KR101887732B1 - 리파아제 활성이 증대된 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체 및 이의 용도 - Google Patents

리파아제 활성이 증대된 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리파아제 활성이 증대된 양친매성 펩타이드(amphipathic peptide) 및 리파아제가 연결된 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체, 상기 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 결합체의 제조방법, 상기 결합체를 이용한 지질의 분해방법 및 상기 리파아제를 이용한 바이오디젤의 생산방법에 관한 것이다.

Description

리파아제 활성이 증대된 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체 및 이의 용도{Amphipathic peptide-lipase conjugate having advanced lipase activity and use thereof}
본 발명은 리파아제 활성이 증대된 양친매성 펩타이드(amphipathic peptide) 및 리파아제가 연결된 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체, 상기 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 결합체의 제조방법, 상기 결합체를 이용한 지질의 분해방법 및 상기 리파아제를 이용한 바이오디젤의 생산방법에 관한 것이다.
리파아제(lipase; triacylglycerol acylhydrolase, EC3.1.1.3)는 트리글리세라이드를 지방산과 글리세라이드 혹은 글리세롤로 가수분해하는 효소로서, 아밀라제(amylase) 및 프로테아제(protease)와 함께 3대 소화효소의 주축을 이루고, 동물, 식물 및 미생물 등의 자연계에 광범위하게 분포한다.
상기 리파아제는 생체 내에서 지방대사의 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 치즈 풍미 증진, 야채 발효시 유리지방산 증가, 육류 숙성시 향기 증진 및 어류 지방 분해에도 작용하고, 고가의 순수광학 이성질체 합성에도 사용될 수 있는 등의 폭넓은 활용범위를 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 산업적으로도 널리 활용되고 있는데, 구체적으로, 낙농산업 분야에서는 유지방 분해를 통한 치즈의 제조, 버터나 크림의 지방분해를 위해 사용되고, 세제산업 분야에서는 세탁 또는 세척세제의 제조, 환경오염 폐수 감소, 반응온도 감소 등에 사용되며, 유화학산업 분야에서는 불포화 지방산 생산, 비누제조, 싼 팜유를 이용한 코코아 버터의 생산 등에 활용되고, 제지산업 분야에서는 나무의 송진 또는 수지 제거, 폐지의 잉크제거 등에 활용되며, 제약산업 분야에서는 R, S- 광학이성질체 구분 합성, 라세믹 혼합물의 분리, 약제조 등에 이용되고, 화장품산업 분야에서는 왁스를 비롯한 피부용품, 선탠크림, 목욕용품 등의 제조에 이용되며, 에너지산업 분야에서는 식물성 기름으로부터 바이오디젤의 생산에 활용되고 있다.
특히, 신재생 에너지로 평가받고 있는 바이오디젤은 현재 국내외에서 화학촉매를 이용한 방법으로 생산되고 있지만, 다량의 유기 용매 사용, 환경처리 비용, 고온의 반응 조건에 따른 에너지 과다사용 등의 문제로 인한 높은 생산 단가 때문에 상업화가 어려워 효소인 리파아제를 촉매로 이용하는 공정이 주목받고 있다. 상기 공정을 이용할 경우, 낮은 반응온도에 따른 에너지 절약과 부산물인 글리세롤을 이용한 추가 수익 발생을 통하여, 생산비용을 낮출 수 있고, 환경오염 문제가 거의 없다는 장점이 있는 반면, 효소의 안정성이 약하고, 비용대비 효율이 낮다는 단점이 있었다. 상기 단점을 해결하기 위하여 효소를 고정화하는 방법이 개발되었으나, 이는 효소의 특징을 개선한다는 직접적인 연구 방법이기 보다 간접적인 해결책을 제시한 것이기 때문에, 직접적인 효소의 활성을 증대시켜 산업적 이용가치를 증가시키는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되었다.
예를 들어, 리파아제의 효율적 활용을 위하여 저렴하면서도 강력한 활성의 리파아제를 개발하기보다는 기존의 리파아제의 반응조건을 바꾸거나, 효소 고정화와 같은 간접적 방법을 통해서 문제를 해결하거나 또는 메타제노믹스를 통해 새로운 리파아제를 찾으려는 연구가 수행되었으나, 별다른 성과를 얻지 못하였다. 또한, 다양한 리파아제의 X-ray 구조를 분석하고, 효소 작용부위와 그 주변의 아미노산 치환하여 효소활성, 기질 특이성, 내열성, 프로테아제 안정성을 증가시키는 연구, 특히 위치지정 돌연변이 방법(site-directed mutagenesis)과 같은 단백질 공학을 사용하여 리파아제를 개량하려는 연구가 많이 진행되어 왔으나, 리파아제의 활성이 부분적으로 증가되는 결과만을 얻을 수 있었다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 리파아제의 기질이 불용성이기 때문에 상기 기질에 대한 리파아제의 접근성이 낮다는 점에 착안하여, 기존의 리파아제에 친수기와 소수기를 가지는 양친매성(amphiphacity)의 펩타이드를 융합시켜, 양친매성 펩타이드 및 리파아제를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제작하였고, 상기 융합 폴리펩타이드를 사용할 경우, 기질에 대한 접근성, 결합성 및 반응성이 향상됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 양친매성 펩타이드(amphipathic peptide) 및 리파아제가 연결된 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체를 이용한 지질의 분해방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체를 이용한 바이오디젤의 생산방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 양친매성 펩타이드(amphipathic peptide) 및 리파아제가 연결된 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "양친매성 펩타이드"란 극성 아미노산과 비극성 아미노산을 포함하고, 상기 극성 아미노산과 비극성 아미노산이 부분적으로 서로 밀집되어 극성 부분과 비극성 부분을 나타내는 펩타이드를 의미하는데, 상기 극성 아미노산으로는 시스테인, 글루타민, 트레오닌, 타이로신, 세린 및 아스파라긴을 들 수 있고, 상기 비극성 아미노산으로는 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 프롤린, 발린, 이소류신, 류신, 글리신 및 알라닌을 들 수 있다. 본 발명에서 상기 양친매성 펩타이드는 리파아제와 그의 기질인 지방성분 간의 결합 및 반응성을 증가시키는 매체로서 사용될 수 있는데, 아미노산 서열상 극성 아미노산과 비극성 아미노산이 서로 밀집된 형태일 수 있고, 아미노산 서열상 극성 아미노산과 비극성 아미노산이 서로 밀집되어 있지는 않으나, 상기 아미노산을 포함하는 펩타이드가 3차원 구조를 형성할 때, 상기 3차원 구조에 의하여 극성 아미노산과 비극성 아미노산이 서로 밀집되는 형태일 수도 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 목적상 상기 양친매성 펩타이드는 리파아제와 결합하여 리파아제의 기질 접근성 또는 반응성을 향상시킬 수 있는 펩타이드라면 제한없이 포함하며, 그 예로 부포린 IIb(Buforin IIb, 서열번호 1), B0(서열번호 2), 파라신 I(Paracin I, 서열번호 3), NKC(서열번호 4), NRC(서열번호 5)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 양친매성 펩타이드는 리파아제와 결합하여 리파아제의 기질 접근성 또는 반응성을 향상시킬 수 있는 펩타이드라면 특별히 그 길이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 부포린 IIb, B0, 파라신 I, NKC 및 NRC를 대표적인 양친매성 펩타이드로 사용하였다.
상기 양친매성 펩타이드는 서열번호 1 내지 5로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 리파아제의 활성을 증진시킬 수 있는 생물학적 활성을 갖는 단백질이라면 모두 포함한다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 양친매성 펩타이드와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, "리파아제(lipase)"란 지방을 분해하는 효소를 의미하는데, 구체적으로 중성지방에 작용하여 트라이아실글리세리드에서 다이아실글리세리드와 모노아실글리세리드를 거쳐서 지방산과 글리세린으로 분해하는 효소를 의미한다. 대체로 동물의 췌장액에 풍부하게 포함되어 있고, 식물에서는 밀, 아주까리, 콩 등의 종자에 포함되어 있다. 상기 리파아제는 지방을 분해하는 생물학적 활성을 지닌 효소라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 그 예로 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 유래의 리파아제 TliA(thermostable lipase) 또는 포토박테리움 리포리티쿰(Photobacterium lipolyticum) 유래의 리파아제 M37일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 리파아제에 관한 정보는 미국 국립보건원 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 AAD09856인 TliA 또는 AAS78630인 M37일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 TliA 리파아제는 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 리파아제이거나, M37은 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 리파아제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 리파아제는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 리파아제뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 지질을 분해하는 생물학적 활성을 갖는 단백질이라면 모두 포함한다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 리파아제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, "양친매성 펩타이드-리파아제 결합체"는 양친매성 펩타이드가 리파아제의 생물학적 활성을 저해시키지 않도록 리파아제에 연결된 형태를 의미한다. 상기 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체는 화학적으로 연결되거나, 두 종류 이상의 폴리펩타이드가 효소작용에 의하여 연결되거나, 또는 유전자의 조작을 통해 두 종류 이상의 상이한 폴리펩타이드가 하나의 폴리펩타이드로 발현된 형태로 연결될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 양친매성 펩타이드와 리파아제는 양친매성 펩타이드와 리파아제가 직접 연결된 형태일 수도 있고, 링커(linker)에 의해 연결된 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "링커(linker)"란 기본적으로는 두 개의 서로 다른 융합 파트너(예를 들어, 생물학적 고분자 등)를 수소결합, 정전기적 상호작용, 반데르발스력, 이황화 결합, 염 브릿지, 소수성 상호작용, 공유결합 등을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미한다. 바람직하게는 생리학적 조건 또는 다른 표준 펩타이드 조건(예를 들면, 펩타이드 정제 조건, 펩타이드 저장 조건)하에서 적어도 하나의 이황화 결합에 참여할 수 있는 적어도 하나의 시스테인을 가질 수 있으며, 단순히 각각의 융합 파트너를 연결하는 역할 이외에도, 융합 파트너 사이에 일정한 크기의 간격을 부여하는 역할을 수행하거나 또는 융합체에 유연성 또는 강직성을 제공하는 힌지(hinge)의 역할을 수행할 수도 있다. 상기 링커는 비펩타이드 링커 또는 펩타이드 링커일 수 있으며, 펩티드 결합, 이황화 결합 등에 의해서 직접 연결되는 것도 포함된다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드 링커"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체적합성 링커를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.
