CN113025596A

CN113025596A - 耐甲醇脂肪酶

Info

Publication number: CN113025596A
Application number: CN201911355008.9A
Authority: CN
Inventors: 宣姚吉; 牛其文; 贾青杰; 徐正军
Original assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2021-06-25

Abstract

本申请提供了新的具有脂肪酶活性的多肽，其包含如SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列或上述序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列。本申请还提供了编码所述多肽的多核苷酸、含有上述多核苷酸的表达载体和宿主细胞。此外，本申请还涉及上述具有脂肪酶活性的多肽的用途。本文公开的多肽能够在高温及高甲醇浓度下快速地制备脂肪酸甲酯，进而用于生物柴油的制备。

Description

耐甲醇脂肪酶

发明领域

本申请属于酶工程领域，具体地，涉及具有脂肪酶活性的多肽、其编码核酸，以及包含所述编码核酸的表达载体和宿主细胞。本申请还涉及上述多肽的筛选方法及其用途。

发明背景

脂肪酶(Lipase EC 3..1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业，是重要的工业酶制剂之一。

它能够催化油脂上甘油酯键的水解,也可催化酯交换、酯化、醇解和酸解等反应。微生物来源的脂肪酶由于作用多样、易于培养、产量丰富等特点而被广泛用于工业生产,其中热稳定脂肪酶的研究和开发更是具有重要的商业价值。目前，已知大约有2％的微生物产脂肪酶，能产脂肪酶的微生物至少包括65个属，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属。疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一种分布广泛、生长上限温度较高的真菌。它能够产生热稳定的具有重要工业价值的脂肪酶Thermomyceslanuginosus lipase(TL)，TL能够被用来进行脂肪酸甲酯话反应生产生物柴油。因为反应过程中甲醇是其中的一种底物，进一步提高TL的耐甲醇能力，有可能进一步使其更加适合甲酯化反应，比如降低用量。

发明概述

第一方面，提供了具有脂肪酶活性的多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)如SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，其中由(b)获得的多肽变体仍保持脂肪酶活性。

在一实施方案中，本申请的多肽包含SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，上述多肽由SEQ ID NO:4和6任一项所示的氨基酸序列组成。

第二方面，提供了编码第一方面所述的多肽的多核苷酸，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列、或在SEQ ID NO:4或6中包含至少一个氨基酸取代、缺失或添加的序列；以及

(b)在严格条件下与a)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在一实施方案中，本申请的多核苷酸包含SEQ ID NO:3或5所示的核苷酸序列。在优选的实施方案中，上述多核苷酸由SEQ ID NO:3或5所示的核苷酸序列组成。

第三方面，提供了表达载体，其包含至少一种第二方面所述的多核苷酸。

在某些实施方案中，本申请的表达载体还包含调节多核苷酸表达的调控序列，其中多核苷酸与调控序列可操作地连接。在具体的实施方案中，所述表达载体为质粒载体。

第四方面，提供了包含第二方面的多核苷酸或第三方面的表达载体的宿主细胞。

在一些实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌、或者酵母例如毕赤酵母。

第五方面，提供了第一方面所述的多肽用于进行脂肪酸甲酯化反应或用于制备生物柴油的用途。

在一些实施方案中，在不高于30％浓度，优选15％-25％浓度的甲醇环境进行脂肪酸甲酯化反应或制备生物柴油。

第六方面，提供了制备生物柴油的方法，其包括将第一方面所述的多肽与油脂原料和低级醇进行接触。

在一些实施方案中，所述低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇或者其任意组合。

在一些实施方案中，第一方面所述的多肽与油脂原料和低级醇在不高于30％浓度，优选15％-25％浓度的低级醇环境下进行接触，在一些实施方案中，低级醇为甲醇。

第七方面，提供了筛选本申请的多肽的方法，其包括：

1)将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行突变，得到突变序列，

2)将步骤1)中获得的突变序列克隆在表达载体上，然后转化或转导至合适的宿主细胞中，

3)培养步骤2)中的宿主细胞，回收重组表达载体，然后将其转化至酵母菌株中培养，以及

4)筛选耐甲醇性能高于SEQ ID NO:2所示的多肽的突变多肽。

另外，本申请还提供了SEQ ID NO:1所示的核酸序列用于筛选本文公开的多肽的用途。

本申请的多肽具有较好的甲醇稳定性，特别的，本申请的多肽在高温(例如50℃)环境下具有较好的甲醇稳定性，其中，在50℃、30％甲醇浓度条件下，G2-4D的甲醇稳定性相比于野生型提高了1.56倍，突变体A12的甲醇稳定性相比于野生型提高了1.64倍。

附图简要说明

图1显示了TL、G2-4D和A12在50℃和30％甲醇条件下的稳定性。

图2显示了TL、G2-4D和A12在50℃的稳定性。

图3显示了脂肪酶活力检测方法。

具体实施方式

本申请的多肽

本申请提供了具有脂肪酶活性的多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)如SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列，以及

