CN113462678A

CN113462678A - 一种谷氨酸脱羧酶突变体

Info

Publication number: CN113462678A
Application number: CN202110973668.4A
Authority: CN
Inventors: 王金刚; 韦炎龙; 梁岩; 任亮
Original assignee: Shanghai Banglin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Banglin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-24
Filing date: 2021-08-24
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2041-08-24
Also published as: CN113462678B

Abstract

本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:3，其能高效催化L‑谷氨酸生成γ‑氨基丁酸，在pH4.0～7.0范围内具有高稳定性。以枯草芽孢杆菌为宿主过表达该谷氨酸脱羧酶突变体并制备固定化酶，添加300g/L的谷氨酸钠为底物，γ‑氨基丁酸的得率高达85％。

Description

一种谷氨酸脱羧酶突变体

技术领域

本发明属于酶催化技术领域，具体地说，涉及一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ-氨基丁酸合成中的应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种非蛋白质氨基酸，是哺乳动物的中枢神经系统中重要的抑制性神经传递物，具有镇定、抗焦虑、抗癫痫、促进睡眠、改善更年期或老年精神障碍、增强肝肾功能、降血压、高效减肥、促进酒精代谢等功能，于2009年被国家卫生部批准为新资源食品，在医药、保健、种植业、饲料、化工、食品等行业具有广泛应用。

GABA的生产方法主要有直接提取法、化学合成法或生物合成法。直接提取法是从植物组织中直接提取GABA，但组织内的GABA含量较低，一般在0.3-32.5μmol/g范围内，因此该方法难以实现工业化应用(蒋振晖等,植物生理学通讯,2003,39(3):249-254)。化学合成法是当下最常使用的工业生产方法之一，一般利用γ-氯丁氰或者吡咯烷酮为原料合成GABA(林亲录等,现代食品科技,2008,5:496-500)，但反应过程条件要求苛刻、危险系数高、副反应较多，导致生产成本高，且成品由于化学杂质存在而难以用于食品、医药等行业。生物合成法包括微生物发酵法和酶催化法，是利用谷氨酸脱羧酶催化底物L-谷氨酸裂解为γ-氨基丁酸和CO₂，具有条件温和、转化率高、安全性高、产量高等优点，也是目前GABA生产的主要方法之一。

生产GABA常用的微生物有大肠杆菌、酿酒酵母、红曲霉、乳酸菌等。赵景联用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，可将1％谷氨酸底物完全转化为GABA(赵景联,生物工程学报,1989,2:124-128)。专利文献CN106967616A公开了从酒曲中筛选获得的米根霉(Rhizopus oryzae)，在含有0.5％谷氨酸钠的发酵培养基中培养5天后，GABA的含量达到1.08mg/g。专利文献CN107475151A公开了一株副短乳酸杆菌(Lactobacillusparabrevis)HX12-19，采用传统发酵和生物转化分段控制，GABA产量可以达到235g/L。专利文献CN112899260A公开了一种谷氨酸脱羧酶突变体，热稳定性和结构稳定性得到提高，且在更宽的pH值范围内能够保持较高的活性，但采用全细胞形式进行催化需加热提高细胞膜通透性，对酶的热稳定性要求较高，且所用的宿主大肠杆菌因含有内毒素、普通消费者一般将大肠肝菌视为致病性细菌而产生心理排斥等问题，导致获得的GABA产品难以用于医药、食品等行业。

发明内容

为了开发一种具有生物安全性、高效的GABA生物转化方法，发明人对于众多微生物来源的谷氨酸脱羧酶进行了筛选，筛选出一种能够高效催化L-谷氨酸裂解反应的谷氨酸脱羧酶，其为来源于大肠杆菌E.coli的谷氨酸脱羧酶(EcGAD1，GenBank:CP053601.1)；为了进一步提高其酶活力和温度适应性，还尝试着对其进行突变改造，以及表达系统的优化，所得到的谷氨酸脱羧酶突变体在pH值中性条件下的稳定性显著提高。具体地，本发明包含如下技术方案：

一种谷氨酸脱羧酶突变体，其为野生谷氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1氨基酸序列中下述位点的一个以上、优选两个以上、更优选三个以上、更优选四个以上发生突变后所形成的突变体：第46位的异亮氨酸I46、第79位的精氨酸S79、第189位的甲硫氨酸突变为亮氨酸M189、第245位的丙氨酸A245、第299位的亮氨酸L299、第305位的酪氨酸Y305、第442位的谷氨酸K442，该谷氨酸脱羧酶突变体与SEQ ID NO:1氨基酸序列有98％以上、优选99％以上同源性、具有谷氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1的功能，优选是催化L-谷氨酸裂解反应生成γ-氨基丁酸的功能、但具有更高的酶活力。

上述的术语“突变”包括但不限于氨基酸的取代、缺失或添加。

优选地，上述谷氨酸脱羧酶突变体为谷氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1氨基酸序列中下述位点的一个以上发生突变后所形成的突变体：第46位的异亮氨酸突变为缬氨酸(I46V)，第79位的精氨酸突变为半胱氨酸(S79C)，第189位的甲硫氨酸突变为亮氨酸(M189L)，第245位的丙氨酸突变为谷氨酸(A245E)，第299位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(L299M)，第305位的酪氨酸突变为半胱氨酸(Y305C)，第442位的谷氨酸突变为谷氨酸(K442E)。