본 발명에 사용가능한 비펩타이드 링커는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG) 단독 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독 중합체, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다. 더욱 바람직하게는 분자량 1 내지 5 kDa의 분자량인 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체이며, 가장 바람직하게는 3.4 kDa 정도이며, 양 말단에 양기능성 알데히드(bifunctional aldehyde) 형태로 폴리펩타이드 아미노 말단의 아민그룹과 결합하여, 양친매성 펩타이드와 리파아제를 서로 연결시킬 수 있다. 특히, 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하는 데 효과적이다.
또한, 상기 양친매성 펩타이드와 리파아제의 결합 형태는 특별히 이에 제한되지 않으나, 리파아제의 N-말단에 양친매성 펩타이드가 결합한 형태가 될 수 있고, 상기 리파아제의 C-말단에 양친매성 펩타이드가 결합한 형태가 될 수도 있으며, 상기 리파아제의 N-말단과 C-말단에 양친매성 펩타이드가 각각 결합한 형태가 될 수도 있다. 예를 들어, 리파아제 TliA의 N-말단에 부포린 IIb, B0, 파라신 I, NKC 또는 NRC가 융합된 형태(서열번호 8 내지 12), 리파아제 M37의 N-말단에 부포린 IIb, B0, 파라신 I, NKC 또는 NRC가 융합된 형태(서열번호 13 내지 17), 리파아제 TliA의 C-말단에 부포린 IIb, B0, 파라신 I, NKC 또는 NRC가 융합된 형태(서열번호 18 내지 22), 리파아제 M37의 C-말단에 부포린 IIb, B0, 파라신 I, NKC 또는 NRC가 융합된 형태(서열번호 23 내지 27), 리파아제 TliA의 N-말단과 C-말단에 부포린 IIb, B0, 파라신 I, NKC 또는 NRC가 융합된 형태(서열번호 28 내지 32), 리파아제 M37의 N-말단과 C-말단에 부포린 IIb, B0, 파라신 I, NKC 또는 NRC가 융합된 형태(서열번호 33 내지 37) 등이 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 부포린 IIb, B0, 파라신 I, NKC 또는 NRC를 양친매성 펩타이드로 사용하였고, 리파아제로 TliA 또는 M37을 사용하였다. 상기 양친매성 펩타이드를 리파아제의 N-말단에 연결시킨 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체를 제조하였고, 상기 양친매성 펩타이드-리파아제가 리파아제의 지질 분해 활성을 최대 10배까지 증대시킴을 확인하여(도 4 내지 7), 본 발명의 양친매성 펩타이드를 연결시킨 리파아제가 뛰어난 지질 분해 활성을 나타냄을 확인하여, 지질 분해가 필요한 다양한 분야에 사용될 수 있는 경제적이면서도 뛰어난 리파아제임을 확인하였다. 또한, 양친매성 펩타이드를 리파아제에 결합시킨 경우, 지질 입자에 대한 접근성 또한 향상되는 결과를 보였다(도 8). 아울러, 본 발명의 대표적인 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체인 NKC-M37 리파아제의 경우, 바이오디젤의 생산에 사용되는 메탄올의 존재하에서도 야생형 리파아제인 M37에 비하여 뛰어난 안정성 및 지질분해활성을 보임으로써(도 9 및 10), 본 발명의 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체가 바이오디젤의 생산에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하였다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 상기 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid)가닥으로서, 상기 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 리파아제 TliA의 N-말단에 부포린 IIb, B0, 파라신 I, NKC 또는 NRC가 융합된 형태의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 45 내지 49), 리파아제 M37의 N-말단에 부포린 IIb, B0, 파라신 I, NKC 또는 NRC가 융합된 형태의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 50 내지 54), 리파아제 TliA의 C-말단에 부포린 IIb, B0, 파라신 I, NKC 또는 NRC가 융합된 형태의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 55 내지 59), 리파아제 M37의 C-말단에 부포린 IIb, B0, 파라신 I, NKC 또는 NRC가 융합된 형태의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 60 내지 64), 리파아제 TliA의 N-말단과 C-말단에 부포린 IIb, B0, 파라신 I, NKC 또는 NRC가 융합된 형태의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 65 내지 69), 리파아제 M37의 N-말단과 C-말단에 부포린 IIb, B0, 파라신 I, NKC 또는 NRC가 융합된 형태의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 70 내지 74)일 수 있다.
본 발명의 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 결합체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 결합체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 제공하는 상기 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 대장균 세포를 숙주세포로 이용하였다(실시예 2).
본 발명에서 용어, "도입"은 상기 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은 바람직하게는 (a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 형질전환체 또는 이의 배양액으로부터 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체를 회수하는 단계를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 결합체를 회수하는 단계는 상기 배양물로부터 수득한 배양균체 또는 배양 상등액을 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 단백질 침전, 투석 등의 공지된 정제방법을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 수행될 수 있고, 회수된 목적 단백질의 확인은 SDS-PAGE, 웨스턴 블럿 등의 공지된 통상의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 양친매성 펩타이드와 리파아제가 연결된 결합체인 파라신 I-TliA 리파아제, 부포린 IIb-TliA 리파아제, B0-TliA 리파아제, 파라신 I-M37 리파아제, 부포린 IIb-M37 리파아제, B0-M37 리파아제, NKC-M37 리파아제 및 NRC-M37 리파아제의 유전자를 각각 제작하고, 이를 포함하는 발현벡터(pET-Par-TliA, pET-Buf-TliA, pET-B0-TliA, pET-Par-M37, pET-Buf-M37, pET-B0-M37, pET-NKC-M37 및 pET-NRC-M37)를 각각 수득하였다. 상기 수득한 각 발현벡터를 대장균에 도입하여 각각의 형질전환체를 제작한 다음, 상기 제작된 각각의 형질전환체를 배양하고, 각각의 배양물로부터 각각의 융합 폴리펩타이드를 회수하여, 양친매성 펩타이드와 리파아제가 연결된 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체를 제조하였다(실시예 1 및 2, 도 2 및 3).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체와 지질을 반응시키는 단계를 포함하는, 상기 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체를 이용한 지질의 분해방법을 제공한다.
상기 양친매성 펩타이드, 리파아제 및 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체는 양친매성 펩타이드로 인하여 지질 기질에 대한 향상된 접근성 및 반응성을 나타내므로(도 4 내지 8), 지질의 분해에 있어 효율적으로 사용될 수 있다. 또한, 양친매성 펩타이드가 결합되어 별도의 계면활성제의 사용이 요구되지 않으며, 리파아제 사용량이 적게 요구되므로, 경제적인 지질의 분해에 이용될 수 있다.
상기 지질은 본 발명의 리파아제에 분해될 수 있는 지질이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 결합체의 리파아제 활성을 양친매성 펩타이드가 결합되지 않은 야생형 리파아제 활성과 비교하였다. 이때, 기질로는 파라니트로페닐 팔미테이트 및 올리브유를 사용하였다. 그 결과, 파라니트로페닐 팔미테이트를 기질로 사용할 경우, 리파아제 TliA를 포함하는 결합체는 야생형 리파아제 TliA에 비하여 리파아제 활성이 약 10% 정도 증가되었고(도 4), 리파아제 M37을 포함하는 결합체는 야생형 리파아제 M37에 비하여 리파아제 활성이 약 1.2 내지 4.2배 증가되는 결과를 보였다(도 6). 또한, 올리브유를 기질로 사용할 경우, 리파아제 TliA를 포함하는 결합체는 리파아제 TliA에 비하여 리파아제 활성이 약 35.5 내지 78배 증가되었고(도 5), 리파아제 M37을 포함하는 융합단백질은 리파아제 M37에 비하여 리파아제 활성이 약 2.2 내지 10.2배 증가되는 결과를 나타내었다(도 7). 상기와 같은 결과들은 본 발명의 결합체가 지질의 분해에 있어 효율적으로 사용될 수 있음을 뒷받침하는 결과이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체를 이용한 바이오디젤의 생산방법을 제공한다.