在某些实施方案中，上述氨基酸取代、缺失或添加的数目为1-30个，优选为1-20个，更优选为1-10个，其中获得的多肽变体基本上保持未改变的蛋白的脂肪酶活性。

在某些实施方案中，上述多肽变体与SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在优选的实施方案中，上述多肽变体与SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加。

在一些实施方案中，上述多肽由SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，在所述多肽的氨基酸序列中发生1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸的保守性取代。进行保守性取代后的多肽基本上保持原多肽的脂肪酶活性。本领域的技术人员熟知具体可实施的保守型取代。

在其他实施方案中，所述多肽的C端或N端可以缺失约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然具有脂肪酶活性。

在另外的实施方案中，还可以在所述多肽的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的多肽变体仍具有脂肪酶催化活性。

此外，还可以在所述多肽的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的多肽基本上保持原多肽的脂肪酶活性。

如本文所用的，术语“氨基酸”表示天然存在的和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物。天然存在的氨基酸包括蛋白生物合成中使用的20种(L)-氨基酸以及其他氨基酸，例如4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、高半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。非天然存在的氨基酸包括例如(D)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、p-氟苯丙氨酸、乙基硫氨酸等，这些是本领域技术人员已知的。氨基酸类似物包括天然和非天然存在的氨基酸的修饰形式。这种修饰可以包括例如取代氨基酸上的化学基团和部分，或者氨基酸的衍生化。氨基酸模拟物包括例如表现出功能上类似性质的有机结构，所述性质例如氨基酸的电荷和电荷空间特性。例如，模拟精氨酸(Arg或R)的有机结构具有位于类似分子空间并且具有与天然存在的Arg氨基酸的侧链的e-氨基相同程度的移动性的正电荷部分。模拟物还包括约束结构以维持氨基酸或氨基酸官能团的最佳空间和电荷相互作用。本领域技术人员可以确定什么结构构成功能上等效的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。

在一些实施方案中，SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的变体与SEQ ID NO:4具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同源性。在优选的实施方案中，多肽变体与SEQ ID NO:1所示序列具有99％以上的同源性。

在一些实施方案中，SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的变体与SEQ ID NO:6具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同源性。在优选的实施方案中，多肽变体与SEQ ID NO:2所示序列具有99％以上的同源性。

本文所述的“同源性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。

本申请的“多肽”和“蛋白”在本文可互换使用，指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成的和天然存在的类似物。因此，这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物及其天然存在的化学衍生物，以及其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(诸如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物。此类衍生物包括例如翻译后修饰和降解产物，包括SEQ ID NO:4或6所示的多肽片段的磷酸化的、糖基化的、氧化的、异构化的和脱氨基化的变体。

被称为“保守氨基酸取代”的某些氨基酸取代能够在蛋白质中频繁出现，但不改变该蛋白质的构象或功能，这是蛋白质化学中已建立的法则。

本申请中的保守氨基酸取代包括但不限于用甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)中的任一个取代这些脂肪族氨基酸的任何另外一个；用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦然；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；用赖氨酸(K)取代精氨酸(R)，反之亦然；用苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)取代这些芳香族氨基酸中的任何另外一个；以及用甲硫氨酸(M)取代半胱氨酸(C)，反之亦然。其他的取代也可以被视为是保守性的，这取决于特定氨基酸环境和它在蛋白三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)经常可以互换，如同丙氨酸(A)和缬氨酸(V)可以互换。相对疏水的甲硫氨酸(M)可以经常与亮氨酸和异亮氨酸互换，以及有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常在以下位置互换：其中氨基酸残基的重要特征是其电荷，以及这两种氨基酸残基的不同pK并不明显。在特定的环境下，仍有其他一些变化可以视为“保守性”的(参见，例如，BIOCHEMISTRY at pp.13-15,2nd ed.Lubert Stryered.(Stanford University)；Henikoff et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA(1992)89:10915-10919；Lei et al.,J.Biol.Chem.(1995)270(20):11882-11886)。

在某些实施方案中，本申请的多肽，例如SEQ ID NO:4或6所示多肽或其变体与异源多肽融合。在一些实施方案中，所述融合蛋白基本上保持SEQ ID NO:4或6所示多肽的脂肪酶活性。在某些实施方案中，异源多肽与SEQ ID NO:4或6所示多肽的N端连接。在某些实施方案中，异源多肽与SEQ ID NO:4或6所示多肽的C端连接。在这些实施方案中，异源多肽可以选自纯化标签(例如可以包括但不限于：GST、MBP)、表位标签(例如可以包括但不限于：Myc、FLAG)、靶向序列、信号肽等。在具体实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:4或6所示多肽和标签，所述标签与SEQ ID NO:4或6所示多肽的C-末端或N-末端结合，通常为肽标签。

