CN112725307A - 一种耐热性降低的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程及蛋白质改造技术领域，具体来说是一种耐热性降低的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4及应用，该突变体MutG169Δ4的氨基酸序列是在去除野生外切菊粉酶InuAMN8的第169位至172位氨基酸基础上得到的，即去除了InuAMN8的第169位至172位的甘氨酸‑甘氨酸‑丙氨酸‑甘氨酸这4个氨基酸，MutG169Δ4的序列如SEQ ID NO.1所示。与野生酶InuAMN8相比，突变酶MutG169Δ4的耐热性降低，有利于通过温度变化控制酶的催化反应。本发明的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4可应用于食品、酿酒和洗涤等行业。

Description

一种耐热性降低的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及蛋白质改造技术，具体为一种耐热性降低的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4及应用。

背景技术

菊粉是末端含一分子葡萄糖残基的果聚糖，其富含于菊芋、菊苣等多种菊科植物中，是一种来源丰富的可再生资源。菊芋抗病能力非常强、产量高，适合在贫瘠坡地、干旱盐碱的非耕边际土地上种植，不与农作物争耕地。

外切菊粉酶可将菊粉降解成果糖和少量葡萄糖，生成糖含量高达95％的果糖浆。果糖广泛用于食品、医药、生物能源等行业。因而，外切菊粉酶可应用于食品、酿酒和医药等行业中(Singh RS et al.I nternational Journal of Biological Macromolecules,2017,96:312～322.)。

在一些实际的应用中，需要低温环境，例如低温下的食品处理可防止微生物的污染、营养损失和食品品质降低，清酒和葡萄酒的发酵、水产养殖环境、洗涤、污水处理通常在低温下进行；此外，低温处理还可降低能耗(Cavicchioli et al.MicrobialBiotechnology,2011,4(4):449～460.)。因此，低温酶具有重要的开发价值。

对热越敏感的酶越容易变性，热变性又使酶容易被降解，该特性使酶的催化反应得以简易控制，同时使酶的使用更具安全性，在食品、酿酒和洗涤等行业中具有应用的价值。因此，获得耐热性降低的突变酶，将有利于酶在食品、酿酒和洗涤等行业中的应用。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种耐热性降低的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4，可应用于食品、酿酒和洗涤等行业。

为了实现该技术目标，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种耐热性降低的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4，所述的突变体MutG169Δ4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。与GenBank记录的外切菊粉酶序列AGC01505(SEQ IDNO.3)相比，MutG169Δ4少了4个氨基酸，即少了AGC01505的第169位至172位的甘氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸这4个氨基酸。

所述突变体MutG169Δ4的最适温度为40℃，温度从0℃上升到30℃，MutG169Δ4的活性从14％上升到77％；50℃处理10～60min后，MutG169Δ4剩余76％以上的酶活；55℃处理10～60min后，MutG169Δ4的酶活从43％降至5％；该酶可水解菊粉产生果糖。

本发明提供了所述的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4的编码基因mutG169Δ4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一目的在于提供一种包含低温外切菊粉酶突变体编码基因mutG169Δ4的重组载体。

本发明的另一目的在于提供一种包含低温外切菊粉酶突变体编码基因mutG169Δ4的重组菌。

另外，本发明所述的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4在食品、酿酒和洗涤用品制备中的应用也在本发明的保护范围内。

本发明所述的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4的制备方法，具体包括以下步骤：

1)将野生外切菊粉酶基因inuAMN8(SEQ ID NO.4)和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含inuAMN8的重组表达质粒pEasy-E1-inuAMN8；

2)以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板，设计突变引物5'TGGTACGACAGTTACTGGGTGATGGTCGCCGTC 3'和5'CCAGTAACTGTCGTACCAAAAAACCTTTGGATC 3'，通过PCR扩增得到包含mutG169Δ4的重组表达质粒pEasy-E1-mutG169Δ4；

3)将重组表达质粒pEasy-E1-mutG169Δ4转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含mutG169Δ4的重组菌株；

