KR100572722B1

KR100572722B1 - 신규 에스터라제

Info

Publication number: KR100572722B1
Application number: KR1020040085516A
Authority: KR
Inventors: 오종원; 이진규; 안대균; 김연구
Original assignee: 학교법인연세대학교
Priority date: 2004-10-25
Filing date: 2004-10-25
Publication date: 2006-04-24

Abstract

본 발명은 인도네시아 화산지대의 토양 샘플로 구축한 메타게놈 라이브러리로부터 분리한 신규한 에스터라제, 이를 코딩하는 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이러한 형질전환체를 배양하여 에스터라제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

메타게놈 라이브러리, 에스터라제, 호르몬 민감성 리파제, 내열성

Description

신규 에스터라제{Novel esterase}

도 1은 토양 샘플로부터 40 내지 50 kbp의 DNA를 추출하고, 이를 포스미드(fosmid) 벡터에 클로닝하여 구성한 메타게놈 라이브러리의 제한 효소 분석 사진이다. 화살표는 7.5 kbp의 포스미드 밴드를 가리킨다.

lane M1, 1 kb Plus DNA ladder marker(Invitrogen, 미국);

lane M2, Lambda PFG marker(NEB, 미국);

lane 1-24, NotI 제한효소 처리된 플라스미드.

도 2는 토양 샘플로부터 구축한 메타게놈 라이브러리를 트리뷰티린(tributyrin) LB 플레이트상에 도말하고 발현을 유도하여 에스터라제 활성을 가진 구성원을 탐색한 사진이다.

도 3은 본 발명의 에스터라제 EstE1의 뉴클레오타이드와 아미노산 서열이다. 호르몬 민감성 리파제의 주요 모티프는 밑줄로 표시되었다. 세작용기 촉매(catalytic triad)는 박스로 표시되었다. 정지 코돈은 *로 표시되었다.

도 4a는 본 발명의 에스터라제 EstE1의 아미노산 서열과 이와 유사한 리파제 및 에스터라제의 아미노산 서열사이의 상동성을 비교한 결과이며, 도 4b는 이에 근거하여 구축한 계통발생 나무(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다.

도 5는 재조합 플라스미드 pET-22b(+)-estE1의 구조를 나타낸 제한효소지도이다.

Ap: 암피실린(ampicillin) 내성 유전자

lacI: 베타갈락토시다아제(β-galactosidase) 유전자

도 6a와 6b은 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pET-22b(+)-estE1에 IPTG를 처리하고 12시간 배양 후에 대량 생산된 에스터라제 및 이를 순수 정제한 에스터라제를 포함한 단백질들의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿(western blot) 분석 결과를 나타낸 사진이다. 도 6c는 최종 정제된 EstE1의 실버 염색 사진이다.

Lane 1, 분자량 표준 마커;

lane 2, pET-22b(+) 벡터만으로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)의 전체 세포 용해물;

lane 3, EstE1 발현벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)의 전체 세포 용해물;

lane 4, 열처리한 후의 에스터라제;

lane 5, Ni-NTA 컬럼에서 분리한 분획;

lane 6, 겔 여과 크로마토그래피로 분리한 최종 순수 정제된 에스터라제.

도 7은 순수 정제된 에스터라제 EstE1을 겔 여과 크로마토그래피를 시행하여 정제 정도를 확인하는 사진이다.

도 8a는 pH에 따른 에스터라제의 활성을 나타낸 그래프이고, 도 8b는 pH 안정성을 나타낸 그래프이다.

도 9a는 온도에 따른 에스터라제의 활성을 나타낸 그래프이고, 도 9b는 아레니우스(Arrhenius) 그래프이다.

도 10는 에스터라제의 열에 대한 안정성을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 신규한 에스터라제에 관한 것으로서, 구체적으로는 인도네시아 화산지대의 토양 샘플로 구축한 메타게놈 라이브러리로부터 분리한 에스터라제, 이를 코딩하는 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이러한 형질전환체를 배양하여 에스터라제를 제조 하는 방법에 관한 것이다.

