CN111139229B

CN111139229B - 一种新型gdsl家族脂类水解酶eii-2及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN111139229B
Application number: CN201911212279.9A
Authority: CN
Inventors: 杨晓宸; 戎振; 许学伟; 刘倩; 吴月红; 周鹏
Original assignee: Second Institute of Oceanography MNR
Current assignee: Second Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2039-12-02
Also published as: CN111139229A

Abstract

本发明公开了一种高盐度、金属离子及有机溶剂条件下都能够高效催化酯类水解的热稳定脂类水解酶EII‑2及其应用。本发明所涉及脂类水解酶基因来自海洋细菌Altererythrobacter aestuarii JCM16339，所述的脂类水解酶基因经大肠杆菌E.coli菌株异源表达后，具有较好的热稳定性和对高盐度、金属离子、有机溶剂较强的适应性，使其可应用于废水处理、精细化工、制药和环境修复等含盐和含有机溶剂条件下的工业生产。

Description

一种新型GDSL家族脂类水解酶EII-2及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种海洋细菌来源且耐受高盐度、金属离子及有机溶剂的GDSL家族脂类水解酶及应用。

背景技术

脂类水解酶广泛存在于微生物、动物和植物中，是一种能够催化脂肪酸酯键水解或合成反应的一类水解酶的总称。脂类水解酶参与生物体多个代谢过程，在酯类运输、细胞结构构建以及能量代谢中发挥重要功能，是维持生命体生存所必需的酶类之一。细菌GDSL家族脂类水解酶又称为酯酶第二家族，该家族蛋白的氨基酸序列中存在一个特有的GDSL序列，并且比其他家族的蛋白GXSXG五肽序列更靠近肽链的N端，其三个催化残基丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸分别位于三个保守区域内。GDSL家族水解酶广泛存在于原核与真核生物中，是具有广泛底物谱的一类水解酶。广泛底物谱和功能多样性使该家族水解酶在诸如食品、医药、纺织、洗涤、污水处理、环境修复等领域具有广泛的潜在应用价值，成为国内外研究热点。

本发明从一种海洋细菌中筛选到一种新型GDSL家族水解酶基因，并对该基因进行了重组表达。重组酶具有热稳定性、耐盐性，并且在金属离子和有机溶剂存在的条件下能提高活性，可用于精细化工、制药、洗涤、废水处理和环境修复等工业领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的海洋细菌来源水解酶、其编码基因及其制备方法，该水解酶可用于广泛pH条件下高温反应中酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。

本发明涉及具有水解酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的多肽所示序列一致；或

(b)多肽，其为SEQ ID NO:2所示多肽的远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO:2所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的水解酶活性。

本发明所述的具有水解酶活性的多肽，其来源于海水的中温细菌Altererythrobacter aestuarii。所述菌株购自日本典型菌种保藏中心，保藏编号为：JCM16339。

本发明针对分离自海水的中温细菌Altererythrobacter aestuarii JCM16339,通过对其基因组DNA序列分析，筛选获得水解酶基因eII-2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。基因eII-2大小为699bp，碱基组成为126A(18.03％)、133T(19.03％)、207C(29.61％)和233G(33.33％)，编码蛋白大小为233个氨基酸残基，分子量24.41kDa。其氨基酸序列如SEQID No.2所示。将该水解酶EII-2氨基酸序列在GenBank数据库中进行同源搜索，与之一致性最高的是细菌菌株Altererythrobacter sp.SSKS-13来源芳香基酯酶，一致性为76.77％(其在GenBank数据库中的注册号为WP_136692206.1)。其序列功能迄今为止尚无正式论文或图书发表。氨基酸序列分析结果表明，该蛋白包含四个氨基酸序列保守区域，分别为谷氨酸－亮氨酸－甘氨酸－甘氨酸－天冬酰胺保守区(氨基酸序列118-123)、包含丝氨酸活性位点(氨基酸位置54)的甘氨酸－天冬氨酸－丝氨酸－亮氨酸保守区(氨基酸序列52-55)、包含天冬氨酸活性位点(氨基酸位置203)的天冬氨酸－精氨酸保守区(氨基酸序列203-204)以及包含组氨酸活性位点(氨基酸位置206)的组氨酸－脯氨酸－苏氨酸保守区(氨基酸序列206-208)。其氨基酸序列特征符合GDSL水解酶家族特征。综上所述，EII-2应为GDSL水解酶家族中的一名新成员。

