CN110129301A - 一种催化活性提高的脂肪酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

发明属于酶工程技术领域，公开了一种催化活性提高的脂肪酶突变体及其应用，所述的脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，脂肪酶突变体由编码疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶氨基酸序列SEQ ID NO.1中的116位天冬氨酸变为赖氨酸、163位天冬氨酸变为苯丙氨酸、170位天冬氨酸变为丙氨酸、259位天冬氨酸变为酪氨酸而获得，其编码基因如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。该4个突变体的催化活性提高。

Description

一种催化活性提高的脂肪酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，涉及一种脂肪酶突变体，特别是一种催化活性提高的脂肪酶突变体及其应用。

背景技术

脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)全称是三酰甘油酰基水解酶，广泛存在于生物体内，属于羧基酯水解酶。脂肪酶可以催化酯交换、酯化、醇解和酸解等反应，也能够催化油脂的甘油酯键的水解。脂肪酶广泛应用于洗涤剂、食品、油脂、皮革、医药等工业。脂肪酶来源于动、植物和微生物中，其中微生物来源的脂肪酶种类繁多、生长周期短、具有广泛的温度和pH作用范围，使得微生物来源的脂肪酶更易于应用到工业生产中。

疏棉状嗜热丝孢菌是一类分布广泛且生长温度上限较高的真菌，它能够产生具有良好热稳定性的、具有重要工业应用价值的脂肪酶、蛋白酶等。相较于其他微生物来源的脂肪酶，疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶有较好的热稳定性，但仍不能满足工业需求；此外疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的催化活性依然受温度、反应介质中的有机溶剂、底物浓度等因素的影响。因此，若提高疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的催化活性或热稳定性将使得疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在工业中有更广泛的应用。因此，本发明通过对疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因上的改造使其成为一种催化活性提高的脂肪酶。

发明内容

本发明利用计算机理性设计的方法对疏棉状丝孢菌脂肪酶基因进行带电氨基酸的定点突变，并在真核外源蛋白表达系统毕赤酵母中进行表达，以期提高疏棉状丝孢菌脂肪酶的催化活性。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种催化活性提高的脂肪酶突变体，该突变体由疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的氨基酸序列经定点突变得到，所述的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的脂肪酶突变体由疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶氨基酸序列SEQ ID NO.1中第111位天冬氨酸变为赖氨酸而获得。

本发明所述的脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的脂肪酶突变体的催化活性提高了35.5％。

所述的脂肪酶突变体由疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶氨基酸序列SEQ ID NO.1中第158位天冬氨酸变为苯丙氨酸而获得。

本发明所述的脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的脂肪酶突变体的催化活性提高了17.0％。

所述的脂肪酶突变体由疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶氨基酸序列SEQ ID NO.1中第165位天冬氨酸变为丙氨酸而获得。

本发明所述的脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的脂肪酶突变体的催化活性提高了44.2％。

所述的脂肪酶突变体由疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶氨基酸序列SEQ ID NO.1中第254位天冬氨酸变为酪氨酸而获得。

本发明所述的脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述的脂肪酶突变体的催化活性提高了25.7％。

在本发明另一方面，所述的氨基酸序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5经修饰、缺失或添加一或几个氨基酸获得氨基酸序列，且保持只有90％的同源性的序列也在本发明的保护范围内。

所述的脂肪酶突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQID NO.8、SEQ ID NO.9所示。

在本发明另一方面，所述的编码基因SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或其互补序列或因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列或其互补序列不同的核苷酸序列也在本发明的保护范围内。

在本发明另一方面，本发明还包括携带有编码基因序列为SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9的脂肪酶突变体的质粒。

在本发明另一方面，本发明还提供了一种脂肪酶突变体的基因的工程菌，所述的工程菌含有具有SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示基因的载体。

所述的工程菌通过将SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示的基因克隆到表达载体上，然后进行细胞转化，获得重组基因工程工程菌。

本发明所述的编码基因SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9的表达载体选自pPIC9K、pPIC9、pPICZaA\B\C、pPICZA\B\C或PGAPZaA\B\C。

在本发明另一方面，本发明提供的脂肪酶突变体在饲料添加剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明的有益效果为：

