KR101741873B1

KR101741873B1 - 활성이 증진된 에스터라제 융합단백질

Info

Publication number: KR101741873B1
Application number: KR1020140034170A
Authority: KR
Inventors: 박진병; 이영아; 전은영
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2014-03-24
Filing date: 2014-03-24
Publication date: 2017-06-01
Also published as: KR20150111455A

Abstract

본 발명은 막결합 단백질로부터 유래된 막결합에 관여하는 소수성 도메인이 에스터라제의 N-말단에 융합된 형태의 에스터라제 융합단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합단백질 발현용 벡터, 상기 벡터가 도입되어, 상기 융합단백질을 제조할 수 있는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 에스터라제 융합단백질은 장쇄지방산을 보다 효과적으로 분해하여 ω-하이드록시 지방산의 제조수율을 향상시킬 수 있으므로, ω-하이드록시 지방산의 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

활성이 증진된 에스터라제 융합단백질{Novel esterase fusion protein with improved activity}

본 발명은 활성이 증진된 에스터라제 융합단백질에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 막결합 단백질로부터 유래된 막결합에 관여하는 소수성 도메인이 에스터라제의 N-말단에 융합된 형태의 에스터라제 융합단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합단백질 발현용 벡터, 상기 벡터가 도입되어, 상기 융합단백질을 제조할 수 있는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

에스터라제는 에스테르 결합을 분해하여 저분자의 지방산/카르복실산과 알코올을 만드는 효소로서, 탄소 10개 이하의 아실 사슬을 가진 글리세롤에스테르(glycerolester)에 대해서 주로 높은 활성을 가지고 있다. 현재까지 박테리아, 효모 및 고등생물을 비롯하여 식물을 포함한 다양한 생물체에서 많은 종류의 에스터라제가 발견되어 왔으며, 이에 대한 생화학적 특성 및 에스터라제 유전자 자체에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 에스터라제는 리피드(lipid)의 가수분해(hydrolysis) 반응, 가산분해(acidolysis, 에스테르화된 지방산을 유리지방산으로 치환) 반응, 트랜스에스테르화(transesterification, 중성지방(triglyceride)간 지방산의 교환), 에스테르의 합성 등에 사용되어, 산업적으로 매우 중요한 효소이다. 특히, 세탁물 얼룩 내의 지방성분을 쉽게 제거 가능한 친수성 물질로 분해할 수 있어 세제 산업에 사용될 수 있고, 치즈의 숙성 및 향미를 추가하는 등의 치즈 생산 및 제빵용 노화 방지제나 천연 버터 향미를 가진 마가린의 제조와 같은 식음료 산업, 쓰레기 처리 산업, 그리고 소화제의 주요성분으로서 제약 산업 등에 이용될 수 있다. 이밖에도 에스터라제는 기질 특이성, 광학활성 특이성 및 위치 특이성 등의 독특한 특성을 갖고 있어 여러가지 생리 활성 키랄 의약품을 개발하는데 그 용도가 주목받고 있다.

이러한 광학활성 의약품 생산에 유용한 키랄 화합물의 생산은 의약산업의 경쟁력 확보와 국민 건강 증진에 매우 큰 영향력을 가지는 과제로 관심을 모으고 있으나, 실질적으로 키랄 화합물의 제조에 적합한 에스터라제는 소수에 불과한데, 그 이유는 각 에스터라제 별로 특이적으로 작용하는 기질이 상이하기 때문이다.

