CN113637656A - 一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R及其应用 - Google Patents

一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R及其应用 Download PDF

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recombinant
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王晓亮
主虎杰
黄遵锡
韩楠玉
周峻沛
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Abstract

本发明公开了一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8‑G45R及其应用，所述酯酶突变体Est8‑G45R氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该酯酶突变体Est8‑G45R和野生酯酶Est8相比，对功能底物7‑氨基头孢烷酸的脱乙酰化活性从2.6U/mg提高到8.53U/mg。本发明在医药领域中对合成新型头孢菌素类抗生素中间体脱乙酰化7‑氨基头孢烷酸具有良好的应用前景。

Description

一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R及其应用。
背景技术
头孢菌素类抗生素属于β-内酰胺类广谱抗生素，能够通过抑制细菌细胞壁的形成、增强细菌细胞膜的通透性、干扰细菌蛋白的合成以及抑制细菌核酸的复制转录来抑制细菌的生长。随着经济的发展，头孢菌素类抗生素在医学和临床上的应用越来越广泛，对合成头孢菌素类抗生素的重要中间体7-ACA(7-amino-cephalsporanic acid,7-ACA)的需求量也日益增加。但是随着抗生素的滥用，细菌出现了耐药性，新型抗生素的开发成为一种趋势。D-7-ACA(Deacetyl-7-amino-cepha losporic acid,D-7-ACA)作为一种合成头孢菌素类抗生素的新型中间体可以由7-ACA脱去3-位上的乙酰基获得。传统合成D-7-ACA的方法为化学裂解法，但存在成本高、工艺流程繁琐和环境污染等问题。新型酶法具有底物专一性，操作简便和对环境友好等优点，对生产D-7-ACA具有良好的发展前景。
酯酶是一类能够催化酯键水解、酯合成和酯交换的酶。GDSL家族酯酶是指在蛋白的N-端具有保守的GDSL序列能够水解硫酯、芳基酯、磷脂和氨基酸等多种底物的一类水解酶，广泛存在于真核生物和原核生物中。因为细菌是单细胞生物，所以细菌来源的酯酶所处位置环境复杂很难确定其真正底物，再加上进化选择压力就难以确定某种酶的真正生理功能。
申请人前期已经获得微生物来源能够水解7-ACA中酯键生成脱乙酰化的7-ACA(D-7-ACA)的GDSL家族酯酶Est8，其生成的D-7-ACA能够为头孢菌素类抗生素的合成提供新型的中间体，但是该酶催化7-ACA生成D-7-ACA的活性较低。
发明内容
本发明针对上述存在对头孢菌素类抗生素新型中间体的迫切需求的问题，旨在提供一种GDSL家族酯酶乙酰化活性改良突变体Est8-G45R及其应用。
为了实现上述技术目的，本发明具体采用以下技术手段：
一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R，所述酯酶突变体Est8-G45R由嗜热芽孢杆菌K91(Bacillus sp.K91)酯酶基因经定向进化获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本申请酯酶突变体Est8-G45R和野生酯酶Est8相比，对功能底物7-氨基头孢烷酸的脱乙酰化活性从2.6U/mg提高至8.53U/mg。
其中野生酯酶Est8的氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
在本发明的另一方面，提供了所述酯酶突变体Est8-G45R的编码基因，所示编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明另一方面，所述酯酶突变体Est8-G45R通过以下方案制备得到：
1)将如SEQ ID NO.2所示基因与表达载体pEASY-E2相连接，将重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，获得重组菌；
2)发酵培养重组菌株，诱导重组酯酶突变体Est8-G45R表达；
3)回收纯化所表达的酯酶突变体Est8-G45R；