4)培养重组菌株，诱导重组外切菊粉酶突变体MutG169Δ4表达；

5)回收并纯化所表达的重组外切菊粉酶突变体MutG169Δ4；

6)活性测定。

本发明的有益效果为：

与野生酶InuAMN8相比，突变酶MutG169Δ4的热稳定性发生了改变，突变酶MutG169Δ4的耐热性降低。55℃处理10～60min后，野生酶InuAMN8的酶活从70％降至17％，突变酶MutG169Δ4的酶活从43％降至5％。本发明的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4可应用于食品、酿酒和洗涤等行业。

附图说明

图1为野生酶InuAMN8和突变酶MutG169Δ4的SDS-PAGE分析，其中，M：蛋白质Marker；

图2为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutG169Δ4的热活性；

图3为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutG169Δ4在50℃时的稳定性；

图4为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutG169Δ4在55℃时的稳定性；

图5为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutG169Δ4水解菊粉的产物分析，其中，W：野生酶InuAMN8水解菊粉的产物；CK：对照组，含菊粉和失活的野生酶InuAMN8(煮沸10min)；F：果糖；G：葡萄糖；Mut：突变酶MutG169Δ4水解菊粉的产物。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明以下实施例中的实验材料和试剂：

1、菌株及载体：大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和表达载体pEasy-E1可购自北京全式金生物技术有限公司；节杆菌(Arthrobacter sp.)由云南师范大学提供。

2、酶类及其它生化试剂：Nickel-NTAAgarose购自QIAGEN公司，DNA聚合酶、dNTP及Mut

II Fast Mutagenesis Kit试剂盒购自南京诺维赞公司，菊粉购自AlfaAesar公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基

LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1野生酶InuAMN8表达载体的构建和转化

1)提取节杆菌基因组DNA：将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，然后按照细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)说明书提取节杆菌基因组DNA，置于-20℃备用。

2)根据GenBank记录的外切菊粉酶核苷酸序列JQ863111(SEQ ID NO.4)，设计引物5'ATGAATTCATTGACGACGGC 3'和5'TCAACGGCCGACGACGTCGA 3'，以节杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应参数为：95℃变性5min；然后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环后72℃保温5min。PCR结果得到野生外切菊粉酶InuAMN8的编码基因inuAMN8。根据外切菊粉酶核苷酸序列JQ863111，inuAMN8也可以通过基因合成得到。

3)将外切菊粉酶基因inuAMN8和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含inuAMN8的重组表达质粒pEasy-E1-inuAMN8。

4)通过热激方式，将pEasy-E1-inuAMN8转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含inuAMN8的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/inuAMN8。

实施例2突变酶MutG169Δ4表达载体的构建和转化

1)设计引物5'TGGTACGACAGTTACTGGGTGATGGTCGCCGTC 3'和5'CCAGTAACTGTCGTACCAAAAAACCTTTGGATC 3'，以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板进行PCR扩增，PCR反应参数为：95℃变性30sec；然后95℃变性15sec，68℃退火15sec，72℃延伸3min 30sec，30个循环后72℃保温5min。PCR结果得到包含mutG169Δ4的重组表达线性化质粒pEasy-E1-mutG169Δ4。mutG169Δ4和pEasy-E1-mutG169Δ4也可以通过基因合成得到。

2)在50μL线性化质粒pEasy-E1-mutG169Δ4的PCR产物中，加入1μL DpnI酶，于37℃消化1h。

3)利用Mut

II Fast Mutagenesis Kit试剂盒，将(2)中的消化产物置于37℃下连接30min。

4)将(3)中的连接产物通过热激方式转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得包含mutG169Δ4的重组菌株BL21(DE3)/mutG169Δ4。

实施例3重组野生酶InuAMN8和突变酶MutG169Δ4的制备

将重组菌株BL21(DE3)/inuAMN8和BL21(DE3)/mutG169Δ4以0.1％的接种量分别接种于LB(含100μg mL^-1Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。

然后将此活化的菌液以1％接种量分别接种到新鲜的LB(含100μg mL^-1Amp)培养液中，快速振荡培养约2～3h(OD600达到0.6～1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH＝7.0McIlvainebuffer悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTAAgarose和0～500mM的咪唑分别亲和和纯化目的蛋白。