在不影响水解酶EII-2蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO:2所示的远离催化中心氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到水解酶突变体。如前所述，本发明所述的水解酶EII-2的催化中心为SEQ ID NO:2所示的52-55、203-204和206-208氨基酸位置。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域52-55、203-204和206-208位氨基酸位置的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的水解酶EII-2具有至少与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。所述的突变体能够基本保留水解酶EII-2的生物学功能，优选该突变体具有与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的水解酶EII-2至少90％以上的酶活性，更优选具有至少95％以上的酶活性，最优选至少99％以上的酶活性。更优选的，所述的突变体具有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少95％以上的同源性及至少95％以上的水解酶活性。最优选的，所述的突变体具有与SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列至少99％以上的同源性及至少99％以上的水解酶活性，且该水解酶EII-2来源于海水的中温细菌Altererythrobacter aestuarii。

本发明还涉及SEQ ID NO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的人工变体，突变位置优选小于5个，更优选小于3个，最优选仅为1个位置氨基酸的突变。保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如Η.Neurath和R.L.Hill，1979于The Proteins，Academic Press，NewYork中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly等。

可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science，241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO95/17413或者WO 95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等，1991，Biochemistry 30:10832-10837；美国专利号5，223，409；WO92/06204)和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等，1986，Gene46:145和1988，DNA 7:127)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有水解酶活性的水解酶EII-2的核苷酸序列，或由编码本发明具有水解酶EII-2活性的突变体的核苷酸序列组成。

本发明涉及编码具有水解酶EII-2活性的分离的多核苷酸，其选自下组：

(a)多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的核苷酸所示序列一致；或

(b)多核苷酸，其为对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除154-165、607-612和616-624位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸得到的突变体基因，该多核苷酸具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％以上的同源性。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明水解酶EII-2的核苷酸序列。该序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列一致；将该水解酶基因序列在GenBank数据库中进行同源搜索，与之一致性最高的是Altererythrobacter sp.B11基因组核苷酸，一致性为75.63％(其在GenBank数据库中的注册号为AP018498.1)。该基因编码催化活性中心氨基酸的密码子位于基因SEQ ID NO:1的154-165、607-612和616-624号碱基对。

本发明还提供对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除154-165、607-612和616-624位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留水解酶EII-2蛋白生物学活性的突变体基因。优选的水解酶EII-2突变体基因具有至少与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性，且该水解酶EII-2来源于海水的中温细菌Altererythrobacter aestuarii。

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，可以用许多方式操作编码本发明水解酶的分离的多核苷酸以提供水解酶的表达。所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶EII-2基因连接到合适的载体上。合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)；动物细胞表达载体pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，可有利地用于水解酶EII-2的重组生产中。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是在本发明的水解酶EII-2的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶EII-2基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组水解酶EII-2。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，可通过如下原生质体转化或或电穿孔法将载体转化到原核细胞中。合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等。本发明优选采用原核表达系统E.coli表达水解酶EII-2。在一个优选的实施方案中，利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶EII-2基因连接到载体上pSMT3(Herrmann,J.1996)上，并转化至原核生物E.coli菌株，利用重组载体pSMT3-EII-2中强启动子大量表达EII-2融合蛋白。

本发明还涉及用于产生本发明所述水解酶EII-2的方法，其包括：

(a)在有助于产生水解酶EII-2的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含SEQ ID NO:1所示核苷酸或对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除154-165、607-612和616-624位核苷酸外具有至少一个突变位点的核苷酸；和

(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生所述水解酶EII-2的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述水解酶的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物回收。

所得水解酶EII-2可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)或差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)等方法。

本发明还提供了水解酶EII-2或能表达水解酶EII-2的宿主菌在工业上的应用，例如可用于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，水解酶EII-2具有酯酶活性。EII-2或上述能表达EII-2的宿主菌可用于水解短链脂肪酸酯，例如C2-C12链脂肪酸酯，包括对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，对硝基苯酚癸酸酯(C10)，对硝基苯酚十二酸酯(C12)。