리파제는 지방을 지방산과 글리세롤로 가수분해하는 효소로, 동물의 소화효소로서 위액, 이자액, 장액 속에 분비되고, 폐, 신장, 부신, 지방조직, 태반 등의 각종 조직에 있으며, 식물에서는 밀, 콩, 아주까리 등의 종자와 곰팡이, 효모, 세균 등에 들어있는 탄소 10개 이상의 아실 사슬을 가진 글리세롤에스테르(glycerolester)에 대해서도 가수분해 활성을 가진 효소이다.

반면, 에스터라제는 에스테르 결합을 분해하여 저분자의 지방과 알코올을 만드는 효소로서, 탄소 10개 이하의 아실 사슬을 가진 글리세롤에스테르(glycerolester)에 대해서만 활성을 가지고 있다. 현재까지 박테리아, 효모 및 고등생물을 비롯하여 식물을 포함한 다양한 생물체에서 많은 종류의 에스터라제가 발견되어 왔으며, 이에 대한 생화학적 특성 및 에스터라제 유전자 자체에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 에스터라제는 리피드(lipid)의 가수분해(hydrolysis) 반응, 가산분해(acidolysis, 에스테르화된 지방산을 유리지방산으로 치환) 반응, 트랜스에스테르화(transesterification, 중성지방(triglyceride)간 지방산의 교환), 에스테르의 합성 등에 사용되어, 산업적으로 매우 중요한 효소이다. 특히, 세탁물 얼룩내의 지방성분을 쉽게 제거 가능한 친수성 물질로 분해할 수 있어 세제 산업에 사용될 수 있고, 치즈의 숙성 및 향미를 추가하는 등의 치즈 생산 및 제빵용 노화 방지제나 천연 버터 향미를 가진 마가린의 제조와 같은 식음료 산업, 쓰레기 처리 산업, 그리고 소화제의 주요성분으 로서 제약 산업 등에 이용될 수 있다. 이밖에도 에스터라제는 기질 특이성, 광학활성 특이성 및 위치 특이성 등의 독특한 특성을 갖고 있어 여러가지 생리 활성 키랄 의약품을 개발하는데 그 용도가 주목받고 있다. 이러한 광학활성 의약품 생산에 유용한 키랄 화합물의 생산은 의약산업의 경쟁력 확보와 국민 건강 증진에 매우 큰 영향력을 가지는 과제로 관심을 모으고 있다.

상기의 중요한 반응은 때때로 고온과 유기 용매 하에서 효과적으로 수행된다. 특히, 식품산업에서 유리 지방산의 생산에 주로 이용되는 우지 (beef tallow) 및 야자유 (palm oil)는 보통의 효소 반응 온도에서는 고체상태를 유지하므로 이러한 재료의 효소적 가공을 위해서는 고온의 반응 환경이 요구된다. 따라서, 고온에서 안정한 내열성 에스터라제가 절실히 요구되고 있다.

상기한 바와 같이 산업적 이용을 위한 에스테라제를 얻기 위한 시도로서, 카르복실산 에스테르 라세미체에 특이적으로 작용하여 광학활성 카르복실산을 생산하고 pH 6.0 내지 8.0에서 안정하며 70℃에서 1시간 배양하여도 활성이 유지되는, 토양으로부터 분리한 슈도모나스 이어루지노사(Pseudomonas aeroginosa) 유래의 에스터라제(대한민국 특허 등록 제330359호), 분자량이 24kDa이고 30 내지 80℃ 및 pH 4 내지 8에서 안정하며, 65℃ 및 pH 6 내지 7에서 최적활성을 나타내는 써모모노스포라 푸스카 유래의 에스테라제(대한민국 특허 공개 제2002-0042694호), 알카라인 pH와 30℃에서 최적 활성을 나타내는 팔마로세 인플루레센스(Palmarose influorescence) 유래의 에스터라제(미국 특허 제6,387,678호) 등의 다양한 에스터라제가 개발되고 있으나, 여전히 보다 우수한 내열, 내산성, 내용매성 등의 목적하 는 특성을 갖는 에스터라제의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 하나의 목적은 신규한 에스터라제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 신규한 에스터라제를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 형질전환체를 배양하여 신규한 에스테라제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자는, 인도네시아 화산지대의 토양 샘플로부터 DNA를 추출하고 이를 포스미드 벡터에 클로닝하여 메타게놈을 구성하고, 이 메타게놈 라이브러리를 트리뷰티린 및 트리올레인을 첨가한 LB 플레이트에 도말하고 50℃에서 배양하였다. 그 후, 투명환을 생성하는 콜로니를 탐색하여 에스터라제 유전자를 포함하는 라이브러리 구성원을 수득하고, 이의 유전자를 클로닝하고 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하는 한편 이의 물리·화학적 특성을 규명하여, 기존에 밝혀진 바 없는 우수한 에스테라제 활성을 갖는 신규 단백질임을 확인하였다.