本申请的多肽在高甲醇含量条件下仍具有较高的酶活力，有利于脂肪酸甲酯化反应。本文所述的“高甲醇含量”为甲醇含量14％以上，优选不高于30％浓度，更优选为15％-25％。在一些实施方案中，所述甲醇含量可以为14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％以及上述两数值之间的任意值。

多核苷酸

本申请提供了编码本文公开的多肽的多核苷酸，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(b)在严格条件下与a)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在某些具体的实施方案中，本申请的多核苷酸编码SEQ ID NO:4或6所示多肽及其功能等同变体。在一实施方案中，本申请的多核苷酸与编码SEQ ID NO:4或6所示多肽及其功能等同变体的多核苷酸具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性。

在某些实施方案中，本申请的多核苷酸包含与SEQ ID NO:3或5所示的核苷酸序列具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本申请的多核苷酸包含SEQ ID NO:3或5所示的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本申请的多核苷酸由与SEQ ID NO:3或5所示的核苷酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核苷酸序列组成。在优选的实施方案中，本申请的多核苷酸由SEQ ID NO:3或5所示的核苷酸序列组成。在更优选的实施方案中，所述多核苷酸由SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列组成。

在具体的实施方案中，SEQ ID NO:3所示的多核苷酸编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；SEQ ID NO:5所示的多核苷酸编码SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA，包括单链和双链形式的DNA。该术语通常指至少10个碱基长度的核苷酸多聚形式，所述核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。

在某些实施方案中，本申请的多核苷酸包含与编码SEQ ID NO:4或6所示多肽及其功能等同变体的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列，或者由与编码SEQ ID NO:4或6所示多肽及其功能等同变体的核苷酸序列特异性杂交且编码与SEQ ID NO:4或6所示多肽在功能上等同的多肽的核苷酸序列组成。

本领域技术人员可以常规选择DNA杂交的严格条件。通常较长的探针需要较高的温度，以便进行适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常取决于当互补链处于低于其解链温度的环境时变性DNA的重退火能力。探针与可杂交序列之间同源性程度越高，所能采用的相对温度越高。较高的相对温度往往使反应条件更严格，而在较低的温度下，则严格度较低。关于杂交反应严格条件的详细描述，可参阅Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology,Wiley Interscience Publishers,(1995)。

在某些实施方案中，DNA杂交采用的严格条件包括：1)洗涤时采用低离子强度和高温，例如50℃下的0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；2)杂交时采用甲酰胺等变性剂，例如42℃下50％(v/v)甲酰胺加0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚二烯吡咯烷酮/pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃下过夜杂交，杂交溶液含50％甲酰胺，5×SSC(0.75M氯化钠，0.075M朽1檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt’s溶液、超声波处理的鲑鱼精子DNA(50.mg/mL)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，然后在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中于42℃洗涤10分钟，再以含有EDTA的0.1×SSC于55℃进行高严格度洗涤。中等严格条件可按Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,NewYork：Cold Spring Harbor Press,1989中的描述加以确定。中等严格条件包括采用严格度低于以上描述的洗涤溶液和杂交条件(如温度、离子强度和SDS百分比)。例如，中等严格条件包括用至少约16％v/v到至少约30％v/v的甲酰胺和至少约0.5M到至少约0.9M的盐在42℃杂交，以及用至少约0.1M到至少约0.2M盐在55℃洗涤。中等严格条件还可以包括用1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％SDS在65℃杂交，以及用(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 47.2)、5％SDS在60-65℃洗涤。专业人员将会根据探针长度等因素调节温度、离子强度等。杂交核酸时的严格度取决于核酸分子长度和互补程度，以及其它本领域内众所周知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性越大，则含有这些序列的核酸杂合体的Tm越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)以下列顺序递减：RNA:RNA、DNA:RNA,DNA:DNA。优选地，可杂交核酸的最低长度至少约为12个核苷酸，优选至少约为16个、更优选至少约为24个、最优选至少约为36个核苷酸。

在一些实施方案中，本申请发明人以来源于疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶(TL)基因为基础，根据毕赤酵母的密码子偏好性，对编码成熟蛋白的序列进行密码子优化，合成的基因以大肠杆菌或毕赤酵母为表达宿主进行表达。

本申请公开的多核苷酸可以与其他DNA序列组合，所述其他DNA序列例如启动子、聚腺苷化信号、其他限制性酶切位点、多克隆位点、其他编码节段等，使得它们的总长度可以显著不同。因此考虑可以利用几乎任意长度的多核苷酸片段；总长度优选地受预期重组DNA方案中制备和使用的便利性的限制。