한편, 폴리에스터 계열의 플라스틱 제조와 화장품, 생활용품 제조에 광범위하게 사용되고 있는 중쇄지방산과 ω-하이드록시지방산은 자연계에 거의 존재하지 않기 때문에 주로 유기합성법을 이용하여 산업적으로 생산되고 있는데, 유기합성법은 고비용과 환경오염 물질이 다량 방출되는 문제점을 가지고 있다. 최근에, 에스터라제를 비롯한 다양한 효소를 이용하여, 장쇄 지방산으로부터 중쇄지방산 또는 ω-하이드록시지방산을 생산하는 방법이 보고되었는데, 예를 들어, 한국특허공개 제2010-0091749호에는 짧은 사슬(short chain) 지방산을 가지는 지질 및 3-하이드록시팔미트산 메틸 에스테르(3-OH palmitic acid methyl ester; 3-OH PAME)를 분해하는 활성을 나타내는 신규한 에스터라제가 개시되어 있고, 한국특허공개 제2011-0120548호에는 내열성을 갖는 에스터라제가 짧은 지방산을 분해하는 활성을 나타냄이 개시되어 있다. 그러나, 상기 에스터라제들은 기질로서 짧은 길이의 지방산을 사용할 뿐, 중쇄지방산과 ω-하이드록시지방산을 생산하기 위한 장쇄지방산을 기질로서 사용할 수 없다는 문제점이 있었다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 장쇄지방산으로부터 중쇄지방산 또는 ω-하이드록시 지방산을 생산할 수 있는 에스터라제를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 막결합 단백질로부터 유래된 막결합에 관여하는 소수성 도메인이 에스터라제의 N-말단에 융합된 형태의 에스터라제 융합단백질이 장쇄지방산을 분해하여 중쇄지방산 또는 ω-하이드록시 지방산을 효율적으로 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 막결합 단백질로부터 유래된 막결합에 관여하는 소수성 도메인이 에스터라제의 N-말단에 융합된 형태의 에스터라제 융합단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합단백질 발현용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터가 도입되어, 상기 융합단백질을 제조할 수 있는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 장쇄지방산으로부터 중쇄지방산 또는 ω-하이드록시 지방산을 생산할 수 있는 에스터라제를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 소수성 도메인에 주목하게 되었다. 중쇄지방산 또는 ω-하이드록시 지방산의 생산에 사용되는 장쇄지방산은 높은 소수성을 갖기 때문에 수용성 환경에서 에스터라제와의 접근성이 낮아, 장쇄지방산을 기질로 사용할 수 있음에도 불구하고, 반응수율이 낮을 것으로 생각되었다. 이에 따라, 에스터라제와 장쇄 지방산의 접근성을 향상시키는 방법으로서, 세포막과 같은 소수성 영역에 특이적으로 결합하는 활성을 나타내는 소수성 영역의 펩타이드를 상기 에스터라제에 부가하면, 장쇄지방산에 대한 에스터라제의 접근성을 향상시킬 수 있고, 결과적으로는 중쇄지방산 또는 ω-하이드록시 지방산의 생산수율을 향상시킬 수 있을 것으로 예상하였다.

이에, 슈도모나스속 미생물로부터 유래된 에스터라제를 대상으로, 에스터 화합물을 분해하여 보다 효율적으로 ω-하이드록시 지방산을 생산할 수 있는 에스터가수분해 효소를 스크리닝한 결과, 슈도모나스 플루오르센스 SIK W1 유래 에스터라제가 장쇄 지방산으로부터 유래된 에스터 화합물에 대하여 상당히 높은 수준의 분해활성을 나타냄을 확인하였다. 이러한 효소의 활성을 더욱 향상시키기 위하여, 슈도모나스 플루오르센스 DSM 50106 유래 에스터라제로부터 N-말단 소수성 영역을 추출하고, 이를 슈도모나스 플루오르센스 SIK W1 유래 에스터라제의 N-말단에 삽입시킨 형태의 융합단백질을 제조하고, 이의 에스터 화합물에 대한 분해활성을 측정한 결과, 장쇄 지방산에 대한 분해활성이 현저하게 향상됨을 확인하였다.

따라서, 에스터라제에 소수성 영역을 부가하여 제조된 에스터라제 융합단백질은 장쇄 지방산에 대하여 특이적인 높은 활성을 나타내므로, 중쇄 지방산 또는 ω-하이드록시 지방산의 생산시에 범용적으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

이에, 상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 막결합 단백질로부터 유래된 막결합에 관여하는 소수성 도메인이 에스터라제의 N-말단에 융합된 형태의 에스터라제 융합단백질을 제공한다.

