CN110904077B - 低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10及制备和用途 - Google Patents

低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10及制备和用途 Download PDF

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Abstract

本发明公开了一种低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10及制备和用途，该突变体MutLK10的氨基酸序列由野生木糖苷酶HJ14GH43第317～329位的氨基酸序列KIEEKVFAPTYHT突变为SVEEVSWEKDYDE获得，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的木糖苷酶突变体MutLK10与野生酶HJ14GH43相比，其热适应性质发生了变化，MutLK10在20℃具有更高的酶活，更容易热变性，使得易于通过温度变化控制酶催化反应，能够应用于食品、酿酒、水产等行业。

Description

低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10及制备和用途
技术领域
本发明涉及一种木糖苷酶突变体，具体涉及一种低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10及制备和用途。
背景技术
木聚糖主要来源于植物细胞壁，约占植物细胞干重的15％～35％，其主链由木糖聚合而成，具有多样的侧链取代基团，完全水解木聚糖需要多种酶的协同作用，包括内切木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanase，EC3.2.1.8)和木糖苷酶(β-D-xylosidase，EC3.2.1.37)等。内切木聚糖酶可随机地切割木聚糖的主链骨架，生成低聚木糖，而木糖苷酶可将低聚木糖水解为木糖(Collins et al.FEMS Microbiology Reviews,2005,29:3～23.)。木糖可作为原料，用于生产乙醇、乳酸、木糖醇等。除了木聚糖外，植物的糖蛋白和动物体内的蛋白聚糖中也含有木糖，其皆可被木糖苷酶降解(Leszczuk et al.Plant Physiology andBiochemistry,2019,139:681～690；Takagaki et al.The Journal of BiologicalChemistry,1990,265:854～860.)。
低温酶可应用于低温环境要求下的生物技术领域，如：清酒和葡萄酒的发酵温度一般<25℃，水产生境常常为10～25℃。低温下的处理(如：果汁澄清)可防止微生物的污染、营养损失和食品品质降低，将中温或者高温处理方式转为低温处理方式还可起到降低能耗的作用(Cavicchioli et al.Microbial Biotechnology,2011,4(4):449～460.)。低温活性越高的酶往往对热越敏感，即越容易热变性，热变性又使酶容易被降解，该特性使酶的催化反应得以简易控制，同时使酶的使用更具安全性，在低温生物技术特别是食品领域具有应用的价值。因此，低温适应性更优的酶具有重要的开发价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10及制备和用途，该突变体MutLK10能够适应低温，且在温度提高后活性降低，易于控制酶催化反应。
为了达到上述目的，本发明提供了一种低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10，该突变体MutLK10的氨基酸序列由野生木糖苷酶HJ14GH43第317～329位的氨基酸序列KIEEKVFAPTYHT突变为SVEEVSWEKDYDE获得，其序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种编码所述的木糖苷酶突变体MutLK10的基因mutlk10，该基因mutlk10的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种含有所述的基因mutlk10的重组载体。
优选地，所述重组载体采用pEasy-E1。
本发明还提供了一种含有所述的基因mutlk10的重组菌。
优选地，所述重组菌采用的宿主细胞包含：大肠杆菌BL21。
本发明还提供了所述的木糖苷酶突变体MutLK10在食品、酿酒、水产行业中的应用。
优选地，所述木糖苷酶突变体MutLK10用于在低温中对木聚糖或/和含木糖基的物质进行降解，所述低温为10～25℃。
优选地，通过调高温度控制木糖苷酶突变体MutLK10对木聚糖或/和含木糖基的物质的降解。
本发明还提供了一种所述的木糖苷酶突变体MutLK10的制备方法，该方法包含：
将所述的基因mutlk10与表达载体相连接，获得重组载体；将所述重组载体转化宿主细胞，获得重组菌；培养所述重组菌株，诱导木糖苷酶突变体MutLK10表达，回收并纯化表达的木糖苷酶突变体MutLK10。
本发明的低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10及制备和用途，具有以下优点：
与野生酶HJ14GH43相比，突变酶MutLK10的热适应性质发生了变化，MutLK10在20℃具有更高的酶活，更容易热变性，使得易于通过温度变化控制酶催化反应。野生酶HJ14GH43的最适温度为25℃，突变酶MutLK10的最适温度为20℃；野生酶HJ14GH43分别在10℃和20℃时处理60min，酶活分别剩余88％和70％，而突变酶MutLK10在10℃时处理60min，酶活剩余69％，MutLK10在20℃时半衰期约为20min。本发明的低温适应性改良的木糖苷酶突变体MutLK10可应用于食品、酿酒、水产等行业。
附图说明
图1为野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10的SDS-PAGE分析结果。
图2为纯化的突变酶MutLK10的pH活性结果。
图3为纯化的突变酶MutLK10的pH稳定性结果。
图4为纯化的突变酶MutLK10的热活性结果。
图5为纯化的突变酶MutLK10的热稳定性结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实验例中的实验材料和试剂如下：
菌株及载体：大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和表达载体pEasy-E1均购自北京全式金生物技术有限公司；
酶类及其它生化试剂：pNP(p-nitrophenol)和pNPX(p-nitrophenyl-β-d-xylopyranoside)均购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)；
LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
以下实验例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实验例1表达载体的构建和转化
根据GenBank记录的木糖苷酶核苷酸序列KY391885(SEQ ID NO.4)，合成野生木糖苷酶HJ14GH43的编码基因hJ14GH43；另合成突变酶MutLK10的编码基因mutlk10(SEQ IDNO.2)。
将合成的木糖苷酶核苷酸和突变酶MutLK10核苷酸序列分别和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含hJ14GH43和mutlk10的表达载体；将连接产物分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得分别表达野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10的重组菌株。
实验例2野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10的制备