优选地，上述谷氨酸脱羧酶突变体为SEQ ID NO:1的I46V、S79C、M189L、A245E、L299M、Y305C、K442E突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3：

MDKKQVTDLRSELLDSRFGAKSISTIAESKRFPLHEMRDDVAFQIVNDELYLDGNARQNLATFCQTWDDENVHKLMDLCINKNWIDKEEYPQSAAIDLRCVNMVADLWHAPAPKNGQAVGTNTIGSSEACMLGGMAMKWRWRKRMEAAGKPTDKPNLVCGPVQICWHKFARYWDVELREIPMRPGQLFLDPKRMIEACDENTIGVVPTFGVTYTGNYEFPQPLHDALDKFQADTGIDIDMHIDAESGGFLAPFVAPDIVWDFRLPRVKSISASGHKFGLAPLGCGWVIWRDEEALPQEMVFNVDCLGGQIGTFAINFSRPAGQVIAQYYEFLRLGREGYTKVQNASYQVAAYLADEIAKLGPYEFICTGRPDEGIPAVCFKLKDGEDPGYTLYDLSERLRLRGWQVPAFTLGGEATDIVVMRIMCRRGFEMDFAELLLEDYEASLKYLSDHPKLQGIAQQNSFKHT(SEQ ID NO:3)。

本发明的第二个方面提供了一种编码上述谷氨酸脱羧酶突变体的基因。

优选地，当表达谷氨酸脱羧酶突变体的微生物是大肠杆菌时，编码谷氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列可以为SEQ ID NO:4；当表达谷氨酸脱羧酶突变体的微生物是枯草芽孢杆菌时，编码谷氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列可以为SEQ ID NO:5。

本发明的第三个方面提供了一种包含上述基因的质粒。该质粒包含用于表达上述基因的载体，当表达谷氨酸脱羧酶突变体的微生物是大肠杆菌时，载体可以是PET系列，比如载体是pET22b、pET24a、pET28a等，但并不受限于此；当表达谷氨酸脱羧酶突变体的微生物是枯草芽孢杆菌时，载体可以是pUB110、pE194、pUCX05-bgaB、pWB980等，例如是pWB980，但并不受限于此。

本发明的第四个方面提供了一种用于表达上述谷氨酸脱羧酶突变体的微生物。例如，该微生物是转化了上述质粒的转化子。

上述微生物可以选自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌，优选枯草芽孢杆菌，更优选枯草芽孢杆菌WB800。

本发明的第五个方面提供了上述谷氨酸脱羧酶突变体或者上述微生物在生产γ-氨基丁酸中的用途。

具体地，在生产γ-氨基丁酸中，以L-谷氨酸或者谷氨酸钠为底物，用上述谷氨酸脱羧酶突变体或者其表达微生物作为催化剂来催化反应。

当使用固定化的上述谷氨酸脱羧酶突变体即固定化酶催化时，反应体系中底物L-谷氨酸的浓度可选择100～300g/L，优选300g/L左右；反应温度选择30～50℃，优选35～45℃，更优选38～42℃，最优选40±0.5℃；pH值选择4.2-6.5，优选4.5-6.0，更优选4.8-5.5最优选5.0±0.5。

上述反应体系中还可以添加磷酸吡哆醛作为辅酶，其转氨基作用有助于促进L-谷氨酸向γ-氨基丁酸的转化。

本发明筛选并经突变获得的谷氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:3催化L-谷氨酸反应时，具有热稳定性好、体系pH适用范围广、底物浓度耐受性高、产品得率高的优点，固定化酶工艺过程不引入病原性杂质，提高了工业化生产γ-氨基丁酸适用性。

附图说明

图1是不同pH值条件下野生谷氨酸脱羧酶BL-gad1和谷氨酸脱羧酶突变体BL-gad4的相对酶活曲线。

图2是表达谷氨酸脱羧酶突变体BL-gad4的质粒pWB980-gad4的结构示意图。

具体实施方式

发明人对于已报到的微生物来源的谷氨酸脱羧酶进行了广泛筛选，比较它们催化L-谷氨酸裂解生成γ-氨基丁酸的酶活力，筛选出来源于大肠杆菌E.coli的谷氨酸脱羧酶(EcGAD1，GenBank:CP053601.1)，氨基酸序列为SEQ ID NO:1：

MDKKQVTDLRSELLDSRFGAKSISTIAESKRFPLHEMRDDVAFQIINDELYLDGNARQNLATFCQTWDDENVHKLMDLSINKNWIDKEEYPQSAAIDLRCVNMVADLWHAPAPKNGQAVGTNTIGSSEACMLGGMAMKWRWRKRMEAAGKPTDKPNLVCGPVQICWHKFARYWDVELREIPMRPGQLFMDPKRMIEACDENTIGVVPTFGVTYTGNYEFPQPLHDALDKFQADTGIDIDMHIDAASGGFLAPFVAPDIVWDFRLPRVKSISASGHKFGLAPLGCGWVIWRDEEALPQELVFNVDYLGGQIGTFAINFSRPAGQVIAQYYEFLRLGREGYTKVQNASYQVAAYLADEIAKLGPYEFICTGRPDEGIPAVCFKLKDGEDPGYTLYDLSERLRLRGWQVPAFTLGGEATDIVVMRIMCRRGFEMDFAELLLEDYKASLKYLSDHPKLQGIAQQNSFKHT(SEQ ID NO:1)。