상기 바이오디젤의 생산방법은 바람직하게는 상기 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체와 유지 및 알코올을 반응시키는 단계를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 바이오디젤의 생산방법은 (a) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 형질전환체를 배양하여 배양물 또는 배양 상등액으로부터 리파아제를 회수하는 단계; 및 (c) 상기 회수된 리파아제를 사용하여 유지와 알코올로부터 바이오디젤을 생산하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 바이오디젤의 생산에 사용되는 리파아제는 이에 제한되지 않으나, 자유로운 형태 또는 고정화된 형태로 사용할 수 있다. 또한, 상기 리파아제의 고정화는 당업계에서 통상적으로 사용하는 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는 다양한 응용이 가능하다. 예를 들어, 흡착법, 포괄법 등의 물질적인 방법 및 공유결합법, 가교연결방법 등의 화학적인 방법을 사용할 수 있다.
상기 유지는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 천연유지, 가공유지 및폐유지 중에서 선택된 것을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 대두유, 채종유, 팜유 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 알코올은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 탄소 수가 2개 내지 8개인 알코올을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 탄소 수가 2개 내지 4개인 알코올을 사용할 수 있으며, 구체적으로 에탄올, 메탄올, 1-프로판올, 이소-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 이소-부탄올 또는 테르-부탄올 등을 사용할 수 있다. 상기 알코올은 당업계에 공지된 다양한 공급 방식을 이용하여 공급할 수 있으며, 여러 단계에 걸쳐서 공급하거나 연속적으로 공급하는 방식을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 유지로서, 올리브오일 또는 오일 폐기물을 사용하였으며, 알코올로서 메탄올을 사용하였다(실시예 5). 또한, 높은 농도의 메탄올 배지에서 불안정한 일반적인 리파아제와 달리 본 발명의 리파아제는 CalB 리파아제에 비하여 3.3%, 5% 및 10%에서도 높은 활성을 유지하였다(도 9). 또한, 3 단계 메탄올 공급 방법(1 당량)을 사용하여 본 발명의 대표적인 결합체인 NKC-M37 리파아제의 올리브오일의 바이오디젤로의 생산 효율을 확인한 결과, 야생형 M37 리파아제에 비하여 21시간이나 빨리 95%의 전환 수율에 도달하였다(도 10 a). 또한, 3 단계 메탄올 공급 방법에 비하여 보다 경제적인 2 단계 메탄올 공급 방법을 사용하였을 때, 야생형 M37 리파아제에 비하여 27시간 빨리 최대 전환 수율에 도달하는 결과를 보였으며(도 10 b), 1 단계 메탄올 공급 방법을 사용하였을 때도 야생형 M37 리파아제 비하여 훨씬 빠르게 최대 전환 수율에 도달하는 결과를 나타내었다(도 10 c). 또한, 공급 원료가 훨씬 저렴하나 불순물, 유리 지방산 및 함수량 등을 포함하여 리파아제의 활성에 영향을 미쳐 바이오디젤의 생산에 사용이 어려운 것으로 알려진 오일 폐기물을 기질로서 사용하였다. 그 결과, 오일 폐기물에 본 발명의 대표적인 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체인 NKC-M37 리파아제를 사용하였을 때, 올리브유 및 팜유와 비슷한 정도의 바이오디젤이 생산되는 결과를 나타내어, 본 발명의 결합체가 바이오디젤 생산에 있어 경제적 가치를 지니는 결합체임을 확인하였다(실시예 5).
본 발명의 융합 폴리펩타이드는 종래의 리파아제에 기질의 반응성을 증가시킬 수 있는 양친매성 펩타이드가 융합된 형태로서, 리파아제의 효소활성을 현저하게 증가시키므로 바이오디젤 생산과 같은 리파아제가 필요한 분야에 있어 소량을 사용하여도 충분한 지질 전환 수율을 보일 수 있을 뿐만 아니라, 리파아제의 활성을 증가시키기 위한 별도의 계면활성제를 사용하지 않을 수 있으므로, 리파아제의 경제적인 사용에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은, 양친매성 펩타이드(amphipathic peptide)을 Schiffer-Edmundson wheel projection으로 나타낸 도로서, 1번은 펩타이드의 1번 잔기를 나타내며, 검은 동그라미(filled circle)은 소수성 아미노산을, 흰 동그라미는 친수성 아미노산을 나타낸다.
도 2는, 활성이 증대된 리파아제를 발현하기 위한 벡터의 유전자 구조도이다.
도 3은, 본 발명에서 발현된 펩타이드-리파아제 TliA 발현양상을 나타내는 SDS-PAGE 사진이다.
도 4는, 본 발명에 따라 제조된 TliA 리파아제의 지질분해활성을, 리파아제 반응시 발색하는 파라니트로페닐 팔미테이트(para-Nitrophenyl palmitate)를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는, 본 발명에 따라 제조된 TliA 리파아제의 지질분해활성 증대를 pH-STAT으로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은, 본 발명에 따라 제조된 M37 리파아제의 지질분해활성을, 리파아제 반응 시 발색하는 파라니트로페닐 팔미테이트를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따라 제조된 M37 리파아제의 지질분해활성 증대를 pH-STAT으로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은, NKC-M37 리파아제의 지질 입자에 대한 위치를 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는, 칸디다 안탁티카(Candida antarctica) 유래의 CalB 리파아제(a), 야생형 M37 리파아제(b) 및 NKC-M37 리파아제(c)의 효소 활성을 나타낸 도로서, 40℃에서 12시간 내의 시간에서 반응시킨 결과를 나타낸 것이다. CalB 리파아제, 야생형 M37 리파아제 및 NKC-M37 리파아제의 가수분해활성을 0%, 3.3%, 5% 및 10%의 메탄올-수용액에서 측정하였다.
도 10은, 야생형 M37 리파아제 및 NKC-M37 리파아제를 이용하여 올리브 오일을 사용하여 바이오디젤 생산을 확인한 도이다. 바이오디젤의 양은 가스 크로마토그래피 및 박층 크로마토그래피를 이용하여 정량적으로 분석하였다. 도 10 a는 3 단계 에스테르교환반응을 시간 의존적으로 수행한 결과를 나타낸 것으로, 야생형 M37 리파아제는 흰 동그라미(open circle)로, NKC-M37 리파아제는 검은색 동그라미(closed circle)로 나타내었다. 또한, 야생형 M37 리파아제(왼쪽) 및 NKC-M37 리파아제(오른쪽)을 사용한 에스테르 교환반응에 대한 반응 혼합물의 TLC 분석을 나타내었다. 도 10 b는 야생형 M37 리파아제 및 NKC-M37 리파아제를 사용하여 올리브 오일의 2 단계 에스테르 교환반응을 시간 의존적으로 수행한 결과를 나타내는 것이다. 도 10 c는 야생형 M37 리파아제 및 NKC-M37 리파아제를 사용하여 올리브 오일의 1 단계 에스테르 교환반응을 시간 의존적으로 수행한 결과를 나타내는 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 다양한 양친매성 펩타이드 유도체와 리파아제가 융합된 리파아제 단백질의 개발
실시예 1-1: 펩타이드 유도체 제작
여러 항균 펩타이드들은 강력한 항균활성을 가지고 있으면서 동시에 소수기와 친수기를 가지는 양친매성의 α-helix 구조를 이루고 있다. 본 발명자들은 그 중 특히 우수한 양친매성을 나타내는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재된 부포린 IIb(대한민국 등록특허 제10-314721호), 상기 부포린 IIb를 변형시킨 서열번호 2의 아미노산 서열로 기재된 펩타이드 B0, 서열번호 3의 아미노산 서열로 기재된 파라신 I(대한민국 등록특허 제10-330136호), 서열번호 4의 아미노산 서열로 기재된 NKC 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 기재된 NRC(대한민국 등록특허 제10-836596호)를 제작하였고(표 1), 이를 이용하여 지질분해 활성이 증대된 융합 폴리펩타이드를 제작하였다.
본 발명에서 사용된 양친매성 펩타이드
명칭 아미노산 서열(N-C) 서열번호
부포린 IIb RAGLQFPVGRLLRRLLRRLLR 1
B0 RAGLQFPVG 2
파라신 I KGRGKQGGKVRAKAKTRSS 3
NKC APKAMKLLKKLLKLQKKGI 4
NRC APKAMRLLRRLLRLQKKGI 5
상기 5가지 양친매성 펩타이드의 α-helix 구조는 Schiffer-Edmundson wheel projection을 통하여 시각화할 수 있으며, 이를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 Wheel에서 연이은 아미노산(consecutive amino acids)은 싸이클(cycle) 당 3.6 아미노산을 가지도록, 서로 100°가량 떨어져 있다.
실시예 1-2: 펩타이드와 리파아제가 융합된 유전자의 제작
효소의 활성이 강하며 바이오디젤 생산 시 전환효율이 뛰어난 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 유래의 리파아제 TliA와 메탄올 내성이 강한 포토박테리움 리포리티쿰(Photobacterium lipolyticum) 유래의 리파아제 M37의 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pHOPE(Eom, GT, et al., Applied Environ. Microbiol., 71:3468-3474, 2005)와 pEML37(Yang KS, et al., J. Biosci. Bioeng., 107:599-604, 2009)를 주형으로 이용하여 재조합 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 통해 상기 리파아제 유전자와 선별한 펩타이드 유전자를 융합시켰다. 구체적인 실험 방법은 하기와 같으며, 본 실험에서 사용한 프라이머를 하기 표 2에 나타내었다.
