CN117821422A - 核酸内切酶iv突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核酸内切酶IV突变体，其中，所述核酸内切酶IV突变体相比于如SEQ ID NO：1所示的野生型核酸内切酶包含在以下一个或者多个位置处的突变：Y58、K61、K82、E83、K116、E171、R135、D139、K161、N205、E226、R231、E236、K253和I281。本发明提供的核酸内切酶IV突变体在宿主细胞中的可溶表达量相对于野生型核酸内切酶IV得到进一步提高，而其活性并无下降，这使得可以降低批量制备的成本，满足寡核苷酸批量生产的需求。大量的实验表明，相比于野生型核酸内切酶IV，本发明提供的核酸内切酶IV突变体的表达量可提高至少将近1倍，甚至可提高3倍多。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种核酸内切酶IV突变体、其编码基因、包含该基因的表达载体、包含该基因或该表达载体的宿主细胞，利用该核酸内切酶IV突变体生产目标寡核苷酸的方法，以及包含该核酸内切酶IV突变体的试剂盒。
背景技术
单链DNA的酶促法切割是一种快速且环保的获取目的寡核苷酸的方法，该方法需要使用两种特定活性酶催化来进行，基本原理为：使用尿嘧啶糖苷酶(Uracil-DNAglycosylase、UDG)特异性地识别单链DNA中的尿嘧啶核苷酸，随后切除尿嘧啶核苷酸中尿嘧啶与脱氧五碳糖之间的糖苷键，形成无嘌呤嘧啶碱基(apurinic或apyrimidinic，AP)位点；特定种类的无嘌呤嘧啶碱基位点内切酶(AP sites endonuclease，AP Endonuclease)识别单链DNA上的AP位点，并对该位点的磷酸二酯键进行切割。
目前，炽热球菌(Pyrococcus furiosus)来源的核酸内切酶IV(pfIV)已经被报道能够较好地识别并切割单链DNA的活性，然而在实际技术实践过程中，野生型pfIV通常使用大肠杆菌表达系统通过异源表达大量分离获取，但其可溶表达量偏低，分离成本较高，提高了下游寡核苷酸批量制备的成本水平，不能满足寡核苷酸批量生产的需求。
因此，如何在不降低核酸内切酶IV活性的同时提高其可溶表达量是本领域亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种核酸内切酶IV突变体，以在不降低核酸内切酶IV活性的同时提高其可溶表达量。
因此，根据本发明的第一方面，提供了一种核酸内切酶IV突变体，其中，所述核酸内切酶IV突变体相比于如SEQ ID NO：1所示的野生型核酸内切酶包含在以下一个或者多个位置处的突变：Y58、K61、K82、E83、K116、E171、R135、D139、K161、N205、E226、R231、E236、K253和I281。
根据本发明的第二方面，提供了一种分离的基因，其编码本发明的第一方面的核酸内切酶IV突变体。
根据本发明的第三方面，提供了一种表达载体，包含本发明的第二方面的基因。
根据本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，包含本发明的第二方面的基因或本发明的第三方面的表达载体。
根据本发明的第五方面，提供了一种生产目标寡核苷酸的方法，所述方法包括使用本发明的第一方面的核酸内切酶IV突变体对单链DNA进行切割的步骤。
根据本发明的第六方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明的第一方面的核酸内切酶IV突变体、任选的尿嘧啶糖苷酶、以及使用说明。
本发明提供的核酸内切酶IV突变体在宿主细胞中的可溶表达量相对于野生型核酸内切酶IV得到进一步提高，而其活性并无下降，这使得可以降低批量制备的成本，满足寡核苷酸批量生产的需求。大量的实验表明，相比于野生型核酸内切酶IV，本发明提供的核酸内切酶IV突变体的表达量可提高至少将近1倍，甚至可提高3倍多。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施方案。