SDS-PAGE结果(图1)表明，重组InuAMN8和MutG169Δ4都获得了纯化，产物为单一条带。

实施例4纯化的重组野生酶InuAMN8和突变酶MutG169Δ4的性质测定

1)纯化的重组野生酶InuAMN8和突变酶MutG169Δ4的活性分析

活性测定方法采用3,5－二硝基水杨酸(DNS)法：将底物菊粉溶于缓冲液中，使其终浓度为0.5％(w/v)；反应体系含50μL适量酶液，450μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加750μL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值；1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖(以果糖计)所需的酶量。

2)纯化的重组野生酶InuAMN8和突变酶MutG169Δ4的热活性测定

在pH＝7.0的缓冲液中，于0～60℃下进行酶促反应。以菊粉为底物，反应10min，测定重组野生酶InuAMN8和突变酶MutG169Δ4的酶学性质。

结果表明：野生酶InuAMN8的最适温度为35℃，温度从0℃上升到30℃，InuAMN8的活性从15％上升到88％；突变酶MutG169Δ4的最适温度为40℃，温度从0℃上升到30℃，MutG169Δ4的活性从14％上升到77％(图2)。

3)纯化的重组野生酶InuAMN8和突变酶MutG169Δ4的热稳定性测定

将同样酶量的酶液分别置于50℃和55℃处理10～60min后，在pH＝7.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以菊粉为底物，反应10min，测定重组野生酶InuAMN8和突变酶MutG169Δ4的酶学性质。

结果表明：50℃处理10～60min后，野生酶InuAMN8剩余81％以上的酶活，突变酶MutG169Δ4剩余76％以上的酶活(图3)；55℃处理10～60min后，野生酶InuAMN8的酶活从70％降至17％，突变酶MutG169Δ4的酶活从43％降至5％。(图4)。

4)纯化的重组野生酶InuAMN8和突变酶MutG169Δ4水解菊粉的产物分析

产物分析反应体系含450μL 0.5％(w/v)的菊粉，50μL适当稀释酶液(共0.1U酶液)。在pH7.0及37℃下，酶促反应4h后终止反应。产物分析采用薄层层析法(使用青岛海洋化工有限公司的高效薄层层析硅胶板G型)。

薄层层析步骤如下所示：

①配制展开剂(冰醋酸20mL，双蒸水20mL，正丁醇40mL，混匀)，取适量倒入展开槽，静置30min左右；

②将硅胶板放在110℃烘箱中活化30min，冷却后划线，点样(每次0.5μL，吹干，共点3次)；

③将点样的一端硅胶板朝下放入展开槽中，点样点不要没入展开剂；

④待展开剂到距硅胶板上沿1.5cm时，取出硅胶板，吹干，再展开一次；

⑤第二次展开结束后，硅胶板直接浸入适量显色剂(1g二苯胺溶于50mL丙酮中，溶解后加入1mL苯胺及5mL 85％的磷酸，混匀，现用现配)；

⑥几秒钟后，立即取出硅胶板并放置于90℃烘箱中10–15min，使斑点显色。

结果表明：野生酶InuAMN8和突变酶MutG169Δ4水解菊粉的产物几乎都为果糖(图5)。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 云南师范大学

<120> 一种耐热性降低的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 501

<212> PRT

<213> 突变酶(MutG169Δ4)

