CN108239626B

CN108239626B - 一种高酯化活力的脂肪酶突变体

Info

Publication number: CN108239626B
Application number: CN201611225678.5A
Authority: CN
Inventors: 宣姚吉; 周美凤; 戴小军; 徐正军; 牛其文
Original assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2016-12-27
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2036-12-27
Also published as: CN108239626A

Abstract

本发明提供一种高酯化活力的脂肪酶突变体。具体而言，本发明提供一种多肽，所述多肽选自：(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的多肽；和(2)由SEQ ID NO：7所示的序列与促进SEQ ID NO：7所示的序列表达与纯化的序列组成的多肽。本发明还提供编码该多肽的多核苷酸序列，相应的核酸构建物、宿主细胞，以及本发明多肽、多核苷酸序列、核酸构建物和宿主细胞在制备生物柴油中的应用。

Description

一种高酯化活力的脂肪酶突变体

技术领域

本发明涉及一种高酯化活力的脂肪酶突变体。

背景技术

柴油作为一种重要的石油炼制产品，在各国燃料结构中占有较高的份额，已成为重要的动力燃料。随着世界范围内车辆柴油化趋势的加快，未来柴油的需求量会愈来愈大，而石油资源的日益枯竭和人们环保意识的提高，大大促进了世界各国加快柴油替代燃料的开发步伐，尤其是进入了20世纪90年代，生物柴油以其优越的环保性能受到了各国的重视。目前世界每年新车产量大约5000万辆，全世界汽车保有量大约7.5亿辆(含摩托车)。随着汽车工业的快速发展，汽油和柴油的用量随汽车保有量的增加而增加，同时也带来了汽车尾气污染等问题。

众所周知，柴油分子是由15个左右的碳链组成的，研究发现植物油分子则一般由14～18个碳链组成，与柴油分子中碳数相近。因此生物柴油就是一种用油菜籽等可再生植物油加工制取的新型燃料。与常规柴油相比，生物柴油具有下述无法比拟的性能：

(1)具有优良的环保特性；使用生物柴油可降低90％的空气毒性，降低94％的患癌率；一氧化碳的排放与柴油相比减少约10％；

(2)具有较好的低温发动机启动性能；

(3)具有较好的润滑性能；

(4)具有较好的安全性能；

(5)具有良好的燃料性能；

(6)具有可再生性能。

生物柴油燃烧时排放的二氧化碳远低于该植物生长过程中所吸收的二氧化碳，从而改善由于二氧化碳的排放而导致的全球变暖这一有害于人类的重大环境问题。因而生物柴油是一种真正的绿色柴油。

目前在美国、欧洲、亚洲的一些国家和地区已开始建立商品化生物柴油生产基地，并把生物柴油作为代用燃料广泛使用。主要因为美国有大豆、欧洲有菜籽、亚洲有棕榈，这些农产业的可持续发展要求寻找食用、化工以外的大宗消耗植物油的途径，以法律形式保证生物柴油的使用，以补贴促进生物柴油产业的发展。

目前生物柴油主要是用化学法生产，即用动物和植物油脂和甲醇或乙醇等低碳醇在酸性或者碱性催化剂和高温(230～250℃)下进行转酯化反应，生成相应的脂肪酸甲酯或乙酯，再经洗涤干燥即得生物柴油。甲醇或乙醇在生产过程中可循环使用，生产设备与一般制油设备相同，生产过程中可产生10％左右的副产品甘油。

目前生物柴油的主要问题是成本高，据统计，生物柴油制备成本的75％是原料成本。因此采用廉价原料及提高转化从而降低成本是生物柴油能否实用化的关键。美国已开始通过基因工程方法研究高油含量的植物。日本采用工业废油和废煎炸油。欧洲是在不适合种植粮食的土地上种植富油脂的农作物。亚洲采用废油脂及油脂加工副产物来生产。

但化学法合成生物柴油有以下缺点：工艺复杂、醇必须过量，后续工艺必须有相应的醇回收装置，能耗高；色泽深，由于脂肪中不饱和脂肪酸在高温下容易变质；酯化产物难于回收，成本高；生产过程有废碱液排放。

为解决上述问题，人们开始研究用生物酶法合成生物柴油，即用动物油脂和低碳醇通过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯及乙酯。酶法合成生物柴油具有条件温和，醇用量小、无污染排放的优点。但目前主要问题有：酶的高温稳定性差，短链醇对酶有一定毒性，酶的使用寿命短。副产物甘油和水难于回收，不但对产物形成抑制，而且甘油对固定化酶有毒性，使固定化酶使用寿命短。

Thermomyces dupontii lipase(TDL)的序列在2012年被公开，其蛋白全长为291个氨基酸，其中有一个22个氨基酸长度的信号肽，成熟肽的长度为269个氨基酸。其具有典型脂肪酶的三联体催化域结构，为Ser168-Asp223-His280。TDL在50℃，pH9.0的条件下，对于水解C8长度的甘油三酯有较高的偏好性。以餐饮废油(Waste Cooking Oil，WCO)作为油料生产生物柴油，其转化率为91.6％。

发明内容

本发明第一方面提供一种多肽，所述多肽选自：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的多肽；和

(2)由SEQ ID NO：7所示的序列与促进SEQ ID NO：7所示的序列表达与纯化的序列组成的多肽。

在一个或多个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4或6所示。

在一个或多个实施方案中，所述多肽为脂肪酶。

本发明第二方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

(1)编码本发明多肽的多核苷酸；

(2)与(1)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸；和

(3)(1)或(2)所述的多核苷酸的长10-40个碱基的片段。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列的序列如SEQ ID NO：3或5所示。

本发明第三方面提供一种多核苷酸构建物，所述多核苷酸构建物含有本发明所述的多核苷酸。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸构建物是表达载体或克隆载体。