图1示出了野生型pfIV酶及其突变体的表达结果，其中，BSA浓度梯度分别为1：0.05mg/ml；2：0.10mg/ml；3：0.20mg/ml；4：0.40mg/ml；5：0.80mg/ml；6：1.00mg/ml；7：2.00mg/ml；8：4.00mg/ml，M表示蛋白质分子量，单位为kD，从下到上大小依次为14.4、18.4、25、35、45、66、95，WT表示野生型pfIV，IV1、IV2、IV3分别对应于pfIV1、pfIV2、pfIV3。
图2示出了pfIV1突变体的活性检测结果，其中，WT表示野生型pfIV，IV1、IV2、IV3分别对应于pfIV1、pfIV2、pfIV3，箭头所示为产物。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施方案和附图，对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同的含义。
术语“突变体”在本文中主要是指相对于野生型蛋白在一个或者多个位置处的氨基酸发生了突变而产生的突变蛋白。
术语“表达载体”是指可将编码某蛋白的核苷酸序列插入其中并使蛋白在合适的宿主细胞中得到表达的一种核酸运载工具。表达载体可以通过转化、转导或者转染宿主细胞来使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中得到表达。表达载体的种类包括本领域熟知的细菌质粒、慢病毒载体等。在表达载体中，除了含有复制起点外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。
术语“宿主细胞”是指为目标蛋白编码核酸序列提供场所以在其中表达该目标蛋白的细胞。对目标蛋白编码核酸序列进入宿主细胞的方法没有特别的限制，可以为例如直接摄取、转导、转染或所属领域中已知的其他方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。
“可溶表达”是指目标蛋白质在表达系统中表达为溶解的形式。
如本领域技术人员所已知的，野生型pfIV能够较好地识别单链DNA上的AP位点并对该位点的磷酸二酯键进行切割。然而，野生型pfIV的可溶表达量偏低，分离成本较高，从而导致下游寡核苷酸的批量制备成本较高，不能满足寡核苷酸的批量生产等一系列问题。
为解决现有技术中存在的问题，本发明旨在提供一种核酸内切酶IV突变体，其在宿主细胞中的可溶表达量相对于野生型pfIV得到进一步提高，而其活性并无下降，由此降低批量制备的成本，满足寡核苷酸批量生产的需求。
因此，根据本发明的第一方面，提供了一种核酸内切酶IV突变体，其中，所述核酸内切酶IV突变体相比于如SEQ ID NO：1所示的野生型核酸内切酶包含在以下一个或者多个位置处的突变：Y58、K61、K82、E83、K116、E171、R135、D139、K161、N205、E226、R231、E236、K253和I281。
可以理解，上文的字母数字组合中，字母表示氨基酸，数字表示该氨基酸在序列中的位置。氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用Ala或A表示，甘氨酸可用Gly或G表示，缬氨酸可用Val或V表示，亮氨酸可用Leu或L表示，异亮氨酸可用Ile或I表示，脯氨酸可用Pro或P表示，苯丙氨酸可用Phe或F表示，酪氨酸可用Tyr或Y表示，色氨酸可用Trp或W表示，丝氨酸可用Ser或S表示，苏氨酸可用Thr或T表示，半胱氨酸可用Cys或C表示，蛋氨酸可用Met或M表示，天冬酰胺可用Asn或N，谷氨酰胺可用Gln或Q表示，天冬氨酸可用Asp或D表示，谷氨酸可用Glu或E表示，赖氨酸可用Lys或K表示，精氨酸可用Arg或R表示，组氨酸可用His或H表示。
在一些实施方案中，所述核酸内切酶IV突变体包含以下任意一个或多个突变：Y58E、K61E、K82P、E83S、K116G、R135K、D139E、K161D、E171S、N205K、E226D、R231K、E236K、K253D和I281V。
在一个实施方案中，所述核酸内切酶IV突变体包含以下突变：Y58E、K61E、K82P、E83S、R135K、D139E、K161D、N205K、E236K和I281V，该突变体在本文中称为“pfIV1”。
在一个实施方案中，所述核酸内切酶IV突变体包含以下突变：Y58E、K61E、K82P、E83S、K116G、E171S、N205K、E236K、K253D和I281V，该突变体在本文中称为“pfIV2”。