본 발명의 용어 "막결합 단백질(membrane-anchoring proteins)"이란, 단백질의 일정영역이 소수성 도메인을 형성하고, 상기 소수성 도메인이 세포의 막구조와 결합하거나 또는 막구조를 투과하는 방식으로, 결합된 상태로 존재하는 단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 막결합 단백질은 에스터라제 융합단백질을 형성하기 위한 융합파트너인 소수성 도메인의 원천이 되는 단백질로 해석될 수 있는데, 상기 막결합 단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 막과 결합된 효소단백질이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 막과 결합되며 지방산 분해활성을 나타내는 효소단백질이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 Pseudomonas fluorescens DSM50106 유래의 에스터라제, Pseudomonas Synxantha 유래의 ZipA, Pseudomonas fluorescens SS101 유래의 BamD, Pseudomonas azotoformans 유래의 카복실에스터라제(carboxylesterase), Pseudomonas veronii 유래의 하이드롤라제(hydrolase) 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "소수성 도메인"이란, 상기 막결합 단백질을 구성하는 아미노산 서열에 있어서, 막결합 활성을 나타내는 영역(membrane-anchoring domains)을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 소수성 도메인은 에스터라제 융합단백질을 형성하기 위한 융합파트너로 해석될 수 있는데, 상기 소수성 도메인은 에스터라제 융합단백질을 형성하기 위한 융합파트너로 사용될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 막과 결합된 효소단백질로부터 유래된 소수성 도메인이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 막과 결합되며 지방산 분해활성을 나타내는 효소단백질로부터 유래된 소수성 도메인이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 Pseudomonas fluorescens DSM50106 유래 에스터라제의 1 내지 25번 아미노산 서열 또는 1 내지 53번 아미노산 서열로 구성된 펩타이드, Pseudomonas synxantha 유래 ZipA의 7 내지 26번 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 Pseudomonas fluorescens DSM50106 유래 에스터라제의 1 내지 25번 아미노산 서열(서열번호 1) 또는 1 내지 53번 아미노산 서열(서열번호 2)로 구성된 펩타이드를 소수성 도메인으로 사용하였다.

서열번호 1

서열번호 2

본 발명의 용어 "에스터라제(esterase)"란, 넓은 의미로는 에스테르 화합물에 존재하는 에스테르 결합을 가수분해하여 산과 알코올을 생성하는 반응을 촉매하는 효소를 의미하는 것으로 해석될 수 있고, 좁은 의미로는 지질가수분해 효소에 포함된 지방산에스테르 화합물의 가수분해효소군을 별도로 지칭하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 에스터라제는 지질가수분해 효소에 포함된 지방산에스테르 화합물의 가수분해효소군으로서, 에스터라제 융합단백질을 형성하기 위한 융합파트너로 해석될 수 있는데, 상기 에스터라제 융합단백질을 형성하기 위한 융합파트너로 사용될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 Pseudomonas fluorescens SIK W1 유래 에스터라제가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 Pseudomonas fluorescens SIK W1 유래 에스터라제의 전장 또는 일부 아미노산 서열로 구성된 에스터라제가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 Pseudomonas fluorescens SIK W1 유래 에스터라제의 전장 아미노산 서열(서열번호 3)로 구성된 에스터라제 및 상기 에스터라제의 1 내지 17번 아미노산 서열이 제외된 아미노산 서열(서열번호 4)로 구성된 에스터라제를 사용하였다.

서열번호 3

서열번호 4

본 발명의 용어 "융합단백질"이란, 상기 소수성 도메인이 상기 에스터라제의 N-말단에 포함되도록 인위적으로 합성된 에스터라제 융합단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 에스터라제 융합단백질은 소수성 도메인과 에스터라제가 융합되어, 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 장쇄지방산에 대하여 소수성 도메인이 결합되지 않은 에스터라제 보다도 향상된 분해활성을 나타낼 수 있다. 상기 에스터라제 융합단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 Pseudomonas fluorescens DSM50106 유래 에스터라제의 1 내지 25번 아미노산 서열 또는 1 내지 53번 아미노산 서열로 구성된 소수성 도메인이 Pseudomonas fluorescens SIK W1 유래 에스터라제의 전장 아미노산 서열로 구성된 에스터라제 또는 상기 에스터라제의 1 내지 17번 아미노산 서열이 제외된 아미노산 서열로 구성된 에스터라제의 각각의 N-말단에 결합된 형태의 에스터라제 융합단백질(서열번호 5 및 6)이 될 수 있다.

서열번호 5

서열번호 6

아울러, 상기 융합단백질은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.

끝으로, 상기 융합단백질은 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 대조군인 슈도모나스 플루오르센스 SIK W1(Pseudomonas fluorescens SIK W1) 유래 에스터라제(PFEI), 상기 PFEI의 N-말단에 슈도모나스 플루오르센스 DSM 50106의 에스터라제의 N-말단 소수성 영역인 1 내지 25번 아미노산 서열을 삽입한 융합단백질(PFEI25) 및 PFEI의 N-말단에서 1번 내지 17번 아미노산을 제거하고, 상기 제거된 위치에 슈도모나스 플루오르센스 DSM 50106의 에스터라제의 N-말단 소수성 영역인 1 내지 53번 아미노산 서열을 삽입한 융합단백질(PFEI53)을 사용하여 장쇄지방산의 일종인 (Z)-11-(헵타노일옥시)언덱-9-에노인산((Z)-11-(heptanoyloxy)undec-9-enoic acid)에 대한 분해활성을 비교한 결과, 융합단백질은 대조군에 비하여 상기 에스터 화합물에 대한 분해활성이 증가하였고, 융합단백질 중에서는 PFEI25가 PFEI53에 비하여 비교우위에 있음을 확인할 수 있었다(도 2 및 표 1).

