CN112980814A - 低温适应性提高的外切菊粉酶突变体MutV268Δ13 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低温适应性提高的外切菊粉酶突变体MutV268Δ13，该突变体MutV268Δ13具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。与野生酶InuAMN8相比，突变酶MutV268Δ13的热活性和热稳定性发生了改变，在低温下的活性提高，在中温下的活性和稳定性降低，有利于应用于低温环境要求下的生物技术领域。温度从0℃上升到25℃，InuAMN8的活性从15％上升到74％，MutV268Δ13的活性从24％上升到94％；50℃处理后，InuAMN8保持81％以上的活性，MutV268Δ13的酶活从25％降至0％。本发明的突变体MutV268Δ13可应用于食品、酿酒和洗涤等行业。

Description

低温适应性提高的外切菊粉酶突变体MutV268Δ13

技术领域

本发明涉及一种外切菊粉酶突变体，具体涉及一种低温适应性提高的外切菊粉酶突变体MutV268Δ13。

背景技术

菊粉主要存在于菊芋、菊苣、蒲公英、牛蒡和朝鲜蓟等植物体的根部或茎部，是一种来源丰富的可再生资源。菊芋价格低廉、产量高，更重要的是菊芋属于非粮作物，这些特点使菊芋的有效利用成为关注的焦点。

外切菊粉酶是一类能水解β-2,1-D-果聚糖的水解酶，可将菊粉降解，生成糖含量高达95％的果糖浆。果糖广泛用于食品、医药、生物能源等行业。因而，外切菊粉酶可应用于食品、酿酒和医药等行业中(Singh RS et al.Inter national Journal of BiologicalMacromolecules,2017,96:312–322.)。

在一些实际的应用中，需要低温环境，例如低温下的食品处理可防止微生物的污染、营养损失和食品品质降低，清酒和葡萄酒的发酵、水产养殖环境、洗涤、污水处理通常在低温下进行；此外，低温处理还可降低能耗(Ca vicchioli et al.MicrobialBiotechnology,2011,4(4):449–460.)。因此，低温酶具有重要的开发价值，提高酶在低温下的催化活性将有利于酶在食品、酿酒和洗涤等行业中的应用。

低温酶除了在低温下具有高的催化活性外，还常常容易热变性，热变性又使酶容易被降解，该特性使酶的催化反应得以简易控制，同时使酶的使用更具安全性，在食品、酿酒和洗涤等行业中具有应用的价值。因此，需要获得耐热性降低的突变酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种低温适应性提高的外切菊粉酶突变体 MutV268Δ13，该突变体MutV268Δ13的热活性和热稳定性发生了改变，在低温下的活性提高，在中温下的活性和稳定性降低，能够应用于食品、酿酒和洗涤等行业。

为了达到上述目的，本发明提供了低温适应性提高的外切菊粉酶突变体 MutV268Δ13，该突变体MutV268Δ13具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。与GenBank记录的外切菊粉酶序列AGC01505(SEQ ID NO.3)相比， MutV268Δ13少了13个氨基酸，即少了AGC01505的第268位至280位的 VTEGLQKDSSRMR这13个氨基酸。

本发明的突变体MutV268Δ13，最适温度为30℃，在40℃和50℃时分别具有55％和9％的活性，温度从0℃上升到25℃，MutV268Δ13的活性从 24％上升到94％；50℃处理10–40min后，MutV268Δ13的酶活从25％降至 0％；该酶可水解菊粉产生果糖。

本发明的另一目的是提供所述的突变体MutV268Δ13的编码基因 mutV268Δ13。

优选地，该编码基因mutV268Δ13具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供包含所述的编码基因mutV268Δ13的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含所述的编码基因mutV268Δ13的重组菌。

本发明的另一目的是提供所述的突变体MutV268Δ13的制备方法，该方法包含：将具有如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的野生外切菊粉酶基因 inuAMN8和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含inuAMN8的重组表达质粒 pEasy-E1-inuAMN8；以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板，以如SEQ ID NO.7 和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的突变引物，通过PCR扩增得到包含 mutV268Δ13的重组表达质粒pEasy-E1-mutV268Δ13；将重组表达质粒 pEasy-E1-mutV268Δ13转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含mutV268Δ13的重组菌株；培养重组菌株，诱导重组外切菊粉酶突变体MutV268Δ13表达，以获得重组外切菊粉酶突变体MutV268Δ13。