可以利用本领域内已知的和可获得的多种成熟技术中的任何一种来制备、操控和/或表达多核苷酸及其融合物。例如，编码本申请的多肽或其变体的多核苷酸序列可以用于重组DNA分子中以指导多肽在适当的宿主细胞中表达。由于遗传密码子固有的简并性，编码基本上相同或在功能上等同的氨基酸序列的其他DNA序列也可以用于本申请中，并且这些序列可以用于克隆和表达给定的多肽。本领域的技术人员，也可根据宿主细胞的特性，而选择适合特定宿主细胞的密码子优化策略，而得到编码基本上相同或在功能上等同的氨基酸序列的其他DNA序列。

此外，本领域的技术人员清楚，在真核生物中表达的DNA序列，为保持其稳定性，往往还会包含内含子，相关内含子序列在编码过程中会被真核生物的编辑系统剪切而得到最终表达的序列。因此，对于拥有在真核系统中表达的DNA序列，其还应该包括包含内含子的序列，只要该DNA序列最终编码的氨基酸序列与前述的氨基酸序列基本上相同或在功能上等同。

此外，可以使用本领域内公知的方法改造本申请的多核苷酸序列，包括但不限于基因产物的克隆、加工、表达和/或活性的改变。

在某些实施方案中，本申请的多核苷酸通过人工合成产生，例如直接的化学合成或酶合成。在可选的实施方案中，上述多核苷酸通过重组技术产生。

在具体的实施方案中，本申请使用的野生型TL氨基酸序列来源于NCBI(GenBankAccession：O59952)，根据毕赤酵母密码子偏爱性设计DNA序列SEQ ID NO:1，将该DNA序列克隆至pAO815质粒中，得到pAO-TL表达载体。

在某些实施方案中，可以通过常规方法优选如双脱氧链终止法(Sanger etal.PNAS,1977,74:5463-5467)测定所获得的多核苷酸的序列。这类多核苷酸序列测定也可用购买的测序试剂盒来完成。

表达载体

本申请提供了包含本申请的多核苷酸的表达载体。

本申请所述的“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定的核酸在宿主细胞中转录的特异性核酸元件。本申请使用的表达载体可以是诸如pPIC9K、pAO815、pUC57、pET-24a(+)、pIRES2-EGFP、pcDNA3.1、pCI-neo、pDC516、pVAC、pcDNA4.0、pGEM-T、pDC315的质粒载体，或者是诸如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体的病毒载体，或者是本领域熟知的其它载体。

在某些实施方案中，编码SEQ ID NO:4或6所示多肽及其变体的多核苷酸序列被克隆到载体中，以构成含有本申请所述多核苷酸的重组载体。

在优选的实施方案中，用于克隆多核苷酸的表达载体为质粒载体。在更优选的实施方案中，所述质粒载体为pPIC9K或pAO815。

在具体的实施方案中，上述表达载体还包含调节多核苷酸表达的调控序列，其中所述多核苷酸与所述调控序列可操作地连接。

本文所用的术语“调控序列”是指实现与其连接的编码序列表达所需的多核苷酸序列。这类调控序列的性质随宿主生物而改变。在原核生物中，这类调控序列一般包括启动子、核糖体结合位点和终止子；在真核生物中，这类调控序列一般包括启动子、终止子以及在某些情况下的增强子。因此，术语“调控序列”包括其存在对目的基因的表达是必需的最低限度的所有序列，也可以包括其存在对目的基因表达是有利的其它序列，例如前导序列。

本文所用的术语“可操作地连接”是指如下情形：所涉及到的序列处于允许它们以希望的方式起作用的关系之中。因此，例如“可操作地连接”到一编码序列的调控序列使得在与所述调控序列相容的条件下实现该编码序列的表达。

在某些实施方案中，利用本领域的技术人员熟知的方法构建包含编码SEQ ID NO:4或6所示多肽及其变体的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.MolecularCloning,a Laboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。核苷酸序列可操作地连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性实例可包括但不限于：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。实例包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。

宿主细胞

本申请提供了包含本文公开的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。

在某些实施方案中，将编码SEQ ID NO:4或6所示多肽及其变体的多核苷酸或含有该多核苷酸的表达载体转化或转导入宿主细胞，获得含有该多核苷酸或表达载体的基因工程化宿主细胞。

本文所用的宿主细胞可以是本领域技术人员熟知的任一种宿主细胞，包括原核细胞、真核细胞，例如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞等。示例性的细菌细胞包括埃希氏菌属、杆菌属、链霉菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属中的任何种，包括例如大肠杆菌、乳酸球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、荧光假单胞菌。示例性的真菌细胞包括曲霉属的任何种。示例性的酵母细胞包括毕赤酵母属、啤酒酵母菌属、裂殖酵母属或酵母菌属中的任何种，包括毕赤酵母、啤酒酵母或裂殖酵母。示例性的昆虫细胞包括斜纹夜蛾或果蝇中的任何种，包括果蝇S2和斜纹夜蛾Sf9。示例性的动物细胞包括CHO、COS或黑色素瘤或任何小鼠或人细胞系。选择合适的宿主在本领域技术人员的能力范围内。

