及转化率。

Description

胆碱激酶突变体及其在胞磷胆碱生产中的应用
技术领域
本发明涉及酶催化技术领域，具体地说，涉及胆碱激酶突变体及其在胞磷胆碱生产中的应用。
背景技术
胞磷胆碱是磷脂生物合成的重要中间体，具有保护脑神经，调节脑血管张力以及修复脑损伤等药理功能，临床上用于急性颅脑外伤和脑术术后意识障碍。
目前胞磷胆碱的主要生产方法包括化学合成法、生物发酵法以及酶促合成法。
化学合成法见于早期工艺路线，但是需要多种毒性有机试剂，且底物转化率低，因此不适于大规模生产应用（Kennedy E P. The synthesis of cytidine diphosphatecholine, cytidine diphosphate ethanolamine, and related compounds [J].Journal of Biological Chemistry, 1956, 222(1): 185-191.）。
生物发酵法的原理是在微生物细胞中利用微生物自身的酶系，将原料胞苷酸和磷酸胆碱经多步反应催化生成胞磷胆碱。例如，CN115197984A公开了一种发酵培养毕赤酵母菌株生产S-腺苷甲硫氨酸的方法。但生物发酵法不可避免地具有周期长、转化率低、副产物多以及难以提纯等问题。
酶促合成法是通过在微生物中分别过表达合成胞磷胆碱的关键酶，通过破坏微生物细胞将反应酶释放出来，在微生物体外完成胞磷胆碱的酶促合成。与发酵法相比较而言，酶促合成法具有周期短、转化率高以及易于提纯等优势。
Fujio 等（Fujio T, Maruyama A. Enzymatic production of pyrimidinenucleotides using Corynebacterium ammoniagenes cells and recombinantEscherichia coli cells: enzymatic production of CDP-choline from orotic acidand choline chloride (part I)[J]. Bioscience, biotechnology, andbiochemistry, 1997, 61(6): 956-959.）（Fujio T, Teshiba S, Maruyama A.Construction of a plasmid carrying both CTP synthetase and a fused geneformed from cholinephosphate cytidylyltransferase and choline kinase genesand its application to industrial CDP-choline production: enzymaticproduction of CDP-choline from orotic acid (part II) [J]. Bioscience,biotechnology, and biochemistry, 1997, 61(6): 960-964）早在1997年就构建了大肠杆菌重组菌E. coliMM294/pCKG55 来表达胆碱激酶关键酶，偶联产氨棒杆菌应用于胞磷胆碱生产，然而其反应底物乳清酸到胞磷胆碱的转化率不足 40％，且反应时间长，反应过程中还有大量中间产物积累。该方法反应过程中存在关键酶的酶活不高的问题，同时低转化率和长转化时间不利于节约工业化生产成本，而大量副产物的产生，也不利于后期分离提纯胞磷胆碱。
此外，早期的酶促合成法利用胞苷三磷酸和磷酸胆碱为底物，用磷酸胆碱胞苷基转移酶（CCT）催化生产胞磷胆碱，由于胞苷三磷酸和磷酸胆碱价格昂贵，生产成本较高，不适用于商业化生产。以胞苷酸和氯化胆碱为底物的多酶催化体系生产胞磷胆碱的工艺流程应运而生，该多酶体系包括胞苷酸激酶（CMK）、核苷二磷酸激酶（NDK）、磷酸胆碱胞苷基转移酶（CCT）、胆碱激酶（CKI）以及再生ATP的多聚磷酸激酶（PPK），反应流程如图1所示。其中，胆碱激酶CKI催化氯化胆碱和ATP合成磷酸胆碱，是胞磷胆碱合成的关键酶。虽然该方法降低了生产成本，具备一定的产业化生产条件，但是关键酶胆碱激酶的活性普遍不高，在大肠杆菌、酵母以及昆虫细胞中进行过表达时可溶性蛋白表达水平低，难以大规模用于工业化酶促合成生产胞磷胆碱。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的胆碱激酶突变体及其在胞磷胆碱生产中的应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种胆碱激酶突变体，所述突变体包含如下的氨基酸序列或由其组成：
1）来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第70位氨基酸由Q到E的突变（CKIQ70E）；
2）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第79-80位氨基酸由KG到DE的突变（CKIKG79-80DE）；