优选地，所述包含mutV268Δ13的重组菌株的制备为，将所述重组表达质粒pEasy-E1-mutV268Δ13经DpnI酶消化，利用Mut

II Fast Mutagenesis Kit试剂盒将消化产物进行连接，再通过热激方式转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。

优选地，所述诱导采用IPTG进行诱导。

优选地，所述重组外切菊粉酶突变体MutV268Δ13表达的产物经 Nickel-NTAAgarose和0–500mM的咪唑分别亲和和纯化，获得重组外切菊粉酶突变体MutV268Δ13。

本发明的另一目的是提供所述的突变体MutV268Δ13在食品、酿酒及洗涤中的应用。

本发明的低温适应性提高的外切菊粉酶突变体MutV268Δ13，具有以下优点：

与野生酶InuAMN8相比，突变酶MutV268Δ13的热活性和热稳定性发生了改变，突变酶MutV268Δ13在低温下的活性提高，在中温下的活性和稳定性降低，有利于应用于低温环境要求下的生物技术领域。野生酶InuAMN8 的最适温度为35℃，在40℃和50℃时分别具有94％和40％的活性，温度从 0℃上升到25℃，InuAMN8的活性从15％上升到74％；突变体MutV268Δ13 的最适温度为30℃，在40℃和50℃时分别具有55％和9％的活性，温度从0℃上升到25℃，MutV268Δ13的活性从24％上升到94％；50℃处理10–60min 后，InuAMN8保持81％以上的活性；50℃处理10–40min后，MutV268Δ13 的酶活从25％降至0％。本发明的低温外切菊粉酶突变体MutV268Δ13可应用于食品、酿酒和洗涤等行业。

附图说明

图1为野生酶InuAMN8和突变酶MutV268Δ13的SDS-PAGE分析。

图2为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutV268Δ13的热活性。

图3为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutV268Δ13在45℃时的稳定性。

图4为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutV268Δ13在50℃时的稳定性。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中的实验材料和试剂：

1、菌株及载体

大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和表达载体pEasy-E1可购自北京全式金生物技术有限公司；节杆菌(Arthrobacter sp.)由云南师范大学提供，保藏于云南省微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为YMF 4.00006。

2、酶类及其它生化试剂

Nickel-NTA Agarose购自QIAGEN公司，DNA聚合酶、dNTP及Mut

II FastMutagenesis Kit试剂盒购自南京诺维赞公司，菊粉购自Alfa Aesar公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基

LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000 mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1野生酶InuAMN8表达载体的构建和转化

提取节杆菌基因组DNA：将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入1mL 溶菌酶，37℃处理60min，然后按照细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)说明书提取节杆菌基因组DNA，置于-20℃备用。

根据GenBank记录的外切菊粉酶核苷酸序列JQ863111(SEQ ID NO. 4)，设计引物5'-ATGAATTCATTGACGACGGC-3'(SEQ ID NO.5)和5'- TCAACGGCCGACGACGTCGA-3'(SEQ IDNO.6)，以节杆菌基因组DN A为模板进行PCR扩增，PCR反应参数为：95℃变性5min；然后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环后72℃保温5 min。PCR结果得到野生外切菊粉酶InuAMN8的编码基因inuAMN8。根据外切菊粉酶核苷酸序列JQ863111，inuAMN8也可以通过基因合成得到。

将外切菊粉酶基因inuAMN8和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含in uAMN8的重组表达质粒pEasy-E1-inuAMN8。

通过热激方式，将pEasy-E1-inuAMN8转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含inuAMN8的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/inuAMN8。

实施例2突变酶MutV268Δ13表达载体的构建和转化

设计引物5'-TTCCGGATCGACTGAGTACGGCTGGCTGGACTG-3'(SE Q ID NO.7)和5'-TACTCAGTCGATCCGGAATGGAACG-3'(SEQ ID NO. 8)，以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板进行PCR扩增，PCR反应参数为： 95℃变性30sec；然后95℃变性15sec，63℃退火15sec，72℃延伸3min 30sec，30个循环后72℃保温5min。PCR结果得到包含mutV268Δ13(SEQ ID NO.2)的重组表达线性化质粒pEasy-E1-mutV268Δ13。mutV268Δ13和 pEasy-E1-mutV268Δ13也可以通过基因合成得到。