在一个实施方案中，所述核酸内切酶IV突变体包含以下突变：Y58E、K61E、K82P、E83S、R135K、D139E、K161D、N205K、E226D、R231K和E236K，在本文中称为“pfIV3”。
根据本发明的第二方面，提供了一种分离的基因，其编码本发明的第一方面的核酸内切酶IV突变体。
在一个实施方案中，所述基因的核酸序列如SEQ ID NO：5-8中任一项所示。
根据本发明的第三方面，提供了一种表达载体，包含本发明的第二方面的基因。
在一些实施方案中，所述表达载体为质粒如pET28a、pET22b、pET32a、pET50b，噬菌体颗粒，或病毒载体。当然，该表达载体也可以为本领域普通技术人员已知的适用于本发明的其他表达载体，本发明对此不作限制。
根据本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，包含本发明的第二方面的基因或本发明的第三方面的表达载体。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为原核细胞例如大肠杆菌细胞如BL21(DE3)、BL21(DE3)plys、Rosseta(DE3)、Origami，或真核细胞如酵母菌。当然，该宿主细胞也可以为本领域普通技术人员已知的适用于本发明的其他宿主细胞，本发明对此不作限制。
根据本发明的第五方面，提供了一种生产目标寡核苷酸的方法，所述方法包括使用本发明的第一方面的核酸内切酶IV突变体对单链DNA进行切割的步骤。
在一些实施方案中，所述方法包括：1)使用尿嘧啶糖苷酶切除所述单链DNA的尿核苷酸中尿嘧啶与脱氧五碳糖之间的糖苷键，形成无嘌呤嘧啶碱基位点；2)使用本发明的第一方面所述的核酸内切酶IV突变体识别所述无嘌呤嘧啶碱基位点并对该位点的磷酸二酯键进行切割，从而得到目标寡核苷酸。
根据本发明的第六方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明的第一方面的核酸内切酶IV突变体、任选的尿嘧啶糖苷酶、以及使用说明。
本发明提供的核酸内切酶IV突变体在宿主细胞中的可溶表达量相对于野生型核酸内切酶IV得到进一步提高，而其活性并无下降，这使得可以降低批量制备的成本，满足寡核苷酸批量生产的需求。大量的实验表明，相比于野生型核酸内切酶IV，本发明提供的核酸内切酶IV突变体的表达量可至少提高将近1倍，甚至可提高3倍多。
下面结合附图和实施例对本发明进行更为具体和详细的描述，实施例仅是本发明的优选实施方案，并不用于限制本发明。若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例
实施例1：pfIV突变体的设计
为了进一步提高pfIV酶的可溶表达量，本发明通过PymoL软件对野生型pfIV的三维结构进行分析，获得了相对溶剂可及表面积小于30％的极性氨基酸残基(如D、E、K、R、N、Q、Y、H、S和T中的几种)和大于30％的疏水性氨基酸残基(I、L、F和W中的几种)，并去除对活性中心附近的氨基酸残基。随后，使用ProteinMPNN进行蛋白质序列设计，针对上述被筛选出的氨基酸残基进行突变设计。
本发明中，pfIV包含以下具体突变设计：经筛选，确定进行突变设计的位点为Y58、K61、K82、E83、K116、E171、R135、D139、K161、N205、E226、R231、E236、K253和I281，经设计所获得的组合见表1。
表1突变位点组合
野生型pfIV的序列(Genbak:GenBank:AAL80382.1、uniprot:Q8U437)SEQ ID NO：1如下所示：
MFKIDRLRFGTAGIPLSTPKPSTIAGIERVRELGLDAMELEFVRGVNIRPELAKKIKYVA
KKNDVVLTAHAPYYINLNAKEKEKVESSKRRIIQSAERLYEAGGWSVVFHAGYYLKE
HPEKVYQKIESTLKDIERELKDRGIEVWLRPELTGKPTQFGDLKELIKLSQNLELVLPAI
DFAHAHARNKGKCNSEEEWREMLALIENELGREALDNMHIHISGIEYTEKGEKRHLNL
EESDLKWEDLLKVLKEFKVKGVVISESPNIEGDALLMKKKWEELKI