<400> 1

Met Asn Ser Leu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp

1 5 10 15

Gln Tyr Arg Pro Ala Phe His Tyr Thr Ala Glu Arg Asn Trp Leu Asn

20 25 30

Asp Pro Asn Gly Leu Val Tyr Leu Asn Gly Thr Tyr His Leu Phe Tyr

35 40 45

Gln His Asn Pro Phe Gly Ala Asp Trp Gly Asn Met Ser Trp Gly His

50 55 60

Ala Thr Ser Arg Asp Leu Leu His Trp Asp Glu Gln Pro Val Ala Ile

65 70 75 80

Pro Cys Asp Glu His Glu Ala Ile Phe Ser Gly Ser Ala Val Phe Asp

85 90 95

Gln His Asn Thr Ser Gly Leu Gly Thr Ala Ala Asn Pro Pro Leu Val

100 105 110

Ala Ile Tyr Thr Ser Ala Tyr Ser Asp Ala Ala Pro Leu Pro Gly Arg

115 120 125

Gln Ala Gln Ser Leu Ala Tyr Ser Leu Asp Glu Gly Arg Thr Trp Thr

130 135 140

Lys Tyr His Gly Asn Pro Val Leu Asp Arg Ala Ser Ala Asp Phe Arg

145 150 155 160

Asp Pro Lys Val Phe Trp Tyr Asp Ser Tyr Trp Val Met Val Ala Val

165 170 175

Glu Ala Val Gln Arg Gln Val Val Leu Tyr Lys Ser Ala Asp Leu Lys

180 185 190

Ala Trp Glu His Leu Ser Thr Phe Gly Pro Ala Asn Ala Thr Gly Gly

195 200 205

Val Trp Glu Cys Pro Asp Leu Phe Glu Leu Pro Val Asp Gly Asn Pro

210 215 220

Glu Asp Asn Arg Trp Val Leu Ile Val Asn Ile Asn Pro Gly Gly Ile

225 230 235 240

Ala Gly Gly Ser Ala Gly Gln Tyr Phe Val Gly Glu Phe Asp Gly Val

245 250 255

Ala Phe His Ser Gly Ser Thr Val Thr Glu Gly Leu Gln Lys Asp Ser

260 265 270

Ser Arg Met Arg Glu Tyr Gly Trp Leu Asp Trp Gly Arg Asp Tyr Tyr

275 280 285

Ala Ala Val Ser Phe Ser Asn Val Pro Asp Gly Arg Arg Ile Met Ile

290 295 300

Gly Trp Met Asn Asn Trp Asp Tyr Ala Arg Glu Thr Pro Thr Gly Gly

305 310 315 320

Trp Arg Ser Ala Met Ser Leu Pro Arg Glu Val Ser Leu Thr Arg Val

325 330 335

Asp Gly Lys Val Met Leu Arg Gln Gln Ala Ile Asp Pro Leu Pro Glu

340 345 350

Arg Glu Thr Gly His Val Arg Leu Gly Pro Gln Pro Leu Ala Ser Gly

355 360 365

Val Leu Asp Val Pro Ala Ala Ala Ser Val Ala Arg Ile Asp Val Glu

370 375 380

Leu Glu Pro Gly Ala Ala Ala Gly Val Gly Leu Val Leu Arg Ala Gly

385 390 395 400

Asp Asp Glu Arg Thr Val Leu Arg Tyr Asp Thr Ser Asp Gly Met Leu

405 410 415

Arg Leu Asp Arg Arg Glu Ser Gly Gln Val Ala Phe His Glu Thr Phe

420 425 430

Pro Ser Ile Glu Ala Met Ala Val Pro Leu Gln Gly Gly Arg Leu Arg

435 440 445

Leu Arg Val Tyr Leu Asp Arg Cys Ser Val Glu Val Phe Ala Gln Asp

450 455 460

Gly Leu Ala Thr Leu Thr Asp Leu Val Phe Pro Gly Glu Ala Ser Thr

465 470 475 480

Gly Leu Ala Ile Phe Ala Glu Gly Glu Gly Ala His Leu Val Val Leu

485 490 495

Asp Val Val Gly Arg

500

<210> 2

<211> 1506

<212> DNA

<213> 突变酶基因(mutG169Δ4)