3）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第344-348位氨基酸由NTPSL到ETEDD的突变（CKINTPSL344-348ETEDD）；
4）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第368位氨基酸由S到D的突变（CKIS368D）；
5）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第569位氨基酸由K到E的突变（CKIK569E）；
6）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第580位氨基酸由S到E的突变（CKIS580E）；
7）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中包含上述1）-6）中的两种或两种以上突变；或
8）在1）-7）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。
进一步地，所述突变体（CKIKG79-80DE,S368D）包含如下的氨基酸序列或由其组成：
a）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第79-80位氨基酸由KG到DE以及第368位氨基酸由S到D的突变；或
a′）在a）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。
进一步地，所述突变体（CKIKG79-80DE,K569E）包含如下的氨基酸序列或由其组成：
b）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第79-80位氨基酸由KG到DE以及第569位氨基酸由K到E的突变；或
b′）在b）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。
进一步地，所述突变体（CKIKG79-80DE,S368D,K569E）包含如下的氨基酸序列或由其组成：
c）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第79-80位氨基酸由KG到DE、第368位氨基酸由S到D以及第569位氨基酸由K到E的突变；或
c′）在c）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白是在所述胆碱激酶突变体的N端融合来源于丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae）的冰核蛋白（NCBI登录号O30611）的N端第1-215位氨基酸序列组成的。
任选所述胆碱激酶突变体与冰核蛋白的N端第1-215位氨基酸序列之间通过Linker连接。
所述Linker的氨基酸序列优选为VDGSGGSG。
优选地，所述融合蛋白为inKN-CKIKG79-80DE,S368D,K569E、inKN-CKIKG79-80DE,S368D、inKN-CKIKG79-80DE,K569E。其中，融合蛋白inKN-CKIKG79-80DE,S368D,K569E的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
第三方面，本发明提供编码所述胆碱激酶突变体或所述融合蛋白的核酸分子。
第四方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
第五方面，本发明提供所述胆碱激酶突变体或所述融合蛋白或所述生物材料在胞磷胆碱生产中的应用。
第六方面，本发明提供一种胞磷胆碱的合成方法，以胞苷酸和氯化胆碱为底物，使底物与混合酶接触，酶促合成胞磷胆碱。
所述混合酶包含所述胆碱激酶突变体或所述融合蛋白、胞苷酸激酶（CMK）、核苷二磷酸激酶（NDK）、磷酸胆碱胞苷基转移酶（CCT）和聚磷酸激酶（PPK）。优选地，胞苷酸激酶（UniProt ID:P9WPA9）来自结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis），核苷二磷酸激酶（UniProt ID:P36010）来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，磷酸胆碱胞苷基转移酶（UniProt ID:P13259）来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，聚磷酸激酶（UniProt ID: B9KLX7）来自类球红细菌(Cereibacter sphaeroides)。
在本发明的一个具体实施方式中，以大肠杆菌为宿主细胞，在大肠杆菌中表达胆碱激酶CKI突变体重组融合蛋白。培养表达目标融合蛋白的重组大肠杆菌，高压破碎重组细胞后获得含有目标融合蛋白的反应酶液。另外，为获得该多酶反应体系中的其他辅助酶，以大肠杆菌为宿主细胞，在大肠杆菌中分别表达胞苷酸激酶（CMK）、核苷二磷酸激酶（NDK）、磷酸胆碱胞苷基转移酶（CCT）和聚磷酸激酶（PPK）重组蛋白，分别培养表达上述重组蛋白的重组大肠杆菌，高压破碎重组细胞后混合细胞破碎液，获得含有CMK、NDK、CCT、PPK的混合反应酶液。将所述含有目标融合蛋白的反应酶液和所述含有CMK、NDK、CCT、PPK的混合反应酶液加入酶促反应体系中。