本发明第四方面提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞：

(1)表达本发明的多肽；和/或

(2)含有本发明的多核苷酸或多核苷酸构建物。

本发明第五方面提供一种生物柴油的制备方法，所述方法包括使用本发明多肽合成生物柴油的步骤。

在一个或多个实施方案中，使用动植物油脂制备生物柴油。

在一个或多个实施方案中，使用餐饮废油制备生物柴油。

在一个或多个实施方案中，使用粗油酸、酸化油、或PFAD与脂肪酸酯的混合物制备生物柴油。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括以粗油酸、酸化油、或PFAD与脂肪酸酯的混合物和有机醇为原料，在水和本发明多肽的存在下进行酯交换反应的步骤。

在一个或多个实施方案中，所述PFAD和脂肪酸酯的混合物中，以重量计，PFAD的含量为70～80％，脂肪酸酯的含量为20～30％。

在一个或多个实施方案中，所述脂肪酸酯是脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯，所述有机醇是甲醇或乙醇。

在一个或多个实施方案中，所述有机醇以分批或流加的方式添加。

在一个或多个实施方案中，所述有机醇的总用量为所述动植物油脂中所含游离脂肪酸质量的2倍以上。

在一个或多个实施方案中，本发明多肽的用量为粗油酸、酸化油、或PFAD与脂肪酸酯的混合物重量的0.005％以上、0.007％以上、0.0075％以上、0.008％以上、0.01％以上、0.015％以上、0.02％以上、0.0225％以上、0.03％以上、或0.05％以上，例如在0.005～0.05％、0.005～0.03％、0.007～0.03％、0.007～0.05％、0.015～0.05％、或0.02％～0.05％之间。

在一个或多个实施方案中，本发明的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其用量为粗油酸、酸化油、或PFAD与脂肪酸酯的混合物重量的0.015％以上、0.02％以上、或0.0225％以上，优选地0.015～0.05％之间、或0.02～0.05％、或0.0225～0.05％之间。

在一个或多个实施方案中，本发明的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，其用量为粗油酸、酸化油、或PFAD与脂肪酸酯的混合物重量的0.007％以上，例如0.0075％以上、0.008％以上、0.01％以上或0.015％以上，例如0.007～0.03％或0.007～0.05％。

在一个或多个实施方案中，水的添加量为粗油酸、酸化油、或PFAD与脂肪酸酯的混合物重量的1％以上或2％以上，例如1～5％、1～10％、2～5％、或2～10％之间。

在一个或多个实施方案中，添加碱如NaOH调节酯交换反应物的pH，优选地，碱如NaOH的添加量为粗油酸、酸化油、或PFAD与脂肪酸酯的混合物重量的0.005％以上，例如在0.005～0.02％、0.005～0.1％、0.005～0.15％、0.02％～0.1％、或0.02％～0.15％之间。

在一个或多个实施方案中，反应温度在35±5℃的范围内。

本发明第六方面提供本发明多肽、多核苷酸序列、核酸构建物以及宿主细胞在制备生物柴油中的应用。

本发明第七方面提供一种酯交换反应混合物，所述反应混合物含有：动植物油脂；有机醇；水；和本发明的多肽。

在一个或多个实施方案中，所述动植物油脂选自：餐饮废油、粗油酸、酸化油、或PFAD与脂肪酸酯的混合物；优选地，所述脂肪酸酯为脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。

在一个或多个实施方案中，所述有机醇为甲醇或乙醇；优选地，所述有机醇的总用量为所述动植物油脂中所含游离脂肪酸质量的2倍以上。

在一个或多个实施方案中，所述多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.005％以上、0.007％以上、0.0075％以上、0.008％以上、0.01％以上、0.015％以上、0.02％以上、0.0225％以上、0.03％以上、或0.05％以上，优选地是0.005～0.05％、0.007～0.05％、0.007～0.03％、0.015～0.05％、或0.02％～0.05％之间。

在一个或多个实施方案中，水的用量为所述动植物油脂重量的1％以上或2％以上，例如1～5％、1～10％、2～5％、或2～10％。

附图说明

图1：TDL和TDLm生物柴油制备效果比较。

图2：EP14和TDLm酯化活力比较。

图3：EP14生物柴油制备结果。

图4：TDLm生物柴油制备结果。

具体实施方式

本发明提供具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的脂肪酶。本发明还包括在SEQID NO:7所示的氨基酸序列的基础上用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时所获得的多肽。这种保守性取代通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。或者，根据其化学结构，“性能相近或相似的氨基酸”包括脂肪族氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香族氨基酸，如苯丙氨酸和酪氨酸；杂环族氨基酸，如组氨酸和色氨酸；和杂环亚氨基酸，如脯氨酸。

因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基相互替换，或用具有相同化学结构的氨基酸相互替换，将不会在实质上影响其活性。

本发明因此包括在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：7所具备的脂肪酶活性的由SEQ ID NO:7衍生的多肽。所述几个通常为10个以内，优选8个以内，更优选5个以内。

在知晓SEQ ID NO:7的序列和生物学功能的情况下，本领域技术人员可采用常规的技术手段判断SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中哪些氨基酸残基可被取代或删除。例如，通过比对来自不同种属、活性相同或类似或明显不同的序列，可以判断这些序列中哪些氨基酸残基是可以被取代或删除。可采用本领域常规的方法(包括本发明所公开的方法)验证这样的序列是否具备本发明所述的酶活。

在某些实施方案中，本发明的多肽仅在SEQ ID NO:7第231-232位存在突变。在某些实施方案中，本发明的多肽在SEQ ID NO:7至少一个以下位置上存在突变：第1位、第33位、第95位、第259位和第264位。在某些实施方案中，突变为取代突变。

