CN110184254B

CN110184254B - 一种具有高耐碱性的酯酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN110184254B
Application number: CN201910215706.2A
Authority: CN
Inventors: 李继喜; 李正阳; 鲍路瑶; 刘雪鹤
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2019-03-21
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2039-03-21
Also published as: CN110184254A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体为具有高耐碱性的酯酶突变体及其应用。本发明涉及通过定点突变的方法提高来源于海洋细菌Croceicoccusmarinus E4A9^T的酯酶CrmE10耐碱性；由此获得具有高耐碱性的酯酶突变体。所述酯酶CrmE10与其同家族酯酶AlinE4具有相似的三维结构，但耐碱性差异较大。通过序列比对分析结合结构比对分析，找出了五个与耐碱性相关的氨基酸位点。使用定点突变的方法将这五个位点突变，可以提高酯酶CrmE10的耐碱性。本发明的酯酶突变体及能表达酯酶突变体的宿主菌可用于催化酯类水解中。

Description

一种具有高耐碱性的酯酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及具有高耐碱性的酯酶突变体及其应用，并涉及通过定点突变的方法提高来源于海洋细菌Croceicoccusmarinus E4A9^T的酯酶CrmE10耐碱性。

背景技术

酯酶是一类能够将酯类通过化学反应分解为酸和醇的水解酶类。酯酶通常存在一个由丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸三个氨基酸残基组成的催化三角为其活性中心；其中，丝氨酸残基经常出现在GXSXG这样一个保守的五肽序列中。大部分酯酶催化反应时不需要辅助因子参与，并且对反应底物具有广泛性和一定的立体结构特异性，这些特性使其作为一种生物催化剂越来越受到人们关注。如今，酯酶作为一种环境友好、经济并且清洁的催化剂，在食品、造纸、精细化学合成以及医疗诊断等领域扮演着越来越重要的角色。工业上应用的酯酶主要来源于不同的生物体内，特别是来自于真菌和细菌，这主要是由于微生物来源的酯酶具有产量高、反应稳定、副产物毒性小及分子生物学操作简单等优点。近年来，随着对酯酶极端反应条件（高温、低温、耐酸、耐碱、耐盐、耐受有机溶剂等）需求的日益增加，从极端环境中分离新型酯酶或工业应用酶的改造引起了人们的普遍关注。

海洋来源的酯酶通常具有与海洋环境相关的优良性质，例如温度稳定性、耐盐性、耐碱性、耐低温、以及优异的手性选择性等。因此，以海洋来源酯酶为依据对现有工业应用酶的改造成为重要的方向。CrmE10和AlinE4分别是从海洋细菌CroceicoccusmarinusE4A9^T和Altererythrobacterindicus DSM 18604^T的基因组中筛选而来，尽管两个酯酶的序列及三维结构都极为相似，且同属于SGNH超家族，但在耐碱性、热稳定性及耐盐度等方面存在较大的差异。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于海洋细菌Croceicoccusmarinus E4A9^T的酯酶CrmE10的高耐碱性突变体及其应用。

本发明通过两个同家族且结构极其相似的酯酶的比较，找到了5个与耐碱性相关的氨基酸位点，突变后CrmE10耐碱性显著提高，在工业应用酶改造方面具有广泛前景。

本发明提供的来源于海洋细菌Croceicoccusmarinus E4A9^T的酯酶CrmE10的突变体，与未突变的酯酶CrmE10相比，具有酯酶活性，并且相对于亲代酯酶，显示如下性质中至少一种性质的改变：耐高温、耐低温、耐酸、耐碱、耐盐或耐受有机溶剂，特别是耐碱性。

本发明将来源于海洋细菌Croceicoccusmarinus E4A9^T的酯酶CrmE10（其氨基酸序列如Seq ID No：1所示，含有205个氨基酸，分子量为22.36kD）和来源于海洋细菌Altererythrobacterindicus DSM 18604^T的酯酶AlinE4（其氨基酸序列如Seq ID No：3所示，含有190个氨基酸，分子量为20.5 kDa）进行了三维结构、酶活性质及一级序列之间的比较（如图1-图3所示），找到了5个与耐碱性相关的氨基酸位点，分别为：CrmE10：Asp77，Glu86，Asp123，Glu159，Asp200；AlinE4：Lys61，Lys70，Lys107，Lys143，Lys184。这五个氨基酸位点在酯酶CrmE10中为酸性氨基酸（D或E），而在酯酶AlinE4中为碱性氨基酸（K），且在三维结构中这五个位点位于同一区域，可能为底物分子进出的通道，如图3和图4所示。本发明推测将CrmE10这五个位点的酸性氨基酸突变为碱性氨基酸后会提高酯酶的耐碱性，反之将AlinE4这五个位点的碱性氨基酸突变为酸性氨基酸后会降低酯酶的耐碱性，并得到证实。