将含hJ14GH43和mutlk10的重组菌株以0.1％的接种量分别接种于LB(含100μgmL- 1Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。
然后，将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100μgmL-1Amp)培养液中，快速振荡培养约2～3h(OD600达到0.6-1.0)后，加入终浓度0.1mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h。
12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0 Tris～HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。
以上胞内浓缩的粗酶液经12,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTAAgarose和0～500mM的咪唑分别亲和和洗脱目的蛋白，获得纯化的目的蛋白。
如图1所示，为野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10的SDS-PAGE分析结果(M：蛋白质Marker；W：HJ14GH43)，表明野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10在大肠杆菌中都得到了表达，经纯化后，产物均为单一条带。
实验例3纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10的性质测定
采用pNP法测定纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10的活性，具体如下：
将pNPX溶于缓冲液中，使其终浓度为2mM；反应体系含50μL适量酶液，450μL的2mM底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液再反应适当时间，然后加2mL 1M Na2CO3终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定释放出的pNP；1个酶活单位(U)定义为每分钟分解底物产生1μmo lpNP所需的酶量。
1、纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10的pH活性和pH稳定性测定
酶的最适pH测定：将酶液置于20℃下和pH6.0～9.0的缓冲液中进行酶促反应，以pNPX为底物，反应10min，测定纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10的酶学性质。
酶的pH稳定性测定：将酶液置于pH6.0～9.0的缓冲液中，在10℃下处理1h，然后在pH7.0及20℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照，以pNPX为底物，反应10min，测定纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10的酶学性质。
上述缓冲液为：McIlvaine buffer(pH6.0～8.5)和0.1M glycine-NaOH(pH9.0)。
如图2所示，为纯化的突变酶MutLK10的pH活性结果，表明野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10在pH6.0～9.0中具有活性，最适pH都为7.0，但在偏碱性条件下(pH7.5～9.0)，突变酶MutLK10的活性低于野生酶HJ14GH43。
如图3所示，为纯化的突变酶MutLK10的pH稳定性结果，表明野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10的pH稳定性非常相似，两者在pH7.0～8.0的缓冲液中保持稳定，经pH7.0～8.0缓冲液在20℃下处理1h，酶活剩余达80％以上。
2、纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10的热活性及热稳定性测定
酶的热活性测定：在pH7.0的缓冲液中，于0～40℃下进行酶促反应，以pNPX为底物，反应10min，测定纯化的突变酶MutLK10的酶学性质。
酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液分别置于10℃和20℃，处理0～60min后，在pH7.0及20℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照，以pNPX为底物，反应10min，测定纯化的突变酶MutLK10的酶学性质。
如图4所示，为纯化的突变酶MutLK10的热活性结果，表明野生酶HJ14GH43的最适温度为25℃，在0℃、10℃、20℃和30℃分别具有14.5％、46.4％、88.2％和87.7％的酶活；突变酶MutLK10的最适温度为20℃，在0℃、10℃、25℃和30℃分别具有12.7％、44.8％、81.4％和47.8％的酶活。
如图5所示，为纯化的突变酶MutLK10的热稳定性结果，表明野生酶H J14GH43在10℃时处理60min，酶活剩余88％，在20℃时处理60min，酶活剩余70％；突变酶MutLK10在10℃时处理60min，酶活剩余69％，MutLK10在20℃时半衰期约为20min。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 云南师范大学
<120> 低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10及制备和用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 535
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Lys Ile Thr Asn Pro Val Leu Lys Gly Phe Asn Pro Asp Pro Ser
1 5 10 15
Ile Cys Arg Val Gly Glu Asp Tyr Tyr Met Ala Val Ser Thr Phe Glu
20 25 30
Trp Phe Pro Gly Val Gln Ile Tyr His Ser Lys Asp Leu Val His Trp
35 40 45
Arg Leu Ala Ala Arg Pro Leu Gln Lys Thr Ser Gln Leu Asp Met Lys
50 55 60
Gly Asn Pro Asp Ser Gly Gly Val Trp Ala Pro Cys Leu Ser Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Gly Gln Phe Trp Leu Ile Tyr Ser Asp Ile Lys Val Val Asp Gly
85 90 95
Pro Phe Lys Asp Gly His Asn Tyr Leu Val Thr Ala Ser Glu Val Asp
100 105 110
Gly Asp Trp Ser Glu Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Gly Phe Asp Pro
115 120 125
Ser Leu Phe His Asp His Ser Gly Lys Lys Tyr Val Leu Asn Met Leu
130 135 140
Trp Asp His Arg Glu Lys His His Ser Phe Ala Gly Ile Ala Leu Gln
145 150 155 160
Glu Tyr Ser Val Ala Glu Lys Lys Leu Ile Gly Gln Arg Lys Val Ile
165 170 175
Phe Lys Gly Thr Pro Ile Lys Leu Thr Glu Ala Pro His Leu Tyr His
180 185 190
Ile Gly Asp Tyr Tyr Tyr Leu Leu Thr Ala Glu Gly Gly Thr Arg Tyr