따라서, 상기 에스터라제 융합단백질은 장쇄 지방산으로부터 생산되는 ω-하이드록시 지방산의 생산수율을 보다 향상시킬 수 있을 것으로 분석되었다.

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합단백질 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드는 상기 본 발명에서 제공하는 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 Pseudomonas fluorescens DSM50106 유래 에스터라제의 1 내지 25번 아미노산 서열 또는 1 내지 53번 아미노산 서열로 구성된 소수성 도메인이 Pseudomonas fluorescens SIK W1 유래 에스터라제의 전장 아미노산 서열로 구성된 에스터라제 또는 상기 에스터라제의 1 내지 17번 아미노산 서열이 제외된 아미노산 서열로 구성된 에스터라제의 각각의 N-말단에 결합된 형태의 에스터라제 융합단백질을 코딩하는 서열번호 7 및 8의 폴리뉴클레오티드를 사용하였다.

서열번호 7

서열번호 8

상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터는 융합단백질의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명에서 제공하는 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 본 발명의 융합단백질을 제조할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등) 이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시켜서 제작되고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 융합단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 융합단백질을 제조할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 본 발명의 융합단백질을 제조할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 대장균 TOP10 균주를 숙주로서 사용하였다.

상기 형질전환체는 본 발명에서 제공하는 에스터라제 융합단백질을 제조하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 에스터라제 융합단백질을 제조하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 에스터라제 융합단백질을 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 융합단백질을 발현시켜서 제조할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 D형 젖산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다. 대체로 D형 젖산은 배양 배지 중으로 배출되지만, 경우에 따라서는 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

아울러, 배양물로부터 상기 융합단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 제조된 본 발명의 융합단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 에스터라제 융합단백질은 장쇄지방산을 보다 효과적으로 분해하여 ω-하이드록시 지방산의 제조수율을 향상시킬 수 있으므로, ω-하이드록시 지방산의 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 장쇄지방산으로부터 ω-하이드록시 지방산을 생산하는데 사용되는 각 효소의 단계적 반응순서를 도식적으로 나타내는 개략도이다.
도 2는 (Z)-11-(헵타노일옥시)언덱-9-에노인산에 대한 각 에스터라제(PFEI, PFEI25 및 PFEI53)의 반응 속도를 나타내는 그래프로서, (□)는 PFEI를 나타내고, (△)는 PFEI25를 나타내며, (▲)는 PFEI53을 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 에스터라제 융합단백질의 제조

Pseudomonas fluorescens SIK W1 유래의 에스터라제(PFEI)의 N-말단에 슈도모나스 플루오르센스 DSM 50106에서 유래된 N-말단의 소수성 영역(1 내지 25번 아미노산 서열)을 삽입하여 첫번째 융합단백질인 PFEI25(서열번호 5)를 제작하였다. 또한, PFEI의 N-말단 영역(1번 내지 17번 아미노산)을 제거하고, 상기 제거된 위치에 PFEII에서 유래된 N-말단의 소수성 영역(1 내지 53번 아미노산 서열)을 삽입하여 두번째 융합단백질인 PFEI53(서열번호 6)을 제작하였다.

상기 PFEI25는 슈도모나스 플루오르센스 DSM 50106의 에스터라제에서 유래된 DNA 단편(1 내지 25번 아미노산 서열)을 over-extension PCR을 통해 증폭하고 PFEI의 N-말단에 연결시켜 융합단백질을 만들었다. 그 후 발현벡터에 삽입하여 융합단백질을 합성할 수 있는 E. coli를 구축하였다. 이와 유사하게 PFEI53은 슈도모나스 플루오르센스 DSM 50106의 에스터라제에서 유래된 N-말단의 소수성 영역(1 내지 53번 아미노산 서열)을 coding하는 DNA 단편과 PFEI의 N-말단 영역(1번 내지 17번 아미노산)을 제거한 DNA 단편을 over-extension PCR을 통해 증폭하여 발현벡터에 삽입하여 PFEI53 융합단백질 발현 E. coli를 구축하였다.