在具体的实施方案中，本申请所用的宿主细胞为大肠杆菌。在优选的实施方案中，将携带本申请多核苷酸序列的表达载体转化至大肠杆菌DH5α菌株进行诱导表达。在另一具体的实施方案中，将携带本申请多核苷酸序列的表达载体转化至毕赤酵母细胞中进行表达。可用于本申请的毕赤酵母包括GS115、M314等，其适用于一般的酵母转化方法。

可以利用本领域已知的任何技术将表达载体导入宿主细胞中，包括转化、转导、转染、病毒感染、基因枪或Ti-介导的基因转移。具体的方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Methods inMolecular Biology,(1986))。作为示例，当宿主为原核生物如大肠杆菌时，可在指数生长期后收获感受态细胞，用本领域熟知的电转化法进行转化。

本申请的多肽的筛选和制备方法

可以通过本领域技术人员已知的任何合适方法来筛选和制备本申请的多肽。

在一些实施方案中，本文公开的多肽通过对TL进行定点突变获得，结果可通过测序等方法进行验证，也可用于指导TL的定向改造。

在一些实施方案中，本申请的多肽还可以通过重组技术产生，或者化学合成。产生重组肽的方法是本领域已知的。肽的化学合成方法也为本领域技术人员所熟知，例如，可以通过使用固相技术的定向肽合成来产生本申请的多肽及其变体(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。可以用手动或通过自动化来进行蛋白合成。例如，可以用Applied Biosystems的431A肽合成仪(Perkin Elmer)实现自动化合成。可选择地，不同的片度可以分别通过化学方式合成并利用化学方法进行组合以制备所需的分子。该方法在本领域中如此的普遍，甚至于还可以委托专业的公司进行序列合成。

在一些实施方案中，本文公开的多肽的筛选方法包括：

1)将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行突变，得到突变序列，

3)培养步骤2)中的宿主细胞，回收重组表达载体，然后将产物转化至酵母菌株中培养，以及

4)筛选耐甲醇性能高于SEQ ID NO:2所示的多肽的突变多肽。

在一些实施方案中，对验证后的突变体进行测序，确定突变后的序列。

合适的宿主细胞是指适于表达载体或目的多核苷酸表达的宿主细胞。合适的培养基指适于宿主细胞生长或对其进行诱导表达的培养基。

在某些实施方案中，根据所用的宿主细胞，可以选择各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。优选地，工程化的宿主细胞可以在被修饰适于激活启动子的常规营养培养基中进行培养，以筛选转化子或扩增本申请的多核苷酸。转化合适的宿主细胞并当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间，以允许其生产目的多肽或其片段。

在某些实施方案中，宿主细胞生产的多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。例如，表达的多肽或其片段可以通过本领域熟知的以下方法从重组细胞培养物中回收并纯化：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。作为示例性说明，在C-末端或N-末端包含肽标签(例如His-标签等)的蛋白的亲和色谱法纯化是用于获得高纯度多肽制剂的常规方法。

具有脂肪酶活性的多肽的应用

本申请的多肽是具有脂肪酶活性的多肽，能够利用脂肪酸甲酯化反应来生产生物柴油。在一些实施方案中，将本申请的多肽与油脂原料和低级醇进行接触来制备生物柴油。

在一些实施方案中，反应体系为高甲醇含量环境，例如甲醇含量为14％以上，优选不高于30％浓度，更优选15-25％，具体为14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％以及上述两数值之间的任意值。

在一些实施方案中，上述低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇或者其任意组合。在优选的实施方案中，所述低级醇为甲醇。

本文公开的多肽具有较高的耐甲醇活性，例如，可在高温(例如50℃)高甲醇浓度(例如30％甲醇浓度)下具有较高的耐甲醇活性，从而，本文公开的多肽能够在高温及高甲醇浓度下快速地制备脂肪酸甲酯，进而本文公开的多肽能够在高温及高甲醇浓度下用于生物柴油的制备。

本文公开的多肽在50℃、30％甲醇浓度下可长时间保持活性，因此，本领域的技术人员可以非常容易的预见到在相对30％浓度更低的甲醇浓度，例如，15％-25％甲醇浓度下，本文公开的多肽可以更长时间地保持酶的活性，从而，本文公开的多肽还能够在相对30％浓度更低的甲醇浓度，例如，15％-25％甲醇浓度下，快速地制备脂肪酸甲酯，进而本文公开的多肽能够上述条件下用于生物柴油的制备。