经测定表明，水解酶EII-2对酰基碳链较短脂类物质具有较好催化活性，对于短链脂类的水解活力优于长链脂类。因此，优选EII-2水解酶用于催化水解C2-C8短链脂肪酸酯，例如对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，最适的短链脂肪酸脂底物为具有C6短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯酚己酸酯。

EII-2催化水解活性在pH范围6.0～9.5有很高的活性(为最大酶活的60％以上)，最适pH为7.5。温度范围为15～45℃，最适反应温度30℃。在10～70℃中孵育1h，仍能保持50％以上活性；EII-2活性会被Cu²⁺、Ni²⁺和Zn²⁺离子明显抑制，Ba²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Sr²⁺、EDTA、Co²⁺和Zn²⁺存在下对酶活有不同程度的促进作用。土温20、土温80、Triton X-100和乙腈对EII-2活性抑制作用较为明显，丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、DMSO、DMF和甘油对EII-2的活性有不同程度的促进作用。

从海水分离的的细菌Altererythrobacter aestuarii JCM16339中筛选获得新的耐盐且耐受金属离子及有机溶剂的热稳定水解酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化酯类水解的生产过程中。获得的水解酶基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业化生产。该水解酶可应用于环境中，包括酸性、中性及碱性水解环境，为后续的工业应用提供成本低廉的热稳定水解酶。该酶的生产可在洗涤剂、废水处理、精细化工、制药和环境修复等不同pH环境的生产工艺中显示出重要的经济和社会价值。

附图说明

图1为水解酶EII-2的底物特异性图。C2：对硝基苯酚乙酸酯；C4：对硝基苯酚丁酸酯、C6：对硝基苯酚己酸酯；C8：对硝基苯酚辛酸酯；C10：对硝基苯酚癸酸酯；C12:对硝基苯酚十二酸酯；C14对硝基苯酚十四酸酯；C16:对硝基苯酚十六酸酯。定义底物为C6时测定值为100％。

图2为水解酶EII-2最适反应pH图。

图3为水解酶EII-2最适反应温度图。

图4为水解酶EII-2不同温度下热稳定性图。

图5为二价阳离子对水解酶EII-2活性影响图。

图6为有机溶剂对水解酶EII-2活性影响图。

图7为NaCl浓度对水解酶EII-2活性影响图。

具体实施方式

实施例1水解酶基因eII-2的获取

基于分离自海水的细菌Altererythrobacter aestuarii JCM16339全基因组、开放阅读框预测及基因注释结果，筛选脂类水解酶相关基因。通过Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与数据库中已知水解酶基因序列的同源性。经数据库比对分析获得eII-2基因，大小为699bp，碱基组成为126A(18.03％)、133T(19.03％)、207C(29.61％)和233G(33.33％)其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。编码蛋白大小为233个氨基酸残基，分子量24.41kDa，其氨基酸序列如下所示(其三字母氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)：

将该水解酶EII-2氨基酸序列在GenBank数据库中进行同源搜索，与之一致性最高的是细菌菌株Altererythrobacter sp.SSKS-13来源芳香基酯酶，一致性为76.77％(其在GenBank数据库中的注册号为WP_136692206.1)。其序列功能迄今为止尚无正式论文或图书发表。

序列分析表明，水解酶EII-2属于酯酶GDSL家族。氨基酸序列分析结果显示，该酶活性中心由丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸组成。三个活性残基分别位于甘氨酸－天冬氨酸－丝氨酸－亮氨酸保守区(氨基酸序列52-55)、天冬氨酸－精氨酸保守区(氨基酸序列203-204)以及组氨酸－脯氨酸－苏氨酸保守区(氨基酸序列206-208)。其氨基酸序列特征符合GDSL水解酶家族特征。综上所述，EII-2应为酯酶家族和GDSL水解酶家族中的一名新成员。

实施例2EII-2二级及三级蛋白结构分析

将本发明获得的EII-2氨基酸序列置于蛋白结构预测软件SWISS-MODEL分析，结果表明EII-2由11个α螺旋和5个β折叠构成。通过蛋白三维空间比对显示，EII-2蛋白三级结构与AlinE4蛋白相近(相似度65.26％)。