核酸内切酶IV突变体1(pfIV1)的序列SEQ ID NO：2如下所示：MFKIDRLRFGTAGIPLSTPKPSTIAGIERVRELGLDAMELEFVRGVNIRPELAKKIKEVAEKNDVVLTAHAPYYINLNAKEPSKVESSKRRIIQSAERLYEAGGWSVVFHAGYYLKEHPEKVYQKIESTLKDIEKELKERGIEVWLRPELTGKPTQFGDLDELIKLSQNLELVLPAIDFAHAHARNKGKCNSEEEWREMLALIEKELGREALDNMHIHISGIEYTEKGEKRHLNLKESDLKWEDLLKVLKEFKVKGVVISESPNIEGDALLMKKKWEELKV
核酸内切酶IV突变体2(pfIV2)的序列SEQ ID NO：3如下所示：MFKIDRLRFGTAGIPLSTPKPSTIAGIERVRELGLDAMELEFVRGVNIRPELAKKIKEVAEKNDVVLTAHAPYYINLNAKEPSKVESSKRRIIQSAERLYEAGGWSVVFHAGYYLGEHPEKVYQKIESTLKDIEKELKERGIEVWLRPELTGKPTQFGDLDELIKLSQNLSLVLPAIDFAHAHARNKGKCNSEEEWREMLALIEKELGREALDNMHIHISGIEYTEKGEKRHLNLKESDLKWEDLLKVLKEFDVKGVVISESPNIEGDALLMKKKWEELKV
核酸内切酶IV突变体3(pfIV3)的序列SEQ ID NO：4如下所示：MFKIDRLRFGTAGIPLSTPKPSTIAGIERVRELGLDAMELEFVRGVNIRPELAKKIKEVAEKNDVVLTAHAPYYINLNAKEPSKVESSKRRIIQSAERLYEAGGWSVVFHAGYYLKEHPEKVYQKIESTLKDIEKELKERGIEVWLRPELTGKPTQFGDLDELIKLSQNLELVLPAIDFAHAHARNKGKCNSEEEWREMLALIEKELGREALDNMHIHISGIEYTDKGEKKHLNLKESDLKWEDLLKVLKEFKVKGVVISESPNIEGDALLMKKKWEELKI
野生型pfIV的核酸序列SEQ ID NO：5如下所示：ATGTTCAAAATCGACCGTCTGCGTTTCGGTACCGCTGGTATCCCGCTGTCTACCCCGAAACCGTCTACCATCGCTGGTATCGAACGTGTTCGTGAACTGGGTCTGGACGCTATGGAACTGGAATTCGTTCGTGGTGTTAACATCCGTCCGGAACTGGCTAAAAAAATCAAATACGTTGCTAAAAAAAACGACGTTGTTCTGACCGCTCACGCTCCGTACTACATCAACCTGAACGCTAAAGAAAAAGAAAAAGTTGAATCTTCTAAACGTCGTATCATCCAGTCTGCTGAACGTCTGTACGAAGCTGGTGGTTGGTCTGTTGTTTTCCACGCTGGTTACTACCTGAAAGAACACCCGGAAAAAGTTTACCAGAAAATCGAATCTACCCTGAAAGACATCGAACGTGAACTGAAAGACCGTGGTATCGAAGTTTGGCTGCGTCCGGAACTGACCGGTAAACCGACCCAGTTCGGTGACCTGAAAGAACTGATCAAACTGTCTCAGAACCTGGAACTGGTTCTGCCGGCTATCGACTTCGCTCACGCTCACGCTCGTAACAAAGGTAAATGCAACTCTGAAGAAGAATGGCGTGAAATGCTGGCTCTGATCGAAAACGAACTGGGTCGTGAAGCTCTGGACAACATGCACATCCACATCTCTGGTATCGAATACACCGAAAAAGGTGAAAAACGTCACCTGAACCTGGAAGAATCTGACCTGAAATGGGAAGACCTGCTGAAAGTTCTGAAAGAATTCAAAGTTAAAGGTGTTGTTATCTCTGAATCTCCGAACATCGAAGGTGACGCTCTGCTGATGAAAAAAAAATGGGAAGAACTGAAAATCTAA
核酸内切酶IV突变体1(pfIV1)的核苷酸序列SEQ ID NO：6如下所示：
ATGTTCAAAATCGACCGTCTGCGTTTCGGTACCGCTGGTATCCCGCTGTCTACCCCG