在某些实施方案中，第1位上的突变为谷氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺中的任意一种。在优选实施方案中，第1位上的突变为谷氨酸突变为天冬氨酸。

在某些实施方案中，第33位上的突变为天冬酰胺突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和谷氨酰胺中的任意一种。在某些实施方案中，第33位上的突变为天冬酰胺突变为甘氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸中的任意一种。

在某些实施方案中，第95位上的突变为异亮氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺中的任意一种。在某些实施方案中，第95位上的突变为异亮氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸中的任意一种。

在某些实施方案中，第259位上的突变为亮氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸中的任意一种。在某些实施方案中，第259位上的突变为亮氨酸突变为苯丙氨酸。

在某些实施方案中，第264位上的突变为亮氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺中的任意一种。在某些实施方案中，第264位上的突变为亮氨酸突变为丝氨酸。

在某些实施方案中，本发明多肽在第1位、第33位、第95位、第259位和第264位中的至少两个位置、至少三个位置、至少四个位置和至少五个位置中存在突变。在某些实施方案中，所述突变选自：第1位上的突变为谷氨酸突变为天冬氨酸；第33位上的突变为天冬酰胺突变为异亮氨酸；第95位上的突变为亮氨酸突变为蛋氨酸；第259位上的突变为亮氨酸突变为苯丙氨酸；第264位上的突变为亮氨酸突变为丝氨酸。

在某些实施方案中，本发明的多肽所述多肽第1位的氨基酸残基为谷氨酸或天冬氨酸，和/或第33位上的氨基酸残基为天冬酰胺或异亮氨酸，和/或第95位上的氨基酸残基为亮氨酸或蛋氨酸，和/或第259位上的氨基酸残基为亮氨酸或苯丙氨酸，和/或第264位上的氨基酸残基为亮氨酸或丝氨酸。

在某些实施方案中，本发明的多肽序列如SEQ ID NO：4或6所示。

此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。本发明氨基酸序列的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。使用的标签例子包括Poly-Arg，如RRRRR(SEQ ID NO:10)；Poly-His 2-10个(通常6个)，如HHHHHH(SEQ ID NO:11)；FLAG，即DYKDDDDK(SEQ ID NO:12)；Strep-TagII，即WSHPQFEK(SEQ ID NO:13)；和C-myc，即WQKLISEEDL(SEQ ID NO:14)。应理解，这些氨基酸序列的存在不会影响到所得多肽的活性。因此，本发明也包括在本发明多肽的C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸所得的多肽，这些多肽仍具有本文所述的脂肪酶活性。

因此，本发明也包括与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，更优选至少99％序列相同性的氨基酸序列。在更优选的实施例中，此类氨基酸序列也同样来自Thermomyces dupontii，优选具有与本文SEQ ID NO:6相同或类似的脂肪酶酶活。

可采用常规的手段计算比对的两条序列的序列相同性，例如，采用NCBI提供BLASTP，采用默认参数进行比对。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本申请包括本发明多肽的编码序列。SEQ ID NO:3和5显示了本发明多肽的编码序列例子。所述“编码序列”包括与SEQ ID NO:3或5高度同源的序列或在严格条件下与SEQ IDNO：3或5杂交的核苷酸序列或与上述分子高度同源的家族基因分子。编码本发明多肽的序列可以与例如SEQ ID NO：3或5所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有差别的核苷酸序列。

编码本发明多肽的序列包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明的多肽的编码序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可先采用常规的技术手段从肠杆菌属(Enterobacter sp.)中获取基因组DNA，然后再根据本发明所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，用于从该基因组DNA中扩增出脂肪酶基因。

因此，本发明也包括本发明编码序列的片段，所述片段通常长10～40个、优选15～30个碱基，能作为引物或探针使用。“片段”在本文中指全长序列的连续的一部分序列。

本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本发明的编码序列以及与该编码序列操作性连接并指导该编码序列在宿主细胞中在合适的条件下表达的一个或多个调控序列。编码本发明多肽的多核苷酸可以各种方式被操作，以保证该多肽的表达。在其插入载体之前该多核苷酸序列的操作可能根据该表达载体而是合乎需要或必需的。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列，为由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列包含接到多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。适用于本发明的启动子序列例子包括35S启动子和cspA启动子等。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，为由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何前导序列都可用于本发明。

调控序列也可以是编码与多肽的氨基酸末端连接的氨基酸序列并且指导该编码的多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。核苷酸序列编码序列的5’端可固有地包含天然连接具有编码分泌多肽的编码区节段的翻译阅读框的信号肽编码区。备选地，编码序列的5’端可包含与该编码区外源的信号肽编码区。当编码序列非天然地包含信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。备选地，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区，即分泌进入培养基，都可用于本发明。

本发明也涉及包括本发明多核苷酸的克隆载体或表达载体。这些载体可含有前文所述的各调控序列。

表达载体可以是能够方便地经受重组DNA方法并且可导致感兴趣的核苷酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性或闭合的环形质粒。

载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。

本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。

本发明的载体优选包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独立于基因组自主个复制的元件。

一个以上拷贝的本发明的多核苷酸可被插入宿主细胞以增加该基因产物的产量。多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该多核苷酸来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝多核苷酸的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。

本发明的载体优选包含人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。本发明的表达载体更为优选包含有连续6个组氨酸序列的小肽，有利于蛋白质的提取和纯化。

本发明的表达载体更为优选地选择可用于毕赤酵母中表达的载体。本发明的载体优选商品化的毕赤酵母中使用的载体如pPIC、pPICZ、pAO、pGAP或pGAPZ等一系列的载体。

含有本发明多核苷酸序列的克隆载体可用于复制足够多的目标质粒。因此，本发明的克隆载体带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等。通常，本发明的克隆载体不具有表达元件。