프라이머 서열(5'->3') 서열번호
pET16-L 5'-cgtagaggatcgagatctcgatcc-3' 서열번호 75
pET-R(Par) 5'-gccttcgcacgcaccttgcctccctgtttgcctcttcctttacgaccttcgatatggccg-3' 서열번호 76
TliA-rev(Par) 5'-gggaggcaaggtgcgtgcgaaggcaaagacacgttcatccggtgtatttgactacaagaacc-3' 서열번호 77
NdeI-TliA-for 5'-cttaaggcatatgtcaactgatcagcacaccctcg-3' 서열번호 78
pET-R(Buf) 5'-cgacgcagcagacgaccaaccgggaactgcagaccagcacgacgaccttcgatatggccg-3' 서열번호 79
TliA-rev(Buf) 5'-cccggttggtcgtctgctgcgtcgtctgctgcgtcgtctgctgcgtggtgtatttgactacaagaacc-3' 서열번호 80
pET-R(B0) 5'-caaccgggaactgcagaccagcacgacgaccttcgatatggccg-3' 서열번호 81
TliA-rev(B0) 5'-gctggtctgcagttcccggttggtggtgtatttgactacaagaacc-3' 서열번호 82
pET-R(con) 5'-acgaccttcgatatggccg-3' 서열번호 83
TliA-rev(con) 5'-cggccatatcgaaggtcgtggtgtatttgactacaagaacc-3' 서열번호 84
M37-rev(Buf) 5'-cccggttggtcgtctgctgcgtcgtctgctgcgtcgtctgctgcgtgcatctccacgcgccaatgatg-3' 서열번호 85
Nde-M37-for 5'-cttaaggcatatgttataacaaacccgcgatcgca-3' 서열번호 86
M37-rev(Par) 5'-gggaggcaaggtgcgtgcgaaggcaaagacacgttcatccgcatctccacgcgccaatgatg-3' 서열번호 87
M37-rev(B0) 5'-gctggtctgcagttcccggttggtgcatctccacgcgccaatgatg-3' 서열번호 88
M37-rev(NKC) 5'-actgttgaagaaattgctgaaattacagaaaaaaggcattgcatctccacgcgccaatgatg-3' 서열번호 89
M37-rev(NRC) 5'-tctgttgcgtcgcttgctgcgtttacagaaaaaaggcattgcatctccacgcgccaatgatg-3' 서열번호 90
M37-rev(con) 5'-gcagcggccatatcgaaggtcgtgcatctccacgcgccaatg-3' 서열번호 91
실시예 1-2-1: 펩타이드 파라신 I과 리파아제 TliA가 융합된 유전자의 제작
파라신 I과 리파아제 유전자 TliA가 융합된 유전자를 만들기 위하여 pET16b 벡터(Merck biosciences)를 주형으로 하고, DNA 프라이머 pET16-L과 pET-R(Par)를 이용하여 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag와 연결된 펩타이드 유전자 단편을 PCR 증폭하였다.
또한, pHOPE 플라스미드를 주형으로 하고, 프라이머 TliA-rev(Par)와 Nde-TliA-for를 이용하여, 펩타이드 유전자 일부와 리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 PCR을 이용하여 합성하였다.
상기 증폭된 두 개의 DNA 단편을 주형으로 하여 프라이머 pET16-L과 Nde-TliA-for를 이용해 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag-파라신 I 펩타이드-리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 재조합 PCR 증폭하였다.
실시예 1-2-2: 펩타이드 부포린 IIb와 리파아제 TliA가 융합된 유전자의 제작
부포린 IIb와 리파아제 유전자 TliA가 융합된 유전자를 만들기 위하여 pET16b 벡터를 주형으로 하고, DNA 프라이머 pET16-L과 pET-R(Buf)를 이용하여 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag과 연결된 펩타이드 유전자 단편을 PCR 증폭하였다.
또한, pHOPE 플라스미드를 주형으로 하고, 프라이머 TliA-rev(Buf)와 Nde-TliA-for를 이용하여 펩타이드 유전자 일부와 리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 PCR을 이용하여 합성하였다.
상기 증폭된 두 개의 DNA 단편을 주형으로 하여 프라이머 pET16-L과 Nde-TliA-for를 이용해 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag-부포린 IIb 펩타이드-리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 재조합 PCR 증폭하였다.
실시예 1-2-3: 펩타이드 B0와 리파아제 TliA가 융합된 유전자의 제작
B0와 리파아제 유전자 TliA가 융합된 유전자를 만들기 위하여 pET16b 벡터를 주형으로 하고, DNA 프라이머 pET16-L과 pET-R(B0)를 이용하여 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag과 연결된 펩타이드 유전자 단편을 PCR 증폭하였다.
또한, pHOPE 플라스미드를 주형으로 하고, 프라이머 TliA-rev(B0)와 Nde-TliA-for를 이용하여 펩타이드 유전자 일부와 리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 PCR을 이용하여 합성하였다.
상기 증폭된 두 개의 DNA 단편을 주형으로 하여 프라이머 pET16-L과 Nde-TliA-for를 이용해 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag-B0 펩타이드-리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 재조합 PCR 증폭하였다.
실시예 1-2-4: 리파아제 TliA를 포함하는 대조군 유전자의 제작
펩타이드가 붙지 않은 대조군(T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag-리파아제 TliA) DNA를 증폭시키기 위하여, pET16b 벡터를 주형으로 하고, DNA 프라이머 pET16-L과 pET-R(con)를 이용하여 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag이 연결된 유전자 단편을 PCR 증폭하였다.
또한, pHOPE 플라스미드를 주형으로 하고, 프라이머 TliA-rev(con)와 Nde-TliA-for를 이용하여 리파아제 유전자를 포함하는 DNA 단편을 PCR을 이용하여 합성하였다.
상기 증폭된 두 개의 DNA 단편을 주형으로 하여 프라이머 pET16-L과 Nde-TliA-for를 이용해 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag-리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 재조합 PCR 증폭하였다.
실시예 1-2-5: 펩타이드 부포린 IIb와 리파아제 M37이 융합된 유전자의 제작
부포린 IIb와 M37 리파아제가 융합된 유전자를 만들기 위하여, pET16b 벡터를 주형으로 DNA 프라이머 pET16-L과 pET-R(Buf)를 이용하여 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag과 연결된 펩타이드 유전자 단편을, pEML37 플라스미드를 주형으로 프라이머 M37-rev(Buf)와 Nde-M37-for를 이용하여 펩타이드 유전자 일부와 리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 각각 PCR 증폭한 뒤, 증폭한 두 개의 DNA 단편을 주형으로 하여 프라이머 pET16-L과 Nde-M37-for를 이용해 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag-부포린 IIb-리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 재조합 PCR 증폭하였다.
실시예 1-2-6: 펩타이드 파라신 I과 리파아제 M37이 융합된 유전자의 제작
파라신 I과 M37 리파아제가 융합된 유전자를 만들기 위하여, pET16b 벡터를 주형으로 DNA 프라이머 pET16-L과 pET-R(Par)를 이용하여 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag과 연결된 펩타이드 유전자 단편을, pEML37 플라스미드를 주형으로 프라이머 M37-rev(Par)와 Nde-M37-for를 이용하여 펩타이드 유전자 일부와 리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 각각 PCR 증폭한 뒤, 증폭한 두 개의 DNA 단편을 주형으로 하여 프라이머 pET16-L과 Nde-M37-for를 이용해 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag-파라신 I-리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 재조합 PCR 증폭하였다.
실시예 1-2-7: 펩타이드 B0와 리파아제 M37이 융합된 유전자의 제작
펩타이드 B0와 M37 리파아제가 융합된 유전자를 만들기 위하여, pET16b 벡터를 주형으로 DNA 프라이머 pET16-L과 pET-R(B0)를 이용하여 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag과 연결된 펩타이드 유전자 단편을, pEML37 플라스미드를 주형으로 프라이머 M37-rev(B0)와 Nde-M37-for를 이용하여 펩타이드 유전자 일부와 리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 각각 PCR 증폭한 뒤, 증폭한 두 개의 DNA 단편을 주형으로 하여 프라이머 pET16-L과 Nde-M37-for를 이용해 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag-B0-리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 재조합 PCR 증폭하였다.
실시예 1-2-8: 펩타이드 NKC와 리파아제 M37이 융합된 유전자의 제작
NKC와 M37 리파아제가 융합된 유전자를 만들기 위하여, pET16b 벡터를 주형으로 DNA 프라이머 pET16-L과 pET-R(NKC)를 이용하여 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag과 연결된 펩타이드 유전자 단편을, pEML37 플라스미드를 주형으로 프라이머 M37-rev(NKC)와 Nde-M37-for를 이용하여 펩타이드 유전자 일부와 리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 각각 PCR 증폭한 뒤, 증폭한 두 개의 DNA 단편을 주형으로 하여 프라이머 pET16-L과 Nde-M37-for를 이용해 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag-NKC-리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 재조합 PCR 증폭하였다.
실시예 1-2-9: 펩타이드 NRC와 리파아제 M37이 융합된 유전자의 제작
NRC와 M37 리파아제가 융합된 유전자를 만들기 위하여, pET16b 벡터를 주형으로 DNA 프라이머 pET16-L과 pET-R(NRC)를 이용하여 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag과 연결된 펩타이드 유전자 단편을, pEML37 플라스미드를 주형으로 프라이머 M37-rev(NRC)와 Nde-M37-for를 이용하여 펩타이드 유전자 일부와 리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 각각 PCR 증폭한 뒤, 증폭한 두 개의 DNA 단편을 주형으로 하여 프라이머 pET16-L과 Nde-M37-for를 이용해 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag-NRC-리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 재조합 PCR 증폭하였다.