本发明对这些位点尝试进行了各种突变。这里用常用的1个字母和3个字母的氨基酸代码。为便于参考，本发明中的酯酶突变体通过使用下列表示法描述：原来的氨基酸：位置：取代的氨基酸。依照这种命名法，举例来说，将第77位的天冬氨酸取代为赖氨酸，表示为：Asp77Lys或D77K。进一步的，“D77X”代表下列任何一种取代：D77R，D77N，D77A，D77C，D77Q，D77E，D77G，D77H，D77I，D77L，D77K，D77M，D77F，D77P，D77S，D77T，D77W，D77Y，或D77V；或简写为：A30R，N，A，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V。

本发明将CrmE10的5个与耐碱性相关的氨基酸位点突变后，得到的改造后酯酶突变体，记为CrmE10-mut5，所述突变体相对于Seq ID No：1所示的酯酶CrmE10具有如下改变位点：

D77X1，其中X1选自K或R,优选X1为K；

E86X2，其中X2选自K或R,优选X2为K；

D123X3，其中X3选自K或R,优选X3为K；

E159X4，其中X4选自K或R,优选X4为K；

D200X5, 其中X5选自K或R,优选X5为K。

作为优选方案，本发明提供的酯酶突变体CrmE10-mut5，相对于Seq ID No：1所示的酯酶CrmE10具有如下改变位点：D77K、E86K、D123K、E159K、D200K，其在9<pH<10的条件下仍保留20%左右的酶活，而野生型CrmE10及突变部分位点的突变体CrmE10-mut3（D77K/E86K/D123K）和CrmE10-E159K/D200K则在此环境下没有酶活，如图5所示。

根据上述推测，本发明发明进行了反向验证。在找到5个与耐碱性相关的氨基酸位后，将来源于海洋细菌Altererythrobacterindicus DSM 18604^T的酯酶AlinE4的5个与耐碱性相关的氨基酸位点分别突变后，得到的改造后的酯酶AlinE4-K61D，AlinE4-K107D和AlinE4-K143E，结果发现在9<pH<10.5的条件下，该突变体仅保留40%左右及以下的酶活，而野生型AlinE4则在此环境下具有60%左右的酶活，如图6所示。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有耐碱性的适低温酯酶CrmE10-mut5的核苷酸序列。

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，可以用许多方式操作编码本发明酯酶的分离的多核苷酸，以提供酯酶的表达。所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。所述调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

本发明还涉及利用基因克隆技术，将克隆到的酯酶CrmE10-mut5基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达重组酯酶CrmE10-mut5。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母（如甲醇酵母）及哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢细胞）等，优选采用原核表达系统E.coli。

所述合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1（Invitrogen Corp. San Diego. California. USA）；动物细胞表达载体pSVK3、pMSG（Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA）等。

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，可有利地用于酯酶CrmE10-mut5的重组生产中。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是在本发明的酯酶CrmE10-mut5的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶CrmE10-mut5基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组酯酶CrmE10-mut5。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，可通过如下原生质体转化或或电穿孔法将载体转化到原核细胞中。合适的真核生物宿主包括酵母（如甲醇酵母）及哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢细胞）等。本发明优选采用原核表达系统E.coli表达生产酯酶CrmE10-mut5。一个优选的例子是将本发明筛选到的酯酶基因CrmE10-mut5连接到大肠杆菌表达载体上，并转化到大肠杆菌E. coli BL21（DE3）中，经诱导表达出高活性的重组酶，其最适pH较野生型没有明显差异，但耐碱性显著提升。

本发明还涉及用于产生本发明所述酯酶CrmE10-mut5的方法，其包括：

（a）在有助于产生酯酶CrmE10-mut5的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码酯酶CrmE10-mut5的核苷酸；