本发明提供一种脂肪酶突变体，突变体D116K、D163F、D170A、D259Y的酶活性较野生型分别提高了35.5％、17.0％、44.2％。

附图说明

图1是本发明实施例提供的脂肪酶突变体的构建方法流程图；

图2是本发明实施例提供的最适pH的测定曲线图；

图3是本发明实施例提供的pH稳定性曲线图；

图4是本发明实施例提供的最适温度曲线图；

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

通过对疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的蛋白质序列分析和计算机软件模拟，确定其突变位点为第116位天冬氨酸变为赖氨酸，第163位天冬氨酸变为苯丙氨酸，第170位天冬氨酸变为丙氨酸，第259位天冬氨酸变为酪氨酸。具体实施方案为：以疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因为模板，通过定点突变方法，获得了新的脂肪酶基因，将该突变基因与pPIC9、pPICZaA\B\C、pPICZA\B\C、PGAPZaA\B\C等载体相连构建重组质粒，转入相应宿主菌(GS115或X33、SMD1168、PICHIAPINK)中进行异源表达，发酵可以获得该脂肪酶突变体。该突变体催化活性提高，并且具有较理想耐热特性，适合耐高温制粒，因此适合工业上生产。

1实验材料

1.1菌株和载体

(1)基因来源菌株：疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)，由实验室保存；

(2)表达宿主菌及载体：毕赤酵母(Pichiapastotis)GS115、载体pPIC9K，购于德国Novagen公司；

(3)克隆宿主菌：DMT感受态细胞，购于北京TransGen Biotech公司；

(4)原始质粒：脂肪酶TLL连接在载体pPIC9K上，由实验室构建保存。

1.2主要试剂

定点突变试剂盒Fast Mutagenesis System(北京TransGen Biotech公司)；质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I(Omega公司)；胶回收试剂盒Gel ExtractionKit(Omega公司)；限制性核酸内切酶(EcoRI、NotI)；对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NP)(Sigma公司)。

1.3实验仪器

GD100分子水浴锅(Grant公司)；Legend micro21高速离心机(美国Thermo公司)；MK-20金属浴(杭州奥胜公司)；ETC811PCR仪(苏州东胜公司)；PowerB核酸电泳仪(北京Cavoy公司)；Universal HoodⅡ凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；SpectraMax Plus384酶标仪(美国Molecular Devices公司)；DZKW-4电子恒温水浴锅(北京中兴公司)。

1.4主要培养基

LB培养基：0.5％(w/v)酵母膏，1.0％(w/v)胰蛋白胨，1.0％(w/v)NaCl，使用双蒸水溶解；YEPD培养基：1.0％(w/v)酵母膏，2.0％(w/v)蛋白胨，2.0％(w/v)葡萄糖，使用双蒸水溶解。

实施例1脂肪酶突变体的制备

如图1所示，利用定点突变试剂盒，以pPIC9K-TLL重组质粒为模板，以以下引物，进行定点突变扩增。扩增完成后，取10μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，验证条带大小正确后加1μL DMT酶于PCR产物中，混匀，在37℃消化1小时。之后进行转化：加入3μL消化产物于50μL DMT感受态细胞中，冰浴30min，然后在42℃分子水浴锅中热激45s，冰浴2min，向产物中加入500μLLB培养基，在37℃、180rpm的摇床中孵育1小时，最后取200μL菌液涂至kan⁺抗性的LB培养皿上，于37℃培养箱中过夜培养。第二天随机挑取平板上的单菌落进行阳性克隆验证，阳性菌进行测序比对，测序结果与模板序列进行比对，确定突变是否成功。测序验证突变成功后，提取突变体的重组质粒，用限制性核酸内切酶进行线性化处理，线性化后的重组载体电击转入毕赤酵母中，得到毕赤酵母重组菌株转化子。将上述重组菌株进行发酵，得到发酵液测定脂肪酶酶活。