实施例3基因eII-2的重组表达质粒和重组菌株的构建

将本发明获得的基因eII-2克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。基于NCBI ORFFinder的ORF分析获得的基因开放阅读框序列，设计扩增全基因的上游引物eII-2F(5’-TCGCGGATCCATGCGTATTG GCGGTTTATG-3’，BamHI)和下游引物eII-2R(5’-TCCCGAGCTCCTAGTCTTTTGCATCCGGC-3’，SacI)，PCR扩增确认基因全长序列。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用BamHI和SacI双酶切PCR产物，纯化后的片段与经BamHI和SacI双酶切的质粒pSMT3连接，采用CaCl₂转化法转化至E.coli DH5α中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒(Omega，美国)提取阳性克隆的质粒，经BamHI和SacI双酶切鉴定，获得699bp左右的DNA片段，经测序鉴定为基因eII-2。将重组表达质粒转化到E.coli(BL21)表达菌株中，构建表达重组菌株。

实施例4利用重组表达菌株表达重组基因eII-2

将构建好的3ml重组表达菌株转接到100ml含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，转入20℃以150r/min振荡培养16h。低温离心收集菌体，重悬于NTA-10溶液(500mM氯化钠，10mM咪唑，20mM Tris盐酸，pH 8.0)中，在冰上进行超声波破碎处理。低温离心收集上清，采用NTA-Ni²⁺亲和柱层析纯化表达蛋白。所表达的重组蛋白含有N端的6×His tag，可亲和吸附到层吸柱上，经过不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱，收集洗脱液。经SDS-PAGE检测目的蛋白在洗脱液中的分布情况。利用ULP1酶在透析袋中切除重组蛋白N端的类泛素SUMO，并采用NTA-Ni²⁺亲和柱层析去除SUMO蛋白，收集样品进行SDS-PAGE检测。得到电泳纯的重组蛋白EII-2，分子量约24kDa。用Brandford法测定蛋白质浓度。

实施例5重组水解酶EII-2的活性检测

利用对硝基苯酚己酸酯法测定纯化的重组水解酶EII-2活性。具体操作：1ml反应体系中包括1mM对硝基苯酚己酸酯，100mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH 7.5)和1.54μg纯酶蛋白，采用紫外可见光分光光度计(Beckman DU800型，美国)于30℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min，使用失活的酶液作为对照用于调零。一个酶活力单位定义为每分钟从对硝基苯酚酯催化产生lμmol对硝基苯酚的所需要的酶量。测得的酯酶活性为5U/mg。

实施例6水解酶EII-2底物特异性分析

水解酶EII-2的底物特异性分析采用体系(1ml)：100mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH 7.5)，1mM底物，加入1.54μg纯酶蛋白，在30℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定采用的底物为：对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，对硝基苯酚癸酸酯(C10)，对硝基苯酚十二酸酯(C12)，对硝基苯酚十四酸酯(C14)，对硝基苯酚十六酸酯(C16)。经测定表明，EII-2对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯(C4、C6和C8)具有较高催化活性，其中底物为对硝基苯酚己酸酯(C6)时催化活性最高(图1)。结果表明，水解酶EII-2对酰基碳链较短脂类物质具有较好催化活性，对于短链脂类的水解活力优于长链脂类。

实施例7水解酶EII-2最适反应条件分析

水解酶EII-2最适反应pH在3.0～10.0范围内测定。具体操作为：在不同pH缓冲液中加入1mM对硝基苯酚己酸酯和1.54μg纯酶蛋白，在30℃下连续测定吸光值A₃₄₈ 2min。测定使用的缓冲液为：100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0～6.0)，100mM磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH 6.0～7.5)，100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5～9.0)和50mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0～10.5)。测定结果表明，EII-2最适反应pH为7.5，在pH 6.0～9.5范围内具有活性，且在pH 6.5～8.5之间酶活维持在较高的水平(为最大酶活的50％以上)，显示出十分宽广的pH适用范围(图2)。

水解酶EII-2最适反应温度在15～45摄氏度范围内测定。具体操作为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚己酸酯，100mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH 7.5)和1.54μg纯酶蛋白，分别在15、20、25、30、35、40和45摄氏度条件下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明EII-2的反应温度范围为15～45摄氏度，最适反应温度为30摄氏度(图3)。