따라서, 하나의 양태로서 본 발명은 상기 탐색된 신규한 에스테라제 단백질(EstE1)에 관한 것이다.

인도네시아 화산지대의 토양으로부터 구축한 메타게놈 라이브러리로부터 수득한 본 발명의 에스터라제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며,이 아미노산 서열을 블라스트(BLAST) 데이터베이스로 탐색한 결과가 도 4a에 나타나 있으며, 공지의 리파제 및 에스터라제와는 상이한 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 에스터라제를 코딩하는 936bp의 신규 핵산 분자를 estE1으로 명명하고, 미국 GenBank에 수탁번호 AY726780으로 등록하였다.

본 발명의 에스터라제는 다음과 같은 특성을 나타낸다:

pH 3.0 내지 9.5 범위에서 안정하며, 약 pH 5.5 내지 7.5, 특히 약 6.0에서 최적 활성을 나타내고;

30 내지 95℃ 온도 범위에서 활성(약 95℃에서 최적 활성)을 나타내고, 80℃에서 추가의 안정제 없이도 2시간 이상 잔존 활성을 나타내며;

유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 아세토니트릴, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드 등에 대해서도 내용매성을 나타내고;

염화망간, 염화칼슘 등에 의해 활성이 증가되며;

염화리튬, 염화아연, 염화구리 등에 의해 활성이 감소되고;

C6 기질에 대해 가장 높은 활성을 나타낸다.

또한, 본 발명의 에스터라제는, 251번째 아스파라긴산, 281번째 히스티딘, 글리신-X-세린-X-글리신(G-X-S-X-G)의 공통서열(consensus sequence)내의 촉매 친핵 154번째 세린 잔기로 이루어진, 호르몬 민감성 리파제에 보존되는 세작용기 촉매(catalytic triad)를 갖는다. 상기 세린 잔기는 효소의 활성 중심 부위로 알려져 있으며, 산소음이온 구멍(oxyanion hole)을 안정화하기 위한 수소 결합에 관여하는 히스티딘-글리신-글리신-글리신(HGGG) 모티프도 세린 잔기에서 약 70개 아미노산 앞에 위치하고 있어, 전형적인 호르몬 민감성 리파제로서의 특성을 나타낸다. 이러한 사실은 세린기를 변형시키는 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)와 히스티딘기를 변형시키는 다이에틸 파이로카보네이트(Diethyl pyrocarbonate, DEPC)를 처리하였을 때, 그 활성이 저해되는 것으로 호르몬 민감성 리파제류에 해당하는 것임을 재확인할 수 있었다(표 2).

상기한 바와 같이 본 발명의 에스터라제의 호열 특성은 이를 이용하여 고온에서 유리 지방산의 생성, 지방의 트랜스에스테르화, 에스테르 및 펩타이드의 합성 등에 매우 유용하게 이용할 수 있다. 특히, 식품 산업에서 유리 지방산의 생산에 주로 이용되고 있는 고체 지방인 우지(beef tallow) 및 야자유(palm oil)의 효과적인 효소적 가공을 위해서는 고온에서 안정한 내열성 에스터라제가 필수적으로 요구되므로 본 발명의 에스터라제의 상기한 고온에서의 내열성은 매우 유리하게 이용될 수 있다.