所述酶促反应体系的组成为：磷酸氢二钠150-250 mM、胞苷酸100-180 mM、硫酸镁30-80 mM、六偏磷酸100-150mM、氯化胆碱100-180 mM、ATP 5-15mM以及含有相当于20-30g/L湿菌体的胆碱激酶（CKI）反应酶液，含有相当于10-30g/L湿菌体的胞苷酸激酶（CMK）、相当于5-20 g/L湿菌体的核苷二磷酸激酶（NDK）、相当于20-30 g/L湿菌体的磷酸胆碱胞苷基转移酶（CCT）、相当于5-25 g/L湿菌体的聚磷酸激酶（PPK）的混合反应酶液。所述酶促反应体系的总体积为1 L。
反应条件为：30-40℃、pH6.7-8.2。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明通过对野生型胆碱激酶进行突变，获得了具有更高酶活性的突变体CKIKG79 -80DE、CKIS368D、CKIK569E、CKIKG79-80DE,S368D、CKIKG79-80DE,K569E、CKIKG79-80DE, S368D,K569E。进一步地，为解决胆碱激酶可溶性表达低的问题，在所述胆碱激酶突变体N端引入来源于丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae）的inKN标签，有效提高了胆碱激酶的可溶性表达量，从而有效提高了胞磷胆碱的生产效率及转化率。
附图说明
图1为本发明胞磷胆碱的合成工艺线路。
图2为本发明较佳实施例中胆碱激酶CKI突变体相对酶活比较。
图3为本发明较佳实施例中重组融合蛋白表达情况；其中，1，2，3为未携带融合标签CKI蛋白，大小为66.3kDa（1：全菌体；2：上清；3：沉淀）；4，5，6为inKN-CKI融合蛋白，大小为89.5kDa（4：全菌体；5：上清；6：沉淀）。
图4为本发明较佳实施例中利用未经突变及融合优化的野生型胆碱激酶生产胞磷胆碱产量转化率统计。
图5为本发明较佳实施例中利用融合了inKN标签的CKIKG79-80DE, S368D,K569E突变体重组融合蛋白生产胞磷胆碱产量转化率统计。
图4和图5中，左侧Y轴为胞磷胆碱生成量，右侧Y轴为胞磷胆碱转化率（胞磷胆碱生成量/(CMP+CTP+CDP+胞磷胆碱)）。
具体实施方式
为了解决现有的胆碱激酶CKI酶活低，蛋白表达水平低，不适用于工业化生产胞磷胆碱等问题，本发明提供一种胆碱激酶CKI突变体，其是在SEQ ID NO:1所示的胆碱激酶的基础上，将第70位谷氨酰胺，第79-80位赖氨酸-甘氨酸，第344-348位谷氨酰胺-苏氨酸-脯氨酸-丝氨酸-亮氨酸，第368位丝氨酸，第568位赖氨酸和第580位丝氨酸的任一种氨基酸进行取代得到的，并在突变体的基础上构建了高表达的可溶性重组融合蛋白。所述突变体重组融合蛋白是在CKI突变体氨基酸序列N端融合来源于丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae）的冰核蛋白（NCBI登录号O30611）的N端序列第1-215位氨基酸序列（SEQ ID NO:2）。所述冰核蛋白的N端序列第1-215位氨基酸与所述CKI突变体之间通过Linker连接。所述Linker的氨基酸序列优选为VDGSGGSG。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO:1的基础上，进行了氨基酸位点的突变；所述突变位点如下：
第70位谷氨酰胺突变为谷氨酸；
第79-80位赖氨酸-甘氨酸突变为天冬氨酸-谷氨酸；
第344-348位天冬酰胺-苏氨酸-脯氨酸-丝氨酸-亮氨酸突变为谷氨酸-苏氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸；
第368位丝氨酸突变为天冬氨酸；
第569位赖氨酸突变为谷氨酸；
第580位丝氨酸突变为谷氨酸。
在本发明的另一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO:1的基础上，进行了氨基酸位点的多点突变；所述多突变位点如下：
第79-80位赖氨酸-甘氨酸突变为天冬氨酸-谷氨酸，第368位丝氨酸突变为天冬氨酸；
第79-80位赖氨酸-甘氨酸突变为天冬氨酸-谷氨酸，第569位赖氨酸突变为谷氨酸。
第79-80位赖氨酸-甘氨酸突变为天冬氨酸-谷氨酸，第368位丝氨酸突变为天冬氨酸，第569位赖氨酸突变为谷氨酸。
本发明还提供编码所述突变体的基因。
本发明还提供包含所述胆碱激酶CKI突变体的重组融合蛋白及其编码基因。