本发明也涉及含有被用于重组生产多肽的本发明多核苷酸的重组宿主细胞。包括本发明多核苷酸的载体被导入宿主细胞以使得该载体如早先说明的作为染色体的组成部分或作为染色体外的自我复制载体来维持。宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是植物细胞或单细胞微生物或非单细胞微生物。单细胞微生物例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等；或链霉菌细胞，例如钱青紫链霉菌；或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌和假单胞菌属。在优选的方面，细菌宿主是枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和大肠杆菌细胞。

宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物、酵母或真菌细胞。在优选的方面，宿主细胞是真菌细胞，如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门等。

在更优选的方面，宿主细胞是原核细胞。如在此使用的“原核细胞”包括假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Streptomyces)以及埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。在更为优选的方面，宿主细胞是假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属以及埃希氏菌属的细胞。

在最优选的方面，宿主细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、大肠杆菌(Escherichia coli)以及变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)等。在另外最优选方面，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞。

可采用常规的转染方法将含本发明多核苷酸序列的核酸构建物转入宿主细胞中。转染通常分为瞬时转染和稳定转染。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天。稳定转染中，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。转染的技术手段包括化学转染和物理转染，前者如DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法和人工脂质体法，后者如显微注射、电穿孔和基因枪等。

可通过脂肪酶活性筛选而后通过克隆表达等技术获得本发明多肽的氨基酸及编码多核苷酸序列信息。筛选的方法可以包括文库法、蛋白分离纯化等方法，本发明优选地采用多步层析相结合的分离纯化方法纯化得到具有脂肪酶活性的蛋白，而后再进一步通过活性电泳及酶谱分析的方法获得具体的有活性的蛋白条带。为了获得目的蛋白的序列信息，可以选择常规的化学测序方法以及质谱鉴定等方法。

在获得多肽的编码序列后，可采用如下方法生产本发明多肽，该方法包括：(a)在有助于生产多肽的条件下培养宿主细胞；以及(b)回收该多肽。

本发明的生产方法中，细胞可以利用本领域已知的方法在适于生产多肽的培养基中培养。例如，细胞可通过在实验室或工业发酵罐中进行的摇瓶培养和小规模或大规模的发酵(包括连续的、分批的、分批补料或固态发酵)，在合适的培养基和容许该多肽表达和/或分离的条件下进行培养。培养发生在利用本领域已知的方法包括碳源和氮源和无机盐的合适培养基中。合适的培养基可获得自商业供应者或可根据公开的组合物来制备。如果该多肽分泌进入培养基，该多肽可从培养基直接回收。如果该多肽不分泌进入培养基，它可从细胞裂解物回收。

多肽可利用本领域已知的特异于该多肽的方法来检测。这些检测方法可包括特异抗体的使用，酶产物的形成，或酶底物的消失。例如，酶活性测定可如在此说明的用来测定多肽的活性。

本发明所描述的多肽可利用本领域已知的方法来回收。例如，多肽可通过常规方法，包括但不限于离心、过滤、超滤、萃取、层析、喷雾干燥、冷冻干燥、蒸发或沉淀等从培养基回收。

本发明的多肽可通过本领域已知的多种方法来纯化，包括但不限于色谱法(如离子交换、亲和性、疏水性、色谱聚焦、分子排阻)，电泳法(例如等电聚焦)、差异溶解度(如盐析沉淀)、SDS-PAGE或萃取法以获得基本上纯的多肽。

本发明的多肽具有高的酯化活力，可用于制备生物柴油。因此，本发明提供一种生物柴油的制备方法，所述方法包括使用本发明多肽合成生物柴油的步骤。

生物柴油是指由动植物油脂(脂肪酸甘油三酯)与有机醇(例如甲醇或乙醇)经酯交换反应得到的脂肪酸单烷基酯，最典型的是脂肪酸甲酯。本发明中，动植物油脂可以是本领域周知的用来生产生物柴油的动植物油脂，包括但不限于粗油酸，酸化油，PFAD与脂肪酸酯的混合物，以及餐饮废油或其一种或多种的组合。

因此，本发明生物柴油的制备方法包括使用本发明多肽催化动植物油脂(脂肪酸甘油三酯)与有机醇(例如甲醇或乙醇)的酯交换反应，从而制备得到脂肪酸单烷基酯的步骤。

在某些实施方案中，本发明制备生物柴油的方法包括以粗油酸、酸化油、或PFAD(棕榈脂肪酸馏出物)与脂肪酸酯的混合物以及有机醇为原料，在水的存在下使用本发明的多肽制备生物柴油。

粗油酸可以是本领域常规用来制备生物柴油的粗油酸。酸化油是指对油脂精炼厂所生产的副产品皂脚进行酸化处理所得到的油。酸化油本质上是脂肪酸，其中含有色素以及未酸化的甘油三酯、甘油二酯、单甘脂(中性油)等多种成分。所述脂肪酸通常是长链脂肪酸，碳链一般在12到24之间，其中以16到18为主。

在某些实施方案中，本发明使用PFAD和脂肪酸酯的混合物作为酯交换的原料，与有机醇进行酯交换。在这些实施方案中，优选的是，形成所述脂肪酸酯的有机醇与作为原料的所述有机醇相同。例如，当使用脂肪酸甲酯(FAME)时，有机醇优选为甲醇。在这些实施方案中，PFAD和脂肪酸酯的混合物中，PFAD的含量为70～80％，脂肪酸酯的含量为20～30％。例如，PFAD和FAME的混合物中PFAD的含量为70～80％，FAME的含量为20～30％。

酯交换反应中，有机醇可以分批或流加的方式添加。例如，在最迟反应时，可将本次反应所有有机醇的1/4加到反应混合物中，反应一段时间后，余下的甲醇分三次分别加入反应混合物中。通常，有机醇的总用量为所述动植物油脂中所含游离脂肪酸质量的2倍以上。