实施例8水解酶EII-2酶学稳定性分析

水解酶EII-2的热稳定性分析具体操作为：在30至70摄氏度温度区间内每10摄氏度为一个梯度建立温度梯度。将酶液分别在各温度梯度条件下孵育1h和2h，测定酶的活性；测活体系为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚己酸酯，100mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH 7.5)和1.54μg纯酶蛋白，于30℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。结果表明，在10～70摄氏度中孵育1h条件下，EII-2仍能保持50％以上活性(图4)；说明EII-2具有较好的热稳定性。

二价阳离子对水解酶EII-2活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入10mM Ba²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Sr²⁺、Zn²⁺和乙二胺四乙酸(EDTA)，测定酶活性。测酶活体系为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚丁酸酯，100mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH 7.5)和1.54μg纯酶蛋白，于30℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明，EII-2活性会被Cu²⁺、Ni²⁺和Zn²⁺离子明显抑制，Ba²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Sr²⁺、EDTA、Co²⁺和Zn²⁺存在下对酶活有不同程度的促进作用(提升20％以上活性)(图5)。

有机溶剂对水解酶EII-2活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入有机溶剂，测定酶的活性。加入有机溶剂的用量与种类有5％(v/v)：丙酮(Acetone)、乙腈(Acetonitrile)、乙醇(Ethanol)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Glycerol)、异丙醇(Isopropanol)和甲醇(Methanol)。1％(v/v)：土温20(T20)、土温80(T80)，或100倍Triton，测活体系为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚己酸酯，100mMNaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH 7.5)和1.54μg纯酶蛋白，于30℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明，土温20、土温80、Triton X-100和乙腈对EII-2活性抑制作用较为明显，丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、DMSO、DMF和甘油对EII-2的活性有不同程度的促进作用(图6)。

序列表

<110> 自然资源部第二海洋研究所

<120> 一种新型GDSL家族脂类水解酶EII-2及其编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 699