<400> 2

atgaattcat tgacgacggc ggcgggcgcc acgttggctg ccaccgacca gtaccggccc 60

gcgttccact acaccgccga acggaactgg ttgaacgatc cgaacgggct ggtgtacctc 120

aacggcacct accacctctt ctaccagcac aacccgttcg gcgctgactg gggcaacatg 180

tcctgggggc acgccacctc gcgggacctg ctgcactggg acgagcagcc cgtggccatt 240

ccgtgcgacg aacacgaggc catcttctcc ggctcggcgg tattcgatca gcacaacacc 300

agcggcctcg gcacagcggc caatcccccg ctggtggcca tttacaccag tgcctacagt 360

gacgccgcgc cgcttccggg ccggcaggcg cagtcgctcg cctacagcct cgacgaaggc 420

cggacctgga ccaagtacca cggcaatccc gtgctggacc gcgcgtccgc tgacttccgc 480

gatccaaagg ttttttggta cgacagttac tgggtgatgg tcgccgtcga ggcggtgcag 540

cgccaggtag tgctgtacaa gtcggccgac ctgaaggcgt gggaacacct gagcaccttt 600

ggccctgcca acgccaccgg cggcgtctgg gaatgcccgg acctgtttga gctgcccgtg 660

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tggcgcagcg ccatgtccct gccgcgggag gtgtcgctga cccgggtaga cgggaaagtg 1020

atgcttcggc agcaagccat tgatccgttg ccggagcggg aaacagggca cgtccggctg 1080

gggccgcagc ccttggcgtc cggcgttctg gacgttccgg ccgccgcatc cgtggcgcgg 1140

atcgacgttg agctggagcc gggcgctgcc gcgggagtgg gactggtgct tcgggcgggg 1200

gacgatgagc ggacggtcct ccgctacgac acttcggacg ggatgctgcg gctggaccgc 1260

cgcgaatccg ggcaggttgc cttccacgaa accttcccgt cgatcgaagc catggccgtg 1320

cccttgcagg gaggccggct gcgcctgcgg gtctacctgg accgctgctc ggtggaggtt 1380

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ggcctggcca tcttcgccga aggtgagggg gcgcacctcg tggtgctcga cgtcgtcggc 1500

cgttga 1506

<210> 3

<211> 505

<212> PRT

<213> 野生酶(InuAMN8)

<400> 3

Met Asn Ser Leu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp

1 5 10 15

Gln Tyr Arg Pro Ala Phe His Tyr Thr Ala Glu Arg Asn Trp Leu Asn

20 25 30

Asp Pro Asn Gly Leu Val Tyr Leu Asn Gly Thr Tyr His Leu Phe Tyr

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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Gln His Asn Thr Ser Gly Leu Gly Thr Ala Ala Asn Pro Pro Leu Val

100 105 110

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115 120 125

Gln Ala Gln Ser Leu Ala Tyr Ser Leu Asp Glu Gly Arg Thr Trp Thr

130 135 140

Lys Tyr His Gly Asn Pro Val Leu Asp Arg Ala Ser Ala Asp Phe Arg

145 150 155 160

Asp Pro Lys Val Phe Trp Tyr Asp Gly Gly Ala Gly Ser Tyr Trp Val

165 170 175

Met Val Ala Val Glu Ala Val Gln Arg Gln Val Val Leu Tyr Lys Ser

180 185 190

Ala Asp Leu Lys Ala Trp Glu His Leu Ser Thr Phe Gly Pro Ala Asn

195 200 205

Ala Thr Gly Gly Val Trp Glu Cys Pro Asp Leu Phe Glu Leu Pro Val

210 215 220

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Phe Asp Gly Val Ala Phe His Ser Gly Ser Thr Val Thr Glu Gly Leu

260 265 270

Gln Lys Asp Ser Ser Arg Met Arg Glu Tyr Gly Trp Leu Asp Trp Gly

275 280 285

Arg Asp Tyr Tyr Ala Ala Val Ser Phe Ser Asn Val Pro Asp Gly Arg

290 295 300

Arg Ile Met Ile Gly Trp Met Asn Asn Trp Asp Tyr Ala Arg Glu Thr

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Pro Thr Gly Gly Trp Arg Ser Ala Met Ser Leu Pro Arg Glu Val Ser

325 330 335

Leu Thr Arg Val Asp Gly Lys Val Met Leu Arg Gln Gln Ala Ile Asp

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Pro Leu Pro Glu Arg Glu Thr Gly His Val Arg Leu Gly Pro Gln Pro