4)脱乙酰化活性的测定。
在本发明的另一方面，提供了一种重组质粒和重组菌，所述重组质粒和重组菌包含GDSL家族酯酶脱乙酰化活性改良突变体Est8-G45R的编码基因。
在本发明的另一方面，提供了上述酯酶突变体Est8-G45R、编码基因、重组质粒和重组菌在制备头孢菌素类抗生素中的应用。
具体为在合成新型头孢菌素类抗生素中间体脱乙酰化7-氨基头孢烷酸中的应用。
本发明的有益效果为：
与野生型酯酶Est8相比，获得的突变酯酶Est8-G45R的脱乙酰化活性发生了改变。野生型酯酶Est8和突变酯酶Est8-G45R的最适反应温度分别为40℃和35℃，在20℃，突变酯酶Est8-G45R的酶活比野生型酯酶Est8高11.6％；在30℃，突变酯酶Est8-G45R的酶活比野生型酯酶Est8高17.5％；在35℃，突变酯酶Est8-G45R的酶活比野生型酯酶Est8高11.3％。突变酯酶Est8-G45R对7-ACA的脱乙酰化活性是野生型酯酶Est8的3.2倍。本发明的突变酯酶可应用到医药技术领域方面。
附图说明
图1是本发明基于0.02％的溴麝香草酚蓝指示剂的突变体筛选；
图2是本发明在E.coli BL21(DE3)中表达的重组酯酶Est8及其突变体Est8-G45R的SDS-PAGE分析，其中，M：蛋白质Marker；2：pEASY-E2/Est8在E.coliBL21(DE3)细胞中表达后上清；3和4：纯化的野生重组酯酶Est8和突变体Est8-G45R；
图3是本发明重组酯酶Est8及其突变体Est8-G45R的pH活性；
图4是本发明重组酯酶Est8及其突变体Est8-G45R的pH稳定性；
图5是本发明重组酯酶Est8及其突变体Est8-G45R的热活性；
图6是本发明重组酯酶Est8及其突变体Est8-G45R的热稳定性。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实验例中的实验材料和试剂如下：
LB液体培养基：5g胰蛋白胨，2.5g酵母提取物和5g氯化钠用双蒸馏水定容至500mL。
含氨苄LB固体培养基：5g胰蛋白胨，2.5g酵母提取物，5g氯化钠和2％(w/v)的琼脂用双蒸馏水定容到500mL，灭菌后在50℃左右加入1‰经过0.22μm滤膜过滤除菌的氨苄青霉素，混匀使用。
实施例中涉及的载体和菌株：pEASY-E2表达载体(购于北京全式金生物技术有限公司)、Escherichia coli BL21(DE3)表达菌株(购于北京全式金生物技术有限公司)、嗜热芽孢杆菌K91(Bacillus sp.K91)(云南师范大学提供)。
实施例1突变文库的构建
利用易错PCR扩增嗜热芽孢杆菌K91(Bacillus sp.K91)菌株中的酯酶基因est8，获得突变序列。利用GeneMorphⅡEZClone Domain Mutagenesis Kit随机突变试剂盒(购于安捷伦科技有限公司)进行易错PCR，实验操作严格按照说明书规范操作。
1)Est8的突变大引物PCR(在目的基因中引入随机突变)
以从E.coliBL21(DE3)中提取的含有基因est8的重组质粒为PCR的模板，设计引物：
上游引物est8F：5’-GCAAATCATATTTATCTTGC-3’；
下游引物est8R：5’-CCTTTCTTTGATGATCGATTC-3’。
PCR反应体系如下：
Figure BDA0003198443440000051
PCR反应参数：95℃预变性5min；然后95℃变性30sec，42℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。
2)Est8的EZClone(以突变大引物PCR的产物作为引物扩增突变体)
PCR反应体系如下：
Figure BDA0003198443440000061
PCR反应参数：95℃预变性1min；然后95℃变性50sec，60℃退火50sec，68℃延伸12min，30个循环后37℃保温10min。用DpnⅠ限制性内切酶对PCR产物进行处理，消化Est8质粒模板。
3)突变质粒的转化：在100μL刚好融化的E.coli BL21(DE3)感受态细胞中加入5μLpEASY-E2/est8随机突变的质粒，轻轻震荡混匀；冰浴30min后，于42℃水浴锅中热激45sec；冰浴7min，在超净工作台中加入890μL无抗的LB液体培养基培养(37℃、180rpm、1h)；离心(7000rpm、4min)，利用剩余100μL LB悬浮菌体，吸取涂布于含有1‰Amp的LB固体培养基上；倒置培养(37℃、16h)。
4)筛选与鉴定：从倒置培养的LB固体培养基上随机挑选5个单菌落于500μL含有Amp抗生素的LB液体培养基中培养(37℃、180rmp、3-4h)；以菌液为模版，利用通用引物T7进行PCR扩增，PCR阳性筛选子验证，取200μL鉴定出的阳性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，进一步验证。