在50μL线性化质粒pEasy-E1-mutV268Δ13的PCR产物中，加入1μL DpnI酶，于37℃消化1h。

利用Mut

II Fast Mutagenesis Kit试剂盒，将(2)中的消化产物置于37℃下连接30min。

将(3)中的连接产物通过热激方式转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得包含mutV268Δ13的重组菌株BL21(DE3)/mutV268Δ13。

实施例3重组野生酶InuAMN8和突变酶MutV268Δ13的制备

将重组菌株BL21(DE3)/inuAMN8和BL21(DE3)/mutV268Δ13以0.1％的接种量分别接种于LB(含100μg mL^-1Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。

然后将此活化的菌液以1％接种量分别接种到新鲜的LB(含100μg mL^-1Amp)培养液中，快速振荡培养约2–3h(OD600达到0.6-1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h。12000rpm离心 5min，收集菌体。用适量的pH＝7.0McIlvainebuffer悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose和0–500mM的咪唑分别亲和和纯化目的蛋白。

SDS-PAGE结果(图1，M：蛋白质Marker)表明，重组InuAMN8(SEQ ID NO.3)和MutV268Δ13(SEQ ID NO.1)都获得了纯化，产物为单一条带。

实施例4纯化的重组野生酶InuAMN8和突变酶MutV268Δ13的性质测定

1、纯化的重组野生酶InuAMN8和突变酶MutV268Δ13的活性分析

活性测定方法采用3,5－二硝基水杨酸(DNS)法：将底物菊粉溶于缓冲液中，使其终浓度为0.5％(w/v)；反应体系含50μL适量酶液，450μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加750μL DNS 终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值；1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖(以果糖计)所需的酶量。

2、纯化的重组野生酶InuAMN8和突变酶MutV268Δ13的热活性测定

在pH＝7.0的缓冲液中，于0–60℃下进行酶促反应。以菊粉为底物，反应10min，测定重组野生酶InuAMN8和突变酶MutV268Δ13的酶学性质。

结果表明：野生酶InuAMN8的最适温度为35℃，在40℃和50℃时分别具有94％和40％的活性，温度从0℃上升到25℃，InuAMN8的活性从15％上升到74％；突变体MutV268Δ13的最适温度为30℃，在40℃和50℃时分别具有55％和9％的活性，温度从0℃上升到25℃，MutV268Δ13的活性从 24％上升到94％(图2)。

3、纯化的重组野生酶InuAMN8和突变酶MutV268Δ13的热稳定性测定

将同样酶量的酶液分别置于45℃和50℃处理10–60min后，在pH＝7.0 及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以菊粉为底物，反应 10min，测定重组野生酶InuAMN8和突变酶MutV268Δ13的酶学性质。

结果表明：45℃处理10–60min后，野生酶InuAMN8保持85％以上的活性，突变酶MutV268Δ13保持71％以上的活性(图3)。50℃处理10–60min 后，野生酶InuAMN8保持81％以上的活性；50℃处理10–40min后，突变酶 MutV268Δ13的酶活从25％降至0％(图4)。

4、纯化的重组野生酶InuAMN8和突变酶MutV268Δ13水解菊粉的产物分析

产物分析反应体系含450μL 0.5％(w/v)的菊粉，50μL适当稀释酶液(共 0.1U酶液)。在pH7.0及37℃下，酶促反应4h后终止反应。产物分析采用薄层层析法(使用青岛海洋化工有限公司的高效薄层层析硅胶板G型)。

薄层层析步骤如下所示：

(1)配制展开剂(冰醋酸20mL，双蒸水20mL，正丁醇40mL，混匀)，取适量倒入展开槽，静置30min左右；

(2)将硅胶板放在110℃烘箱中活化30min，冷却后划线，点样(每次 0.5μL，吹干，共点3次)；

(3)将点样的一端硅胶板朝下放入展开槽中，点样点不要没入展开剂；

(4)待展开剂到距硅胶板上沿1.5cm时，取出硅胶板，吹干，再展开一次；

(5)第二次展开结束后，硅胶板直接浸入适量显色剂(1g二苯胺溶于 50mL丙酮中，溶解后加入1mL苯胺及5mL 85％的磷酸，混匀，现用现配)；

(6)几秒钟后，立即取出硅胶板并放置于90℃烘箱中10–15min，使斑点显色。

结果表明：野生酶InuAMN8和突变酶MutV268Δ13水解菊粉的产物几乎都为果糖。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 云南师范大学