실시예 2: 에스터라제 융합단백질의 분해활성 비교

도 1에서 보듯이, 수화효소(hydratase) 또는 리폭시지나제(lipoxygenase), BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase), 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 및 에스터 가수분해효소(esterase)로 구성된 효소반응 시스템에 장쇄지방산을 공급할 경우, 상기 각 효소의 연계반응에 의하여, ω-하이드록시 지방산을 생성할 수 있다(한국특허공개 제2013-0132254호). 상기 도 1에서 3번 에스터 화합물((Z)-11-(heptanoyloxy)undec-9-enoic acid)은 에스터라제에 의하여 ω-하이드록시 지방산(ω-하이드록시언덱-9-에노익 산)으로 분해될 수 있다.

상기 실시예 1에서 제작한 각각의 융합단백질 PFEI25와 PFEI53을 사용하여 에스터 화합물((Z)-11-(heptanoyloxy)undec-9-enoic acid)에 대한 분해활성을 측정하였다(도 2). 이때. 대조군으로는 PFEI을 사용하였다. 도 2에서 보듯이, 각 융합단백질은 대조군에 비하여 상기 에스터 화합물에 대한 분해활성이 증가하였고, 융합단백질 중에서는 PFEI25가 PFEI53에 비하여 비교우위에 있음을 확인하였다.

아울러, 상기 반응에 대한 반응속도 상수를 산출하였다(표 1). 이때, 초기 산물 형성 속도는 다양한 시간대에 GC/MS로 측정한 산물 농도를 기반으로 계산하였다. 효소 농도는 BCA 단백질 실험 키트 (피어스, 미국)로 측정된 전체 단백질 농도를 기반으로 계산하였으며 순도는 SDS-PAGE로 추정하였다.

에스터 3에 대한 PFEI, 융합 단백질 PFEI25, 및 PFEI53의 반응속도 상수.

효소	K_M(mM)	V_max(mM/min)	k_cat(/s)	specific activity(U/mg 효소)
PFEI PFEI25 PFEI53	1.4(±0.3) 7.4(±6.7) 6.8(±0.9)	0.26(±0.03) 1.4(±0.09) 1.2(±0.12)	55(±6) 340(±22) 220(±22)	110(±13) 670(±43) 450(±45)

상기 표 1에서 보듯이, 융합단백질은 대조군의 단백질에 비하여 3번 에스터 화합물에 대한 분해활성(kcat과 비활성(specific activity))이 증가하였고, 융합단백질 중에서는 PFEI25가 PFEI53에 비하여 비교우위에 있음을 다시한번 확인할 수 있었다.

따라서, 상기 에스터라제 융합단백질은 장쇄지방산으로부터 생산되는 ω-하이드록시 지방산의 생산수율을 보다 향상시킬 수 있을 것으로 분석되었다.