（b）回收所述酯酶CrmE10-mut5。

在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生所述酯酶CrmE10-mut5的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述酯酶CrmE10-mut5的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵（包括连续、分批、补料分批或固态发酵）来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物回收。

所得酯酶CrmE10-mut5可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析（例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻）或差示溶解度（例如硫酸铵沉淀）等方法。

根据本发明的提高酯酶CrmE10耐碱性的方法，可以得到具有耐碱性的适低温酯酶CrmE10-mut5。随着人们生活水平的日益提高，对于工业应用酶的要求也越来越高，经常需要其在极端条件下完成催化反应。此方法根据一级序列及三维结构预测出了提高酯酶耐碱性的关键位点，并通过相关酶学鉴定予以验证。此方法亦可作为科学研究及工业应用酶改造的依据。

本发明还提供具有耐碱性的适低温酯酶CrmE10-mut5或能表达适低温酯酶CrmE10-mut5的宿主菌在工业上的应用，例如可用于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，适低温酯酶CrmE10-mut5具有酯酶活性可用于水解短链脂肪酸酯。具有耐碱性的适低温酯酶CrmE10-mut5基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业化生产耐碱水解酶，为后续的工业应用提供成本低廉的耐碱水解酶起始材料。该酶的生产可在洗涤剂、废水处理、精细化工、制药和环境修复等领域显示出重要的经济和社会价值。

附图说明

图1为来源于海洋细菌Croceicoccusmarinus E4A9^T的酯酶CrmE10与来源于海洋细菌Altererythrobacterindicus DSM 18604^T的酯酶AlinE4的结构比较。

图2为酯酶CrmE10与酯酶AlinE4的耐碱性比较。

图3为酯酶CrmE10与酯酶AlinE4一级序列及二级结构的比较。

图4为5个与耐碱性相关的氨基酸位点展示及在蛋白三维结构中的位置。

图5为酯酶CrmE10的野生型及耐碱性相关突变体在不同pH条件下酶活的测定。其中pH7.5条件下的酶活为100%。

图6为酯酶AlinE4的野生型及耐碱性相关突变体在不同pH条件下酶活的测定。其中pH7.5条件下的酶活为100%。

具体实施方式

下面通过具体实例进一步介绍本发明。

实施例1 耐碱性相关位点的突变

本发明采用定点突变的方法以改造酯酶进。定点突变是以环式PCR的方法实现的，具体步骤如下。

（1）设计定点突变引物，如下所示：

a.用于酯酶基因crme10突变，其中酯酶CrmE10来源于海洋细菌Croceicoccusmarinus E4A9^T，其氨基酸序列如Seq ID No：1所示，核苷酸序列则如Seq IDNo：2所示：

MADGEAAGQQ ADAVMPTGPA IDVLAFGDSL FAGYRLDRDE SYPARLQAAL RERGLNVNVT 60

NAGVSGDTTA AGLQRIDFVL DSMAGEPDLV LLELGANDML RGLPAEEARR NLDTILQRLD 120

QRDIPVMVYG MRAAPNLGGD YGRSFDSIFP DLADKYDAEL VPFFIEPLIF DRSLVQQDQL 180

HPTAQGVDAM VEQTVEQVED RIDDL 205

D77E86KF:5’-CGCATCAAATTCGTGCTCGATTCCATGGCGGGAAAACCCGAT-3’（Seq ID No：5）

D77E86KR:5’-ATCGGGTTTTCCCGCCATGGAATCGAGCACGAATTTGATGCG-3’（Seq ID No：6）

D123KF: 5’-CGGCTCGACCAGCGCAAAATCCCGGTGATGGTC-3’（Seq ID No：7）

D123KR: 5’-GACCATCACCGGGATTTTGCGCTGGTCGAGCCG-3’（Seq ID No：8）

E159KF: 5’-GACAAATACGATGCCAAACTCGTGCCCTTCTTC-3’（Seq ID No：9）

E159KR: 5’-GAAGAAGGGCACGAGTTTGGCATCGTATTTGTC-3’（Seq ID No：10）

D200KF: 5’-GTCGAGCAGGTCGAGAAAAGGATCGACGACCTC-3’（Seq ID No：11）

D200KR: 5’-GAGGTCGTCGATCCTTTTCTCGACCTGCTCGAC-3’（Seq ID No：12）；

b.用于酯酶基因aline4突变，其中酯酶AlinE4来源于海洋细菌Altererythrobacterindicus DSM 18604^T，其氨基酸序列如下所示（Seq ID No：3），核苷酸序列则如Seq ID No：4所示：