195 200 205
Glu His Ala Ala Thr Ile Ala Arg Ser Ser His Ile Glu Gly Pro Tyr
210 215 220
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225 230 235 240
His Pro Leu Gln Lys Cys Gly His Ala Ser Ile Val Gln Thr His Thr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Thr Ala Ile Gln Lys Leu Glu Trp Lys Asp Gly Trp Pro Tyr Val Val
290 295 300
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305 310 315 320
Val Ser Trp Glu Lys Asp Tyr Asp Glu Val Asp Glu Phe Lys Glu Ser
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Glu Ser Leu Thr Ser Lys Phe Thr Gln Ala Phe Val Ala Arg Arg Trp
370 375 380
Gln Ser Phe Tyr Phe Glu Ala Glu Thr Ala Val Ser Phe Phe Pro Glu
385 390 395 400
Asn Phe Gln Gln Ala Ala Gly Leu Val Asn Tyr Tyr Asn Thr Glu Asn
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Trp Lys Glu Ile Asp Val Pro Phe Glu Ser Ile His Leu Ser Asp Asp
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<213> Artificial Sequence
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385 390 395 400
Asn Phe Gln Gln Ala Ala Gly Leu Val Asn Tyr Tyr Asn Thr Glu Asn
405 410 415
Trp Thr Ala Leu Gln Val Thr Tyr Asp Glu Glu Leu Gly Arg Thr Leu
420 425 430
Glu Leu Ser Val Cys Gln Asn Leu Ala Phe Ser Gln Pro Leu Thr His
435 440 445
Lys Ile Ile Ile Pro Asp Glu Val Thr Tyr Val Tyr Leu Lys Val Thr
450 455 460
Val Arg Lys Glu Thr Tyr Lys Tyr Ser Tyr Ser Phe Asp Gln Lys Glu
465 470 475 480
Trp Lys Glu Ile Asp Val Pro Phe Glu Ser Ile His Leu Ser Asp Asp
485 490 495
Phe Ile Arg Gly Gly Gly Phe Phe Thr Gly Ala Phe Val Gly Met Gln
500 505 510
Cys Gln Asp Thr Ser Gly Glu Arg Leu Pro Ala Asp Phe His Tyr Phe
515 520 525
Arg Tyr Glu Glu Thr Asp Glu
530 535
<210> 4
<211> 1608
<212> DNA
<213> KY391885
<400> 4
atgaagatta ccaatccagt gctcaaaggg tttaatcctg atccaagtat ttgccgtgta 60
ggagaagatt attatatggc cgtctctaca tttgaatggt ttccaggggt gcaaatttat 120
cattcaaagg atctcgtcca ttggcgtctt gctgcgcgtc cattgcaaaa aacgtcgcag 180
ctggatatga aggggaatcc tgactctggc ggggtatggg cgccgtgctt aagctatgct 240
gatgggcagt tttggcttat ttattcagat atcaaagtag tggatggccc atttaaagac 300
ggtcataatt atttggtcac ggcaagcgag gtggacggcg attggagtga accgatcctg 360
ctcaacagct ctggctttga tccatcttta ttccatgatc acagcgggaa gaaatacgtc 420
ttaaatatgc tgtgggatca tagggaaaag catcattcgt ttgcaggtat tgccttgcag 480
gaatatagtg tggctgaaaa gaagctcatc ggtcaaagga aggtcatttt taaaggcaca 540
ccgattaaac tgacagaagc gccgcatctg tatcatatcg gtgactacta ctatttatta 600
acggcagaag gaggtacccg gtatgagcat gcagcaacga tcgcccggtc ctcgcatatt 660
gaagggcctt atgaggttca tcctgataac ccgattgtaa gtgccttcca tgtgcctgaa 720
catccgcttc aaaaatgcgg gcatgcttca atcgttcaaa cgcatacaaa tgaatggtat 780
ctcgctcatc tcactggccg cccgattcaa tccagcaagg aatcgatttt tcaacagaga 840
gggtggtgcc ctttaggaag agaaacagcg atccaaaagc ttgaatggaa ggatggatgg 900
ccttatgttg taggcggaaa agaggggacg ctagaggttg aagcgccaaa gatcgaagaa 960
aaggtttttg caccaaccta tcatacagtc gatgaattta aagaatcaac tctaaataga 1020
cactttcaaa cattaagaat tccgtttacc gatcagattg gttcgttaac ggagaaacct 1080
cagcatttaa ggttattcgg ccgtgaatct ttaacgtcta agtttaccca agcatttgtt 1140
gcaagacgct ggcaaagctt ttattttgaa gcagagacag ctgtttcgtt cttcccagaa 1200
aactttcagc aagccgcagg tcttgtgaat tattataata cggaaaactg gacagcactc 1260
caggtgacat atgatgagga acttggccgc acgcttgaac tatccgtctg tcaaaacctt 1320
gccttttctc agccgttgac acataaaatc atcattcctg acgaggtcac ttatgtctat 1380
ttaaaagtga ccgttcggaa agagacatat aaatattctt attcatttga tcagaaagag 1440
tggaaggaaa ttgatgtacc gtttgaatcc atccatttat ccgatgattt cattcgaggt 1500
gggggttttt ttacaggggc atttgtcggt atgcagtgcc aagatacgag cggcgagcgt 1560
cttcctgctg attttcacta ttttcgctat gaggaaacag acgaataa 1608