实施例

实验材料

1)实验菌株和质粒

菌株：毕赤酵母GS115(Invitrogen)，大肠杆菌DH5α(TAKARA)。

质粒:pAO815，购自Invitrogen,货号V18020。

2)培养基和溶液

LB液体培养基：0.5％酵母提取物，1％胰化蛋白胨，1％NaCl，pH7.0。

LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂浓度1.5％。

YPD液体培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

YPD固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂浓度2％。

BMMY-橄榄油筛选培养基：A组分：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸，1％甲醇(灭菌后加入)，4×10-5％D-生物素(灭菌后加入)，0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH6.6，2％琼脂。B组分：组分B橄榄油底物溶液：量取4％PVA溶液150ml，加橄榄油50ml，用高速匀浆机8000rpm乳化3min，暂停1min后再乳化3min，制备底物溶液。灭菌的100ml A组分与12ml B组分混合，加入1ml 0.1％罗丹明B。

BMGY液体培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸，1％甘油，4×10-5％D-生物素，0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH6.6。

改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)；

限制性内切酶SacII和EcoRI(购自纽英伦生物技术(北京)有限公司)；

PCR酶：TaKaRa Taq，

HS DNA Polymerase(购自宝生物工程(大连)有限公司)；

T4 DNA连接酶(购自富酶泰斯有限公司)。

3)序列与引物

SEQ ID：No.1为TL编码序列；

SEQ ID：No.2为TL氨基酸序列；

SEQ ID：No.3为G2-4D编码序列；

SEQ ID：No.4为G2-4D氨基酸序列；

SEQ ID：No.5为A12编码序列

SEQ ID：No.6为A12氨基酸序列；

SEQ ID：No.7为α交配因子前导肽序列；

SEQ ID：No.8为TL-1序列：

5’-GCGCCTAGGCCGCGGCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC-3’；

SEQ ID：No.9为TL-2序列：

5’-CCGGAATTCTTACAAGCAAGTACCAATCAG-3’；

SEQ ID：No.10为AOX1-5序列：

5’-GACTGGTTCCAATTGACAACG-3’；

SEQ ID：No.11为AOX1-3序列：

5’-GGCAAATGGCATTCTGACATCCTC-3’。

实施例1：TL突变文库构建和突变体筛选

TL的氨基酸序列根据野生型Thermomyces lanuginosus lipase氨基酸序列而来，野生型氨基酸序列来源于NCBI(GenBank Accession：O59952)，其序列如其编码序列如SEQID NO:2所示。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计DNA序列SEQ ID NO:1，添加α交配因子前导肽序列，该序列来自于商业化载体pPIC9K的DNA序列，其序列如SEQ ID NO:7所示，送上海生工生物工程有限公司进行全基因合成，将该DNA序列克隆至pAO815质粒中，得到pAO-TL表达载体。

以pAO-TL载体为模板，使用TaKaRa Taq酶和引物对TL-1(SEQ ID NO:8)/TL-2(SEQID NO:9)进行易错PCR(在PCR时额外添加0.3mM的MnCl₂)，得到大小为约755bp的突变扩增子片段集合。通过SacII和EcoRI酶切位点将得到的片段克隆至pAO-TL中，并将得到的载体转化入大肠杆菌DH5α菌株，一共得到1×10⁶个TL突变体。

将质粒文库转化入大肠杆菌DH5α菌株，将所有大肠杆菌克隆洗至LB液体培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃培养4h。抽提质粒，用SalI进行线性化，回收约8.5kb的片段。取500ng载体，用电转化法将载体转化至毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞中。将转化物接种于MGYS平板上，30℃培养3天，得到TL的毕赤酵母突变体文库。挑取平板上的单克隆，至BMMY-橄榄油筛选平板上。选取变色圈大的2个克隆，编号分别为G2-4D和A12。

将pAO-TL质粒用用SalI进行线性化，回收约8.5kb的片段。取500ng载体，用电转化法将载体转化至毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞中。将转化物接种于MGYS平板上，30℃培养3天，挑取平板上的单克隆，至BMMY-橄榄油筛选平板上。选取变色圈大的克隆，作为野生TL表达菌株。

实施例2：G2-4D和A12突变体性能检测

取G2-4D和A12突变菌株及野生TL表达菌株，先在液体YPD中活化，然后接种于BMGY培养基中，在30℃下，220rpm振荡培养过夜。将培养物转至BMMY培养基中，初始OD600为6，在30℃下，220rpm振荡培养72h，具体过程如下：

首先，用2％甲醇进行诱导，在24h和32h后各补加1％甲醇，48h和56h后各补加1％甲醇，72h取样。将获得的样品用截留分子量为10kDa的超滤管进行超滤脱盐浓缩40倍。将处理后的样品加入缓冲液中(20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH6.6))。

将TL，G2-4D和A12的酶液调制1mg/ml。取一份置于50℃水浴中，另一份加入30％的甲醇置于50℃水浴中，4h，22h，44h取样测定酶活，以未处理的酶液的酶活(TL，G2-4D和A12的初始酶活分别是8067U/ml；8489U/ml；和8111U/ml)作为对照，相对酶活记为100％。酶活测定方法如图3所示，其中底物溶液如下：