실시예 1-2-10: 리파아제 M37을 포함하는 대조군 유전자의 제작
펩타이드가 붙지 않은 대조군(T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag-리파아제 M37) DNA를 증폭시키기 위하여, pET16b 벡터를 주형으로 DNA 프라이머 pET16-L과 pET-R(NRC)를 이용하여 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag과 연결된 펩타이드 유전자 단편을 증폭하고, pEML37 플라스미드를 주형으로 프라이머 M37-rev(con)와 Nde-M37-for를 이용하여 리파아제 유전자를 PCR 증폭한 뒤, 증폭한 두 개의 DNA 단편을 주형으로 하여 프라이머 pET16-L과 Nde-M37-for를 이용해 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag- M37 리파아제 유전자가 결합된 DNA 단편을 PCR 증폭하였다.
실시예 1-3: 펩타이드와 리파아제 융합 단백질의 발현 플라스미드 제작
상기 실시예 1-2에서 제작된 각 T7 프로모터-리보좀 결합부위-His tag-펩타이드-리파아제 결합 DNA를 제한효소 BglII와 NdeI을 이용하여 자르고, BglII와 NdeI을 이용하여 잘린 pET16b 벡터에 클로닝하였다(도 2). 도 2는 활성이 증대된 리파아제를 발현하기 위한 벡터의 유전자 구조도로서, 리파아제 유전자의 아미노말단(N-terminus)에 조건발현 프로모터(conditional promoter) 하위에 양친매성 펩타이드 유전자를 융합시키고 발현된 단백질의 순수분리를 위해서 펩타이드의 앞쪽에 히스티딘 태그(histidine-tag)를 융합시키고 발현 및 순수분리 이후 히스티딘 태그를 제거하기 위해 히스티딘 태그와 펩타이드 유전자 사이에 단백질 분해효소 Factor Xa 인식부위를 삽입하여, 니켈 칼럼(Ni-column)에 결합하여 분리한 히스티딘 태그-펩타이드-리파아제 구조의 단백질에 Factor Xa 효소를 처리하여 양친매성 펩타이드-리파아제 구조의 원하는 단백질을 순수 분리 하도록 하였다. 그리고 이러한 유전자를 조건발현용 프로모터 하위에 둬, 우리가 원하는 조건에서 양친매성 펩타이드와 융합되어 활성이 증대된 리파아제가 발현되도록 하였다.
상기 클로닝된 플라스미드를 대장균 XL1-Blue(invitrogen 사에서 구매)에 도입하여 형질전환시키고, 항생제 암피실린을 포함하는 LB 평판배지에서 선별하였다. 정확한 플라스미드 제작을 확인하기 위하여 평판배지 상에서 자라는 콜로니에서 플라스미드를 분리한 다음 제한효소 BglII와 NdeI을 이용하여 DNA 단편의 크기를 확인하고 DNA 염기서열 분석을 통하여 정확하게 검증하였다.
이에 따라, 각각의 TliA 리파아제(대조군), 파라신 I-TliA 리파아제, 부포린 IIb-TliA 리파아제, B0-TliA 리파아제, M37 리파아제(대조군), 파라신 I-M37 리파아제, 부포린 IIb-M37 리파아제, B0-M37 리파아제, NKC-M37 리파아제, NRC-M37 리파아제를 발현하기 위하여 완성된 플라스미드를 각각 pET-TliA, pET-Par-TliA, pET-Buf-TliA, pET-B0-TliA, pET-M37, pET-Par-M37, pET-Buf-M37, pET-B0-M37, pET-NKC-M37 및 pET-NRC-M37로 명명하였다.
실시예 2: 펩타이드 -리파아제 융합 단백질의 분리 및 효소 활성 분석
실시예 2-1: 펩타이드 -리파아제 융합 단백질의 발현
펩타이드-리파아제 융합 단백질을 발현하기 위해 앞서 제조한 플라스미드를 전기천공법(electroporation)을 통해 E. coli BL21(DE3)(Merck biosciences)에 도입하고, 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다. 37℃ LB 액체 배지에 접종한 후, 600nm의 파장에서 흡광도가 0.4일 때까지 키우고, 1mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 넣어 펩타이드가 결합된 리파아제의 발현을 유도하였다. 4시간 후 대장균을 수확한 다음, 10% SDS-PAGE로 발현 여부를 확인하였다. 그 다음, Bradford 분석법을 이용하여 단백질의 농도를 측정하였다.
그 결과, 펩타이드-리파아제 융합 단백질은 대장균에서 봉입체(inclusion body)의 형태로 발현되는 것을 확인하였다(도 3). 도 3은 본 발명에서 발현된 펩타이드-리파아제 TliA 융합단백질 발현양상을 나타내는 SDS-PAGE 사진으로서, M번 레인은 단백질 크기 마커(size marker)를 나타내고, 1 내지 4번 레인은 각각 IPTG로 유도되지 않은 세포의 파쇄액, IPTG로 유도된 세포의 파쇄액, IPTG로 유도된 세포의 용해 상층액 부분 및 IPTG로 유도된 세포의 봉입체 부분을 나타낸다. 여기서 Par은 파라신 I을, Buf는 부포린 IIb를 나타내는 것이다.
실시예 2-2: 펩타이드 -리파아제 융합 단백질의 분리
재조합 단백질을 분리하기 위하여 배양한 대장균을 용해 완충용액(50 mM NaH2PO4, 300mM NaCl, pH 8.0)에 현탁시키고 초음파로 분쇄하였다(520초, 0.5싸이클, 50% amplitude). 초음파로 분쇄한 파쇄액을 4℃, 12,000rpm에서 20분간 원심분리하여 용해 상층액(soluble supernatant)과 봉입체(inclusion body)를 포함하는 비용해 부분으로 나눴다. 비용해 부분에 존재하는 펩타이드-리파아제 융합 단백질을 세정완충용액(100mM NaH2PO4, 10mM Tris-Cl, 8M urea, pH 6.3)에 녹이고, 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거했다. 원심분리 후, NTA(Ni2 +nitriloacetic acid) 아가로스 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 상층액 속의 펩타이드-리파아제 융합 단백질을 분리하고, 세포막 투석(dialysis)을 통하여 남아있는 요소를 제거했다. 융합 단백질 분리에 사용된 His Tag을 제거하기 위해서 Factor Xa 효소(New England Biolab, USA)를 이용하였고, 순수 분리된 단백질을 10% SDS-PAGE에서 확인하고 N-말단 아미노산 염기서열을 분석하여 확인하였다.
실시예 2-3: 펩타이드 -리파아제 융합 단백질의 리파아제 활성 측정
실시예 2-3-1: 파라니트로페닐 팔미테이트를 이용한 리파아제의 활성 측정
리파아제의 활성은 일차적으로 파라니트로페닐 팔미테이트(p-nitrophenyl palmitate)의 발색반응을 이용하여 측정하였다. 10mM의 농도로 아세토나이트릴(acetonitrile)에 녹인 파라니트로페닐 팔미테이트 용액과 에탄올, 50mM Tris-HCl 용액(pH 8.5)을 1:4:95의 비율로 섞어 사용하였다. 파라니트로페닐 팔미테이트를 포함하는 용액 0.8㎖에 0.2㎖의 융합 단백질 용액을 혼합한 뒤, 45℃에서 10분간 반응하고 405nm에서 흡광도를 측정한 다음, 그 결과를 도 4 및 도 6에 각각 나타내었다. 도 4는, 본 발명의 양친매성 펩타이드를 융합시킨 TliA 리파아제의 지질분해활성을 리파아제 반응 시 발색하는 파라니트로페닐 팔미테이트를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 6은 본 발명의 양친매성 펩타이드를 융합시킨 M37 리파아제의 지질분해활성을 리파아제 반응시 발색하는 파라니트로페닐 팔미테이트를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
그 결과, 파라신 I이 융합된 파라신-TliA 융합 리파아제(Par-lip)는 상온에서도 반응 최적온도인 45℃에서와 비슷한 활성을 나타냄을 확인하였으며, 파라신 I과 B0가 각각 융합된 TliA의 경우 대조군에 비하여, 45℃에서 활성이 약 10% 증가함을 확인하였다(도 4). 또한, 도 6에서 보듯이, B0가 융합된 M37 리파아제(B0-M37), 부포린 IIb가 융합된 M37 리파아제(Buf-M37), NKC가 융합된 M37 리파아제(NKC-M37), NRC가 융합된 M37 리파아제(NRC-M37) 및 파라신 I이 융합된 M37 리파아제(Par-M37) 각각은 대조군에 비하여 4.2배, 2.7배, 6.3배, 1.3배 및 1.2배 증가함을 나타내었다. 상기와 같은 결과들은, 양친매성 펩타이드를 융합시킨 본 발명의 리파아제는 양친매성 펩타이드를 융합시키지 않은 리파아제에 비하여 뛰어난 리파아제 활성을 나타낼 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
실시예 2-3-2: 올리브유 가수분해를 이용한 리파아제의 활성 측정
리파아제의 활성을 보다 정량적으로 측정하기 위해서 리파아제에 의한 올리브유의 가수분해 후 유리되는 지방산의 양을 측정하였다. 올리브유 에멀션(emulsion)은 20mM NaCl, 1mM CaCl2, 0.5%(w/v) 아라비아 고무(gum arabic) 용액 450㎖에 5㎖의 올리브유를 넣고 워어링 혼합기(Waring blender)에서 최고 속도로 2분간 유탁시켜 준비하고, 10mM NaOH 용액을 이용하여 pH를 8.0이 되도록 맞추고, 상기 올리브유 에멀션(emulsion)에 리파아제를 넣어 유리되는 지방산의 양을 pH 적정기(718 Stat Titrino, Metrohm)를 이용하여 50℃에서 5분간 측정하였고 그 결과를 각각 도 5 및 도 7에 나타내었다. 도 5는 본 발명에 따라 제조된 TliA 리파아제의 지질분해활성 증대를 pH-STAT으로 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 7은 본 발명에 따라 제조된 M37 리파아제의 지질분해활성 증대를 pH-STAT으로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, B0-TliA, Par-TliA, Buf-TliA 융합 단백질의 경우, TliA에 비해서 그 활성이 각각 78±11.3배, 68.5±2.1배, 35.5±19.1배 증가함을 알 수 있었다. 또한, 도 7에서 보듯이, B0-M37, Buf-M37, NKC-M37, NRC-M37, Par-M37 융합 단백질의 경우 M37에 비해 그 활성이 각각 2.8배, 4.2배, 10.2배, 4.1배, 2.2배 증가함을 알 수 있었다.