本发明多肽(即脂肪酶)的酶的用量为动植物油脂(如粗油酸、酸化油、或PFAD(棕榈脂肪酸馏出物)与脂肪酸酯的混合物)重量的0.005％以上、0.007％以上、0.0075％以上、0.008％以上、0.01％以上、0.015％以上、0.02％以上、0.0225％以上、0.03％以上、或0.05％以上，优选地0.005～0.05％、0.005～0.03％、0.007～0.03％、0.007～0.05％、0.015～0.05％、或0.02％～0.05％之间。优选的是，当使用本发明的TDLm时，其添加量可为0.015％以上、0.02％以上、或0.0225％以上，优选地0.015～0.05％之间、或0.02～0.05％之间。当使用本发明的EP14时，其添加量可在0.007％以上，0.0075％以上、0.008％以上、0.01％以上或0.015％以上，优选地0.007～0.03％。

水的添加量通常为动植物油脂(如粗油酸、酸化油、或PFAD(棕榈脂肪酸馏出物)与脂肪酸酯的混合物)重量的1％以上，或2％以上，例如1～5％、1～10％、2～5％、或2～10％。酯交换反应温度通常在35±5℃的范围内。

在某些实施方案中，使用碱来调节反应物的pH，优选地，碱是NaOH。例如，在某些实施方案中，NaOH的添加量为动植物油脂(如粗油酸、酸化油、或PFAD(棕榈脂肪酸馏出物)与脂肪酸酯的混合物)重量的0.005％以上，例如在0.005～0.02％、0.005～0.1％、0.005～0.15％、0.02％～0.1％、或0.02％～0.15％之间。可将NaOH配制成水溶液，然后加到反应混合物中。例如，在某些实施方案中，可将所述用量的NaOH配制成浓度为1～10％的NaOH水溶液。应理解，NaOH水溶液中的水不包括在前文所述的水的添加量中。

在某些实施方案中，先将动植物油脂(如粗油酸、酸化油、或PFAD(棕榈脂肪酸馏出物)与脂肪酸酯的混合物)与碱混合，加入水与酶，最后加入甲醇，进行反应。反应过程中以分批的方式或流加的方式加入甲醇。反应时间不限，当单独所需的脂肪酸转化率后可停止反应。

本发明因此也包括用于制备本发明生物柴油的酯交换反应物，该反应混合物含有：动植物油脂；有机醇；水；和本发明的多肽。反应混合物中动植物油脂、有机醇、水及多肽的种类和用量可如前文所述。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。

实验材料和方法

1、实验菌株和质粒

菌株：毕赤酵母GS115(Invitrogen)，大肠杆菌DH5a(TAKARA)。

质粒：pAO815质粒(Invitrogen)。

2、培养基和溶液

LB液体培养基：0.5％酵母提取物，1％胰化蛋白胨，1％NaCl，pH7.0。

LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂浓度1.5％。

YPD液体培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

YPD固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂浓度2％。

BMGY-橄榄油筛选培养基：A组分：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸，1％甘油，4×10^-5％D-生物素(灭菌后加入)，0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH6.6，2％琼脂；B组分：橄榄油底物溶液：量取4％PVA溶液150ml，加橄榄油50ml，用高速匀浆机8000rpm乳化3min，暂停1min后再乳化3min，制备底物溶液。灭菌的100ml A组分与12ml B组分混合，加入1ml 0.1％罗丹明B。

BMGY液体培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸，1％甘油，4×10^-5％D-生物素，0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH6.6。

改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)。

限制性内切酶EcoRI购自纽英伦生物技术(北京)有限公司。

PCR酶：TaKaRa Taq，

HS DNA Polymerase购自宝生物工程(大连)有限公司。

T4 DNA连接酶(购自富酶泰斯有限公司)。

酸化油：购自上海嘉里食品工业有限公司。

3、FFA检测方法

①称量前油样必须是液态且混匀。

②根据酸价不同称取约1-20g油样(称样量与酸价的关系如下式(1))，精确至0.01g，置于250mL锥形瓶中。

③加入50～150mL中性异丙醇(加入3ml1％酚酞指示剂，用KOH溶液滴定至至出现粉红色，30秒钟不褪色)，振摇，使油样充分溶解(必要时加热)。

④用0.05mol/L氢氧化钾标准溶液边摇动边滴定至出现粉红色，30秒钟不褪色，即为滴定终点。

⑤记录滴定所消耗的氢氧化钾体积V，计算结果。

式中：

V─所用氢氧化钾溶液体积，ml；

c─所用氢氧化钾标准溶液的准确浓度，mol/L；

m─试样质量，g；

56.1─氢氧化钾的摩尔质量，g/mol。

FFA％＝酸价/2％

4、酯化活性的公式如下：

U(umol/(min*ml))＝ΔFFA*10⁴/t/282/V

ΔFFA-----初始FFA％减去反应后FFA％的差值％；

t-----反应时间min；

v----酶的用量ml。

实施例1：TDL和TDLm表达及性能检测

TDL的氨基酸序列根据野生型Thermomyces dupontii脂肪酶氨基酸序列而来，野生型氨基酸序列来源于NCBI，GenBank Accession：AEE61324.1。Thermomyces dupontii脂肪酶的1-22位为信号肽，23-291位为成熟蛋白。选取Thermomyces dupontii脂肪酶23-291位成熟蛋白进行表达，根据毕赤酵母密码子偏爱性设计DNA序列SEQ ID NO:1，添加α-factor的前导肽原序列(来自于商业化载体pPIC9K的DNA序列)，送上海生工生物工程有限公司进行全基因合成，将该DNA序列克隆至pAO815质粒中，得到pAO-TDL表达载体。将成熟肽的231位Thr突变为Arg，第232位Lys突变为Arg，第233位Asn突变为Arg，得到DNA序列SEQ IDNO:3，将该DNA序列克隆至pAO815质粒中，得到pAO-TDLm表达载体。