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 에스터라제 뿐만 아니라, 이와 동등한 에스터라제 활성을 갖는 한, 아미노산 서열 변이체를 또한 본 발명의 범위에 포함한다. 이러한 아미노산 서열 변이체란 에스터라제 EstE1 단백질과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 에스터라제와 동등한 에스터라제 활성을 갖는 한, 이의 단편도 본 발명의 범위에 포함한다.

상기 에스터라제 단백질 또는 이의 변이체 또는 이의 단편은 천연에서 추출 또는 합성하거나(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc.. 85:2149-2156, 1963), DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989). 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, EstE1 에스터라제 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 EstE1 에스터라제 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 이를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 에스터라제를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

바람직하게는, 서열번호 1로 기재되는 염기 서열을 가지는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 에스터라제를 코딩하는 핵산 분자는 936개의 염기서열로 구성되며, 전체 염기서열 중 구아닌/시토신 비율은 59.29%, 분자량은 약 34kDa이며, 등전점은 pI 5.8이다.

상술한 바와 같은 본 발명의 에스터라제 단백질을 코딩하는 핵산 분자는, 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 “재조합 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 재조합 벡터에는 클로닝 벡터, 발현 벡터 등이 포함되며, 특히 목적 단백질의 대량 생산을 위한 발현 벡터와 혼용하여 사용된다.

용어 “작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도 록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

적합한 재조합 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 등과 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 프로모터에는 예를 들어 동물세포를 숙주로 사용하는 경우에는 SRα프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV 프로모터, HSV-TK 프로모터 등, 숙주가 에쉐리키아속 균인 경우에는 trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λP L 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등, 숙주가 바실러스속 균인 경우에는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등, 숙주가 효모인 경우에는 PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등, 숙주가 곤충세포인 경우에는 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터 등이 바람직하게 사용될 수 있다. 상기한 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 시그널 서열로는 숙주가 에쉐리키아속 균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속 균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적 실시에서는 pelB 서열을 에스터라제의 N-말단에 위치시켜 발현된 에스터라제가 페리플라즘으로 유도되도록 하였다. 또한, 재조합 벡터는 발현물의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 본 발명의 구체적 실시에서는 히스티딘-택(His-tag)을 C-말단에 위치시켜 Ni-NTA(nitriloteiacetic acid)-Sepharose 컬럼을 이용하여 발현된 에스터라제를 정제하였다. 또한, 재조합 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 복제가능한 재조합 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적 실시에서는 에스터라제를 코딩하는 핵산 분자, T7 프로모터, T7 터미네이터, pelB 서열, His-tag를 포함하는 재조합 벡터 pET-22b(+)-estE1를 작제하여 본 발명의 에스터라제를 발현시키는데 사용하였다(도 5).

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 명세서에서 용어 “재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포”는 "형질전환체"와 혼용된다. 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하기 위한 숙주 세포의 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하기 위한 당 분야에서 공지된 표준 기 술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법 (electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 숙주세포로는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균 [예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)], 효모 [예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)]등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.

본 발명에서는 신규 에스터라제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 pET-22b(+)-estE1를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시켰으며, 이 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/ pET-22b(+)-estE1을 2004년 10월 07일자로 서울시 서대문구 홍제 1동 유림빌딩 소재의 KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)에 수탁번호 KCCM 제10602호로 기탁하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 본 발명의 신규 에스터라제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포의 배양은 재조합 벡터에 삽입된 외래 유전자의 발현을 위한 적절한 조건하에서 당업자에 익히 공지된 방법을 통해 수행할 수 있으며, 이렇게 숙주세포에서 발현시킨 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 염석 (예: 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(예: 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피, 한외여과 등의 다양한 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 신규 에스터라제를 얻을 수 있다 (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).