이러한 결과는 양친매성 펩타이드를 융합시킨 본 발명의 리파아제는 양친매성 펩타이드를 융합시키지 않은 리파아제에 비해 뛰어난 지질 분해 활성을 나타낼 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
실시예 3: 펩타이드 NKC가 융합된 M37 리파아제( NKC -M37)의 지질 기질(lipid substrates)에 대한 접근성 증대 확인
M37 리파아제의 활성 부위(active site)는 리드 나선(Lid helix, α3)에 가려져 있으며, M37 리파아제의 리드 부위 주변에 위치한 대부분의 소수성 잔기(Ile97, Trp100, Leu101, and Phe102)는 숨겨져 있으며, 활성 부위 주변에 위치해있다. 이러한 사실들은 기질이 리파아제에 결합하게 되면 상기와 같은 소수성 잔기들이 노출되어 넓은 소수성 표면(wide hydrophobic surface)을 형성할 것이라는 것을 시사하는 것으로 소수성 기질들이 M37 리파아제의 활성 부위로 접근하기 위해서는 어느정도의 구조 변화(conformational change)가 필요하다. 본 발명에서는 양친매성 펩타이드인 NKC를 M37 리파아제에 접합(conjugation)시켰으므로, 소수성 기질들이 상기 리파아제의 활성 부위로 접근하기 용이한 상태가 되며, 상기 효소와 기질 간의 친화도(affinity)도 증대될 수 있다. 상기와 같은 점을 입증하기 위하여, 야생형 M37 리파아제와 NKC가 융합된 M37 리파아제(NKC-M37 리파아제) 각각에 GFP를 융합시킨 GFP 하이브리드(GFP hybrid)를 제작하였고, 상기 리파아제의 지질 입자 내의 위치를 확인하였다(도 8).
형광 현미경 관찰 결과, NKC-M37 리파아제의 경우, 야생형 M37 리파아제에 비하여 지질 입자 내에 위치한 정도가 훨씬 컸다. 이러한 결과는, NKC와 같은 양친매성 펩타이드가 리파아제의 기능적인 형태를 형성하는 데 있어 필수적인 것임을 나타내는 결과이다.
실시예 4: 메탄올에 대한 M37 리파아제의 안정성에 미치는 양친매성 펩타이 드의 효과 확인
메탄올은 바이오디젤 생산 과정에 있어 효소 기질일 뿐만 아니라, 용매로서도 기능한다. 그러나 일반적인 리파아제(general lipase)들은 높은 농도의 메탄올 배지에서 불안정하기 때문에, 바이오디젤의 생산량은 상대적으로 제한되어 있다. 트리글리세라이드 1 당량(1 molar equivalent)을 그에 해당되는 메틸 에스터로 완전히 전화시키기 위해서는 적어도 3 당량의 메탄올이 필요하다. 그러나, 일반적인 리파아제들은 오일에 대해 1 당량의 메탄올(3.3% v/v) 이상을 포함하는 배지에서는 불활성화된다. 따라서, 바이오디젤 생산 과정은 리파아제의 불활성화를 방지하기 위하여 메탄올을 여러 단계로 추가하며 수행된다.
M37 리파아제는 높은 농도의 메탄올에서도 높은 안정도를 보이는 것으로 보고된 바 있다. 1 단계 메탄올 공급 방법(1-stepwise methanol feeding method, 3 molar equivalents)을 사용하였을 때, M37 리파아제는 70%의 전환 수율을 보인 반면, 칸디다 안탁티카(Candida antarctica) 리파아제 B인 CalB 리파아제는 매우 극 소량의 오일만을 바이오디젤로 전환시켰다.
이와 같이 높은 농도의 메탄올에서도 높은 안정도를 나타내는 M37 리파아제에 양친매성 펩타이드를 결합시키는 경우, 그 수율이 보다 증진될 수 있는지 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
양친매성 펩타이드 중 하나인 NKC 펩타이드를 융합시킨 NKC-M37 리파아제를 사용하여 높은 농도의 메탄올에서도 안정도를 나타내는지 확인하였다. 상기 안정도 확인은 메탄올 처리후 남아있는 활성을 측정함으로써 결정하였다. CalB 리파아제, 야생형 M37 리파아제 및 NKC-M37 리파아제의 안정도를 4℃ 및 40℃에서 0%, 3.3%, 5% 및 10% 메탄올 용액에서 12시간 동안 반응시킨 후 측정하였다.
그 결과, 야생형 M37 리파아제 및 NKC-M37 리파아제는 4℃의 온도에서 3.3%, 5% 및 10% 메탄올 용액에서도 그 활성을 유지하였다. 에스테르 교환반응에서 사용되는 실제 온도인 40℃에서 메탄올에 대한 리파아제의 안정도를 측정하였을 때, NKC-M37 리파아제는 야생형 M37 리파아제에 비하여 10%의 메탄올 용액에서 안정도가 약간 감소되었으나, CalB 리파아제의 경우 빠르게 불활성화되는 결과를 나타내었다(도 9). 이러한 결과는 본 발명의 NKC-M37 리파아제는 야생형 M37 리파아제와 같이 메탄올에서 매우 안정함을 나타내는 결과로서, 본 발명의 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체가 바이오디젤의 생산에 효율적으로 사용될 수 있음을 시사하는 결과이다.
실시예 5: 펩타이드 NKC가 융합된 M37 리파아제를 이용한 바이오디젤 생산
도 7에 나타낸 바와 같이, NKC-M37 리파아제는 야생형 M37 리파아제에 비하여 10배 높은 촉매 활성(catalytic activity)를 나타낸다. 이러한 사실은 NKC와 같은 양친매성 펩타이드가 리파아제와 지질 기질 간의 접근성을 높임으로써 M37 리파아제의 촉매 증진시키는 데 매우 효과적임을 나타내는 것이다. 이러한 점에서, 촉매 활성이 증대된 NKC-M37 리파아제를 사용하여 바이오디젤 생산 과정 및 올리브 오일의 에스테르 교환 과정을 수행하였다.
바이오디젤 생산을 위해서, 반응 플라스크에서 오일/메탄올을 화학양론적 몰비로 반응시키고, 교반하여 반응 온도를 증가시킨다. 보통, 리파아제들은 오일 대비 메탄올을 1 당량 이상을 포함하는 혼합물에서 혼합시키는 경우, 불활성화된다. 따라서, 상기에서 설명한 바와 같이 바이오디젤 과정은 메탄올을 수회 추가하여 반응시킴으로써 수행된다. 다만, 상기 실시예 4에 나타낸 결과와 같이, 야생형 M37 리파아제 및 NKC-M37 리파아제는 메탄올 3 당량 존재하에서도 안정하였다.
첫 번째로, 3 단계 메탄올 공급 방법(1 당량)을 사용하여 바이오디젤 생산을 확인하였다. 생산된 바이오디젤의 양은 가스 크로마토그래피 및 박층 크로마토크래피 방법을 사용하여 분석하였다(도 10 a).
*박층 크로마토그래피 분석 결과, 올리브 오일의 대부분은 바이오디젤로 전환되는 결과를 보였다. 도 10에는 야생형 M37 리파아제 및 NKC-M37 리파아제에 대한 95% 전환에 도달하는 시간을 나타내었다. 가스 크로마토그래피 분석 결과, 야생형 M37 리파아제를 사용하여 바이오디젤 생산을 보았을 때, 36시간에서 95%의 전환 수율을 나타낸 반면, 본 발명의 NKC-M37 리파아제는 단 15시간 만에 95%의 전환 수율을 나타내었다(도 10 a). 이러한 결과는 본 발명의 양친매성 펩타이드를 융합시킨 리파아제가 바이오디젤의 경제적이면서 효과적인 생산에 이용될 수 있음을 시사하는 결과이다.