量取4％PVA溶液150ml，加橄榄油50ml，用高速匀浆机8000rpm乳化3min，暂停1min后再乳化3min，制备底物溶液(此溶液需现配现用)。

结果如图1和2所示，TL，G2-4D和A12在50℃下放置44h后，酶活仍旧十分稳定，没有明显的变化。但加入30％甲醇后，放置22h后野生型TL的残余酶活只有55％，而G2-4D和A12的残余酶活分别为84％和95％，放置44h后野生型TL的残余酶活只有25％，而G2-4D和A12的残余酶活分别为64％和66％。与TL相比，G2-4D和A12对甲醇的耐受性得到明显提升，从而能够在高温及高甲醇浓度下快速地制备脂肪酸甲酯，进而用于生物柴油的制备。

实施例3：G2-4D和A12突变体序列分析

将G2-4D和A12菌株接种于3ml YPD液体培养基中，30℃培养过夜，抽提基因组DNA。以G2-4D和A12菌株的基因组DNA为模板，使用

HS DNA聚合酶和引物对AOX1-5(SEQ ID NO:10)/AOX1-3(SEQ ID NO:11)进行PCR扩增，得到G2-4D和A12菌株中TL的DNA序列。将得到的序列送往上海生工生物工程公司测序。

G2-4D菌株的TL的DNA测序结果，如SEQ ID NO:3所示，其编码序列如SEQ ID NO:4所示。其中，33位天冬酰胺突变为天冬氨酸，第38位甘氨酸突变为半胱氨酸，第111位天冬氨酸突变为丙氨酸，第231位丝氨酸突变为谷氨酸，第233位天冬酰胺突变为赖氨酸。

A12菌株的TL的DNA测序结果，如SEQ ID NO:5所示，其编码序列如SEQ ID NO:6所示。其中，33位天冬酰胺突变为赖氨酸，第38位甘氨酸突变为苏氨酸，第111位天冬氨酸突变为亮氨酸，第233位天冬酰胺突变为丝氨酸，第259位亮氨酸突变为缬氨酸。

可以理解，尽管本申请以某种形式被说明，但本申请并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请的范围的前提下还可做出各种变化。这些变化都在本申请要求保护的范围内。

序列表

<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司

<120> 一种耐甲醇的脂肪酶突变体

<130> 123123

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 810

<212> DNA

<213> Thermomyces lanuginosus

<400> 1

gaagtctctc aagacttgtt caaccagttc aacttgttcg ctcaatactc tgccgctgcc 60

tactgtggta agaacaatga tgctccagct ggtactaaca ttacctgtac tggtaacgct 120

tgtccagaag ttgagaaggc tgatgctacc ttcctgtact ccttcgaaga ctctggagtt 180

ggagatgtta ctggtttcct ggccttggat aacactaaca agttgatcgt tctgtccttc 240

agaggttcca gatccatcga gaactggatt ggtaacttga actttgactt gaaggagatc 300

aacgacatct gttctggatg tcgtggtcac gatggattta cctcctcttg gagatctgtt 360

gctgatacct tgagacagaa ggtcgaagat gctgtcagag aacatccaga ctatagagtt 420

gtcttcactg gtcactcctt gggaggtgcc ttggctactg ttgctggtgc tgacttgcgt 480

ggtaatggtt atgacattga tgtcttctcc tacggtgctc caagagttgg taatcgtgcc 540

ttcgctgagt ttctgaccgt ccaaactgga ggtactttgt acagaattac ccatactaac 600

gacattgttc caagattgcc accacgtgag ttcggatact ctcattcctc tccagagtac 660

tggatcaagt ctggaacctt ggttccagtc actcgtaacg acatcgtcaa gattgaaggt 720

attgatgcca ctggaggtaa caatcaacca aacattccag acattccagc tcacttgtgg 780

tactttggtc tgattggtac ttgcttgtaa 810

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> Thermomyces lanuginosus

<400> 2

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

85 90 95

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val

115 120 125

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210> 3

<211> 810

<212> DNA

<213> Thermomyces lanuginosus

<400> 3

gaagtctctc aagacttgtt caaccagttc aacttgttcg ctcaatactc tgccgctgcc 60

tactgtggta agaacaatga tgctccagct ggtactaaga ttacctgtac ttctaacgct 120

tgtccagaag ttgagaaggc tgatgctacc ttcctgtact ccttcgaaga ctctggagtt 180

ggagatgtta ctggtttcct ggccttggat aacactaaca agttgatcgt tctgtccttc 240

agaggttcca gatccatcga gaactggatt ggtaacttga actttgactt gaaggagatc 300

aacgacatct gttctggatg tcgtggtcac gcgggattta cctcctcttg gagatctgtt 360

gctgatacct tgagacagaa ggtcgaagat gctgtcagag aacatccaga ctatagagtt 420

gtcttcactg gtcactcctt gggaggtgcc ttggctactg ttgctggtgc tgacttgcgt 480

ggtaatggtt atgacattga tgtcttctcc tacggtgctc caagagttgg taatcgtgcc 540

ttcgctgagt ttctgaccgt ccaaactgga ggtactttgt acagaattac ccatactaac 600

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tggatcaagt ctggaacctt ggttccagtc gagcgtcgtg acatcgtcaa gattgaaggt 720

attgatgcca ctggaggtaa caatcaacca aacattccag acattccagc tcacttgtgg 780

tactttggtc tgattggtac ttgcttgtaa 810

<210> 4

<211> 269

<212> PRT

<213> Thermomyces lanuginosus

<400> 4

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30

Lys Ile Thr Cys Thr Cys Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

85 90 95

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Ala Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val