上游引物T7F：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；
下游引物T7R：5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’。
PCR反应体系如下：
Figure BDA0003198443440000071
PCR反应参数：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环后72℃保温10min。
5)文库的构建：随机挑选酯酶Est8突变体的单菌落接于含有150μL液体Amp-LB的96孔细胞培养板中培养(37℃、200rpm、16h)；每孔加入50μL 40％的甘油，混匀后-70℃保存。每个细胞培养板的A1孔以只含有pEASY-E2空载体的E.coli BL21(DE3)菌为空白对照，A2孔以野生型作为对照。
6)突变文库的诱导表达：将上述菌液转接到含有200μL液体Amp-LB的96深孔板中(37℃、200rpm)，振荡培养至OD600nm>1.0；加入200μL液体Amp-LB，加入终浓度为1.4mM的异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)，诱导表达(20℃、160rpm)；诱导20h后，在96深孔板中加20μL/孔的PopCulture Reagent细胞裂解液(默克公司)，混匀后在25℃下震荡裂解细胞；30min后离心(4℃、3000rpm、10min)，放于4℃冰箱备用。
实施例2脱乙酰化活性改良突变体的筛选
1)初筛：对470个突变子进行筛选。
以100μL底物/孔(底物为50mM 7-ACA，0.02％BTB和pH 7.3的50mM磷酸缓冲液)的量加于96酶标板中；以50μL细胞裂解产物/孔的量加于96酶标板中混匀后，于25℃反应10min后利用酶标仪于616nm吸光度下进行OD值的检测。在此利用比色法进行突变子的筛选：由于酯酶能够催化7-ACA生成D-7-ACA和乙酸，这时溶液的pH下降，当存在0.02％BTB的指示剂时，溶液会由蓝变绿再变黄，溶液颜色越黄则表示酶的活性越高。
2)复筛：对初筛选出的70个突变子进行筛选。
将筛选到的70个7-ACA高脱乙酰化活性的突变子进行DNA测序分析。结果表明，该70个突变子都含有1-3个突变位点的非重复突变基因的突变子。然后对这70个突变子进行复筛，最终获得1个对7-ACA脱乙酰化活性高于野生型的突变子。设计显色板进行显色反应进一步验证：对照组和各实验组均设置3个重复，空白对照每孔加入50μL ddH2O，实验组每个孔加入相应的蛋白0.5U，25℃静置反应10min。结果表明：突变体Est8-G45R所对应的孔中溶液呈黄色，野生酯酶Est8对应的孔中溶液呈绿色，则突变体Est8-G45R对7-ACA的脱乙酰化活性比野生酯酶Est8高(图1)。
实施例3野生酶Est8和突变体Est8-G45R的制备
将含有野生酶Est8和突变体Est8-G45R的重组菌株以1‰的接种量分别加入到两只装有5mL的Amp-LB液体培养基的试管中培养(37℃、180rpm)；15h后取4mL加入到400mL的Amp-LB液体培养基中培养2.5h；加入终浓度为1.4mM的IPTG在20℃、150rpm条件下诱导21h；利用冷冻离心机收集菌体(4℃、5000rpm、10min)；用Tris-HCl 8.0缓冲液重悬菌体后用超声波细胞破碎机破碎细胞；12000rpm、4℃条件下离心20min收集上清蛋白液；将2mL收集的上清蛋白液加到Nickel-NTAAgarose纯化柱中用含有0-500mM咪唑的梯度洗脱液进行洗脱，纯化目的蛋白。
SDS-PAGE结果表明，野生酶Est8和突变酶Est8-G45R都获得了纯化，产物为单一条带(3和4泳道分别为野生酶Est8和突变酶Est8-G45R纯化产物的条带)(图2)。
实施例4野生酯酶Est8及其突变体Est8-G45R的脱乙酰化活性测定
操作步骤严格按照BCA蛋白定量试剂盒说明书和乙酸测定试剂盒说明书规范进行。
1)将纯化后的野生型酯酶Est8和突变酯酶Est8-G45R用pH 7.0的50mM磷酸缓冲液进行超滤浓缩；利用BCA蛋白定量试剂盒(上海雅酶生物科技有限公司)对浓缩后的蛋白进行定量。