Forward-D116K：GGATGCAGAGGACATAAGGGTTTCACTT；

Reverse-D116K：GGACGAAGTGAAACCCTTATGTCCTCTG；

Forward-D163F：ACTGTTGCCGGAGCATTCCTGAGAGGAA；

Reverse-D163F：ACCATTTCCTCTCAGGAATGCTCCGGCA；

Forward-D170A：AGAGGAAATGGTTATGCTATCGACGTGT；

Reverse-D170A：TGAAAACACGTCGATAGCATAACCATTT；

Forward-D259Y：CAGCCTAACATTCCTTACATCCCTGCCC；

Reverse-D259Y：TAGGTGGGCAGGGATGTAAGGAATGTTA。

实施例2脂肪酶突变体酶活及酶学性质的测定

1.脂肪酶突变体酶活的测定

酶活单位定义为：在一定条件下每分钟水解底物p-NP，生成1μmoL的对硝基苯酚所需要的酶量为一个酶活单位以U表示。对硝基苯酚法：吸取50mMpH为9.0的Tris-HCl缓冲液420μL于离心管中，再加入30μL10mM的底物p-NP，充分混匀后在37℃下预热2min，然后加入稀释好的酶液50μL，反应5min，加入50μL10％的SDS终止反应，最后加入500μL 0.5M的碳酸钠显色，用酶标仪在405nm的波长下测定其OD值。突变体酶活测定结果如表1所示：突变体D116K、D163F、D170A、D259Y的酶活性较野生型分别提高了35.5％、17.0％、44.2％。

表1突变体酶活测定结果

2.脂肪酶突变体酶学性质的测定

最适pH测定：使用不同pH(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)的缓冲液体系中分别测定脂肪酶的酶活，将酶液稀释到适应的倍数，用对硝基苯酚法在37℃测定脂肪酶突变体的最适pH。结果如图2所示，疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶与突变体D116K、D163F、D170A、D259Y的最适pH都为9.0。

pH稳定性测定：使用不同pH(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)的缓冲液稀释酶液，将稀释好的酶液放入37℃水浴锅中耐受1小时，立即在37℃最适pH下用对硝基苯酚法测定酶活。对照组的酶液是未耐受过的酶液。结果如图3所示，疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和4个突变体D116K、D163F、D170A、D259Y都在pH为8.0-12.0的范围内稳定。

最适温度测定：在最适pH条件下，将反应体系置于不同温度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)下反应。结果如图4所示，疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、D116K的最适温度为55℃，D163F的最适温度为60℃，D170A、D259Y的最适温度为50℃。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 云南师范大学

<120> 一种催化活性提高的脂肪酶突变体及其应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 274

<212> PRT

<213> 脂肪酶(Lipase)

<400> 1

Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn

1 5 10 15

Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp

20 25 30

Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu

35 40 45

Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly

50 55 60

Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu

65 70 75 80

Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly

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Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys

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Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr

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Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg

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Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala

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Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr

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Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val

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Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu

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Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr

260 265 270

Cys Leu

<210> 2

<211> 274

<212> PRT

<213> 脂肪酶突变体(Lipase mutant)

<400> 2

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Cys Leu

<210> 3

<211> 274

<212> PRT

<213> 脂肪酶突变体(Lipase mutant)

<400> 3

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260 265 270

Cys Leu

<210> 4

<211> 274

<212> PRT

<213> 脂肪酶突变体(Lipase mutant)

<400> 4

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1 5 10 15

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Cys Leu

<210> 5

<211> 274

<212> PRT

<213> 脂肪酶突变体(Lipase mutant)

<400> 5

Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn

1 5 10 15

Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp

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35 40 45

Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly

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Cys Leu

<210> 6

<211> 825

<212> DNA

<213> 编码基因(Coding gene)

<400> 6

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tgcacgggaa atgcctgccc agaggtagag aaggccgatg caacgtttct ctactcgttt 180

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<210> 7

<211> 825

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<213> 编码基因(Coding gene)

<400> 7

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tattctgcag ccgcatactg cggaaaaaac aatgatgccc cagctggtac aaacattacg 120

tgcacgggaa atgcctgccc agaggtagag aaggccgatg caacgtttct ctactcgttt 180

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atcgtcctct ctttcagagg atctagatcc attgagaact ggatcggaaa tcttaacttc 300

gacttgaaag agatcaatga catttgctcc ggatgacgag gacatgacgg tttcacttcg 360

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<211> 825

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tgcacgggaa atgcctgccc agaggtagag aaggccgatg caacgtttct ctactcgttt 180