<120> 低温适应性提高的外切菊粉酶突变体MutV268Δ13

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 492

<212> PRT

<213> 突变酶(MutV268Δ13)

<400> 1

Met Asn Ser Leu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp

1 5 10 15

Gln Tyr Arg Pro Ala Phe His Tyr Thr Ala Glu Arg Asn Trp Leu Asn

20 25 30

Asp Pro Asn Gly Leu Val Tyr Leu Asn Gly Thr Tyr His Leu Phe Tyr

35 40 45

Gln His Asn Pro Phe Gly Ala Asp Trp Gly Asn Met Ser Trp Gly His

50 55 60

Ala Thr Ser Arg Asp Leu Leu His Trp Asp Glu Gln Pro Val Ala Ile

65 70 75 80

Pro Cys Asp Glu His Glu Ala Ile Phe Ser Gly Ser Ala Val Phe Asp

85 90 95

Gln His Asn Thr Ser Gly Leu Gly Thr Ala Ala Asn Pro Pro Leu Val

100 105 110

Ala Ile Tyr Thr Ser Ala Tyr Ser Asp Ala Ala Pro Leu Pro Gly Arg

115 120 125

Gln Ala Gln Ser Leu Ala Tyr Ser Leu Asp Glu Gly Arg Thr Trp Thr

130 135 140

Lys Tyr His Gly Asn Pro Val Leu Asp Arg Ala Ser Ala Asp Phe Arg

145 150 155 160

Asp Pro Lys Val Phe Trp Tyr Asp Gly Gly Ala Gly Ser Tyr Trp Val

165 170 175

Met Val Ala Val Glu Ala Val Gln Arg Gln Val Val Leu Tyr Lys Ser

180 185 190

Ala Asp Leu Lys Ala Trp Glu His Leu Ser Thr Phe Gly Pro Ala Asn

195 200 205

Ala Thr Gly Gly Val Trp Glu Cys Pro Asp Leu Phe Glu Leu Pro Val

210 215 220

Asp Gly Asn Pro Glu Asp Asn Arg Trp Val Leu Ile Val Asn Ile Asn

225 230 235 240

Pro Gly Gly Ile Ala Gly Gly Ser Ala Gly Gln Tyr Phe Val Gly Glu

245 250 255

Phe Asp Gly Val Ala Phe His Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Gly Trp Leu

260 265 270

Asp Trp Gly Arg Asp Tyr Tyr Ala Ala Val Ser Phe Ser Asn Val Pro

275 280 285

Asp Gly Arg Arg Ile Met Ile Gly Trp Met Asn Asn Trp Asp Tyr Ala

290 295 300

Arg Glu Thr Pro Thr Gly Gly Trp Arg Ser Ala Met Ser Leu Pro Arg

305 310 315 320

Glu Val Ser Leu Thr Arg Val Asp Gly Lys Val Met Leu Arg Gln Gln

325 330 335

Ala Ile Asp Pro Leu Pro Glu Arg Glu Thr Gly His Val Arg Leu Gly

340 345 350

Pro Gln Pro Leu Ala Ser Gly Val Leu Asp Val Pro Ala Ala Ala Ser

355 360 365

Val Ala Arg Ile Asp Val Glu Leu Glu Pro Gly Ala Ala Ala Gly Val

370 375 380

Gly Leu Val Leu Arg Ala Gly Asp Asp Glu Arg Thr Val Leu Arg Tyr

385 390 395 400

Asp Thr Ser Asp Gly Met Leu Arg Leu Asp Arg Arg Glu Ser Gly Gln

405 410 415

Val Ala Phe His Glu Thr Phe Pro Ser Ile Glu Ala Met Ala Val Pro

420 425 430

Leu Gln Gly Gly Arg Leu Arg Leu Arg Val Tyr Leu Asp Arg Cys Ser

435 440 445

Val Glu Val Phe Ala Gln Asp Gly Leu Ala Thr Leu Thr Asp Leu Val

450 455 460

Phe Pro Gly Glu Ala Ser Thr Gly Leu Ala Ile Phe Ala Glu Gly Glu

465 470 475 480

Gly Ala His Leu Val Val Leu Asp Val Val Gly Arg

485 490

<210> 2

<211> 1479

<212> DNA

<213> 突变酶基因(mutV268Δ13)