然后，我们根据计算机模拟的蛋白序列3D模型，通过理性分析及半理性设计，对野生谷氨酸脱羧酶进行突变，以便进一步提高其酶活力。

在本文中，术语“野生(型)”、“野生酶”表示相同的意义，都是指氨基酸序列为SEQID NO:1的谷氨酸脱羧酶。为了表述方便起见，在本文中可以将野生型谷氨酸脱羧酶与其突变体统称为“谷氨酸脱羧酶”。

氨基酸的突变包括取代、缺失或添加。其中，氨基酸的取代包括保守取代和非保守取代，“保守取代”是指具有相似侧链的残基的可互换性，并因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。例如但不限于，具有脂肪族侧链的氨基酸可以用另一种脂肪族氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸取代；具有羟基侧链的氨基酸用另一种具有羟基侧链的氨基酸例如丝氨酸和苏氨酸取代；具有芳香族侧链的氨基酸用另一种具有芳香族侧链的氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸取代；具有碱性侧链的氨基酸用另一种具有碱性侧链的氨基酸例如赖氨酸和精氨酸取代；具有酸性侧链的氨基酸用另一种具有酸性侧链的氨基酸例如天冬氨酸或谷氨酸取代；并且疏水性氨基酸或亲水性氨基酸分别用另一种疏水性氨基酸或亲水性氨基酸取代。“非保守取代”是指用具有显著差别的侧链特性的氨基酸取代多肽中的氨基酸。非保守取代可以利用限定组之间而不是它们之内的氨基酸，并且影响：(a)取代区域(例如，脯氨酸取代甘氨酸)中的肽骨架的结构，(b)电荷或疏水性，或(c)侧链体积。例如但不限于，示例性非保守取代可以是用碱性或脂肪族氨基酸取代酸性氨基酸；用小氨基酸取代芳香族氨基酸；和用疏水性氨基酸取代亲水性氨基酸。

本发明的谷氨酸脱羧酶突变体的氨基酸数量有466个，序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。

这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

众所周知，同样一种核苷酸序列，在不同的微生物宿主中的表达结果往往有很大差异。为了在基因工程中最常用的大肠杆菌、或者生物安全性高的细菌枯草芽孢杆菌中最佳地表达谷氨酸脱羧酶或其突变体，可以对这些酶的表达基因进行了密码子优化。

密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。

为了在生物安全的非致病细菌枯草芽孢杆菌中表达谷氨酸脱羧酶，经密码子优化的谷氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQ ID NO:5。

上述转化体宿主可以使任何适合表达谷氨酸脱羧酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、或者大肠杆菌，优选枯草芽孢杆菌，更优选枯草芽孢杆菌WB800。

提高谷氨酸脱羧酶的使用效率和对反应环境(包括温度、pH、底物/产物浓度)适应性能够有效降低γ-氨基丁酸的生产成本，我们对谷氨酸脱羧酶进行了固定化尝试，取得了一定进展。

酶的固定化是用物理或化学手段，将游离酶封锁在固体材料上、或限制在一定区域内，酶仍然可以发挥催化作用，并可循环使用。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。

生物催化领域公知，与游离酶法相比，应用固定化酶技术具有生产过程简化、生产效率提高等优点。同时，由于酶可多次使用，且酶的稳定性提高，从而有效提高了单位酶的生产力；其次，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

材料和方法

实施例中全基因合成、引物合成及测序皆委托苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

底物L-谷氨酸和产物γ-氨基丁酸的HPLC检测方法如下：

样品前处理：0.5mL稀释样品加入10mL柱前衍生剂(5.5g/L邻苯二甲醛，10％无水乙醇(v/v)，0.4％2-巯基乙醇(v/v)，0.4M硼酸缓冲液，pH9.5)，然后用0.4M硼酸缓冲液(pH9.5)定容至50mL。

HPLC检测条件：waters symmetry C18(4.6×250mm，5μm)，流速为1mL/min，检测波长338nm，

流动相A：20mM醋酸钠，1.2mM三乙胺，0.3％四氢呋喃(v/v)，pH6.20。

流动相B：乙腈和甲醇等体积混合液

梯度程序：

时间	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	90	10
17	40	60
			25	0	100

需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，可将菌株编号、质粒编号、酶编号、酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。比如BL-gad1既可以代表野生谷氨酸脱羧酶表达菌株，也可以代表质粒pET-gad1编号、野生酶SEQ ID NO:1编号、野生酶编码基因SEQ ID NO:2编号。

实施例1：野生谷氨酸脱羧酶基因重组大肠杆菌的构建

根据来源于E.coli的谷氨酸脱羧酶(EcGAD1，GenBank:CP053601.1)氨基酸序列SEQ ID NO:1，对应的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

设计如下引物对GAD-5/GAD-3：

正向引物GAD-5：5’-GGAATTCCATATGGATAAGAAGCAAGTAACG-3’，

反向引物GAD-3：5’-CCGCTCGAGTCAGGTATGTTTAAAGCTGTTC-3’。

以E.coli基因组为模板，进行PCR扩增。

50μL PCR反应体系包括：10ng基因组模板，10pmol的引物对，1xKOD plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，1个单位的KOD-plus DNA聚合酶。