<110> Ewha University-Industry Collaboration Foundation <120> Novel esterase fusion protein with improved activity <130> KPA140001-KR <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens DSM 50106 <400> 1 Met Ala Val Gln Trp Leu Ile Ala Ala Gly Val Leu Val Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Val Phe Trp Gly Leu Ser Ala Trp 20 25 <210> 2 <211> 53 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens DSM 50106 <400> 2 Met Ala Val Gln Trp Leu Ile Ala Ala Gly Val Leu Val Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Val Phe Trp Gly Leu Ser Ala Trp Met Thr Arg Arg Ile Glu Ala 20 25 30 Ala Val Pro Gly Asn Gly Arg Phe Val Glu Val Asp Gly Glu Arg Phe 35 40 45 His Tyr Tyr Glu Glu 50 <210> 3 <211> 272 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens WI SIK <400> 3 Met Ser Thr Phe Val Ala Lys Asp Gly Thr Gln Ile Tyr Phe Lys Asp 1 5 10 15 Trp Gly Ser Gly Lys Pro Val Leu Phe Ser His Gly Trp Leu Leu Asp 20 25 30 Ala Asp Met Trp Glu Tyr Gln Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Tyr 35 40 45 Arg Thr Ile Ala Phe Asp Arg Arg Gly Phe Gly Arg Ser Asp Gln Pro 50 55 60 Trp Thr Gly Asn Asp Tyr Asp Thr Phe Ala Asp Asp Ile Ala Gln Leu 65 70 75 80 Ile Glu His Leu Asp Leu Lys Glu Val Thr Leu Val Gly Phe Ser Met 85 90 95 Gly Gly Gly Asp Val Ala Arg Tyr Ile Ala Arg His Gly Ser Ala Arg 100 105 110 Val Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala Val Thr Pro Leu Phe Gly Gln 115 120 125 Lys Pro Asp Tyr Pro Gln Gly Val Pro Leu Asp Val Phe Ala Arg Phe 130 135 140 Lys Thr Glu Leu Leu Lys Asp Arg Ala Gln Phe Ile Ser Asp Phe Asn 145 150 155 160 Ala Pro Phe Tyr Gly Ile Asn Lys Gly Gln Val Val Ser Gln Gly Val 165 170 175 Gln Thr Gln Thr Leu Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Thr 180 185 190 Val Asp Cys Val Thr Ala Phe Ala Glu Thr Asp Phe Arg Pro Asp Met 195 200 205 Ala Lys Ile Asp Val Pro Thr Leu Val Ile His Gly Asp Gly Asp Gln 210 215 220 Ile Val Pro Phe Glu Thr Thr Gly Lys Val Ala Ala Glu Leu Ile Lys 225 230 235 240 Gly Ala Glu Leu Lys Val Tyr Lys Asp Ala Pro His Gly Phe Ala Val 245 250 255 Thr His Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Arg 260 265 270 <210> 4 <211> 255 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens WI SIK <400> 4 Gly Ser Gly Lys Pro Val Leu Phe Ser His Gly Trp Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15 Asp Met Trp Glu Tyr Gln Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Tyr Arg 20 25 30 Thr Ile Ala Phe Asp Arg Arg Gly Phe Gly Arg Ser Asp Gln Pro Trp 35 40 45 Thr Gly Asn Asp Tyr Asp Thr Phe Ala Asp Asp Ile Ala Gln Leu Ile 50 55 60 Glu His Leu Asp Leu Lys Glu Val Thr Leu Val Gly Phe Ser Met Gly 65 70 75 80 Gly Gly Asp Val Ala Arg Tyr Ile Ala Arg His Gly Ser Ala Arg Val 85 90 95 Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala Val Thr Pro Leu Phe Gly Gln Lys 100 105 110 Pro Asp Tyr Pro Gln Gly Val Pro Leu Asp Val Phe Ala Arg Phe Lys 115 120 125 Thr Glu Leu Leu Lys Asp Arg Ala Gln Phe Ile Ser Asp Phe Asn Ala 130 135 140 Pro Phe Tyr Gly Ile Asn Lys Gly Gln Val Val Ser Gln Gly Val Gln 145 150 155 160 Thr Gln Thr Leu Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Thr Val 165 170 175 Asp Cys Val Thr Ala Phe Ala Glu Thr Asp Phe Arg Pro Asp Met Ala 180 185 190 Lys Ile Asp Val Pro Thr Leu Val Ile His Gly Asp Gly Asp Gln Ile 195 200 205 Val Pro Phe Glu Thr Thr Gly Lys Val Ala Ala Glu Leu Ile Lys Gly 210 215 220 Ala Glu Leu Lys Val Tyr Lys Asp Ala Pro His Gly Phe Ala Val Thr 225 230 235 240 His Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Arg 245 250 255 <210> 5 <211> 297 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PFEI25 <400> 5 Met Ala Val Gln Trp Leu Ile Ala Ala Gly Val Leu Val Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Val Phe Trp Gly Leu Ser Ala Trp Met Ser Thr Phe Val Ala Lys 20 25 30 Asp Gly Thr Gln Ile Tyr Phe Lys Asp Trp Gly Ser Gly Lys Pro Val 35 40 45 Leu Phe Ser His Gly Trp Leu Leu Asp Ala Asp Met Trp Glu Tyr Gln 50 55 60 Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Tyr Arg Thr Ile Ala Phe Asp Arg 65 70 75 80 Arg Gly Phe Gly Arg Ser Asp Gln Pro Trp Thr Gly Asn Asp Tyr Asp 85 90 95 Thr Phe Ala Asp Asp Ile Ala Gln Leu Ile Glu His Leu Asp Leu Lys 100 105 110 Glu Val Thr Leu Val Gly Phe Ser Met Gly Gly Gly Asp Val Ala Arg 115 120 125 Tyr Ile Ala Arg His Gly Ser Ala Arg Val Ala Gly Leu Val Leu Leu 130 135 140 Gly Ala Val Thr Pro Leu Phe Gly Gln Lys Pro Asp Tyr Pro Gln Gly 145 150 155 160 Val Pro Leu Asp Val Phe Ala Arg Phe Lys Thr Glu Leu Leu Lys Asp 165 170 175 Arg Ala Gln Phe Ile Ser Asp Phe Asn Ala