상기에서 기술한 바와 같이, 효소적인 바이오디젤 생산 과정(Enzymatic biodisel production process)은 메탄올에 대한 리파아제의 낮은 허용도(low tolerance)를 이유로 주로 3 단계 메탄올 공급 방법이 사용된다. 다만, 경제적인 바이오디젤 생산을 위해서는 2 단계 메탄올 공급 방법이 더욱 유리하므로, 2 단계 메탄올 공급 방법을 사용하여 바이오디젤 생산을 확인하였다. 2 단계 메탄올(2 당량) 공급 방법을 사용하였을 때, 본 발명의 매우 향상된 촉매 활성을 나타내는 NKC-M37 리파아제는 21시간 만에 90% 이상의 높은 전환 수율을 나타낸 반면, 야생형 M37 리파아제는 48시간 만에 같은 수율에 도달했다(도 10 b). 이러한 결과는 본 발명의 양친매성 펩타이드가 융합된 리파아제가 야생형 리파아제에 비하여 매우 효과적인 촉매제(catalyst)임을 나타내는 결과이다. 또한, 더욱 경제적인 1 단계 메탄올 공급방법을 사용하여 바이오디젤 생산을 확인한 결과, 야생형 M37 리파아제보다 본 발명의 대표적인 결합체인 NKC-M37 리파아제가 최대 전환 수율에 훨씬 빠르게 도달하는 결과를 나타내었다(도 10 c).
또한, 바이오디젤에 드는 경비는 대개 공급 원료(feedstock) 가격에 따라 달라진다. 공급 원료 가격은 바이오디젤 생산비에 있어 70% 이상을 차지하는 것으로 알려져 있다. 높은 생산비가 드는 경우, 매우 낮은 상용성을 지니므로, 바이오디젤 가격이 석유디젤에 비하여 경쟁력을 갖추게 하기 위하여 쿠킹오일 폐기물, 우지(beef tallow), 돼지 라드(pork lard) 및 옐로우 그리이스(yellow grease)와 같은 낮은 가격의 공급 원료를 사용하기 위한 연구들이 진행 중이다. 그러나, 오일 폐기물 등을 사용하는 경우, 오일 폐기물 내에 포함되어 있는 불순물, 유리 지방산 및 함수량때문에, 바이오디젤 생산량이 급격히 감소되게 된다. M37 리파아제는 오일 폐기물 내에 있는 유리 지방산 및 함수량에 영향을 받지 않는 새로운 리파아제로 보고된 바 있어, 본 발명은 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체도 이러한 효과를 지니는 지 확인하였다. 오일 폐기물을 기질로 하여 NKC-M37 리파아제를 사용하였을 때, 올리브 오일 및 팜유와 비슷한 정도의 바이오디젤이 생산되는 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 본 발명의 NKC-M37 리파아제를 바이오디젤 생산에 있어 굉장한 효과를 지닌 리파아제로써 사용할 수 있음을 시사하는 결과이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범 위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Intelligent Synthetic Biology Center <120> Amphipathic peptide-lipase conjugate having advanced lipase activity and use thereof <130> PA120765KR-D1 <150> 10-2011-0079609 <151> 2011-08-10 <160> 91 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Buforin IIb <400> 1 Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu 1 5 10 15 Arg Arg Leu Leu Arg 20 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B0 <400> 2 Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly 1 5 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Paracin I <400> 3 Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr 1 5 10 15 Arg Ser Ser <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NKC <400> 4 Ala Pro Lys Ala Met Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Gln Lys 1 5 10 15 Lys Gly Ile <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NRC <400> 5 Ala Pro Lys Ala Met 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Buforin IIb - lipase M37 - Buforin IIb <400> 70 cgtgctggtc tgcagttccc ggttggtcgt ctgctgcgtc gtctgctgcg tcgtctgctg 60 cgtatgtctt atacaaaaga acaactcatg ttggcattca gctatatgag ctactatggc 120 atcactcaca caggttcagc aaaaaaaaat gctgagctca tccttaaaaa aatgaaagaa 180 gccttgaaaa catggaagcc ttttcaggaa gatgactggg aagtcgtctg gggtcctgcg 240 gtttatacca tgcctttcac aatcttcaac gatgccatga tgtatgtcat acagaagaaa 300 ggtgctgaag gggaatacgt gatagccatt cgcggcacca atccagtatc aatttcagac 360 tggctgttta atgatttcat ggtcagcgca atgaagaagt ggccttacgc atccgttgaa 420 ggccgcatac tcaaaatatc cgaaagtacc agctacggac tgaaaacctt acagaaattg 480 aagccaaaat cccatatccc cggcgaaaat aaaacgattc tgcagttcct gaatgaaaag 540 ataggcccag agggtaaagc aaaaatctgt gtaacaggcc acagtaaagg cggcgccttg 600 tcttccactc tggcactgtg gttgaaggac atccaaggag taaaactctc gcaaaacatc 660 gatatctcaa cgattccgtt tgccggacca acagccggta atgctgactt tgccgattac 720 tttgatgatt gtcttggtga tcaatgcacc cgcattgcca actcgttaga tattgtgcct 780 tatgcctgga ataaaattca ttaaaaaaac ttaaatctat atatatttct gaacaagcat 840 cagttaaacc gcttctatat caacgcgctt taatccgtgc aatgatcgca gaaactaaag 900 gtaaaaaata caagcaaatt aaggcggaaa caccaccatt agaaggcaac attaatccta 960 ttcttattga ataccttgtg caggcagcat atcagcatgt cgtcggttac ccagaattaa 1020 tgggtatgat ggatgatatt cctttaacag acatattcga agatgcgatc gcgggtttgt 1080 tataacgtgc tggtctgcag ttcccggttg gtcgtctgct gcgtcgtctg ctgcgtcgtc 1140 tgctgcgt 1148 <210> 71 <211> 1076 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B0 - lipase M37 - B0 <400> 71 cgtgctggtc tgcagttccc ggttggtatg tcttatacaa aagaacaact catgttggca 60 ttcagctata tgagctacta tggcatcact cacacaggtt cagcaaaaaa aaatgctgag 120 ctcatcctta aaaaaatgaa agaagccttg aaaacatgga agccttttca ggaagatgac 180 tgggaagtcg tctggggtcc tgcggtttat accatgcctt tcacaatctt caacgatgcc 240 atgatgtatg tcatacagaa gaaaggtgct gaaggggaat acgtgatagc cattcgcggc 300 accaatccag tatcaatttc agactggctg tttaatgatt tcatggtcag cgcaatgaag 360 aagtggcctt acgcatccgt tgaaggccgc atactcaaaa tatccgaaag taccagctac 420 ggactgaaaa ccttacagaa attgaagcca aaatcccata tccccggcga aaataaaacg 480 attctgcagt tcctgaatga aaagataggc ccagagggta aagcaaaaat ctgtgtaaca 540 ggccacagta aaggcggcgc cttgtcttcc actctggcac tgtggttgaa ggacatccaa 600 ggagtaaaac tctcgcaaaa catcgatatc tcaacgattc cgtttgccgg accaacagcc 660 ggtaatgctg actttgccga ttactttgat gattgtcttg gtgatcaatg cacccgcatt 720 gccaactcgt tagatattgt gccttatgcc tggaataaaa ttcattaaaa aaacttaaat 780 ctatatatat ttctgaacaa gcatcagtta aaccgcttct atatcaacgc gctttaatcc 840 gtgcaatgat cgcagaaact aaaggtaaaa aatacaagca aattaaggcg gaaacaccac 900 cattagaagg caacattaat cctattctta ttgaatacct tgtgcaggca gcatatcagc 960 atgtcgtcgg ttacccagaa ttaatgggta tgatggatga tattccttta acagacatat 1020 tcgaagatgc gatcgcgggt ttgttataac gtgctggtct gcagttcccg gttggt 1076 <210> 72 <211> 1136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Paracin I - lipase M37 - Paracin I <400> 72 aaaggaagag gcaaacaggg aggcaaggtg cgtgcgaagg caaagacacg ttcatccatg 60 tcttatacaa aagaacaact catgttggca ttcagctata tgagctacta tggcatcact 120 cacacaggtt cagcaaaaaa aaatgctgag ctcatcctta aaaaaatgaa agaagccttg 180 aaaacatgga agccttttca ggaagatgac tgggaagtcg tctggggtcc tgcggtttat 240 accatgcctt tcacaatctt caacgatgcc atgatgtatg tcatacagaa gaaaggtgct 300 gaaggggaat acgtgatagc cattcgcggc accaatccag tatcaatttc agactggctg 360 tttaatgatt tcatggtcag cgcaatgaag aagtggcctt acgcatccgt tgaaggccgc 420 atactcaaaa tatccgaaag taccagctac ggactgaaaa ccttacagaa attgaagcca 480 aaatcccata tccccggcga aaataaaacg attctgcagt tcctgaatga aaagataggc 540 ccagagggta aagcaaaaat ctgtgtaaca ggccacagta aaggcggcgc cttgtcttcc 600 actctggcac tgtggttgaa ggacatccaa ggagtaaaac tctcgcaaaa catcgatatc 660 tcaacgattc cgtttgccgg accaacagcc ggtaatgctg actttgccga ttactttgat 720 gattgtcttg gtgatcaatg cacccgcatt gccaactcgt tagatattgt gccttatgcc 780 tggaataaaa ttcattaaaa aaacttaaat ctatatatat ttctgaacaa gcatcagtta 840 aaccgcttct atatcaacgc gctttaatcc gtgcaatgat cgcagaaact aaaggtaaaa 900 aatacaagca aattaaggcg gaaacaccac cattagaagg caacattaat cctattctta 960 ttgaatacct tgtgcaggca gcatatcagc atgtcgtcgg ttacccagaa ttaatgggta 1020 tgatggatga tattccttta acagacatat tcgaagatgc gatcgcgggt ttgttataaa 1080 aaggaagagg caaacaggga ggcaaggtgc gtgcgaaggc aaagacacgt tcatcc 1136 <210> 73 <211> 1136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKC - lipase M37 - NKC <400> 73 gcgccgaaag cgatgaaact gttgaagaaa ttgctgaaat tacagaaaaa aggcattatg 60 tcttatacaa aagaacaact catgttggca ttcagctata tgagctacta tggcatcact 120 cacacaggtt cagcaaaaaa aaatgctgag ctcatcctta aaaaaatgaa agaagccttg 180 aaaacatgga agccttttca ggaagatgac tgggaagtcg tctggggtcc tgcggtttat 240 accatgcctt