본 발명의 구체적 실시에서는 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/ pET-22b(+)-estE1을 배양하고, 이를 분쇄한 후, 에스터라제-함유 상등액을 친화성(Affinity) 크로마토그래피(예: Ni-NTA-Sepharose 이용)하여 분리하였다. 또한, 추가의 정제를 위해 겔 여과 크로마토그래피하였다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 메타게놈 라이브러리의 구성

인도네시아의 화산지대에서 채취한 토양 샘플 100g(건조중량)을 동일 부피의 DNA 추출 완충액(100mM Tris-HCl [pH 8.0], 100mM EDTA, 100mM sodium phosphate [pH 8.0], 1.5 M NaCl, 1% CTAB)과 잘 섞은 후, N-라우릴-사르코시네(N-lauroyl sarcosine)를 최종 1.5%가 되게 첨가하였다. 이를 65℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 동일 부피의 클로로포름/이소아밀 알코올(chloroform/isoamyl alcohol)(24:1)을 첨가하고 부드럽게 섞은 후, 50℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.

그 후, 원심분리를 시행하여 취득한 수상(aqueous phase)에 이소프로파놀(isopropanol) 침전으로 DNA를 획득하였다. 이어서, PFGE(Pulse-field gel electrophoresis)를 걸어 40 내지 50kbp의 크기를 가지는 DNA를 모으고, CopyControl fosmid 라이브러리 제작 키트(Epicentre, 호주)를 사용해 메타게놈 라이브러리를 구성하였으며, 24개의 임의 추출한 클론을 NotI 제한효소를 처리하여 확인하였다(도 1).

실시예 2 : 에스터라제 활성을 가진 라이브러리 구성원의 탐색

메타게놈 라이브러리로부터 에스터라제 또는 리파제를 탐색하기 위해 트리뷰티린 (tributyrin) 및 트리올레인 (triolein)을 기질로서 첨가한 LB 플레이트에 도말하고, 50℃에서 인큐베이션하여 콜로니 주변에 투명환의 여부로 에스터라제 유전자를 가진 라이브러리 구성원을 획득하였다(도 2).

실시예 3 : 에스터라제 DNA의 클로닝 및 아미노산 서열 결정

메타게놈 라이브러리로부터 탐색하여 수득한 구성원에 BamHI 제한 효소를 처리하여 얻어진 절편을 pET-22b(+) 벡터에 서브 클로닝하고, 이를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시킨 후, 상기 실시예 2와 같이 트리뷰티린 LB 플레이트에 도말하여 투명환이 생기는 콜로니를 탐색하였다. 그 후, 메타게놈 라이브러리로부터 탐색하여 수득된 구성원의 DNA 염기 서열을 분석하였다. 염기서열분석은 자동 염기서열 분석기(ABI PRISM 377 autosequencer, Perkin-Elmer, 미국)를 사용하여 수행하였다. 936개의 염기서열(서열번호 1)로 구성되며, 전체 염기서열 중 구아닌/시토신 비율은 59.29%임을 확인하였다. 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 유전자를 estE1으로 명명하고, 미국 GenBank에 수탁번호 AY726780으로 등록하였다.

도 4a의 회색으로 된 박스 내의 아미노산 서열은 공지의 호르몬 민감성 리파 제와 상동성을 가지는 아미노산 배열을 나타내는 것이다. 세린을 포함하는 GXSXG 공통 서열의 세린 잔기로부터 약 70개 아미노산 앞에 상기 서열의 활성을 돕는 HGGG의 또 다른 공통 서열이 위치하여 전형적인 호르몬 민감성 리파제의 특성을 나타내므로, 본 발명의 에스터라제는 호르몬 민감성 리파제의 일종임을 알 수 있다. 도 4a의 결과를 바탕으로 도 4b의 계통발생나무(phylogenetic tree)를 구축했다.

실시예 4 : 형질전환체의 제조

본 발명의 신규 에스터라제를 대량으로 생산할 수 있는 estE1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하기 위해, pET22b(+)(Novegen사, 미국)의 제한효소HindIII와 NotI부위에 서열번호 1로 기재되는 estE1 유전자를 클로닝하여 pET22b(+)-estE1을 제조하였다.