<400> 2

atgaattcat tgacgacggc ggcgggcgcc acgttggctg ccaccgacca gtaccggccc 60

gcgttccact acaccgccga acggaactgg ttgaacgatc cgaacgggct ggtgtacctc 120

aacggcacct accacctctt ctaccagcac aacccgttcg gcgctgactg gggcaacatg 180

tcctgggggc acgccacctc gcgggacctg ctgcactggg acgagcagcc cgtggccatt 240

ccgtgcgacg aacacgaggc catcttctcc ggctcggcgg tattcgatca gcacaacacc 300

agcggcctcg gcacagcggc caatcccccg ctggtggcca tttacaccag tgcctacagt 360

gacgccgcgc cgcttccggg ccggcaggcg cagtcgctcg cctacagcct cgacgaaggc 420

cggacctgga ccaagtacca cggcaatccc gtgctggacc gcgcgtccgc tgacttccgc 480

gatccaaagg ttttttggta cgacggcggc gccggaagtt actgggtgat ggtcgccgtc 540

gaggcggtgc agcgccaggt agtgctgtac aagtcggccg acctgaaggc gtgggaacac 600

ctgagcacct ttggccctgc caacgccacc ggcggcgtct gggaatgccc ggacctgttt 660

gagctgcccg tggacgggaa tccggaggac aaccggtggg tcctcattgt gaacatcaac 720

ccgggcggca ttgccggcgg ctccgcggga cagtacttcg tgggagagtt cgacggcgtg 780

gcgttccatt ccggatcgac tgagtacggc tggctggact gggggcggga ctactacgcc 840

gccgtttcgt tcagcaacgt gccggacggg cgccggatca tgatcggctg gatgaacaac 900

tgggactacg cccgcgagac gcccaccggc ggctggcgca gcgccatgtc cctgccgcgg 960

gaggtgtcgc tgacccgggt agacgggaaa gtgatgcttc ggcagcaagc cattgatccg 1020

ttgccggagc gggaaacagg gcacgtccgg ctggggccgc agcccttggc gtccggcgtt 1080

ctggacgttc cggccgccgc atccgtggcg cggatcgacg ttgagctgga gccgggcgct 1140

gccgcgggag tgggactggt gcttcgggcg ggggacgatg agcggacggt cctccgctac 1200

gacacttcgg acgggatgct gcggctggac cgccgcgaat ccgggcaggt tgccttccac 1260

gaaaccttcc cgtcgatcga agccatggcc gtgcccttgc agggaggccg gctgcgcctg 1320

cgggtctacc tggaccgctg ctcggtggag gttttcgccc aggacgggct cgccacgctc 1380

actgacctgg tgttccccgg ggaggcgagc acgggcctgg ccatcttcgc cgaaggtgag 1440

ggggcgcacc tcgtggtgct cgacgtcgtc ggccgttga 1479

<210> 3

<211> 505

<212> PRT

<213> 野生酶InuAMN8(AGC01505)