AAACCGTCTACCATCGCTGGTATCGAACGTGTTCGTGAACTGGGTCTGGACGCTATG
GAACTGGAATTCGTTCGTGGTGTTAACATCCGTCCGGAACTGGCTAAAAAAATCAA
AGAAGTTGCTGAAAAAAACGACGTTGTTCTGACCGCTCACGCTCCGTACTACATCA
ACCTGAACGCTAAAGAACCGTCTAAAGTTGAATCTTCTAAACGTCGTATCATCCAGT
CTGCTGAACGTCTGTACGAAGCTGGTGGTTGGTCTGTTGTTTTCCACGCTGGTTACT
ACCTGAAAGAACACCCGGAAAAAGTTTACCAGAAAATCGAATCTACCCTGAAAGA
CATCGAAAAAGAACTGAAAGAACGTGGTATCGAAGTTTGGCTGCGTCCGGAACTG
ACCGGTAAACCGACCCAGTTCGGTGACCTGGACGAACTGATCAAACTGTCTCAGAA
CCTGGAACTGGTTCTGCCGGCTATCGACTTCGCTCACGCTCACGCTCGTAACAAAG
GTAAATGCAACTCTGAAGAAGAATGGCGTGAAATGCTGGCTCTGATCGAAAAAGAA
CTGGGTCGTGAAGCTCTGGACAACATGCACATCCACATCTCTGGTATCGAATACACC
GAAAAAGGTGAAAAACGTCACCTGAACCTGAAAGAATCTGACCTGAAATGGGAAG
ACCTGCTGAAAGTTCTGAAAGAATTCAAAGTTAAAGGTGTTGTTATCTCTGAATCTC
CGAACATCGAAGGTGACGCTCTGCTGATGAAAAAAAAATGGGAAGAACTGAAAGT
TTAA
核酸内切酶IV突变体2(pfIV1)的核苷酸序列SEQ ID NO：7如下所示：
ATGTTCAAAATCGACCGTCTGCGTTTCGGTACCGCTGGTATCCCGCTGTCTACCCCG
AAACCGTCTACCATCGCTGGTATCGAACGTGTTCGTGAACTGGGTCTGGACGCTATG
GAACTGGAATTCGTTCGTGGTGTTAACATCCGTCCGGAACTGGCTAAAAAAATCAA
AGAAGTTGCTGAAAAAAACGACGTTGTTCTGACCGCTCACGCTCCGTACTACATCA
ACCTGAACGCTAAAGAACCGTCTAAAGTTGAATCTTCTAAACGTCGTATCATCCAGT
CTGCTGAACGTCTGTACGAAGCTGGTGGTTGGTCTGTTGTTTTCCACGCTGGTTACT
ACCTGGGTGAACACCCGGAAAAAGTTTACCAGAAAATCGAATCTACCCTGAAAGA
CATCGAAAAAGAACTGAAAGAACGTGGTATCGAAGTTTGGCTGCGTCCGGAACTG
ACCGGTAAACCGACCCAGTTCGGTGACCTGGACGAACTGATCAAACTGTCTCAGAA
CCTGTCTCTGGTTCTGCCGGCTATCGACTTCGCTCACGCTCACGCTCGTAACAAAGG
TAAATGCAACTCTGAAGAAGAATGGCGTGAAATGCTGGCTCTGATCGAAAAAGAAC
TGGGTCGTGAAGCTCTGGACAACATGCACATCCACATCTCTGGTATCGAATACACCG
AAAAAGGTGAAAAACGTCACCTGAACCTGAAAGAATCTGACCTGAAATGGGAAGA
CCTGCTGAAAGTTCTGAAAGAATTCGACGTTAAAGGTGTTGTTATCTCTGAATCTCC
GAACATCGAAGGTGACGCTCTGCTGATGAAAAAAAAATGGGAAGAACTGAAAGTT
TAA
核酸内切酶IV突变体3(pfIV1)的核苷酸序列SEQ ID NO：8如下所示：
ATGTTCAAAATCGACCGTCTGCGTTTCGGTACCGCTGGTATCCCGCTGTCTACCCCG
AAACCGTCTACCATCGCTGGTATCGAACGTGTTCGTGAACTGGGTCTGGACGCTATG
GAACTGGAATTCGTTCGTGGTGTTAACATCCGTCCGGAACTGGCTAAAAAAATCAA