PCR反应条件为：95℃ 3min；98℃ 10s，57℃ 30s，68℃ 2min/kbp，30个循环；68℃10min。

PCR扩增约1.4kb的DNA片段，克隆到pET22b的NdeI/XhoI位点，获得野生型谷氨酸脱羧酶(EcGAD1)表达质粒pET-gad1，将其转化BL21(DE3),获得野生型表达菌株pET-gad1/BL21(DE3)，即BL-gad1。

实施例2：I46V/Y305C双位点突变体构建

第46位和第305位双位点突变体构建步骤如下。

在质粒pET-gad1基础上，利用PCR技术获得I46V/Y305C突变体(EcGAD2)。

设计如下两个引物对I46V-5/I46V-3、Y305C-5/Y305C-3：

引物I46V-5：5’-TGTCGCATTCCAGATTGTTAATGACGAATTATATCT-3’，

引物I46V-3：5’-AATCTGGAATGCGACATCGT-3’；

引物Y305C-5：5’-CTGGGTGGTCAAATTGGTAC-3’，

引物Y305C-3：5’-ACCAATTTGACCACCCAGACAATCAACGTTGAACACCAG-3’。

以质粒pET-gad1为模板，以I46V-5和Y305C-3为引物，PCR扩增约0.8kb的DNA片段GAD1；以质粒pET-gad1为模板，以Y305C-5和I46V-3为引物，PCR扩增约5.4kb的DNA片段GAD2。

PCR扩增条件如下：95℃变性4min；(95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1kb/min)共10循环；(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1kb/min)共20循环；72℃延伸5min。

利用利用南京诺唯赞生物科技有限公司的一步克隆试剂盒将两个DNA片段GAD1和GAD2重组，化学转化DH5a感受态(Novagen)，最终获得含有pET-gad2质粒的DH5a菌株。

实施例3：I46V/Y305C/M189L/A245E/L299M五位点突变体构建

第189位、第245位和第299位突变体构建步骤如下。

在质粒pET-gad2基础上，利用PCR技术进一步获得其M189L/A245E/L299M突变体即野生酶I46V/Y305C/M189L/A245E/L299M突变体(EcGAD3)。

设计如下三个引物对M189L-5/M189L-3、A245E-5/A245E-3、L299M-3/L299M-5：

引物M189L-5：5’-CCGGTCAGTTGTTTCTGGACCCGAAACGCATGATTGA-3’，

引物M189L-3：5’-AATCTGGAATGCGACATCGT-3’；

引物A245E-5：ACATGCACATCGACGCTGAAAGCGGTGGCTTCCTGGCACC，

引物A245E-3：5’-AGCGTCGATGTGCATGTCGA-3’；

引物L299M-5：5’-AGCGCTGCCGCAGGAAATGGTGTTCAACGTTGATTGTCT-3’，

引物L299M-3：5’-TTCCTGCGGCAGCGCTTCTT-3’。

以质粒pET-gad2为模板，以M189L-5和A245E-3为引物，PCR扩增约0.2kb的DNA片段GAD3；以质粒pET-gad2为模板，以A245E-5和L299M-3为引物，PCR扩增约0.2kb的DNA片段GAD4；以质粒pET-gad2为模板，以L299M-5和M189L-3为引物，PCR扩增约5.8kb的DNA片段GAD5。

利用南京诺唯赞生物科技有限公司的一步克隆试剂盒将三个DNA片段GAD3、GAD4和GAD5重组，化学转化DH5a(Novagen)感受态，最终获得含有pET-gad3质粒的DH5a菌株。

实施例4：S79C/K442E/I46V/Y305C/M189L/A245E/L299M七位点突变体构建

第79位和第442位双位点突变体构建步骤如下。

在质粒pET-gad3基础上，利用PCR技术进一步获得S79C/K442E突变体(EcGAD4)。

设计如下两个引物对S79C-5/S79C-3、K442E-3/K442E-5：

引物S79C-5：5’-CAAATTGATGGATTTATGCATTAACAAAAACTGGATCGA-3’，

引物S79C-3：5’-TAAATCCATCAATTTGTGGAC-3’；

引物K442E-5：5’-GTTGCTGGAAGACTACGAAGCTTCCCTGAAATATCTCAG-3’，

引物K442E-3：5’-GTAGTCTTCCAGCAACAGTT-3’。

以质粒pET-gad3为模板，以S79C-5和K442E-3(5’-GTAGTCTTCCAGCAACAGTT-3’)为引物，PCR扩增约1.1kb的DNA片段GAD6；以质粒pHY300PLK-gad3为模板，以K442E-5和S79C-3为引物，PCR扩增约5.1kb的DNA片段GAD7。

利用利用南京诺唯赞生物科技有限公司的一步克隆试剂盒将两个DNA片段GAD6和GAD7重组，重组后产物直接化学转化BL21(DE3)(Novagen)感受态，获得pET-gad4/BL21(DE3)突变体菌株，即BL-gad4。

pET-gad4/BL21(DE3)突变体菌株装载的谷氨酸脱羧酶突变体的核酸序列为SEQID NO:4，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其为野生酶SEQ ID NO:1的I46V、S79C、M189L、A245E、L299M、Y305C、K442E突变体。