MGESRVILAF GDSLFAGYGL DKGESYPAKL ETALRSHGIN ARIINAGVSG DTTAAGLQRI 60

KFVLDSQPDK PELAIVELGG NDLLRGLSPA EARQNLSGIL EELQRRKIPI LLMGMRAPPN 120

LGAKYQREFD GIYPYLAEKY DAKLVPFFLE AVADRPDLIQ KDHVHPTARG VEELVSATSN 180

AVAKALPAKK 190

K61D_F: 5’-GGGCTGCAGCGAATCAATTTCGTGCTGGATAGC-3’（Seq ID No：13）

K61D_R: 5’-GCTATCCAGCACGAAATTGATTCGCTGCAGCCC-3’（Seq ID No：14）

K70E_F: 5’-GATAGCCAGCCGGACGAGCCGGAATTGGCCATA-3’（Seq ID No：15）

K70E_R: 5’-TATGGCCAATTCCGGCTCGTCCGGCTGGCTATC-3’（Seq ID No：16）

K107D_F: 5’-GAATTGCAGAGGCGGAATATTCCAATCCTGTTG-3’（Seq ID No：17）

K107D_R: 5’-CAACAGGATTGGAATATTCCGCCTCTGCAATTC-3’（Seq ID No：18）

K143E_F: 5’-GAAAAATATGACGCCGAGCTGGTACCTTTCTTC-3’（Seq ID No：19）

K143E_R: 5’-GAAGAAAGGTACCAGCTCGGCGTCATATTTTTC-3’（Seq ID No：20）

K184D_F: 5’-TCGAATGCAGTTGCCAATGCGCTGCCTGCGAAG-3’（Seq ID No：21）

K184D_R: 5’-CTTCGCAGGCAGCGCATTGGCAACTGCATTCGA-3’（Seq ID No：22）。

（2）通过高保真聚合酶（PrimeSTAR™ GXL DNA Polymerase）以野生型重组质粒或上一步突变质粒为模板进行PCR反应，双向扩增出突变质粒，其PCR反应体系和PCR程序如下所示：

定点突变PCR反应体系：

定点突变PCR反应程序：

PCR反应结束后，酶切掉原始的野生型质粒，每50 μl PCR产物中加入1 μlDpnI，37℃酶切2 h。获得的酶切产物直接转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞中，提取阳性质粒进行测序，将测序正确的质粒转化至大肠杆菌E. coli BL21（DE3）进行异源表达及酶活测定。酶活测定结果如实施例2所示。

实施例2、酯酶耐碱性测定

本发明所采用的标准反应体系（ml-1）为：980 μl不同pH的缓冲液，10 μl纯化后的酶液，1mM底物（CrmE10为对硝基苯酚乙酸酯，AlinE4为对硝基苯酚丁酸酯）。在最适温度（CrmE10为20℃，AlinE4为40℃）下连续测定405 nm紫外光下吸收值5 min，并以热变性失活的酶液作为对照用于调零。测定最适催化pH所用的缓冲液有：100 mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（Citrate buffer，pH 3.0-6.0）、100 mM磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液（Phosphatebuffer，pH 6.0-7.5）、100 mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（Tris-HCl buffer，pH 7.5-9.0）以及50 mM 2-环己胺基乙续酸-氢氧化纳缓冲液（CHES-NaOH，pH 8.5-11）。根据酶活测定可以看出，在pH大于8.5时，CrmE10-mut3与CrmE10-E159K/D200K的酶活几乎消失，与野生型酯酶CrmE10无明显差异；而酯酶CrmE10-mut5的耐碱性具有显著性提高，在pH为10的条件下仍保留20%的酶活，野生型CrmE10则在此条件下没有酶活。此外，本发明还将AlinE4中相关的碱性氨基酸突变为酸性氨基酸予以反向验证，发现所测定的突变体蛋白AlinE4-K61D、AlinE4-K107D和AlinE4-K143在pH大于9.0时仅保留45%或更低的酶活，远低于野生型的60%左右。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种具有高耐碱性的酯酶突变体及其应用