本发明还提供表达所述胆碱激酶CKI突变体重组融合蛋白的重组微生物细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组微生物细胞以大肠杆菌为宿主细胞，在该重组细胞中表达了胆碱激酶CKI突变体重组融合蛋白。培养表达CKI突变体重组融合蛋白的重组大肠杆菌，高压破碎重组细胞后获得含有CKI突变体重组融合蛋白的反应酶液。另外，为获得该多酶反应体系中的其他辅助酶，以大肠杆菌为宿主细胞，在大肠杆菌中分别表达胞苷酸激酶（CMK）、核苷二磷酸激酶（NDK）、磷酸胆碱胞苷基转移酶（CCT）和聚磷酸激酶（PPK）重组蛋白，分别培养表达上述重组蛋白的重组大肠杆菌，高压破碎重组细胞后混合细胞破碎液，获得含有CMK、NDK、CCT、PPK的混合反应酶液。将所述含有CKI突变体重组融合蛋白的反应酶液和所述含有CMK、NDK、CCT、PPK的混合反应酶液加入酶促反应体系中。
所述酶促反应体系组成为：磷酸氢二钠150-250 mM、胞苷酸100-180 mM、硫酸镁30-80 mM、六偏磷酸100-150 mM、氯化胆碱100-180 mM、ATP 5-15 mM以及含有相当于20-30g/L湿菌体的胆碱激酶（CKI）反应酶液，含有相当于10-30g/L湿菌体的胞苷酸激酶（CMK）、相当于5-20 g/L湿菌体的核苷二磷酸激酶（NDK）、相当于20-30 g/L湿菌体的磷酸胆碱胞苷基转移酶（CCT）、相当于5-25 g/L湿菌体的聚磷酸激酶（PPK）的混合反应酶液。所述酶促反应体系总体积为1 L。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 胆碱激酶CKI突变体的构建
酿酒酵母来源的CKI（编码SEQ ID NO:1所示的胆碱激酶），经密码子优化后由上海生工生物工程股份有限公司合成，将优化后的胆碱激酶CKI基因序列构建到载体pET28b上，得到重组载体pET28b-CKI。
以重组载体pET28b-CKI为模板，使用突变引物对（表1）对CKI基因进行相应位点突变，PCR扩增产物用Dpn I酶切2h后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行测序鉴定。将含有突变体基因的质粒转入大肠杆菌BL21（DE3），获得突变体重组菌株CKIQ70E、CKIKG79-80DE、CKINTPSL344-348ETEDD、CKIS368D、CKIK569E、CKIS580E、CKIKG79-80DE,S368D、CKIKG79-80DE,K569E、CKIKG79-80DE, S368D,K569E。
表1 CKI基因定点突变引物
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实施例2 胆碱激酶CKI突变体的测试
1、蛋白诱导及菌体裂解
将实施例1构建的突变体重组菌株，在LB培养基中，于37℃下振荡培养，当菌液浓度达到OD600为1.0时，加入终浓度为0.4 mM的IPTG进行诱导，25℃培养20h后收集菌体。
用加入无菌水重悬菌体并于4℃离心除去上清，重复2次。加入裂解缓冲液（50mMTris-HCl，300mM NaCl，pH8.0）充分悬浮菌体。取10 OD菌体，低温超高压破碎菌体，4℃离心收集上清。
2、酶活测定
将上清液加入到反应液中。反应液组成为：Tris-HCl 50 mM、ATP 20 mM、氯化胆碱20 mM、硫酸镁50 mM，反应条件为35℃、pH7.5。用HPLC-CAD法测定磷酸胆碱含量。结果如图2所示，与野生型胆碱激酶相比，突变体CKIKG79-80DE、CKIS368D、CKIK569E均具有较高酶活提升。
实施例3 胆碱激酶CKI突变体的叠加构建
在实施例1突变体CKIKG79-80DE的基础上进行叠加突变，以pET28b-CKIKG79-80DE为模板，使用突变引物对（表1）对CKI基因进行相应位点突变，PCR扩增产物用Dpn I酶切2h后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行测序鉴定。将含有突变体基因的质粒转入大肠杆菌BL21（DE3），获得突变体重组菌株CKIKG79-80DE,S368D、CKIKG79-80DE,K569E、CKIKG79 -80DE, S368D,K569E。
实施例4 胆碱激酶CKI突变体的测试
1、蛋白诱导及菌体裂解
将实施例2构建的突变体重组菌株，在LB培养基中，于37℃下振荡培养,当菌液浓度达到OD600为1.0时，加入终浓度为0.4 mM的IPTG进行诱导，25℃培养20h后收集菌体。
用加入无菌水重悬菌体并于4℃离心除去上清，重复2次。加入裂解缓冲液（50mMTris-HCl，300mM NaCl，pH8.0）充分悬浮菌体。取10 OD菌体，低温超高压破碎菌体，4℃离心收集上清。
2、酶活测定
将上清液加入到反应液中。反应液组成为：Tris-HCL 50 mM、ATP 20 mM、氯化胆碱20 mM、硫酸镁50 mM，反应条件为35℃、pH 7.5。用HPLC-CAD法测定磷酸胆碱含量。结果如图2所示，与实施例2中的野生型以及具有提升的酶活性的突变体CKIKG79-80DE相比，CKIKG79 -80DE,S368D、CKIKG79-80DE,K569E、CKIKG79-80DE, S368D,K569E，在该条件下具有更高酶活，其中，CKIKG79 -80DE, S368D,K569E酶活最高，达到了野生型胆碱激酶的7.6倍。