实施例5：谷氨酸脱羧酶突变体的活力测定

为了验证设计的谷氨酸脱羧酶突变体BL-gad4的酶活力，挑取重组大肠杆菌BL-gad1和BL-gad4单菌落到含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃震荡培养10～14h，然后转入装有100mL含有50μg/mL硫酸卡那霉素和1mM磷酸吡哆醛的TB培养基，在37℃下培养3h，随后添加终浓度为0.2mM的IPTG诱导表达谷氨酸脱羧酶，30℃下继续培养4h。4℃条件下离心收集菌体细胞，再用冰冷的生理盐水洗涤细胞，4℃条件下再次离心收集菌体细胞，用100mL0.2M醋酸钠缓冲液(pH为5.0)重悬2g菌体，超声破碎制备粗酶溶液。超声破碎条件：25％的能量，工作3s，暂停3s，破碎10min。

在50mL底物测活溶液(0.2M醋酸钠、200mM的谷氨酸钠、1mM的磷酸吡哆醛，pH5.0)下，加入1mL破碎菌体混液，37℃下反应1h，取样后用等体积0.2M硼酸缓冲液(pH 10)的终止反应，95℃处理5min，然后12,000rpm离心15min，取上清进行HPLC检测产物含量。

结果显示，突变菌株BL-gad4活力较野生型BL-gad1提升了约120％，尽管远不如根据计算机3D模型设计所预期的酶活力提高幅度。

实施例6：谷氨酸脱羧酶突变体的pH耐受性测定

参照实施例5中的谷氨酸脱羧酶反应体系配制溶液，分别在不同的pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)条件下测定酶活，确定最适的pH值并分别计算两个谷氨酸脱羧酶的相对酶活。不同pH值条件下酶活占最高酶活比例为相对酶活(％)，以菌株BL-gad1的最高酶活作为100％。

结果表明，野生型菌株BL-gad1和突变菌株的最适反应pH值均为5.0，如图1所示，表明BL-gad1酶的上述突变并没有影响其pH选择性。另一方面，与野生型BL-gad1相比，突变菌株BL-gad4在pH6.0时可保留39％的酶活力，而同等条件下野生型活力酶活残留约10％，表明BL-gad1(即EcGAD1)酶的上述突变拓宽了pH适应性，使得突变体BL-gad4(即EcGAD4)适合更宽的pH变动范围，这对于酶催化反应显然是有利的，因为对于反应体系的pH控制要求不再是特别严格。

实施例7：谷氨酸脱羧酶突变体枯草芽孢杆菌株构建

为了提高酶催化产品γ-氨基丁酸被食品、保健品和药品销售商和消费者的接受度，尝试了通过生物安全的枯草芽孢杆菌进行表达。

根据谷氨酸脱羧酶突变体(EcGAD4)的氨基酸序列SEQ ID NO:3，按照枯草芽孢杆菌的密码子偏好性进行密码子优化，获得SEQ ID NO:5。委托苏州金唯智生物科技有限公司合成SEQ ID NO:5，并将该DNA序列克隆到pWB980载体的BamHI和SphI位点，获得质粒pWB980-gad4，其结构参见图2。将质粒pWB980-gad4转化到枯草芽孢杆菌WB800中，获得菌株WB800-gad4，用于表达谷氨酸脱羧酶突变体。

实施例8：谷氨酸脱羧酶突变体的表达及固定化酶制备

在5L生物反应器中培养WB800-gad4，通过发酵表达谷氨酸脱羧酶突变体EcGAD4。挑取单菌落至含有200mL液体LB培养基的摇瓶中，在30℃，220rpm条件下过夜孵育16h(2瓶)。2瓶过夜菌液各取120mL，转接至5L发酵罐中。5L生物反应器中含3L的KCT培养基(葡萄糖30g、酵母膏62.4g、蛋白胨33.75g、NaCl 30g、KH₂PO₄ 6.9g、K₂HPO₄ 27.3g、MnSO₄ 3.75g、MgSO₄ 1.5g、1mM的磷酸吡哆醛)。温度控制在37℃；转速为450rpm；空气流速为2.5L/h。发酵48h后，在6000rpm条件下离心去除菌体，收集发酵液中的谷氨酸脱羧酶突变体EcGAD4，经截留分子量10kDa的中空纤维膜过滤浓缩。

向500mL的浓缩蛋白液中加入pH8.0磷酸钾盐缓冲液，使得磷酸钾盐缓冲液终浓度达到0.7M，向混合液中加入70g LXTE-600环氧树脂，在25℃，200rpm下固定化40h，纯水洗涤固定化酶3遍，最终获得EcGAD4固定化酶。

实施例9：固定化酶催化合成γ-氨基丁酸的考察

1L反应体积：300g/L的L-谷氨酸，1mM的磷酸吡哆醛，0.2M醋酸钠缓冲液(pH为5.0)，5％(w/V)的EcGAD4固定化酶，40℃，200rpm下搅拌反应16h，经HPLC检测到产物得率85％，底物转化率超过95％。

综上所述，相比野生谷氨酸脱羧酶EcGAD1，本发明构建筛选的谷氨酸脱羧酶突变体EcGAD4(SEQ ID NO:3)催化L-谷氨酸反应生成γ-氨基丁酸的酶活力有了大幅度提高，并且拓宽了对反应体系pH的适应范围，增强了工业化应用的可行性。

序列表

<110> 上海邦林生物科技有限公司

<120> 一种谷氨酸脱羧酶突变体

<130> SHPI2110297

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 466

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 1

Met Asp Lys Lys Gln Val Thr Asp Leu Arg Ser Glu Leu Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Phe Gly Ala Lys Ser Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Lys Arg Phe