AGAAGTTGCTGAAAAAAACGACGTTGTTCTGACCGCTCACGCTCCGTACTACATCA
ACCTGAACGCTAAAGAACCGTCTAAAGTTGAATCTTCTAAACGTCGTATCATCCAGT
CTGCTGAACGTCTGTACGAAGCTGGTGGTTGGTCTGTTGTTTTCCACGCTGGTTACT
ACCTGAAAGAACACCCGGAAAAAGTTTACCAGAAAATCGAATCTACCCTGAAAGA
CATCGAAAAAGAACTGAAAGAACGTGGTATCGAAGTTTGGCTGCGTCCGGAACTG
ACCGGTAAACCGACCCAGTTCGGTGACCTGGACGAACTGATCAAACTGTCTCAGAA
CCTGGAACTGGTTCTGCCGGCTATCGACTTCGCTCACGCTCACGCTCGTAACAAAG
GTAAATGCAACTCTGAAGAAGAATGGCGTGAAATGCTGGCTCTGATCGAAAAAGAA
CTGGGTCGTGAAGCTCTGGACAACATGCACATCCACATCTCTGGTATCGAATACACC
GACAAAGGTGAAAAAAAACACCTGAACCTGAAAGAATCTGACCTGAAATGGGAAG
ACCTGCTGAAAGTTCTGAAAGAATTCAAAGTTAAAGGTGTTGTTATCTCTGAATCTC
CGAACATCGAAGGTGACGCTCTGCTGATGAAAAAAAAATGGGAAGAACTGAAAAT
CTAA
实施例2：pfIV突变体的获得
pfIV酶的氨基酸序列在设计好后，使用Jcat软件进行密码子优化获得核酸序列(SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8)，并将该核酸序列发送至南京擎科生物有限公司进行合成，其中将该核酸序列合成至基于T7启动子的商业化表达载体pET-28a(Novagen公司)，所述表达载体含有响应IPTG诱导表达的操纵子序列。
实施例3：pfIV酶的表达纯化
1)将野生型pfIV及其突变体pfIV1、pfIV2、pfIV3表达载体分别加入100μL的感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min。然后，将大肠杆菌加入900μLLB，于37℃、220rpm孵育1h，再将大肠杆菌涂布于含卡那抗性LB平板，37℃过夜培养。
2)挑菌至4mL的LB液体培养基中，于37℃、180rpm培养4h；然后将4mL菌液转接至500mL的LB液体培养基中，于37℃、160rpm继续培养4h，后降温至16℃，降速至140rpm，加入终浓度为0.3mM的IPTG，诱导表达20h。
3)随后在3500rpm下离心15min，收集菌体，称重，减去收集管重量，获得各菌体湿重。
4)使用50mL裂解缓冲液(20mM Tris-Cl pH7.6，250mM NaCl，10％甘油)重悬菌体；使用高通量超声破碎仪破碎细胞，时间间隔为10s，功率为100％，时长为60min。
5)超声破碎结束后，在12000rpm下离心30min，收集上清，与100μL的Ni-NTA填料(填料经EDTA脱镍和再次挂镍复生处理)混合，4℃旋转孵育1h。随后，在2500rpm下离心1min，收集填料。收集流穿样和填料样品用于SDS-PAGE。依次使用含有20mM咪唑、50mM咪唑和300mM咪唑的缓冲液洗涤填料，收集洗涤样品。
所得蛋白结果如图1所示，其中浓度梯度的BSA条带作为参照。从图1中可以看到，野生型pfIV酶及其突变体pfIV1、pfIV2、pfIV3均能良好可溶表达。
实施例4：可溶表达量对比
通过SDS-PAGE进行表达量对比，并使用浓度梯度的BSA条带作为参照，估测目的酶的浓度。对比结果见表2。从表2结果可知，与野生型pfIV(WT)相比，pfIV1的表达量是WT的约1.74倍，pfIV2是WT的约4.09倍，pfIV3是WT的约3.41倍。
表2野生型pfIV及其各突变体的表达量对比
实施例5：活性检测和对比