实施例5 胆碱激酶CKI突变体融合蛋白的构建
选取酶活最高的突变体CKIKG79-80DE, S368D,K569E ，在其N端构建来源于丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae）的inKN标签，以pET28b-CKIKG79-80DE, S368D,K569E为模板，上游引物为：5’- ACGGGAGTGGTGGCAGCGGAATGGTTCAAGAAAGTCGTCC -3'，下游引物为：5’- GTGGTGGTGGTGCTCGAGTCACAGGTAGCTGGTGTCCA-3'，进行PCR扩增，得到CKIKG79-80DE, S368D,K569E基因片段。inKN核苷酸序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。利用搭桥PCR扩增获得inKN-CKIKG79-80DE, S368D,K569E融合基因片段，所用引物为：5’- AGGAGATATACCATGGATGACCCTGGATAAAGCACT -3'，下游引物为：5’- GGACGACTTTCTTGAACCATTCCGCTGCCACCACTCCCGT -3'。融合基因序列如SEQ ID NO:3所示，将其连接到pET28b载体上，获得载体pET28b-inKN-CKIKG79 -80DE,S368D,K569E。用SDS-PAGE检测融合蛋白表达情况，结果如图3所示，重组融合蛋白的可溶性表达明显多于非融合蛋白。
融合蛋白inKN-CKIKG79-80DE,S368D,K569的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例6 利用胆碱激酶CKI突变体生产胞磷胆碱
1、制备CMK、NDK、CCT、PPK的混合反应酶液
将结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）来源的胞苷酸激酶（CMK）（UniProt ID: P9WPA9），经密码子优化后由上海生工生物工程股份有限公司合成，将优化后的胞苷酸激酶CMK基因序列构建到载体pET28b上，得到重组载体pET28b-CMK。
将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的核苷二磷酸激酶（NDK）序列（UniProt ID: P36010），经密码子优化后由上海生工生物工程股份有限公司合成，将优化后的核苷二磷酸激酶NDK基因序列构建到载体pET28b上，得到重组载体pET28b-NDK。
将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的磷酸胆碱胞苷基转移酶（CCT）序列（UniProt ID: P13259），经密码子优化后由上海生工生物工程股份有限公司合成，将优化后的磷酸胆碱胞苷基转移酶CCT基因序列构建到载体pET28b上，得到重组载体pET28b-CCT。
将类球红细菌(Cereibacter sphaeroides)来源的聚磷酸激酶(PPK)序列（UniProt ID: B9KLX7），经密码子优化后由上海生工生物工程股份有限公司合成，将优化后的聚磷酸激酶PPK基因序列构建到载体pET28b上，得到重组载体pET28b-PPK。
将上述四种重组表达载体分别转化入转入大肠杆菌BL21（DE3），分别获得胞苷酸激酶（CMK）、核苷二磷酸激酶（NDK）、磷酸胆碱胞苷基转移酶（CCT）、聚磷酸激酶（PPK）的表达菌株。
在LB培养基中分别培养表达胞苷酸激酶（CMK）、核苷二磷酸激酶（NDK）、磷酸胆碱胞苷基转移酶（CCT）、聚磷酸激酶（PPK）的表达菌株，于37℃下振荡培养，当菌液浓度达到OD600为1.0时，加入终浓度为0.4 mM的IPTG进行诱导。25℃培养20h后，分别取含有20g湿菌体的胞苷酸激酶（CMK）表达菌株培养物、含有10g 湿菌体的核苷二磷酸激酶（NDK）表达菌株培养物、含有25 g湿菌体的磷酸胆碱胞苷基转移酶（CCT）表达菌株培养物、含有12 g湿菌体的聚磷酸激酶（PPK）表达菌株培养物进行高压细胞破碎，再混合后获得CMK、NDK、CCT及PPK的混合反应酶液。
2、制备CKI反应酶液
在LB培养基中分别培养表达野生型胆碱激酶CKI（对照）以及突变体重组融合蛋白inKN-CKIKG79-80DE,S368D,K569E的重组大肠杆菌，于37℃下振荡培养，当菌液浓度达到OD600为1.0时，加入终浓度为0.4 mM的IPTG进行诱导。25℃培养20h后，分别取含有25g 湿菌体的重组细胞培养物进行高压细胞破碎，获得野生型胆碱激酶的反应酶液以及突变体重组融合蛋白的反应酶液。
3、粗酶液催化生产胞磷胆碱