20 25 30

Pro Leu His Glu Met Arg Asp Asp Val Ala Phe Gln Ile Ile Asn Asp

35 40 45

Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Arg Gln Asn Leu Ala Thr Phe Cys

50 55 60

Gln Thr Trp Asp Asp Glu Asn Val His Lys Leu Met Asp Leu Ser Ile

65 70 75 80

Asn Lys Asn Trp Ile Asp Lys Glu Glu Tyr Pro Gln Ser Ala Ala Ile

85 90 95

Asp Leu Arg Cys Val Asn Met Val Ala Asp Leu Trp His Ala Pro Ala

100 105 110

Pro Lys Asn Gly Gln Ala Val Gly Thr Asn Thr Ile Gly Ser Ser Glu

115 120 125

Ala Cys Met Leu Gly Gly Met Ala Met Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg

130 135 140

Met Glu Ala Ala Gly Lys Pro Thr Asp Lys Pro Asn Leu Val Cys Gly

145 150 155 160

Pro Val Gln Ile Cys Trp His Lys Phe Ala Arg Tyr Trp Asp Val Glu

165 170 175

Leu Arg Glu Ile Pro Met Arg Pro Gly Gln Leu Phe Met Asp Pro Lys

180 185 190

Arg Met Ile Glu Ala Cys Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Pro Thr

195 200 205

Phe Gly Val Thr Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Pro Gln Pro Leu His

210 215 220

Asp Ala Leu Asp Lys Phe Gln Ala Asp Thr Gly Ile Asp Ile Asp Met

225 230 235 240

His Ile Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Leu Ala Pro Phe Val Ala Pro

245 250 255

Asp Ile Val Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile Ser Ala

260 265 270

Ser Gly His Lys Phe Gly Leu Ala Pro Leu Gly Cys Gly Trp Val Ile

275 280 285

Trp Arg Asp Glu Glu Ala Leu Pro Gln Glu Leu Val Phe Asn Val Asp

290 295 300

Tyr Leu Gly Gly Gln Ile Gly Thr Phe Ala Ile Asn Phe Ser Arg Pro

305 310 315 320

Ala Gly Gln Val Ile Ala Gln Tyr Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Gly Arg

325 330 335

Glu Gly Tyr Thr Lys Val Gln Asn Ala Ser Tyr Gln Val Ala Ala Tyr

340 345 350

Leu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Leu Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Cys Thr

355 360 365

Gly Arg Pro Asp Glu Gly Ile Pro Ala Val Cys Phe Lys Leu Lys Asp

370 375 380

Gly Glu Asp Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Glu Arg Leu Arg

385 390 395 400

Leu Arg Gly Trp Gln Val Pro Ala Phe Thr Leu Gly Gly Glu Ala Thr

405 410 415

Asp Ile Val Val Met Arg Ile Met Cys Arg Arg Gly Phe Glu Met Asp

420 425 430

Phe Ala Glu Leu Leu Leu Glu Asp Tyr Lys Ala Ser Leu Lys Tyr Leu

435 440 445

Ser Asp His Pro Lys Leu Gln Gly Ile Ala Gln Gln Asn Ser Phe Lys

450 455 460

His Thr

465

<210> 2

<211> 1401

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

atggataaga agcaagtaac ggatttaagg tcggaactac tcgattcacg ttttggtgcg 60

aagtctattt ccactatcgc agaatcaaaa cgttttccgc tgcacgaaat gcgcgacgat 120

gtcgcattcc agattatcaa tgacgaatta tatcttgatg gcaacgctcg tcagaaccta 180

gccactttct gccagacttg ggacgacgaa aatgtccaca aattgatgga tttatccatt 240

aacaaaaact ggatcgacaa agaagaatat ccgcaatccg cagccatcga cctacgttgc 300

gtaaatatgg ttgccgatct gtggcatgcg cctgcgccga aaaatggtca ggccgttggc 360

accaacacca ttggttcttc cgaggcctgt atgctcggcg ggatggcgat gaaatggcgt 420

tggcgcaagc gtatggaagc tgcaggcaaa ccaacggata aaccaaacct ggtgtgcggt 480

ccggtacaaa tctgctggca taaattcgcc cgctactggg atgtggagct gcgtgagatc 540

cctatgcgcc ccggtcagtt gtttatggac ccgaaacgca tgattgaagc ctgtgacgaa 600

aacaccatcg gcgtggtgcc gactttcggc gtgacctaca ctggtaacta tgagttccca 660

caaccgctgc acgatgcgct ggataaattc caggccgata ccggtatcga catcgacatg 720

cacatcgacg ctgccagcgg tggcttcctg gcaccgttcg tcgccccgga tatcgtctgg 780

gacttccgcc tgccgcgtgt gaaatcgatc agtgcttcag gccataaatt cggtctggct 840

ccgctgggct gcggctgggt tatctggcgt gacgaagaag cgctgccgca ggaactggtg 900

ttcaacgttg attacctggg tggtcaaatt ggtacttttg ccatcaactt ctcccgcccg 960

gcgggtcagg taattgcaca gtactatgaa ttcctgcgcc tcggtcgtga aggctatacc 1020

aaagtacaga acgcctctta ccaggttgcc gcttatctgg cggatgaaat cgccaaactg 1080

gggccgtatg agttcatctg tacgggtcgc ccggacgaag gcatcccggc ggtttgcttc 1140

aaactgaaag atggtgaaga tccgggatac accctgtatg acctctctga acgtctgcgt 1200

ctgcgcggct ggcaggttcc ggccttcact ctcggcggtg aagccaccga catcgtggtg 1260

atgcgcatta tgtgtcgtcg cggcttcgaa atggactttg ctgaactgtt gctggaagac 1320

tacaaagctt ccctgaaata tctcagcgat cacccgaaac tgcagggtat tgcccaacag 1380

aacagcttta aacatacctg a 1401

<210> 3

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Asp Lys Lys Gln Val Thr Asp Leu Arg Ser Glu Leu Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Phe Gly Ala Lys Ser Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Lys Arg Phe