使用尿嘧啶核苷酸的ssDNA链(5’FAM-GTATTGCCTTTCCTACGACCTCACGC(dU)TAATGAATGAC ACTCAATGCACAT-3’)对所得到的各pfIV酶进行活性检测，ssDNA链5’端含有荧光标记FAM基团，有利于更好地观测产物。ssDNA总量为200pmol，先加入NEB UDG(货号：M0372S)于37℃反应5min，于50℃失活5min，随后分别加入等浓度的野生型pfIV酶及其突变体pfIV1、pfIV2、pfIV3各1μL，反应5min，最后加入终浓度10mM的EDTA终止反应。具体反应体系如下：
表3反应体系1
表4反应体系2
| 名称 | 加入量 |
| UDG反应后产物 | 24μL |
| 核酸内切酶IV或其突变体 | 1μL |
| 总计 | 25μL |
最后，使用SDS-PAGE进行电泳，在220V的电压下进行60min电泳，结果如图2所示。在图2中，CK1为未添加UDG和pfIV的阴性对照；CK2为仅添加UDG的对照，用以表明产物无法单独由UDG催化产生；条件对照为仅添加野生型pfIV及其各pfIV突变体但未加UDG的对照，用以表明单独pfIV突变体不能形成产物。由图2可知，结合各个对照，与WT相比，突变体pfIV1、pfIV1、pfIV3的产物量并未减少，表明可溶表达量提高后，活性并未下降。
Claims (10)
1.一种核酸内切酶IV突变体，其中，所述核酸内切酶IV突变体相比于如SEQ ID NO：1所示的野生型核酸内切酶包含在以下一个或者多个位置处的突变：Y58、K61、K82、E83、K116、E171、R135、D139、K161、N205、E226、R231、E236、K253和I281。
2.根据权利要求1所述的核酸内切酶IV突变体，其中，所述核酸内切酶IV突变体包含以下任意一个或多个突变：Y58E、K61E、K82P、E83S、K116G、R135K、D139E、K161D、E171S、N205K、E226D、R231K、E236K、K253D和I281V。
3.根据权利要求1或2所述的核酸内切酶IV突变体，其中，所述核酸内切酶IV突变体包含以下突变：(1)Y58E、K61E、K82P、E83S、R135K、D139E、K161D、N205K、E236K和I281V，(2)Y58E、K61E、K82P、E83S、K116G、E171S、N205K、E236K、K253D和I281V，或(3)Y58E、K61E、K82P、E83S、R135K、D139E、K161D、N205K、E226D、R231K和E236K。
4.一种分离的基因，其编码权利要求1-3中任一项所述的核酸内切酶IV突变体；优选地，所述基因的核酸序列如SEQ ID NO：5-8中任一者所示。
5.一种表达载体，包含权利要求4所述的基因；优选地，所述表达载体为质粒如pET28a、pET22b、pET32a、pET50b，噬菌体颗粒，或病毒载体。
6.一种宿主细胞，包含权利要求4所述的基因或权利要求5所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，所述宿主细胞为原核细胞例如大肠杆菌细胞如BL21(DE3)、BL21(DE3)plys、Rosseta(DE3)、Origami，或真核细胞如酵母菌细胞。
8.一种生产目标寡核苷酸的方法，所述方法包括使用权利要求1-3中任一项所述的核酸内切酶IV突变体对单链DNA进行切割的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，所述方法包括：
1)使用尿嘧啶糖苷酶切除所述单链DNA的尿核苷酸中尿嘧啶与脱氧五碳糖之间的糖苷键，形成无嘌呤嘧啶碱基位点；
2)使用权利要求1-3中任一项所述的核酸内切酶IV突变体识别所述无嘌呤嘧啶碱基位点并对该位点的磷酸二酯键进行切割，从而得到目标寡核苷酸。
10.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-3中任一项所述的核酸内切酶IV突变体、任选的尿嘧啶糖苷酶、以及使用说明。
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| CN (1) | CN117821422A (zh) |
-
2023
- 2023-12-07 CN CN202311670481.2A patent/CN117821422A/zh active Pending
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