2)利用乙酸测定试剂盒(Megazyme公司)进行野生型酯酶Est8及其突变体Est8-G45R对7-ACA脱乙酰化活性的测定。吸取浓度为10mM的7-ACA底物溶液300μL与100μL稀释后的酶液混匀，在25℃的水浴锅中进行酶促反应；10min后，吸取200μL反应液与乙酸测定试剂盒中的相应试剂混合，用紫外分光光度计在340nm处读数，以不加酶液的反应液作为对照。定义每分钟生成1μM的底物所需的酶量为一个酶活单位(1U/mg)。利用试剂盒测定体系中的乙酸含量即为产物的生成量，已知反应时间和酶量则通过酶活力计算公式得野生型酯酶Est8及其突变体Est8-G45R对7-ACA脱乙酰化活性分别为2.6U/mg和8.53U/mg(表1)。
表1重组酯酶Est8及其突变体Est8-G45R对功能底物7-ACA的脱乙酰化活性
Figure BDA0003198443440000101
实施例5突变体酯酶Est8-G45R和野生型酯酶Est8的性质测定
1)野生酯酶Est8和突变体Est8-G45RpH活性和稳定性测定
最适pH的测定：在37℃水浴锅中，将用ddH2O适当稀释后的酶液与提前预热5min的pH 6.5-9.5的缓冲液和乙酸-4-硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate,p-NPC2)的混合液反应2min，于405nm读数。pH稳定性测定：用pH 2.2-12.0的缓冲液稀释酶液，并在37℃下处理1h，然后将野生型重组酯酶Est8及其突变体Est8-G45R分别在pH 8.5及40℃和35℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：100mM的Citrate-phosphate buffer(pH 2.4-6.0)、100mM的Tris-HCl(pH 7.0-9.5)和100mM的Boric acid-NaOH(pH 10.0-12.0)。
结果表明：野生酶Est8及其突变体Est8-G45R的最适反应pH均为8.5(图3)，突变体Est8-G45R在pH 2.2-12.0的缓冲液中的稳定性比野生酶Est8差(图4)。
2)野生型Est8及突变体Est8-G45R的热活性及热稳定性测定
热活性测定：在pH 8.5的Tris-HCl缓冲液中，于20-80℃下进行酶促反应。热稳定性测定：将稀释后的野生型酯酶Est8和突变体Est8-G45R酶液均分别置于25℃、37℃、50℃和60℃下处理1h后(每隔10min测一次酶活)，在pH 8.5及40℃和35℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。
结果表明：野生酯酶Est8和突变酯酶Est8-G45R的最适反应温度分别为40℃和35℃，在20℃-35℃，突变酯酶Est8-G45R的酶活比野生酯酶Est8高10％，但在40℃-80℃，突变酯酶Est8-G45R的酶活比野生酯酶Est8差(图5)；在25℃下野生酯酶Est8和突变酯酶Est8-G45R均较稳定，在50℃和60℃下突变酯酶Est8-G45R的半衰期小于10min，但在37℃的半衰期大于60min(图6)。
3)不同金属离子及化学试剂对突变体Est8-G45R及野生酶Est8的纯化酶活力的影响
在35℃和40℃及pH 8.5条件下，以p-NPC2为底物测定酶活性。结果表明：突变酯酶Est8-G45R在1mM不同金属离子溶液和化学试剂中的活性比野生酶Est8差(表2)。
表2金属离子及化学试剂对野生酶Est8及其突变体Est8-G45R活力的影响
Figure BDA0003198443440000111
Figure BDA0003198443440000121
实施例6脱乙酰化活性改良的突变体的序列分析
Figure BDA0003198443440000122
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 云南师范大学
<120> 一种GDSL家族酯酶脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 217
<212> PRT
<213> 酯酶突变体(Est8-G45R)
<400> 1
Met Ala Asn His Ile Tyr Leu Ala Gly Asp Ser Thr Val Gln Thr Tyr
1 5 10 15
Gly Asp Ser Thr Asn Gln Gly Gly Trp Gly Gln Phe Leu Gly Ser His
20 25 30
Leu Pro Glu His Ile Gln Val Ile Asn Arg Ala Ile Arg Gly Arg Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Phe Val Glu Glu Gly Arg Leu Gln Ala Ile Leu Asp Val
50 55 60
Ile Glu Pro Asp Asp Trp Leu Phe Val Gln Met Gly His Asn Asp Ala