20 25 30

Pro Leu His Glu Met Arg Asp Asp Val Ala Phe Gln Ile Val Asn Asp

35 40 45

Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Arg Gln Asn Leu Ala Thr Phe Cys

50 55 60

Gln Thr Trp Asp Asp Glu Asn Val His Lys Leu Met Asp Leu Cys Ile

65 70 75 80

Asn Lys Asn Trp Ile Asp Lys Glu Glu Tyr Pro Gln Ser Ala Ala Ile

85 90 95

Asp Leu Arg Cys Val Asn Met Val Ala Asp Leu Trp His Ala Pro Ala

100 105 110

Pro Lys Asn Gly Gln Ala Val Gly Thr Asn Thr Ile Gly Ser Ser Glu

115 120 125

Ala Cys Met Leu Gly Gly Met Ala Met Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg

130 135 140

Met Glu Ala Ala Gly Lys Pro Thr Asp Lys Pro Asn Leu Val Cys Gly

145 150 155 160

Pro Val Gln Ile Cys Trp His Lys Phe Ala Arg Tyr Trp Asp Val Glu

165 170 175

Leu Arg Glu Ile Pro Met Arg Pro Gly Gln Leu Phe Leu Asp Pro Lys

180 185 190

Arg Met Ile Glu Ala Cys Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Pro Thr

195 200 205

Phe Gly Val Thr Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Pro Gln Pro Leu His

210 215 220

Asp Ala Leu Asp Lys Phe Gln Ala Asp Thr Gly Ile Asp Ile Asp Met

225 230 235 240

His Ile Asp Ala Glu Ser Gly Gly Phe Leu Ala Pro Phe Val Ala Pro

245 250 255

Asp Ile Val Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile Ser Ala

260 265 270

Ser Gly His Lys Phe Gly Leu Ala Pro Leu Gly Cys Gly Trp Val Ile

275 280 285

Trp Arg Asp Glu Glu Ala Leu Pro Gln Glu Met Val Phe Asn Val Asp

290 295 300

Cys Leu Gly Gly Gln Ile Gly Thr Phe Ala Ile Asn Phe Ser Arg Pro

305 310 315 320

Ala Gly Gln Val Ile Ala Gln Tyr Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Gly Arg

325 330 335

Glu Gly Tyr Thr Lys Val Gln Asn Ala Ser Tyr Gln Val Ala Ala Tyr

340 345 350

Leu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Leu Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Cys Thr

355 360 365

Gly Arg Pro Asp Glu Gly Ile Pro Ala Val Cys Phe Lys Leu Lys Asp

370 375 380

Gly Glu Asp Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Glu Arg Leu Arg

385 390 395 400

Leu Arg Gly Trp Gln Val Pro Ala Phe Thr Leu Gly Gly Glu Ala Thr

405 410 415

Asp Ile Val Val Met Arg Ile Met Cys Arg Arg Gly Phe Glu Met Asp

420 425 430

Phe Ala Glu Leu Leu Leu Glu Asp Tyr Glu Ala Ser Leu Lys Tyr Leu

435 440 445

Ser Asp His Pro Lys Leu Gln Gly Ile Ala Gln Gln Asn Ser Phe Lys

450 455 460

His Thr

465

<210> 4

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atggataaga agcaagtaac ggatttaagg tcggaactac tcgattcacg ttttggtgcg 60