메타게놈 라이브러리부터 탐색하여 수득한 구성원을 주형 DNA로 하고, 합성된 서열번호 3 및 4로 기재된 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Rection, PCR)을 수행하였다:

서열번호 3:

5'-CCCAAGCTTATGCCGCTCGACCCACAAATC-3'

서열번호 4:

5'-TTTTCCTTTTGCGGCCGCAGAGGGCTGGAGGCCAGAACG-3'

estE1 유전자 N-말단 프라이머와 C-말단 프라이머는 각각 HindIII와 NotI제한 효소 절단부위를 가지며 서열번호 3 및 4로 기재되는 올리고뉴클레오타이드이다. 재조합 벡터 pET22b(+)-estE1에는 강력한 T7 프로모터와 판독 신호가 내재되어 있어서, 이를 T7 RNA 중합효소를 갖고 있는 컴피턴트(competent) 대장균 BL21(DE3)을 숙주로 사용하는 경우 원하는 에스터라제의 대량 생산이 가능하다. 에스터라제의 발현량을 늘리기 위해 페리플라즘(periplasm)으로 유도되도록 하는 pelB 시퀀스가 에스터라제의 N-말단에 존재하고, C-말단에는 정제를 수월하게 수행하기 위한 6개의 히스티딘을 암호화하는 택이 존재한다.

PCR은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 구성되는 사이클로 30회 반복하여 실시하였다.

상기와 같은 반응으로 대량 증폭된 DNA 단편을 제한효소 HindIII와 NotI으로 완전히 자른 후, 동일한 제한효소들로 자르고 포스파타제(calf intestinal phosphatase)로 처리한 대량 생산용 벡터pET-22b(+)와 연결(ligation)하여 에스터라제 대량 생산용 재조합 플라스미드 pET-22b(+)-estE1을 제조하였다(도 5). 상기 재조합 플라스미드 pET-22b(+)-estE1을 대장균 BL21(DE3)(Invitrogen사, 미국) 컴피턴트 세포와 혼합하고 진 펄서(Gene Pulser, biorad, 미국)를 이용하여 전자충격유전자전달(electroporation)을 수행하여 형질전환된 균주를 제조하였다. 상기 형질전환체를 BL21(DE3)/pET-22b(+)-estE1이라 명명하고, 2004년 10월 07일자로 서울시 서대문구 홍제 1동 유림빌딩 소재의 KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)에 수탁번호 KCCM 제10602호로 기탁하였다.

실시예 5 : 형질전환체에서 에스터라제의 분리 정제 및 발현

실시예 5-1 : 형질전환된 대장균에서 에스터라제의 분리 정제

먼저 재조합 플라스미드 pET22b(+)-estE1을 지니는 형질전환된 대장균 BL21(DE3)를 암피실린(100mg/mL)이 포함된 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액 및 0.5% NaCl)에서 OD 600nm가 0.6으로 될 때까지 배양한 후, IPTG(최종농도 1mM)를 배양액에 넣은 후, 12시간 배양하였다. 배양액을 취하여 포스페이트 완충액(pH 7.4)으로 두 번 세척하고, 결합 완충액 (50mM Nap-phosphate [pH 8.0], 300mM NaCl, 10mM imidazole, 10mM b-mercatoethanol, 10% glycerol, 1% Nonidet P-40)에 다시 부유시키고 -80℃에 12시간 저장하였다.

상기 -80℃에서 저장하였던 대장균 BL21(DE3)/pET22b(+)-estE1을 상온에서 서서히 녹인 후, 초음파 분쇄법으로 분쇄하고, 원심분리하여 얻은 상층액을 80℃에 10분간 방치하였다. 이를 다시 원심분리하여 고온에서 안정한 단백질만으로 구성된 상등액을 얻은 후, Ni-NTA(nitriloteiacetic acid)-Sepharose 컬럼에 가하였다. 이미다졸(imidazole) 농도구배를 이용해 에스터라제를 용출시킨 후, 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography) 완충액(50mM Tris-HCl [pH 7.8], 150mM NaCl, 1mM DTT, 0.5mM EDTA)으로 투석시켜 완충액을 바꾸고, 이를 Sephacryl S-200HR 컬럼에 가한 후, 분자량에 따라 분획을 얻어 에스터라제를 순수분리하였다. 이렇게 얻어진 에스터라제 EstE1을 다시 Ni-NTA-Sepharose 컬럼으로 농축하였다.