65 70 75 80
Ser Lys Asn Lys Pro Glu Arg Tyr Thr Glu Pro Tyr Thr Thr Tyr Lys
85 90 95
Gln Tyr Leu Lys Gln Tyr Ile Ala Gly Ala Arg Glu Lys Gly Ala His
100 105 110
Pro Leu Leu Ile Thr Pro Val Ala Arg Phe His Tyr Glu Asn Gly Val
115 120 125
Phe Leu Asn Asp Phe Pro Asp Tyr Cys Ile Ala Met Lys Gln Thr Ala
130 135 140
Glu Glu Glu Asn Val Gln Leu Ile Asp Leu Met Glu Lys Ser Leu Ala
145 150 155 160
Phe Phe Thr Glu Lys Gly Glu Glu Lys Val Tyr Thr Tyr Phe Met Ile
165 170 175
Ser Glu Gly Ile Asn Asp Tyr Thr His Phe Thr Lys Lys Gly Ala Asn
180 185 190
Glu Met Ala Lys Leu Val Ala Lys Gly Ile Lys Glu Leu Gly Leu Pro
195 200 205
Leu Thr Glu Ser Ile Ile Lys Glu Arg
210 215
<210> 2
<211> 654
<212> DNA
<213> 酯酶突变体基因(Est8-G45R)
<400> 2
cttgcaaatc atatttatct tgccggcgat tcgactgttc aaacgtatgg agacagcaca 60
aatcaagggg gctgggggca gtttctcggc tcgcatctgc cggagcatat tcaagtgatc 120
aacagagcga tcaggggaag aagctcgaaa acatttgtgg aagagggcag gcttcaggca 180
atcctcgatg tgattgagcc ggatgattgg ctgttcgtgc agatgggcca taatgacgcg 240
tcaaaaaata agccggagcg ctacaccgag ccctatacta cttataaaca atatttaaag 300
cagtatatcg caggcgcgcg ggaaaaaggc gcccatccgc ttctcattac ccccgtagcc 360
cgctttcatt acgaaaacgg cgtgtttttg aacgattttc ctgattactg cattgccatg 420
aagcagacgg ctgaagagga gaatgtccag ctcattgatc tgatggagaa aagtctcgct 480
ttctttactg agaagggcga ggaaaaagtg tacacctatt ttatgatttc agaagggatt 540
aatgattaca cgcattttac aaaaaaaggc gcaaatgaaa tggcgaaact tgtggcaaaa 600
ggcataaagg agctcggcct gccattgaca gaatcgatca tcaaagaaag gaag 654
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<211> 217
<212> PRT
<213> 野生酯酶(Est8)
<400> 3
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65 70 75 80
Ser Lys Asn Lys Pro Glu Arg Tyr Thr Glu Pro Tyr Thr Thr Tyr Lys
85 90 95
Gln Tyr Leu Lys Gln Tyr Ile Ala Gly Ala Arg Glu Lys Gly Ala His
100 105 110
Pro Leu Leu Ile Thr Pro Val Ala Arg Phe His Tyr Glu Asn Gly Val
115 120 125
Phe Leu Asn Asp Phe Pro Asp Tyr Cys Ile Ala Met Lys Gln Thr Ala
130 135 140
Glu Glu Glu Asn Val Gln Leu Ile Asp Leu Met Glu Lys Ser Leu Ala
145 150 155 160