Claims (10)

1.一种低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10，其特征在于，该突变体MutLK10的氨基酸序列由野生木糖苷酶HJ14GH43第317～329位的氨基酸序列KIEEKVFAPTYHT突变为SVEEVSWEKDYDE获得，其序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码如权利要求1所述的木糖苷酶突变体MutLK10的基因mutlk10，其特征在于，该基因mutlk10的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种含有如权利要求2所述的基因mutlk10的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体采用pEasy-E1。
5.一种含有如权利要求2所述的基因mutlk10的重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌采用的宿主细胞包含：大肠杆菌BL21。
7.如权利要求1所述的木糖苷酶突变体MutLK10在食品、水产行业中的应用，食品行业包含酿酒。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述木糖苷酶突变体MutLK10用于在低温中对木聚糖或/和含木糖基的物质进行降解，所述低温为10～25℃。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，通过调高温度控制木糖苷酶突变体MutLK10对木聚糖或/和含木糖基的物质的降解。
10.一种如权利要求1所述的木糖苷酶突变体MutLK10的制备方法，其特征在于，该方法包含：
将如权利要求2所述的基因mutlk10与表达载体相连接，获得重组载体；将所述重组载体转化宿主细胞，获得重组菌；培养所述重组菌株，诱导木糖苷酶突变体MutLK10表达，回收并纯化表达的木糖苷酶突变体MutLK10。
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