Pro Phe Tyr Gly Ile Asn 180 185 190 Lys Gly Gln Val Val Ser Gln Gly Val Gln Thr Gln Thr Leu Gln Ile 195 200 205 Ala Leu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Thr Val Asp Cys Val Thr Ala Phe 210 215 220 Ala Glu Thr Asp Phe Arg Pro Asp Met Ala Lys Ile Asp Val Pro Thr 225 230 235 240 Leu Val Ile His Gly Asp Gly Asp Gln Ile Val Pro Phe Glu Thr Thr 245 250 255 Gly Lys Val Ala Ala Glu Leu Ile Lys Gly Ala Glu Leu Lys Val Tyr 260 265 270 Lys Asp Ala Pro His Gly Phe Ala Val Thr His Ala Gln Gln Leu Asn 275 280 285 Glu Asp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Arg 290 295 <210> 6 <211> 308 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PFEI53 <400> 6 Met Ala Val Gln Trp Leu Ile Ala Ala Gly Val Leu Val Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Val Phe Trp Gly Leu Ser Ala Trp Met Thr Arg Arg Ile Glu Ala 20 25 30 Ala Val Pro Gly Asn Gly Arg Phe Val Glu Val Asp Gly Glu Arg Phe 35 40 45 His Tyr Tyr Glu Glu Gly Ser Gly Lys Pro Val Leu Phe Ser His Gly 50 55 60 Trp Leu Leu Asp Ala Asp Met Trp Glu Tyr Gln Met Glu Tyr Leu Ser 65 70 75 80 Ser Arg Gly Tyr Arg Thr Ile Ala Phe Asp Arg Arg Gly Phe Gly Arg 85 90 95 Ser Asp Gln Pro Trp Thr Gly Asn Asp Tyr Asp Thr Phe Ala Asp Asp 100 105 110 Ile Ala Gln Leu Ile Glu His Leu Asp Leu Lys Glu Val Thr Leu Val 115 120 125 Gly Phe Ser Met Gly Gly Gly Asp Val Ala Arg Tyr Ile Ala Arg His 130 135 140 Gly Ser Ala Arg Val Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala Val Thr Pro 145 150 155 160 Leu Phe Gly Gln Lys Pro Asp Tyr Pro Gln Gly Val Pro Leu Asp Val 165 170 175 Phe Ala Arg Phe Lys Thr Glu Leu Leu Lys Asp Arg Ala Gln Phe Ile 180 185 190 Ser Asp Phe Asn Ala Pro Phe Tyr Gly Ile Asn Lys Gly Gln Val Val 195 200 205 Ser Gln Gly Val Gln Thr Gln Thr Leu Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser 210 215 220 Leu Lys Ala Thr Val Asp Cys Val Thr Ala Phe Ala Glu Thr Asp Phe 225 230 235 240 Arg Pro Asp Met Ala Lys Ile Asp Val Pro Thr Leu Val Ile His Gly 245 250 255 Asp Gly Asp Gln Ile Val Pro Phe Glu Thr Thr Gly Lys Val Ala Ala 260 265 270 Glu Leu Ile Lys Gly Ala Glu Leu Lys Val Tyr Lys Asp Ala Pro His 275 280 285 Gly Phe Ala Val Thr His Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Leu Ala 290 295 300 Phe Leu Lys Arg 305 <210> 7 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFEI25 <400> 7 atggctgtgc aatggttgat tgctgcgggt gtgctggtgg gggcgagcgt cgtgttttgg 60 ggcttgagtg cctggatgag cacatttgtt gcaaaagacg gtacccagat ctatttcaag 120 gactggggca gcggtaaacc ggtgttgttc agccacggtt ggctactgga tgccgacatg 180 tgggaatacc agatggagta cctcagcagc cgcggctatc gcaccatcgc ctttgaccgc 240 cgcggctttg gccgctcgga ccaaccctgg accggcaacg actacgacac cttcgccgac 300 gacatcgccc agttgatcga acacctggac ctcaaggagg tgaccctggt gggcttctcc 360 atgggcggcg gcgatgtggc ccgctacatc gcccgccacg gcagcgcacg ggtggccggc 420 ctggtgctgc tgggcgccgt caccccgctg ttcggccaga agcccgacta tccgcagggt 480 gtcccgctcg atgtgttcgc aaggttcaag actgagctgc tgaaggatcg cgcgcagttc 540 atcagcgatt tcaacgcacc gttctatggc atcaacaagg gccaggtcgt ctcccaaggc 600 gtgcagaccc agaccctgca aatcgccctg ctggcctcgc tcaaggccac ggtggattgc 660 gtcaccgcgt tcgccgaaac cgacttccgc ccggacatgg ccaagatcga cgtacccacc 720 ctggtgatcc atggcgatgg cgaccagatc gtgccgttcg agaccaccgg caaagtggcg 780 gcggagttga tcaagggcgc cgaactgaag gtgtacaagg acgcgcccca cgggttcgcg 840 gtgacccacg cccagcagtt gaacgaagac ctgttggcgt tcttgaaacg ctga 894 <210> 8 <211> 927 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFEI53 <400> 8 atggctgtgc aatggttgat tgctgcgggt gtgctggtgg gggcgagcgt cgtgttttgg 60 ggcttgagtg cctggatgac acggcggatt gaagcagcgg ttccaggcaa tgggcgcttt 120 gtggaggtcg atggcgagcg ctttcattat tacgaagagg gcagcggtaa accggtgttg 180 ttcagccacg gttggctact ggatgccgac atgtgggaat accagatgga gtacctcagc 240 agccgcggct atcgcaccat cgcctttgac cgccgcggct ttggccgctc ggaccaaccc 300 tggaccggca acgactacga caccttcgcc gacgacatcg cccagttgat cgaacacctg 360 gacctcaagg aggtgaccct ggtgggcttc tccatgggcg gcggcgatgt ggcccgctac 420 atcgcccgcc acggcagcgc acgggtggcc ggcctggtgc tgctgggcgc cgtcaccccg 480 ctgttcggcc agaagcccga ctatccgcag ggtgtcccgc tcgatgtgtt cgcaaggttc 540 aagactgagc tgctgaagga tcgcgcgcag ttcatcagcg atttcaacgc accgttctat 600 ggcatcaaca agggccaggt cgtctcccaa ggcgtgcaga cccagaccct gcaaatcgcc 660 ctgctggcct cgctcaaggc cacggtggat tgcgtcaccg cgttcgccga aaccgacttc 720 cgcccggaca tggccaagat cgacgtaccc accctggtga tccatggcga tggcgaccag 780 atcgtgccgt tcgagaccac cggcaaagtg gcggcggagt tgatcaaggg cgccgaactg 840 aaggtgtaca aggacgcgcc ccacgggttc gcggtgaccc acgcccagca gttgaacgaa 900 gacctgttgg cgttcttgaa acgctga 927