Phe Phe Thr Glu Lys Gly Glu Glu Lys Val Tyr Thr Tyr Phe Met Ile
165 170 175
Ser Glu Gly Ile Asn Asp Tyr Thr His Phe Thr Lys Lys Gly Ala Asn
180 185 190
Glu Met Ala Lys Leu Val Ala Lys Gly Ile Lys Glu Leu Gly Leu Pro
195 200 205
Leu Thr Glu Ser Ile Ile Lys Glu Arg
210 215
<210> 4
<211> 654
<212> DNA
<213> 野生酯酶基因(Est8)
<400> 4
atggcaaatc atatttatct tgccggcgat tcgactgttc aaacgtatgg agacagcaca 60
aatcaagggg gctgggggca gtttctcggc tcgcatctgc cggagcatat tcaagtgatc 120
aacagagcga tcgggggaag aagctcgaaa acatttgtgg aagagggcag gcttcaggca 180
atcctcgatg tgattgagcc ggatgattgg ctgttcgtgc agatgggcca taatgacgcg 240
tcaaaaaata agccggagcg ctacaccgag ccctatacta cttataaaca atatttaaag 300
cagtatatcg caggcgcgcg ggaaaaaggc gcccatccgc ttctcattac ccccgtagcc 360
cgctttcatt acgaaaacgg cgtgtttttg aacgattttc ctgattactg cattgccatg 420
aagcagacgg ctgaagagga gaatgtccag ctcattgatc tgatggagaa aagtctcgct 480
ttctttactg agaagggcga ggaaaaagtg tacacctatt ttatgatttc agaagggatt 540
aatgattaca cgcattttac aaaaaaaggc gcaaatgaaa tggcgaaact tgtggcaaaa 600
ggcataaagg agctcggcct gccattgaca gaatcgatca tcaaagaaag gtga 654
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaaatcata tttatcttgc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctttctttg atgatcgatt c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taatacgact cactataggg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgctagttat tgctcagcgg 20

Claims (7)

1.一种GDSL家族脱乙酰化酯酶突变体Est8-G45R，其特征在于，所述酯酶突变体Est8-G45R氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述酯酶突变体Est8-G45R的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述酯酶突变体Est8-G45R的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将如SEQ ID NO.2所示基因与表达载体pEASY-E2相连接，将重组质粒转化大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)，获得重组菌；
2)发酵培养重组菌株，诱导重组酯酶突变体Est8-G45R表达；
3)回收纯化所表达的酯酶突变体Est8-G45R；
4)脱乙酰化活性的测定。
4.一种重组质粒，其特征在于，包含如SEQ ID NO.2所示基因。
5.一种重组菌，其特征在于，包含如SEQ ID NO.2所示基因。
6.权利要求1所述酯酶突变体Est8-G45R、权利要求2所述编码基因、权利要求4所述重组质粒或权利要求5所述重组菌在制备头孢菌素类抗生素中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，用于合成头孢菌素类抗生素中间体脱乙酰化7-氨基头孢烷酸。
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