<130> 001

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Gln Gln Ala Asp Ala Val Met Pro

1 5 10 15

Thr Gly Pro Ala Ile Asp Val Leu Ala Phe Gly Asp Ser Leu Phe Ala

20 25 30

Gly Tyr Arg Leu Asp Arg Asp Glu Ser Tyr Pro Ala Arg Leu Gln Ala

35 40 45

Ala Leu Arg Glu Arg Gly Leu Asn Val Asn Val Thr Asn Ala Gly Val

50 55 60

Ser Gly Asp Thr Thr Ala Ala Gly Leu Gln Arg Ile Asp Phe Val Leu

65 70 75 80

Asp Ser Met Ala Gly Glu Pro Asp Leu Val Leu Leu Glu Leu Gly Ala

85 90 95

Asn Asp Met Leu Arg Gly Leu Pro Ala Glu Glu Ala Arg Arg Asn Leu

100 105 110

Asp Thr Ile Leu Gln Arg Leu Asp Gln Arg Asp Ile Pro Val Met Val

115 120 125

Tyr Gly Met Arg Ala Ala Pro Asn Leu Gly Gly Asp Tyr Gly Arg Ser

130 135 140

Phe Asp Ser Ile Phe Pro Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Asp Ala Glu Leu

145 150 155 160

Val Pro Phe Phe Ile Glu Pro Leu Ile Phe Asp Arg Ser Leu Val Gln

165 170 175

Gln Asp Gln Leu His Pro Thr Ala Gln Gly Val Asp Ala Met Val Glu

180 185 190

Gln Thr Val Glu Gln Val Glu Asp Arg Ile Asp Asp Leu

195 200 205

<210> 2

<211> 618

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtggcggacg gcgaggcggc gggtcagcag gccgatgcgg tcatgcccac cggccccgcc 60

atcgacgtgc tggcgttcgg cgacagcctg ttcgcgggat accggctgga ccgcgacgaa 120

tcctatcccg caaggcttca ggccgcgctg cgcgagcggg ggctgaacgt caatgtcacc 180

aacgccggag tatcgggcga taccacggcg gcggggctgc agcgcatcga cttcgtgctc 240

gattccatgg cgggagagcc cgatctggtg ctgctggaac tgggcgcgaa cgacatgctg 300

cgcggccttc cggccgagga agcgcggcgc aatctcgaca cgatcctgca gcggctcgac 360

cagcgcgaca tcccggtgat ggtctatggc atgcgcgccg cgcccaacct gggtggcgat 420

tacggccgca gcttcgacag catcttcccc gatctggccg acaaatacga tgccgaactc 480

gtgcccttct tcatcgagcc gctgatcttc gaccggtcgc tggtgcagca ggaccagctg 540

catcccacgg ctcagggcgt cgacgcgatg gtcgagcaga cggtcgagca ggtcgaggac 600

aggatcgacg acctctag 618

<210> 3

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Glu Ser Arg Val Ile Leu Ala Phe Gly Asp Ser Leu Phe Ala

1 5 10 15

Gly Tyr Gly Leu Asp Lys Gly Glu Ser Tyr Pro Ala Lys Leu Glu Thr

20 25 30

Ala Leu Arg Ser His Gly Ile Asn Ala Arg Ile Ile Asn Ala Gly Val

35 40 45

Ser Gly Asp Thr Thr Ala Ala Gly Leu Gln Arg Ile Lys Phe Val Leu

50 55 60

Asp Ser Gln Pro Asp Lys Pro Glu Leu Ala Ile Val Glu Leu Gly Gly

65 70 75 80

Asn Asp Leu Leu Arg Gly Leu Ser Pro Ala Glu Ala Arg Gln Asn Leu

85 90 95

Ser Gly Ile Leu Glu Glu Leu Gln Arg Arg Lys Ile Pro Ile Leu Leu

100 105 110

Met Gly Met Arg Ala Pro Pro Asn Leu Gly Ala Lys Tyr Gln Arg Glu

115 120 125

Phe Asp Gly Ile Tyr Pro Tyr Leu Ala Glu Lys Tyr Asp Ala Lys Leu

130 135 140

Val Pro Phe Phe Leu Glu Ala Val Ala Asp Arg Pro Asp Leu Ile Gln

145 150 155 160

Lys Asp His Val His Pro Thr Ala Arg Gly Val Glu Glu Leu Val Ser

165 170 175

Ala Thr Ser Asn Ala Val Ala Lys Ala Leu Pro Ala Lys Lys

180 185 190

<210> 4

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggcgaat cgcgcgtgat tctcgccttc ggagacagcc tgtttgcagg ctatggcctt 60