115 120 125

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Glu Arg Arg Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210> 5

<211> 810

<212> DNA

<213> Thermomyces lanuginosus

<400> 5

gaagtctctc aagacttgtt caaccagttc aacttgttcg ctcaatactc tgccgctgcc 60

tactgtggta agaacaatga tgctccagct ggtactcgta ttacctgtac tacgaacgct 120

tgtccagaag ttgagaaggc tgatgctacc ttcctgtact ccttcgaaga ctctggagtt 180

ggagatgtta ctggtttcct ggccttggat aacactaaca agttgatcgt tctgtccttc 240

agaggttcca gatccatcga gaactggatt ggtaacttga actttgactt gaaggagatc 300

aacgacatct gttctggatg tcgtggtcac cttggattta cctcctcttg gagatctgtt 360

gctgatacct tgagacagaa ggtcgaagat gctgtcagag aacatccaga ctatagagtt 420

gtcttcactg gtcactcctt gggaggtgcc ttggctactg ttgctggtgc tgacttgcgt 480

ggtaatggtt atgacattga tgtcttctcc tacggtgctc caagagttgg taatcgtgcc 540

ttcgctgagt ttctgaccgt ccaaactgga ggtactttgt acagaattac ccatactaac 600

gacattgttc caagattgcc accacgtgag ttcggatact ctcattcctc tccagagtac 660

tggatcaagt ctggaacctt ggttccagtc actcgttcgg acatcgtcaa gattgaaggt 720

attgatgcca ctggaggtaa caatcaacca aacattccag acattccagc tcacctttgg 780

tactttggtc tgattggtac ttgcttgtaa 810

<210> 6

<211> 269

<212> PRT

<213> Thermomyces lanuginosus

<400> 6

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30

Lys Ile Thr Cys Thr Thr Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

85 90 95

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Leu Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val

115 120 125

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Ser Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

245 250 255

Ala His Val Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210> 7

<211> 267

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctcttgaga aaagagaggc tgaagct 267

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gcgcctaggc cgcggcgaaa cgatgagatt tccttcaatt tttac 45

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

ccggaattct tacaagcaag taccaatcag 30

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gactggttcc aattgacaac g 21

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ggcaaatggc attctgacat cctc 24

Claims

1.具有脂肪酶活性的多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)如SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，

其中由(b)获得的多肽变体仍保持脂肪酶活性。

2.如权利要求1所述的多肽，其包含SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列，优选地，所述多肽由SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列组成。

3.编码权利要求1或2所述的多肽的多核苷酸，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)核苷酸序列，其编码如权利要求1(a)或1(b)所述的氨基酸序列；以及

(b)在严格条件下与(a)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:3或5所示的核苷酸序列，优选地，所述多核苷酸由SEQ ID NO:3或5所示的核苷酸序列组成。

5.表达载体，其包含至少一种权利要求3或4所述的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的表达载体，其还包含调节所述多核苷酸表达的调控序列，其中所述多核苷酸与所述调控序列可操作地连接，优选地，所述表达载体为质粒。

7.宿主细胞，其包含3或4所述的多核苷酸、或者权利要求5或6所述的表达载体，优选地，所述宿主细胞为酵母或大肠杆菌。

8.权利要求1或2所述的多肽用于进行脂肪酸甲酯化反应或用于制备生物柴油的用途，优选的，所述多肽于不高于30％浓度，优选15％-25％浓度的甲醇环境进行脂肪酸甲酯化反应或用于制备生物柴油。

9.制备生物柴油的方法，其包括将权利要求1或2所述的多肽与油脂原料和低级醇进行接触，其中所述低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或其任意组合，优选地，所述低级醇为甲醇或乙醇；优先地，所述接触为将权利要求1或2所述的多肽与油脂原料和低级醇于不高于30％浓度，优选15％-25％浓度的低级醇，优选为甲醇，环境下进行接触。

10.筛选权利要求1或2所述的多肽的方法，其包括：

1)将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行突变，得到突变序列，

3)培养步骤2)中的宿主细胞，回收重组表达载体，然后将其转化至酵母菌株中培养，和

4)筛选耐甲醇性能高于SEQ ID NO:2所示的多肽的突变多肽。