gaagactctg gagtgggaga tgtcaccgga ttccttgctc tcgacaacac gaacaaattg 240

atcgtcctct ctttcagagg atctagatcc attgagaact ggatcggaaa tcttaacttc 300

gacttgaaag agatcaatga catttgctcc ggatgacgag gacatgacgg tttcacttcg 360

tcctggagat ctgtagccga tacgttaaga cagaaggtgg aggatgctgt gagagagcat 420

ccagactata gagtggtgtt taccggacat agcttgggtg gtgcattggc aactgttgcc 480

ggagcagacc tgagaggaaa tggttatgct atcgacgtgt tttcatatgg agcccctaga 540

gtcggaaaca gagcttttgc agagttcctg accgtacaga ccggaggaac actctacaga 600

attacccaca ccaatgatat tgtccctaga ctccctccac gcgagttcgg ttacagacat 660

tctagcccag agtactggat caaatctgga acccttgtcc cagtcaccag aaacgatatc 720

gtgaagattg aaggaatcga tgccaccgga ggaaacaacc agcctaacat tcctgatatc 780

cctgcccacc tatggtactt cggtttaatt ggaacatgtc tttag 825

<210> 9

<211> 825

<212> DNA

<213> 编码基因(Coding gene)

<400> 9

agtcctatta gaagagaggt ctcgcaggat ctgtttaacc agttcaatct ctttgcacag 60

tattctgcag ccgcatactg cggaaaaaac aatgatgccc cagctggtac aaacattacg 120

tgcacgggaa atgcctgccc agaggtagag aaggccgatg caacgtttct ctactcgttt 180

gaagactctg gagtgggaga tgtcaccgga ttccttgctc tcgacaacac gaacaaattg 240

atcgtcctct ctttcagagg atctagatcc attgagaact ggatcggaaa tcttaacttc 300

gacttgaaag agatcaatga catttgctcc ggatgacgag gacatgacgg tttcacttcg 360

tcctggagat ctgtagccga tacgttaaga cagaaggtgg aggatgctgt gagagagcat 420

ccagactata gagtggtgtt taccggacat agcttgggtg gtgcattggc aactgttgcc 480

ggagcagacc tgagaggaaa tggttatgat atcgacgtgt tttcatatgg agcccctaga 540

gtcggaaaca gagcttttgc agagttcctg accgtacaga ccggaggaac actctacaga 600

attacccaca ccaatgatat tgtccctaga ctccctccac gcgagttcgg ttacagacat 660

tctagcccag agtactggat caaatctgga acccttgtcc cagtcaccag aaacgatatc 720

gtgaagattg aaggaatcga tgccaccgga ggaaacaacc agcctaacat tccttacatc 780

cctgcccacc tatggtactt cggtttaatt ggaacatgtc tttag 825

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggatgcagag gacataaggg tttcactt 28

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggacgaagtg aaacccttat gtcctctg 28

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

actgttgccg gagcattcct gagaggaa 28

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

accatttcct ctcaggaatg ctccggca 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agaggaaatg gttatgctat cgacgtgt 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgaaaacacg tcgatagcat aaccattt 28

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cagcctaaca ttccttacat ccctgccc 28

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

taggtgggca gggatgtaag gaatgtta 28

Claims (9)

1.一种催化活性提高的脂肪酶突变体，其特征在于，所述的脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的一种催化活性提高的脂肪酶突变体，其特征在于，所述的脂肪酶突变体由疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶氨基酸序列SEQ ID NO.1中116位、163位、170位、259位取代获得。

3.根据权利要求2所述的一种催化活性提高的脂肪酶突变体，其特征在于，所述的取代具体为116位天冬氨酸变为赖氨酸、163位天冬氨酸变为苯丙氨酸、170位天冬氨酸变为丙氨酸、259位天冬氨酸变为酪氨酸。

4.编码权利要求1所述的脂肪酶突变体的DNA分子。

5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，所述的DNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。

6.权利要求1所述的脂肪酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因连接到载体上的重组质粒为模板，分别设计引物进行突变PCR扩增；

2)添加lμL DMT消化酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育70min；

3)加入l0μL消化产物于50μL DMT感受态细胞中，经冰浴冷却、热激，冷却后，加500μLLB培养基，37℃180转培养1h，离心保留部分清液悬浮沉淀，取全部菌液涂板，37℃过夜培养；

4)进行阳性克隆子筛选验证，挑取单菌落于相应抗性的LB培养基中，培养2-3h后PCR鉴定，将筛选出的阳性克隆子送出测序，测序结果与原序列比对。

7.一种工程菌，其特征在于，包含具有SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9所示基因的载体。

8.根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述的载体为pPIC9K、pPIC9、pPICZaA\B\C、pPICZA\B\C或PGAPZaA\B\C。

9.权利要求1所述的脂肪酶突变体在饲料添加剂中的应用。