tcacaatctt caacgatgcc atgatgtatg tcatacagaa gaaaggtgct 300 gaaggggaat acgtgatagc cattcgcggc accaatccag tatcaatttc agactggctg 360 tttaatgatt tcatggtcag cgcaatgaag aagtggcctt acgcatccgt tgaaggccgc 420 atactcaaaa tatccgaaag taccagctac ggactgaaaa ccttacagaa attgaagcca 480 aaatcccata tccccggcga aaataaaacg attctgcagt tcctgaatga aaagataggc 540 ccagagggta aagcaaaaat ctgtgtaaca ggccacagta aaggcggcgc cttgtcttcc 600 actctggcac tgtggttgaa ggacatccaa ggagtaaaac tctcgcaaaa catcgatatc 660 tcaacgattc cgtttgccgg accaacagcc ggtaatgctg actttgccga ttactttgat 720 gattgtcttg gtgatcaatg cacccgcatt gccaactcgt tagatattgt gccttatgcc 780 tggaataaaa ttcattaaaa aaacttaaat ctatatatat ttctgaacaa gcatcagtta 840 aaccgcttct atatcaacgc gctttaatcc gtgcaatgat cgcagaaact aaaggtaaaa 900 aatacaagca aattaaggcg gaaacaccac cattagaagg caacattaat cctattctta 960 ttgaatacct tgtgcaggca gcatatcagc atgtcgtcgg ttacccagaa ttaatgggta 1020 tgatggatga tattccttta acagacatat tcgaagatgc gatcgcgggt ttgttataag 1080 cgccgaaagc gatgaaactg ttgaagaaat tgctgaaatt acagaaaaaa ggcatt 1136 <210> 74 <211> 1136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRC - lipase M37 - NRC <400> 74 gcgccgaaag cgatgcgtct gttgcgtcgc ttgctgcgtt tacagaaaaa aggcattatg 60 tcttatacaa aagaacaact catgttggca ttcagctata tgagctacta tggcatcact 120 cacacaggtt cagcaaaaaa aaatgctgag ctcatcctta aaaaaatgaa agaagccttg 180 aaaacatgga agccttttca ggaagatgac tgggaagtcg tctggggtcc tgcggtttat 240 accatgcctt tcacaatctt caacgatgcc atgatgtatg tcatacagaa gaaaggtgct 300 gaaggggaat acgtgatagc cattcgcggc accaatccag tatcaatttc agactggctg 360 tttaatgatt tcatggtcag cgcaatgaag aagtggcctt acgcatccgt tgaaggccgc 420 atactcaaaa tatccgaaag taccagctac ggactgaaaa ccttacagaa attgaagcca 480 aaatcccata tccccggcga aaataaaacg attctgcagt tcctgaatga aaagataggc 540 ccagagggta aagcaaaaat ctgtgtaaca ggccacagta aaggcggcgc cttgtcttcc 600 actctggcac tgtggttgaa ggacatccaa ggagtaaaac tctcgcaaaa catcgatatc 660 tcaacgattc cgtttgccgg accaacagcc ggtaatgctg actttgccga ttactttgat 720 gattgtcttg gtgatcaatg cacccgcatt gccaactcgt tagatattgt gccttatgcc 780 tggaataaaa ttcattaaaa aaacttaaat ctatatatat ttctgaacaa gcatcagtta 840 aaccgcttct atatcaacgc gctttaatcc gtgcaatgat cgcagaaact aaaggtaaaa 900 aatacaagca aattaaggcg gaaacaccac cattagaagg caacattaat cctattctta 960 ttgaatacct tgtgcaggca gcatatcagc atgtcgtcgg ttacccagaa ttaatgggta 1020 tgatggatga tattccttta acagacatat tcgaagatgc gatcgcgggt ttgttataag 1080 cgccgaaagc gatgcgtctg ttgcgtcgct tgctgcgttt acagaaaaaa ggcatt 1136 <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pET16-L <400> 75 cgtagaggat cgagatctcg atcc 24 <210> 76 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pET-R(Par) <400> 76 gccttcgcac gcaccttgcc tccctgtttg cctcttcctt tacgaccttc gatatggccg 60 60 <210> 77 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer TliA-rev(Par) <400> 77 gggaggcaag gtgcgtgcga aggcaaagac acgttcatcc ggtgtatttg actacaagaa 60 cc 62 <210> 78 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer NdeI-TliA-for <400> 78 cttaaggcat atgtcaactg atcagcacac cctcg 35 <210> 79 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pET-R(Buf) <400> 79 cgacgcagca gacgaccaac cgggaactgc agaccagcac gacgaccttc gatatggccg 60 60 <210> 80 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer TliA-rev(Buf) <400> 80 cccggttggt cgtctgctgc gtcgtctgct gcgtcgtctg ctgcgtggtg tatttgacta 60 caagaacc 68 <210> 81 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pET-R(B0) <400> 81 caaccgggaa ctgcagacca gcacgacgac cttcgatatg gccg 44 <210> 82 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer TliA-rev(B0) <400> 82 gctggtctgc agttcccggt tggtggtgta tttgactaca agaacc 46 <210> 83 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pET-R(con) <400> 83 acgaccttcg atatggccg 19 <210> 84 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer TliA-rev(con) <400> 84 cggccatatc gaaggtcgtg gtgtatttga ctacaagaac c 41 <210> 85 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer M37-rev(Buf) <400> 85 cccggttggt cgtctgctgc gtcgtctgct gcgtcgtctg ctgcgtgcat ctccacgcgc 60 caatgatg 68 <210> 86 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Nde-M37-for <400> 86 cttaaggcat atgttataac aaacccgcga tcgca 35 <210> 87 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer M37-rev(Par) <400> 87 gggaggcaag gtgcgtgcga aggcaaagac acgttcatcc gcatctccac gcgccaatga 60 tg 62 <210> 88 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer M37-rev(B0) <400> 88 gctggtctgc agttcccggt tggtgcatct ccacgcgcca atgatg 46 <210> 89 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer M37-rev(NKC) <400> 89 actgttgaag aaattgctga aattacagaa aaaaggcatt gcatctccac gcgccaatga 60 tg 62 <210> 90 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer M37-rev(NRC) <400> 90 tctgttgcgt cgcttgctgc gtttacagaa aaaaggcatt gcatctccac gcgccaatga 60 tg 62 <210> 91 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer M37-rev(con) <400> 91 gcagcggcca tatcgaaggt cgtgcatctc cacgcgccaa tg 42

Claims (18)

  1. 양친매성 펩타이드 및 리파아제가 연결된 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체를 포함하는, 양친매성 펩타이드 비결합 리파아제 대비, 리파아제의 기질 친화도 개선용 조성물로서,
    상기 양친매성 펩타이드는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 부포린 IIb, 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 펩타이드, 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 파라신 I, 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 펩타이드, 및 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이며, 상기 리파아제는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 유래의 리파아제 TliA(thermostable lipase) 또는 포토박테리움 리포리티쿰(Photobacterium lipolyticum) 유래의 리파아제 M37인 것이고, 상기 양친매성 펩타이드는 리파아제의 C-말단에 위치한 것으로서, 상기 결합체는 서열번호 18 내지 37로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 정의되는 것인,
    리파아제의 기질 친화도 개선용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 TliA는 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 리파아제이고, M37은 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 리파아제인 것인 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 양친매성 펩타이드와 리파아제는 링커(linker)에 의해 연결된 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 링커는 비펩타이드성 링커 또는 펩타이드성 링커인 것인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독 중합체, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물.
  10. 삭제
  11. 제1항, 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물에 포함된 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 삭제
  13. 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  14. 제13항의 발현벡터가 도입된 형질전환체.
  15. (a) 제14항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 형질전환체 또는 이의 배양액으로부터 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체를 회수하여 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체를 준비하는 단계를 포함하는,
    양친매성 펩타이드-리파아제 결합체를 포함하는, 리파아제의 기질 친화성 개선용 조성물의 제조방법.
  16. 삭제
  17. 제1항, 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물과 지질을 반응시키는 단계를 포함하는, 지질의 분해방법.
  18. 제1항, 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물과 유지 및 알코올을 반응시키는 단계를 포함하는, 바이오디젤의 생산방법.
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