<400> 3

Met Asn Ser Leu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp

1 5 10 15

Gln Tyr Arg Pro Ala Phe His Tyr Thr Ala Glu Arg Asn Trp Leu Asn

20 25 30

Asp Pro Asn Gly Leu Val Tyr Leu Asn Gly Thr Tyr His Leu Phe Tyr

35 40 45

Gln His Asn Pro Phe Gly Ala Asp Trp Gly Asn Met Ser Trp Gly His

50 55 60

Ala Thr Ser Arg Asp Leu Leu His Trp Asp Glu Gln Pro Val Ala Ile

65 70 75 80

Pro Cys Asp Glu His Glu Ala Ile Phe Ser Gly Ser Ala Val Phe Asp

85 90 95

Gln His Asn Thr Ser Gly Leu Gly Thr Ala Ala Asn Pro Pro Leu Val

100 105 110

Ala Ile Tyr Thr Ser Ala Tyr Ser Asp Ala Ala Pro Leu Pro Gly Arg

115 120 125

Gln Ala Gln Ser Leu Ala Tyr Ser Leu Asp Glu Gly Arg Thr Trp Thr

130 135 140

Lys Tyr His Gly Asn Pro Val Leu Asp Arg Ala Ser Ala Asp Phe Arg

145 150 155 160

Asp Pro Lys Val Phe Trp Tyr Asp Gly Gly Ala Gly Ser Tyr Trp Val

165 170 175

Met Val Ala Val Glu Ala Val Gln Arg Gln Val Val Leu Tyr Lys Ser

180 185 190

Ala Asp Leu Lys Ala Trp Glu His Leu Ser Thr Phe Gly Pro Ala Asn

195 200 205

Ala Thr Gly Gly Val Trp Glu Cys Pro Asp Leu Phe Glu Leu Pro Val

210 215 220

Asp Gly Asn Pro Glu Asp Asn Arg Trp Val Leu Ile Val Asn Ile Asn

225 230 235 240

Pro Gly Gly Ile Ala Gly Gly Ser Ala Gly Gln Tyr Phe Val Gly Glu

245 250 255

Phe Asp Gly Val Ala Phe His Ser Gly Ser Thr Val Thr Glu Gly Leu

260 265 270

Gln Lys Asp Ser Ser Arg Met Arg Glu Tyr Gly Trp Leu Asp Trp Gly

275 280 285

Arg Asp Tyr Tyr Ala Ala Val Ser Phe Ser Asn Val Pro Asp Gly Arg

290 295 300

Arg Ile Met Ile Gly Trp Met Asn Asn Trp Asp Tyr Ala Arg Glu Thr

305 310 315 320

Pro Thr Gly Gly Trp Arg Ser Ala Met Ser Leu Pro Arg Glu Val Ser

325 330 335

Leu Thr Arg Val Asp Gly Lys Val Met Leu Arg Gln Gln Ala Ile Asp

340 345 350

Pro Leu Pro Glu Arg Glu Thr Gly His Val Arg Leu Gly Pro Gln Pro

355 360 365

Leu Ala Ser Gly Val Leu Asp Val Pro Ala Ala Ala Ser Val Ala Arg

370 375 380

Ile Asp Val Glu Leu Glu Pro Gly Ala Ala Ala Gly Val Gly Leu Val

385 390 395 400

Leu Arg Ala Gly Asp Asp Glu Arg Thr Val Leu Arg Tyr Asp Thr Ser

405 410 415

Asp Gly Met Leu Arg Leu Asp Arg Arg Glu Ser Gly Gln Val Ala Phe

420 425 430

His Glu Thr Phe Pro Ser Ile Glu Ala Met Ala Val Pro Leu Gln Gly

435 440 445

Gly Arg Leu Arg Leu Arg Val Tyr Leu Asp Arg Cys Ser Val Glu Val

450 455 460

Phe Ala Gln Asp Gly Leu Ala Thr Leu Thr Asp Leu Val Phe Pro Gly

465 470 475 480

Glu Ala Ser Thr Gly Leu Ala Ile Phe Ala Glu Gly Glu Gly Ala His

485 490 495

Leu Val Val Leu Asp Val Val Gly Arg

500 505

<210> 4

<211> 1518

<212> DNA

<213> 野生酶基因inuAMN8(JQ863111)