将pAO-TDL和pAO-TDLm用SalI线性化，利用LiAC法制备毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞，再通过电转化将线性化的pAO-TDL和pAO-TDLm片段转化GS115感受态细胞，转化物涂布于MGYS平板上，30℃培养3天，将大量平板上的单克隆挑于BMGY-橄榄油筛选平板上，从中挑取活力表现最好的阳性克隆，分别命名为TDL-1和TDLm-1，其氨基酸序列分别如SEQ IDNO:2和4所示。

取TDL-1和TDLm-1菌株，先在液体YPD中活化，接于BMGY中，30℃，220rpm过夜培养，再转接至BMGY培养基中，初始OD600为6，初始用2％的甘油进行诱导，24h和32h后各补加1％，48h和56h后各补加1％，72h取样，用截留分子量为10KD超滤管进行浓缩，使蛋白浓度到达20mg/ml。

按下表1所示各组分用量进行生物柴油制备检测。

表1

	35℃
		PFAD	750mg
FAME	250mg
		8％NaOH(200ppm)	2.5μl
水(PFAD与FAME总重量的2％)	20μl
		酶(TDL或TDLm)，μl*	2％～0.75％
无水甲醇	200μl

*酶添加的体积以μl计的数值与PFAD重量以mg计的数值的百分比。酶液中的蛋白浓度为20mg/ml。

先将PFAD与FAME混合，加入NaOH使得其在混合物中的浓度为200ppm，再将20ul水与酶混合，加入至混合物中，最后加入50ul甲醇，35℃条件下进行反应，其余150ul甲醇分三批在8h内添加，反应进行至24h后停止反应，将样品进行离心，取100ul样品测定酸价，进而得到残留的FFA的含量(％)，从而计算出酶的转化率。

TDL-1和TDLm-1的生物柴油制备效果如图1所示，TDL-1在2％的添加量可以将FFA的含量降至5％，即达到95％的转化率。而TDLm-1在1.5％的添加量就可以将FFA的含量降至5％，即达到95％的转化率。

实施例2：TDLm-1突变体文库构建、筛选及性能检测

1、突变文库构建及突变体筛选

以pAO-TDLm载体为模板，使用Taq酶(TaKaRa)和引物对EPTDL-1/EPTDL-2：

EPTDL-1：5’-ccgGAATTCCGAAACGATGAGATTTCCTTC-3’(SEQ ID NO:8)

EPTDL-2：ccgGAATTCTCACAAACAAGTGCC(SEQ ID NO:9)

进行易错PCR(在PCR时额外添加0.3mM的MnCl₂)，得到大小为约1000bp的突变扩增子片段集合。通过EcoRI酶切位点将得到的片段克隆至pAO-TDLm，并将得到的载体转化入大肠杆菌DH5α菌株，一共得到1×10⁴个TDLm突变体。

将每1×10³个TDLm突变体用2ml的无菌水洗至8ml的LB液体培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃培养4h。抽提质粒，用SalI进行线性化，回收约8.5kb的片段。取500ng载体(使用尽量少的DNA，保证大多数阳性转化子含单拷贝PLC基因)，用电转化法将载体转化至毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞中。将转化物接种于BMGY-橄榄油筛选培养基平板上，30℃培养3天，得到TDLm的毕赤酵母突变体文库。挑取平板上的周围有红色变色圈的单克隆，至500ul BMGY液体培养基中，30℃培养2天，取上清培养基，用pNPP作为底物，测定水解活力，筛选得到一株高比酶活的突变体EP14。

2、EP14突变体性能检测

按下表2配制检测酯化活性反应体系，NaOH的终浓度为1000ppm，在35℃/1400rpm条件下反应1小时后，沸水浴煮10分钟灭酶，再滴定FFA含量。

表2

	35℃
		酸化油	1g
8％NaOH(1000ppm)	12.5μl
		水(酸化油重量的5％)	50μl
无水甲醇	100μl
		酶(EP14或TDLm)*	10μl

*酶液中的蛋白浓度为20mg/ml。

由图2可知，EP14相比于TDLm-1的比酯化活力由42.66U/mg提高至86.34U/mg，所以EP14相比于TDLm-1的比酯化活力提高1倍。

按下表3所示各组分用量进行生物柴油制备检测。

先将PFAD与FAME混合，加入NaOH使得其终浓度为200ppm，再将20ul水与酶混合，加入至原料中，最后加入50ul甲醇，35℃条件下进行反应，其余150ul甲醇分三批在8h内添加，反应进行至24h后停止反应，将样品进行离心，取100ul样品测定酸价，进而得到残留的FFA的含量，从而计算出酶的转化率。

表3

	35℃
		PFAD	750mg
FAME	250mg
		8％NaOH(200ppm)	2.5μl
水(PFAD与FAME总重量的2％)	20μl
		酶(EP14或TDLm)，μl*	2％～0.3％
无水甲醇	200μl

*酶添加的体积以μl计的数值与PFAD重量以mg计的数值的百分比。酶液中

的蛋白浓度为20mg/ml。

EP14和TDLm-1的生物柴油制备效果如图3和4所示，TDLm-1在1.5％的添加量可以将FFA的含量降至5％，即达到95％的转化率。EP14在0.5％的添加量可以将FFA的含量降至7％，即达到93％的转化率。