<212> DNA

<213> Altererythrobacter aestuarii

<400> 1

atgcgtattg gcggtttatg gatggggttg gcggcgcttt cactggcagg ctgcggggca 60

gaggctccgc ccacccagca gcaggtggcc gaacctgcgc cgatcacgga agacctgccc 120

gtgataggac cggagcggac tatcctcgcc tttggagaca gcctgttcgc cggctataat 180

ctggccgagg atgagggata tccggagaaa ctggaagtgg tgctgcgcgc cagcggcatc 240

aatgcccgcg tgatcgatgc gggcgtatcg ggcgatacca ccgcagcggg tgcccagcgg 300

atcggcttcg tgctcgataa tgaggcgcaa aagcccgatc tggcaattgt cgagctgggc 360

gggaatgatc tgctgcgcgg gattaccccc gatgccacgc gcgagaatct gaccgccatc 420

atgcaggaac tggccgctcg cgatattccg gtgctggtga tgggcatgcg cgcgccgccc 480

aatctgggcg tgcagtatca ggaggatttc gattccatct atcccgatct tgccgcccgc 540

ttcgatgccg cgctggtgcc ctttttcctt gaagcggttt atgaccagcc gcgcctgatc 600

caggccgatc gcatccatcc aacggccgaa gggatcgagg cgattgtggc agccacggcc 660

gggtcggttg ccgcagccct gccggatgca aaagactag 699

<210> 2

<211> 232

<212> PRT

<213> Altererythrobacter aestuarii

<400> 2

Met Arg Ile Gly Gly Leu Trp Met Gly Leu Ala Ala Leu Ser Leu Ala

1 5 10 15

Gly Cys Gly Ala Glu Ala Pro Pro Thr Gln Gln Gln Val Ala Glu Pro

20 25 30

Ala Pro Ile Thr Glu Asp Leu Pro Val Ile Gly Pro Glu Arg Thr Ile

35 40 45

Leu Ala Phe Gly Asp Ser Leu Phe Ala Gly Tyr Asn Leu Ala Glu Asp

50 55 60

Glu Gly Tyr Pro Glu Lys Leu Glu Val Val Leu Arg Ala Ser Gly Ile

65 70 75 80

Asn Ala Arg Val Ile Asp Ala Gly Val Ser Gly Asp Thr Thr Ala Ala

85 90 95

Gly Ala Gln Arg Ile Gly Phe Val Leu Asp Asn Glu Ala Gln Lys Pro

100 105 110

Asp Leu Ala Ile Val Glu Leu Gly Gly Asn Asp Leu Leu Arg Gly Ile

115 120 125

Thr Pro Asp Ala Thr Arg Glu Asn Leu Thr Ala Ile Met Gln Glu Leu

130 135 140

Ala Ala Arg Asp Ile Pro Val Leu Val Met Gly Met Arg Ala Pro Pro

145 150 155 160

Asn Leu Gly Val Gln Tyr Gln Glu Asp Phe Asp Ser Ile Tyr Pro Asp

165 170 175

Leu Ala Ala Arg Phe Asp Ala Ala Leu Val Pro Phe Phe Leu Glu Ala

180 185 190

Val Tyr Asp Gln Pro Arg Leu Ile Gln Ala Asp Arg Ile His Pro Thr

195 200 205

Ala Glu Gly Ile Glu Ala Ile Val Ala Ala Thr Ala Gly Ser Val Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Pro Asp Ala Lys Asp

225 230

Claims

1.一种具有水解酶活性的分离的多肽，其与SEQ ID NO:2的多肽所示序列一致。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述的具有水解酶活性的多肽，其来源于海水的中温细菌Altererythrobacter aestuarii。

3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽包含四个氨基酸序列保守区域，分别为118-123氨基酸序列的谷氨酸－亮氨酸－甘氨酸－甘氨酸－天冬酰胺保守区、包含丝氨酸活性位点的52-55氨基酸序列甘氨酸－天冬氨酸－丝氨酸－亮氨酸保守区、包含天冬氨酸活性位点的203-204氨基酸序列天冬氨酸－精氨酸保守区以及包含组氨酸活性位点的206-208氨基酸序列组氨酸－脯氨酸－苏氨酸保守区。

4.编码权利要求1所述多肽的多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的核苷酸所示序列一致。

5.一种核酸构建体，其包含与一种或多种调控序列可操作地连接的如权利要求4所述的多核苷酸，所述调控序列在合适的表达宿主中指导所述多肽的产生。

6.一种重组表达载体，其包含权利要求5的核酸构建体。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于：所述的载体为原核表达载体pET系列载体、pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A、pHIL-D2、pPIC9、pHIL-S1；或动物细胞表达载体pSVK3、pMSG。

8.根据权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于：所述的载体为大肠杆菌表达载体pSMT3。

9.一种宿主，其由权利要求6-8任一项所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。

10.根据权利要求9所述的宿主，其为细菌、酵母或哺乳动物细胞。

11.根据权利要求10所述的宿主，其为E.coli细菌、甲醇酵母或中国仓鼠卵巢细胞。

12.根据权利要求11所述的宿主，其为E.coli细菌。

13.一种制备权利要求1-3任一项所述多肽的方法，其包括：

(a)、在有助于产生多肽的条件下培养权利要求9所述的宿主，其中所述宿主包含SEQID NO:1所示核苷酸；

(b)、回收所述多肽。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中，回收方法包括离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中，通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括离子交换层析、亲和层析、疏水层析、层析聚焦层析、大小排阻层析或差示溶解度方法。

16.权利要求1所述的多肽或权利要求9所述的能表达多肽的宿主在催化酯类水解中的应用。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的酯类为C2-C12短链脂肪酸酯。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述的酯类为对硝基苯酚乙酸酯，对硝基苯酚丁酸酯，对硝基苯酚己酸酯，对硝基苯酚辛酸酯，对硝基苯酚癸酸酯，对硝基苯酚十二酸酯。

19.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述的酯类为C2-C8短链脂肪酸酯。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述的酯类为具有C6短碳链的对硝基苯酚酯。

21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述的酯类为对硝基苯酚己酸酯。

22.根据权利要求16-21任一项所述的应用，其特征在于，所述的多肽水解酶催化水解温度范围为15～45℃。

23.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述的多肽水解酶催化水解温度范围为30℃。

24.根据权利要求16-21任一项所述的应用，其特征在于，所述的多肽水解酶催化水解的pH值范围为6.0～9.5。

25.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，所述的多肽水解酶催化水解的pH值为6.5-8.5。