<400> 4

atgaattcat tgacgacggc ggcgggcgcc acgttggctg ccaccgacca gtaccggccc 60

gcgttccact acaccgccga acggaactgg ttgaacgatc cgaacgggct ggtgtacctc 120

aacggcacct accacctctt ctaccagcac aacccgttcg gcgctgactg gggcaacatg 180

tcctgggggc acgccacctc gcgggacctg ctgcactggg acgagcagcc cgtggccatt 240

ccgtgcgacg aacacgaggc catcttctcc ggctcggcgg tattcgatca gcacaacacc 300

agcggcctcg gcacagcggc caatcccccg ctggtggcca tttacaccag tgcctacagt 360

gacgccgcgc cgcttccggg ccggcaggcg cagtcgctcg cctacagcct cgacgaaggc 420

cggacctgga ccaagtacca cggcaatccc gtgctggacc gcgcgtccgc tgacttccgc 480

gatccaaagg ttttttggta cgacggcggc gccggaagtt actgggtgat ggtcgccgtc 540

gaggcggtgc agcgccaggt agtgctgtac aagtcggccg acctgaaggc gtgggaacac 600

ctgagcacct ttggccctgc caacgccacc ggcggcgtct gggaatgccc ggacctgttt 660

gagctgcccg tggacgggaa tccggaggac aaccggtggg tcctcattgt gaacatcaac 720

ccgggcggca ttgccggcgg ctccgcggga cagtacttcg tgggagagtt cgacggcgtg 780

gcgttccatt ccggatcgac tgtcaccgag ggcctccaga aggacagcag ccggatgcgg 840

gagtacggct ggctggactg ggggcgggac tactacgccg ccgtttcgtt cagcaacgtg 900

ccggacgggc gccggatcat gatcggctgg atgaacaact gggactacgc ccgcgagacg 960

cccaccggcg gctggcgcag cgccatgtcc ctgccgcggg aggtgtcgct gacccgggta 1020

gacgggaaag tgatgcttcg gcagcaagcc attgatccgt tgccggagcg ggaaacaggg 1080

cacgtccggc tggggccgca gcccttggcg tccggcgttc tggacgttcc ggccgccgca 1140

tccgtggcgc ggatcgacgt tgagctggag ccgggcgctg ccgcgggagt gggactggtg 1200

cttcgggcgg gggacgatga gcggacggtc ctccgctacg acacttcgga cgggatgctg 1260

cggctggacc gccgcgaatc cgggcaggtt gccttccacg aaaccttccc gtcgatcgaa 1320

gccatggccg tgcccttgca gggaggccgg ctgcgcctgc gggtctacct ggaccgctgc 1380

tcggtggagg ttttcgccca ggacgggctc gccacgctca ctgacctggt gttccccggg 1440

gaggcgagca cgggcctggc catcttcgcc gaaggtgagg gggcgcacct cgtggtgctc 1500

gacgtcgtcg gccgttga 1518

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaattcat tgacgacggc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcaacggccg acgacgtcga 20

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttccggatcg actgagtacg gctggctgga ctg 33

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tactcagtcg atccggaatg gaacg 25

Claims (10)

1.低温适应性提高的外切菊粉酶突变体MutV268Δ13，其特征在于，该突变体MutV268Δ13具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的突变体MutV268Δ13的编码基因mutV268Δ13。

3.根据权利要求2所述的编码基因mutV268Δ13，其特征在于，该编码基因mutV268Δ13具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.包含如权利要求2或3所述的编码基因mutV268Δ13的重组载体。

5.包含如权利要求2或3所述的编码基因mutV268Δ13的重组菌。

6.如权利要求1所述的突变体MutV268Δ13的制备方法，其特征在于，该方法包含：

将具有如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的野生外切菊粉酶基因inuAMN8和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含inuAMN8的重组表达质粒pEasy-E1-inuAMN8；

以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板，以如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的突变引物，通过PCR扩增得到包含mutV268Δ13的重组表达质粒pEasy-E1-mutV268Δ13；

将重组表达质粒pEasy-E1-mutV268Δ13转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含mutV268Δ13的重组菌株；

培养重组菌株，诱导重组外切菊粉酶突变体MutV268Δ13表达，以获得重组外切菊粉酶突变体MutV268Δ13。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述包含mutV268Δ13的重组菌株的制备为，将所述重组表达质粒pEasy-E1-mutV268Δ13经DpnI酶消化，利用Mut

IIFast Mutagenesis Kit试剂盒将消化产物进行连接，再通过热激方式转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述诱导采用IPTG进行诱导。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述重组外切菊粉酶突变体MutV268Δ13表达的产物经Nickel-NTAAgarose和0–500mM的咪唑分别亲和和纯化，获得重组外切菊粉酶突变体MutV268Δ13。

10.如权利要求1所述的突变体MutV268Δ13在食品、酿酒及洗涤中的应用。

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