실시예 5-2 : 에스터라제의 발현 양상

상기와 같이 제조한 EstE1 에스터라제의 발현 양상을 조사하기 위해 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하였다. 우선, 10%의 폴리아크릴아마이드겔(Biorad사, 미국)을 전기영동장치에 설치하고 전기영동장치에 이동 완충액(Tris-glycine 완충용액)을 채워 전기영동을 준비하였다. 매 과정마다 취한 상등액을 분자량 표준품과 함께 웰에 로딩하고 100V의 전압으로 전기영동하였다. 염색선이 겔의 맨 아래까지 전개되면 전기영동을 멈추고 겔을 꺼낸 후 쿠마시 블루(Cppmassie Brilliant Blue)로 염색하였다. 대조군으로는 pET-22b(+) 벡터만으로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)의 단백질을 사용하였다(도 6).

그 결과 대조군에서는 본 발명의 에스터라제의 아미노산 배열로부터 추론된 분자량인 39kDa의 밴드가 나타나지 않은데 반해, 본 발명의 에스터라제의 발현 12시간 후 시료속의 단백질 분자량 양상은 39kDa에서 진한 밴드를 보여 에스터라제가 효과적으로 생산되었음을 알 수 있었다. 또한, 그 분자량이 아미노산 배열로부터 추론된 분자량과 상당히 근접하여 이 단백질 밴드가 본 발명의 신규 에스터라제임을 확인할 수 있었다. 이렇게 정제된 에스터라제 EstE1을 다시 겔 여과 크로마토그래피에 걸어 순수 분리되었음을 확인하였다(도 7).

에스터라제의 활성은 일정한 pH에서 p-니트로페닐 카프로에이트(Nitrophenyl caproate)를 기질로 사용하여 분해되어 나오는 p-니트로페놀을 405nm에서의 OD로 측정하였다. 1 unit(U)는 분당 1mmol의 p-Nitrophenol을 가수분해하여 생산할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다. 상기와 같이 12시간 배양 후 추출액의 리터당 83,200U이 생산이 되었으며, 순수분리된 에스터라제의 활성은 12,760U으로 약 15% 회수되었음을 알 수 있었다(표 1).

실시예 6 : 에스터라제의 특성 실험

실시예 6-1 : pH에 대한 에스터라제의 특성

순수분리된 에스터라제에 대해 pH의 영향을 조사하였다. pH를 달리하면서 에스터라제 활성을 측정한 결과, 최적 pH가 6.0 에서 7.5로 나타났으며(도 8a), 다양한 pH로 4℃에서 12시간 동안 방치한 후, 에스터라제의 잔존 활성을 측정한 결과, pH 3.0 에서 8.5의 넓은 범위에서 안정한 것으로 나타났다(도 8b).

실시예 6-2 : 온도에 대한 에스터라제의 특성

도 9a에 도시된 바와 같이, EstE1은 95℃에서 최적 활성을 보였으며, 100℃에서는 효소활성이 감소하기 시작하였다. 또한, 도 9b에 도시된 바와 같이, 30℃에서 95℃까지 선형의 그래프를 나타내었으며 에스터라제의 구조가 모든 온도에 걸쳐 활성형으로 유지되었다. 95℃에서 4,640U/mg, 30℃에서 1,038U/mg의 활성을 나타내었다. 상기 특성은 30℃에서 최적 활성을 나타내는 반면, 55℃이상에서는 활성을 보이지 않는 식품 및 제약 산업에서 폭넓게 사용하고 있는 대표적인 시판용 캔디다 씰린드래씨이(Candida cylindracea) 리파제와 전혀 다른 특성이다.