将步骤1获得的混合反应酶液和步骤2获得的反应酶液分别加入到酶促反应体系中用于生产胞磷胆碱。所述酶促反应体系组成为：磷酸氢二钠200 mM、胞苷酸140 mM、硫酸镁55 mM、六偏磷酸120 mM、氯化胆碱140 mM、ATP 10 mM以及含有相当于25 g/L湿菌体的胆碱激酶（CKI）反应酶液、含有相当于20g/L湿菌体湿菌体的胞苷酸激酶（CMK）、相当于10 g/L湿菌体的核苷二磷酸激酶（NDK）、相当于25 g/L湿菌体的磷酸胆碱胞苷基转移酶（CCT）、相当于12 g/L湿菌体的聚磷酸激酶（PPK）的混合反应酶液。所述酶促反应体系总体积为1 L。用HPLC检测6h内的胞磷胆碱生成情况，分别取反应1h，2h，4h，6h时的反应液，用1 M硫酸终止反应。结果如图4所示，采用野生型胆碱激酶反应6h胞磷胆碱产量最高只有52.7 mM，转化率为40.5%，胞磷胆碱生产效率为8.8 mM/h；结果如图5所示，采用突变体重组融合蛋白inKN-CKIKG79-80DE,S368D,K569E反应6h胞磷胆碱产量最高可达130 mM，转化率为92.8%，胞磷胆碱生产效率为21.7 mM/h,远高于野生型。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.胆碱激酶突变体，其特征在于，所述突变体包含如下的氨基酸序列或由其组成：
1）来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第70位氨基酸由Q到E的突变；
2）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第79-80位氨基酸由KG到DE的突变；
3）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第344-348位氨基酸由NTPSL到ETEDD的突变；
4）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第368位氨基酸由S到D的突变；
5）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第569位氨基酸由K到E的突变；
6）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第580位氨基酸由S到E的突变；
7）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中包含上述1）-6）中的两种或两种以上突变；或
8）在1）-7）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含如下的氨基酸序列或由其组成：
a）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第79-80位氨基酸由KG到DE以及第368位氨基酸由S到D的突变；或
a′）在a）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含如下的氨基酸序列或由其组成：
b）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第79-80位氨基酸由KG到DE以及第569位氨基酸由K到E的突变；或
b′）在b）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含如下的氨基酸序列或由其组成：
c）来自酿酒酵母胆碱激酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第79-80位氨基酸由KG到DE、第368位氨基酸由S到D以及第569位氨基酸由K到E的突变；或
c′）在c）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。
5.融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是在权利要求1-4任一项所述突变体的N端融合来源于丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae）的冰核蛋白的N端第1-215位氨基酸序列组成的；
其中，所述突变体与冰核蛋白的N端第1-215位氨基酸序列之间通过Linker连接。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述Linker的氨基酸序列为VDGSGGSG。
7.编码权利要求1-4任一项所述突变体或权利要求5或6所述融合蛋白的核酸分子。
8.含有权利要求7所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
9.权利要求1-4任一项所述突变体或权利要求5或6所述融合蛋白或权利要求8所述生物材料在胞磷胆碱生产中的应用。
10.胞磷胆碱的合成方法，其特征在于，以胞苷酸和氯化胆碱为底物，使底物与混合酶接触，酶促合成胞磷胆碱；
所述混合酶包含权利要求1-4任一项所述突变体或权利要求5或6所述融合蛋白、胞苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、磷酸胆碱胞苷基转移酶和聚磷酸激酶。
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