aagtctattt ccactatcgc agaatcaaaa cgttttccgc tgcacgaaat gcgcgacgat 120

gtcgcattcc agattgttaa tgacgaatta tatcttgatg gcaacgctcg tcagaaccta 180

gccactttct gccagacttg ggacgacgaa aatgtccaca aattgatgga tttatgcatt 240

aacaaaaact ggatcgacaa agaagaatat ccgcaatccg cagccatcga cctacgttgc 300

gtaaatatgg ttgccgatct gtggcatgcg cctgcgccga aaaatggtca ggccgttggc 360

accaacacca ttggttcttc cgaggcctgt atgctcggcg ggatggcgat gaaatggcgt 420

tggcgcaagc gtatggaagc tgcaggcaaa ccaacggata aaccaaacct ggtgtgcggt 480

ccggtacaaa tctgctggca taaattcgcc cgctactggg atgtggagct gcgtgagatc 540

cctatgcgcc ccggtcagtt gtttctggac ccgaaacgca tgattgaagc ctgtgacgaa 600

aacaccatcg gcgtggtgcc gactttcggc gtgacctaca ctggtaacta tgagttccca 660

caaccgctgc acgatgcgct ggataaattc caggccgata ccggtatcga catcgacatg 720

cacatcgacg ctgaaagcgg tggcttcctg gcaccgttcg tcgccccgga tatcgtctgg 780

gacttccgcc tgccgcgtgt gaaatcgatc agtgcttcag gccataaatt cggtctggct 840

ccgctgggct gcggctgggt tatctggcgt gacgaagaag cgctgccgca ggaaatggtg 900

ttcaacgttg attgtctggg tggtcaaatt ggtacttttg ccatcaactt ctcccgcccg 960

gcgggtcagg taattgcaca gtactatgaa ttcctgcgcc tcggtcgtga aggctatacc 1020

aaagtacaga acgcctctta ccaggttgcc gcttatctgg cggatgaaat cgccaaactg 1080

gggccgtatg agttcatctg tacgggtcgc ccggacgaag gcatcccggc ggtttgcttc 1140

aaactgaaag atggtgaaga tccgggatac accctgtatg acctctctga acgtctgcgt 1200

ctgcgcggct ggcaggttcc ggccttcact ctcggcggtg aagccaccga catcgtggtg 1260

atgcgcatta tgtgtcgtcg cggcttcgaa atggactttg ctgaactgtt gctggaagac 1320

tacgaagctt ccctgaaata tctcagcgat cacccgaaac tgcagggtat tgcccaacag 1380

aacagcttta aacatacctg a 1401

<210> 5

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atggataaga aacaagttac agatctgaga tcagaactgc tggattcaag atttggcgca 60

aaatcaattt caacaattgc agaatcaaaa agatttccgc tgcatgaaat gagagatgat 120

gttgcatttc aaattgttaa tgatgaactg tatctggatg gcaatgcaag acaaaatctg 180

gcaacatttt gccaaacatg ggatgatgaa aatgttcaca aactgatgga tctgtgcatt 240

aataaaaatt ggattgataa agaagaatat ccgcaatcag cagcaattga tctgagatgc 300

gttaatatgg ttgcagatct gtggcatgca ccggcaccga aaaatggcca agcagttggc 360

acaaatacaa tcggatcatc agaagcatgc atgctgggcg gcatggcaat gaaatggaga 420

tggagaaaaa gaatggaagc agcgggcaaa ccgacagata aaccgaatct ggtttgcggc 480

ccggttcaaa tttgctggca taaatttgca agatattggg atgttgaact gagagaaatt 540

ccgatgagac cgggccaact gtttcttgat ccgaaaagaa tgattgaagc atgcgatgaa 600

aatacaattg gcgttgttcc gacatttggc gttacatata cgggcaatta tgaatttccg 660

cagccgctgc atgatgcact ggataaattt caagcagata cgggcattga tattgatatg 720

catattgatg cagaaagcgg cggctttctg gcaccgtttg ttgcaccgga tattgtttgg 780

gattttagac tgccgagagt taagtcaatt tcagcaagcg gccataaatt tggcctggca 840

ccgctgggct gcggctgggt tatttggaga gatgaagaag cactgccgca agaaatggtt 900

tttaatgttg attgcctggg cggccaaatt ggcacatttg caattaattt ttcaagaccg 960

gcgggccaag ttattgcaca atattatgaa ttcctgagac tgggcagaga aggctataca 1020

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ggcccgtatg aatttatttg cacgggcaga ccggatgaag gcattccggc agtttgcttt 1140

aaactgaaag atggcgaaga tccgggctat acactgtatg atctgtcaga aagactgaga 1200

ctgagaggct ggcaagttcc ggcatttaca ctgggcggcg aagcaacaga tattgttgtt 1260

atgagaatta tgtgcagaag aggctttgaa atggattttg cagaactgct tctggaagat 1320

tatgaagcat cactgaaata tctgtcagat catccgaaac tgcaaggcat tgcacaacaa 1380

aattcattta aacatacata a 1401

Claims

1.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，其为谷氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1氨基酸序列中下述位点的一个以上、优选两个以上、更优选三个以上、更优选四个以上发生突变后所形成的突变体：I46、S79、M189、A245、L299、Y305、K442，该谷氨酸脱羧酶突变体具有催化L-谷氨酸裂解为γ-氨基丁酸的功能。

2.如权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，其为谷氨酸脱羧酶SEQ IDNO:1氨基酸序列中发生一个以上选自下组的突变后所形成的突变体：I46V、S79C、M189L、A245E、L299M、Y305C、K442E。

3.如权利要求2所述的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1的I46V、S79C、M189L、A245E、L299M、Y305C、K442E突变体。

4.编码如权利要求1-3中任一项所述谷氨酸脱羧酶突变体的基因。

5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，当表达谷氨酸脱羧酶突变体的微生物是大肠杆菌时，编码谷氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4；当表达谷氨酸脱羧酶突变体的微生物是枯草芽孢杆菌时，编码谷氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:5。

6.包含如权利要求6所述基因的质粒。

7.一种用于表达如权利要求4所述谷氨酸脱羧酶突变体的微生物。例如，该微生物是转化了如权利要求6所述质粒的转化子。

8.如权利要求7所述的微生物，其特征在于，选自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌，优选枯草芽孢杆菌。

9.如权利要求1-3中任一项所述谷氨酸脱羧酶突变体或者如权利要求7所述微生物在生产γ-氨基丁酸中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，以L-谷氨酸或者谷氨酸钠为底物，催化合成γ-氨基丁酸。