에스터라제의 열안정성을 측정하기 위해 각 온도에서 30분 단위로 잔존 활성을 측정한 결과, 80℃까지 그 활성이 유지되어 안정하였다(도 10). 80℃에서 추가의 안정제 없이 그 활성이 유지되었고, 85℃에서 120분후에 20%의 잔존활성을 가지고 있었고, 90℃에서 20분, 95℃에서 2분의 반감기를 가지고 있다.

실시예 6-3 : 유기용매에 대한 에스터라제의 잔존활성

하기의 표 2에서와 같은 유기용매를 50% 또는 80%의 농도로 하여 1시간 동안 인큐베이션한 후 남아 있는 활성을 측정하였다. 대부분의 유기 용매에 대해 그 활성이 크게 영향을 받지 않음을 확인하였다.

실시예 6-4 : 단백질 가수분해 효소 저해제에 의한 에스터라제 활성의 저해도

여러 가지 단백질 가수분해 효소 저해제로 사용되는 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF), 다이에틸 파이로카보네이트 (diethyl pyrocarbonate, DEPC)에 의해 에스터라제의 활성 영향을 살펴본 결과 각각 1mM, 10mM에서 10%정도로 활성이 떨어지도록 저해를 받았다(표 3).

실시예 6-5 : 금속이온에 대한 에스터라제의 활성

금속이온에 대한 에스터라제의 활성을 측정한 결과, MnCl₂ 및 CaCl₂에 의해 에스터라제 활성이 증가되고, LiCl, ZnCl₂, 및 CuCl₂에 의해 활성이 감소됨을 알 수 있었다(표 4).

실시예 6-6 : 에스테르류에 대한 상대 가수분해력

EstE1 에스터라제의 다른 길이의 아실 사슬을 가진 p-나이트로페닐 에스테르(p-Nitrophenyl ester)에 대해 효소 활성을 조사하여 기질 특이성 및 가장 활성이 좋은 기질을 선정하였다(표 5).

상기 표 5에서 나타난 바와 같이, C₆까지 아실 사슬이 길어질수록 K _m , k _cat 은 점점 줄어드는 양상을 보였다. p-니트로페닐 카프로에이트에서 kcat/Km이 가장 높게 나타나, 가장 좋은 기질로 선정하였다. C₁₀이상에서는 거의 활성이 보이지 않았다. EstE1의 k _cat 값은 1,600s^-1로 C₄에 비해 1.54배, C ₅에 비해 1.77배 높게 나타났다. 파일로배큘럼 캘리디폰티스(Pyrobaculum calidifontis)의 경우 2620s^-1, 알리사이클로바실러스 아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius)의 경우 3,420s^-1, 알키애글로부스 펄지더스(Archaeglobus fulgidus)의 경우 1,014s^-1로 다른 열에 안정한 에스터라제와 유사한 범위의 값을 가짐을 확인하였다

본 발명의 신규 에스터라제는 고온에서 높은 활성을 나타내는 내열성 효소이고, 넓은 pH영역 및 다양한 유기용매에서 안정하여, 실온에서 고체인 지방을 고온의 공정에 적용하여 고가의 유리 지방산을 생산할 수 있으며, 다양한 에스테르와 펩타이드 합성 등 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 형질전환체를 이용하여 신규 에스터라제를 대량으로 생산할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 에스테라제.
제1항의 에스터라제를 코딩하는 핵산 분자.
제2항에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 염기 서열을 가지는 핵산 분자.
제2항의 에스터라제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
제4항에 있어서, 도 5의 제한지도를 갖는 pET-22b(+)-estE1인 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제6항에 있어서, 대장균 BL21(DE3)/pET22b(+)-estE1인 형질전환체.
제6항의 형질전환체를 배양하여 배양물로부터 제1항의 에스터라제를 분리하는 단계를 포함하는, 제1항의 에스터라제의 제조 방법.
제8항에 있어서, 친화(affinity) 크로마토그래피하는 단계를 추가로 포함하 는 방법.
제9항에 있어서, 겔 여과 크로마토그래피하는 단계를 추가로 포함하는 방법.