gataaggggg agagctatcc ggcaaagctg gaaactgcgc tgcgcagcca tggcatcaat 120

gccagaatca ttaatgccgg cgtttcgggt gacaccactg cggcagggct gcagcgaatc 180

aaattcgtgc tggatagcca gccggacaag ccggaattgg ccatagtgga actgggcggg 240

aatgaccttt tacgcggcct ctcaccagcc gaagcgcggc agaacctcag cggaatcctc 300

gaagaattgc agaggcggaa aattccaatc ctgttgatgg gaatgcgagc gccgcccaat 360

ctaggggcaa aatatcagcg cgaatttgat gggatttatc cctatctggc cgaaaaatat 420

gacgccaagc tggtaccttt cttccttgag gccgtggcag atagacctga cctcattcag 480

aaggatcacg ttcaccccac tgcgcgcggt gtggaggaac tcgtgtctgc aacatcgaat 540

gcagttgcca aggcgctgcc tgcgaagaag tga 573

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcatcaaat tcgtgctcga ttccatggcg ggaaaacccg at 42

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcgggtttt cccgccatgg aatcgagcac gaatttgatg cg 42

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggctcgacc agcgcaaaat cccggtgatg gtc 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaccatcacc gggattttgc gctggtcgag ccg 33

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gacaaatacg atgccaaact cgtgcccttc ttc 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaagaagggc acgagtttgg catcgtattt gtc 33

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtcgagcagg tcgagaaaag gatcgacgac ctc 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaggtcgtcg atccttttct cgacctgctc gac 33

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gggctgcagc gaatcaattt cgtgctggat agc 33

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctatccagc acgaaattga ttcgctgcag ccc 33

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gatagccagc cggacgagcc ggaattggcc ata 33

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tatggccaat tccggctcgt ccggctggct atc 33

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaattgcaga ggcggaatat tccaatcctg ttg 33

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caacaggatt ggaatattcc gcctctgcaa ttc 33

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaaaaatatg acgccgagct ggtacctttc ttc 33

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gaagaaaggt accagctcgg cgtcatattt ttc 33

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tcgaatgcag ttgccaatgc gctgcctgcg aag 33

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cttcgcaggc agcgcattgg caactgcatt cga 33

Claims

1.一种酯酶突变体，所述的突变体相对于Seq ID No：1所示的酯酶CrmE10具有如下改变位点：

D77X1，其中X1选自K或R；

E86X2，其中X2选自K或R；

D123X3，其中X3选自K或R；

E159X4，其中X4选自K或R；

D200X5, 其中X5选自K或R。

2.根据权利要求1所述的酯酶突变体，其特征在于，所述的突变体相对于Seq ID No：1所示的酯酶CrmE10具有如下改变位点：D77K、E86K、D123K、E159K、D200K。

3.编码权利要求1-2任一项所述的酯酶突变体的多核苷酸。

4.一种核酸构建体，其包含与一种或多种调控序列可操作地连接的权利要求3所述的多核苷酸，所述调控序列在合适的表达宿主中指导所述酯酶突变体的产生。

5.一种重组表达载体，其包含权利要求4所述的核酸构建体。

6.一种宿主，其由权利要求5所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。

7.根据权利要求6所述的宿主，其为细菌、酵母或哺乳动物细胞。

8.一种生产权利要求1-2任一项所述酯酶突变体的方法，其包括：

（1）在有助于产生酯酶突变体的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含权利要求3所述的多核苷酸；

（2）回收所述酯酶突变体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，回收方法选自离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

10.权利要求1或2所述的酯酶突变体或权利要求6所述的能表达酯酶突变体的宿主菌在催化酯类水解中的应用。