实施例3：EP14突变体序列分析

将EP14菌株接种于3ml YPD液体培养基中，30℃培养过夜，抽提基因组DNA。以EP14菌株的基因组DNA为模板，使用

HS DNA聚合酶和SEQ ID NO:15和16所示引物对进行PCR扩增，得到EP14菌株中TDL的DNA序列。将得到的序列送往上海生工生物工程公司，用SEQ ID NO:15和16所示引物对进行测序。EP14菌株的TDL的DNA测序结果，如SEQ IDNO:5所示，有5个碱基发生了突变，第1位谷氨酸突变为天冬氨酸(GAA→GAT)；第33位天冬酰胺突变为异亮氨酸(TAA→TAT)，第95位亮氨酸突变为蛋氨酸(TTG→ATG)，第259位亮氨酸突变苯丙氨酸(TTG→TTT)，第264位亮氨酸突变为丝氨酸(TAA→TCA)。其氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示。

序列表

<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司

<120> 一种高酯化活力的脂肪酶突变体

<130> 167237

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据毕赤酵母密码子偏爱性设计的TDL的编码序列

<400> 1

gaagtgtccc aggatctttt cgatcagttc aacttattcg ctcaatactc cgcagctgca 60

tactgtgcaa agaacaacga tgcacctgca ggagctaacg ttacatgtag aggatctatc 120

tgtccagaag tagagaaggc agatgctaca ttcctatact ccttcgaaga ttccggtgtt 180

ggtgacgtaa caggatttct agctctagat aacacaaaca ggctgatcgt actgtccttc 240

cgaggaagta gaagtctgga gaactggata ggaaacatca acttggatct gaagggtatc 300

gatgatattt gctcaggttg caaaggtcac gacggtttta cgtcatcttg gaggtctgtg 360

gctaatacgc ttactcaaca agtccagaat gctgtgagag aacaccctga ttacagagtc 420

gtttttaccg gacactcatt gggaggtgct cttgctactg ttgctggtgc ttctttaaga 480

ggaaatggtt acgacataga tgtcttttct tacggggccc ctagagttgg gaatagagcc 540

tttgccgaat ttttgactgc ccaaactggt ggtactttat atagaataac ccataccaat 600

gacattgtgc ctcgacttcc accacgtgaa ttggggtatt ctcattcatc accagagtat 660

tggattacca gtggcacttt ggtccccgtt actaagaacg acattgttaa agttgagggt 720

attgacagta ctgacggcaa taatcaacca aatacccccg acattgccgc ccatttgtgg 780

tattttggct taattggcac ttgtttgtga 810

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TDL的氨基酸序列

<400> 2

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Ala

20 25 30

Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly Asn Ile Asn Leu Asp

85 90 95

Leu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly Cys Lys Gly His Asp Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn Thr Leu Thr Gln Gln Val

115 120 125

Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Ser Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp Ile Val Lys Val Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn Thr Pro Asp Ile Ala

245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210> 3

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TDLm的编码序列

<400> 3

gaagtgtccc aggatctttt cgatcagttc aacttattcg ctcaatactc cgcagctgca 60

tactgtgcaa agaacaacga tgcacctgca ggagctaacg ttacatgtag aggatctatc 120

tgtccagaag tagagaaggc agatgctaca ttcctatact ccttcgaaga ttccggtgtt 180

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attgacagta ctgacggcaa taatcaacca aatacccccg acattgccgc ccatttgtgg 780

tattttggct taattggcac ttgtttgtga 810

<210> 4

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TDLm的氨基酸序列

<400> 4

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Ala

20 25 30

Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly Asn Ile Asn Leu Asp

85 90 95

Leu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly Cys Lys Gly His Asp Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn Thr Leu Thr Gln Gln Val

115 120 125

Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Ser Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile Val Lys Val Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn Thr Pro Asp Ile Ala

245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210> 5

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EP14的编码序列

<400> 5

gatgtgtccc aggatctttt cgatcagttc aacttattcg ctcaatactc cgcagctgca 60

tactgtgcaa agaacaacga tgcacctgca ggagctatcg ttacatgtag aggatctatc 120

tgtccagaag tagagaaggc agatgctaca ttcctatact ccttcgaaga ttccggtgtt 180

ggtgacgtaa caggatttct agctctagat aacacaaaca ggctgatcgt actgtccttc 240

cgaggaagta gaagtctgga gaactggata ggaaacatca acatggatct gaagggtatc 300

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attgacagta ctgacggcaa taatcaacca aatacccccg acattgccgc ccatttttgg 780

tattttggct tcattggcac ttgtttgtga 810

<210> 6

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EP14的氨基酸序列

<400> 6

Asp Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Ala

20 25 30

Ile Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly Asn Ile Asn Met Asp

85 90 95

Leu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly Cys Lys Gly His Asp Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn Thr Leu Thr Gln Gln Val

115 120 125

Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Ser Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile Val Lys Val Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn Thr Pro Asp Ile Ala

245 250 255

Ala His Phe Trp Tyr Phe Gly Ser Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210> 7

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 脂肪酶变体的氨基酸序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸

、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨

酰胺

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa是天冬酰胺、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨

酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或谷氨

酰胺

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (95)..(95)

<223> Xaa是异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸

酰胺

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (259)..(259)

<223> Xaa是亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸

或色氨酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (264)..(264)

<223> Xaa是亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸

酰胺

<400> 7

Xaa Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Ala

20 25 30

Xaa Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly Asn Ile Asn Xaa Asp

85 90 95

Leu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly Cys Lys Gly His Asp Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn Thr Leu Thr Gln Gln Val

115 120 125

Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Ser Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile Val Lys Val Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn Thr Pro Asp Ile Ala