Claims

막결합 단백질로부터 유래된 막결합 활성을 나타내는 소수성 도메인이 에스터라제의 N-말단에 인위적으로 융합된 형태의 재조합 에스터라제 융합단백질로서, 상기 막결합 단백질과 에스터라제는 이종의 미생물로부터 유래된 것인, 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열로 구성된 재조합 에스터라제 융합단백질.
제1항에 있어서,
상기 막결합 단백질은 Pseudomonas fluorescens DSM50106 유래의 에스터라제인 것인, 재조합 에스터라제 융합단백질.
제1항에 있어서,
상기 소수성 도메인은 Pseudomonas fluorescens DSM50106 유래 에스터라제의 1 내지 25번 아미노산 서열로 구성된 펩타이드, Pseudomonas fluorescens DSM50106 유래 에스터라제의 1 내지 53번 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 재조합 에스터라제 융합단백질.
제1항에 있어서,
상기 소수성 도메인은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 구성된 것인 재조합 에스터라제 융합단백질.
제1항에 있어서,
상기 에스터라제는 Pseudomonas fluorescens SIK W1 로 부터 유래되고 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 구성된 에스터라제인 것인 재조합 에스터라제 융합단백질.
제1항에 있어서,
상기 재조합 에스터라제 융합단백질은 Pseudomonas fluorescens DSM50106 유래 에스터라제의 1 내지 25번 아미노산 서열로 구성된 소수성 도메인이 Pseudomonas fluorescens SIK W1 로 부터 유래된 에스터라제의 N-말단에 인위적으로 융합된 형태인 것인 재조합 에스터라제 융합단백질.
제1항에 있어서,
상기 재조합 에스터라제 융합단백질은 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 장쇄지방산에 대하여, 융합 이전의 에스터라제보다 향상된 분해활성을 나타내는 것인 재조합 에스터라제 융합단백질.
삭제
제1항의 재조합 에스터라제 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서,
서열번호 7 또는 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제11항의 발현벡터가 도입되어 형질전환된 형질전환체.
(a) 제12항의 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및,
(b) 상기 배양물로부터 재조합 에스터라제 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 제1항의 재조합 에스터라제 융합단백질의 제조방법.