245 250 255

Ala His Xaa Trp Tyr Phe Gly Xaa Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

ccggaattcc gaaacgatga gatttccttc 30

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

ccggaattct cacaaacaag tgcc 24

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 标签序列

<400> 10

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 标签序列

<400> 11

His His His His His His

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 标签序列

<400> 12

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 标签序列

<400> 13

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 标签序列

<400> 14

Trp Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

tccccgcggc gaaacgatga gatttccttc 30

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

ggcaaatggc attctgacat cctc 24

Claims

1.一种多肽，所述多肽选自：

（1）氨基酸序列如SEQ ID NO：4或6所示的多肽；和

（2）由SEQ ID NO：4或6所示的序列与促进其表达与纯化的序列组成的多肽。

2. 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述促进序列表达与纯化的序列选自信号肽、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、标签、Xa因子的蛋白水解酶位点、凝血酶的蛋白水解酶位点和肠激酶的蛋白水解酶位点中的一条或多条序列。

3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述标签为6His或Flag。

4. 一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子的多核苷酸序列选自：

（1）编码权利要求1-3中任一项所述多肽的多核苷酸序列；和

（2）与（1）所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

5. 如权利要求4所述的多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO：3或5所示。

6.一种多核苷酸构建物，其特征在于，所述多核苷酸构建物含有权利要求4或5所述的多核苷酸分子。

7.如权利要求6所述的多核苷酸构建物，其特征在于，所述多核苷酸构建物是表达载体或克隆载体。

8. 一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞：

（1）表达权利要求1-3中任一项所述的多肽；和/或

（2）含有权利要求4或5所述的多核苷酸分子或权利要求6或7所述的多核苷酸构建物。

9.一种生物柴油的制备方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-3中任一项所述的多肽或权利要求8所述的遗传工程化的宿主细胞合成生物柴油的步骤。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以动植物油脂和有机醇为原料，在水和所述多肽的存在下进行酯交换反应的步骤，其中所述动植物油脂选自：餐饮废油、粗油酸、酸化油、或棕榈脂肪酸馏出物与脂肪酸酯的混合物。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法具有以下一项或多项特征：

所述棕榈脂肪酸馏出物和脂肪酸酯的混合物中，以重量计，棕榈脂肪酸馏出物的含量为70～80％，脂肪酸酯的含量为20～30％；

所述有机醇以分批或流加的方式添加；

所述多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.005％以上；

水的添加量为所述动植物油脂重量的1%以上；

添加碱调节酯交换反应物的pH；和

酯交换反应的温度在35±5℃的范围内。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸酯是脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯，所述有机醇是甲醇或乙醇。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述有机醇的总用量为所述动植物油脂中所含游离脂肪酸质量的2倍以上。

14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.01%以上。

15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.02%以上。

16.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.03％以上。

17.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.05％以上。

18.如权利要求11所述的方法，其特征在于，水的添加量为所述动植物油脂重量的2％以上。

19.如权利要求11所述的方法，其特征在于，水的添加量为所述动植物油脂重量的1~5%。

20.如权利要求11所述的方法，其特征在于，水的添加量为所述动植物油脂重量的1～10%。

21.如权利要求11所述的方法，其特征在于，水的添加量为所述动植物油脂重量的2～5％。

22.如权利要求11所述的方法，其特征在于，水的添加量为所述动植物油脂重量的2～10％。

23.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述碱是NaOH。

24.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述碱的添加量为所述动植物油脂重量的0.005％以上。

25.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述碱的添加量为所述动植物油脂重量的0.005～0.15％。

26.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述碱的添加量为所述动植物油脂重量的0.02%～0.1％。

27.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述碱的添加量为所述动植物油脂重量的0.02%～0.15％。

28. 如权利要求10-27中任一项所述的方法，其特征在于，使用氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示的多肽进行酯交换反应，其中，SEQ ID NO:4所示的多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.015%以上。

29. 如权利要求28所述的方法，其特征在于，SEQ ID NO:4所示的多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.015～0.05％。

30. 如权利要求28所述的方法，其特征在于，SEQ ID NO:4所示的多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.02～0.05％之间。

31. 如权利要求10-27中任一项所述的方法，其特征在于，使用氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示的多肽进行酯交换反应，其中，SEQ ID NO:6所示的多肽用量为动植物油脂重量的0.007％以上。

32. 如权利要求31所述的方法，其特征在于，SEQ ID NO:6所示的多肽用量为动植物油脂重量的0.007～0.03％。

33.权利要求1-3中任一项所述的多肽、权利要求4或5所述的多核苷酸分子、权利要求6或7所述的核酸构建物或权利要求8所述的遗传工程化的宿主细胞在制备生物柴油中的应用。

34.一种酯交换反应混合物，其特征在于，所述反应混合物含有：

动植物油脂；

有机醇；

水；和

权利要求1-3中任一项所述的多肽。

35.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，所述动植物油脂选自：餐饮废油、粗油酸、酸化油、或棕榈脂肪酸馏出物与脂肪酸酯的混合物。

36.如权利要求35所述的反应混合物，其特征在于，所述脂肪酸酯为脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。

37.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，所述有机醇为甲醇或乙醇。

38.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，所述有机醇的总用量为所述动植物油脂中所含游离脂肪酸质量的2倍以上。

39.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，所述多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.005％以上。

40.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，所述多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.01%以上。

41.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，所述多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.02%以上。

42.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，所述多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.03％以上。

43.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，所述多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.05％以上。

44.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，所述多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.005～0.05％。

45.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，所述多肽的用量为所述动植物油脂重量的0.02%～0.05％。

46.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，水的用量为所述动植物油脂重量的1%以上。

47.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，水的用量为所述动植物油脂重量的1~5%。

48.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，水的用量为所述动植物油脂重量的1～10%。

49.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，水的用量为所述动植物油脂重量的2～5％。

50.如权利要求34所述的反应混合物，其特征在于，水的用量为所述动植物油脂重量的2～10％。