355 360 365

Leu Ala Ser Gly Val Leu Asp Val Pro Ala Ala Ala Ser Val Ala Arg

370 375 380

Ile Asp Val Glu Leu Glu Pro Gly Ala Ala Ala Gly Val Gly Leu Val

385 390 395 400

Leu Arg Ala Gly Asp Asp Glu Arg Thr Val Leu Arg Tyr Asp Thr Ser

405 410 415

Asp Gly Met Leu Arg Leu Asp Arg Arg Glu Ser Gly Gln Val Ala Phe

420 425 430

His Glu Thr Phe Pro Ser Ile Glu Ala Met Ala Val Pro Leu Gln Gly

435 440 445

Gly Arg Leu Arg Leu Arg Val Tyr Leu Asp Arg Cys Ser Val Glu Val

450 455 460

Phe Ala Gln Asp Gly Leu Ala Thr Leu Thr Asp Leu Val Phe Pro Gly

465 470 475 480

Glu Ala Ser Thr Gly Leu Ala Ile Phe Ala Glu Gly Glu Gly Ala His

485 490 495

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500 505

<210> 4

<211> 1518

<212> DNA

<213> 野生酶基因(inuAMN8)

<400> 4

atgaattcat tgacgacggc ggcgggcgcc acgttggctg ccaccgacca gtaccggccc 60

gcgttccact acaccgccga acggaactgg ttgaacgatc cgaacgggct ggtgtacctc 120

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gatccaaagg ttttttggta cgacggcggc gccggaagtt actgggtgat ggtcgccgtc 540

gaggcggtgc agcgccaggt agtgctgtac aagtcggccg acctgaaggc gtgggaacac 600

ctgagcacct ttggccctgc caacgccacc ggcggcgtct gggaatgccc ggacctgttt 660

gagctgcccg tggacgggaa tccggaggac aaccggtggg tcctcattgt gaacatcaac 720

ccgggcggca ttgccggcgg ctccgcggga cagtacttcg tgggagagtt cgacggcgtg 780

gcgttccatt ccggatcgac tgtcaccgag ggcctccaga aggacagcag ccggatgcgg 840

gagtacggct ggctggactg ggggcgggac tactacgccg ccgtttcgtt cagcaacgtg 900

ccggacgggc gccggatcat gatcggctgg atgaacaact gggactacgc ccgcgagacg 960

cccaccggcg gctggcgcag cgccatgtcc ctgccgcggg aggtgtcgct gacccgggta 1020

gacgggaaag tgatgcttcg gcagcaagcc attgatccgt tgccggagcg ggaaacaggg 1080

cacgtccggc tggggccgca gcccttggcg tccggcgttc tggacgttcc ggccgccgca 1140

tccgtggcgc ggatcgacgt tgagctggag ccgggcgctg ccgcgggagt gggactggtg 1200

cttcgggcgg gggacgatga gcggacggtc ctccgctacg acacttcgga cgggatgctg 1260

cggctggacc gccgcgaatc cgggcaggtt gccttccacg aaaccttccc gtcgatcgaa 1320

gccatggccg tgcccttgca gggaggccgg ctgcgcctgc gggtctacct ggaccgctgc 1380

tcggtggagg ttttcgccca ggacgggctc gccacgctca ctgacctggt gttccccggg 1440

gaggcgagca cgggcctggc catcttcgcc gaaggtgagg gggcgcacct cgtggtgctc 1500

gacgtcgtcg gccgttga 1518

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaattcat tgacgacggc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcaacggccg acgacgtcga 20

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggtacgaca gttactgggt gatggtcgcc gtc 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccagtaactg tcgtaccaaa aaacctttgg atc 33

Claims (6)

1.一种耐热性降低的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4，其特征在于，所述的突变体MutG169Δ4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的突变体MutG169Δ4的编码基因mutG169Δ4，其特征在于，所述的编码基因mutG169Δ4的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.包含权利要求2所述的编码基因mutG169Δ4的重组载体。

4.包含权利要求2所述的编码基因mutG169Δ4的重组菌。

5.权利要求1所述的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将野生外切菊粉酶基因inuAMN8和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含inuAMN8的重组表达质粒pEasy-E1-inuAMN8；

2)以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板，设计突变引物5'TGGTACGACAGTTACTGGGTGATGGTCGCCGTC 3'和5'CCAGTAACTGTCGTACCAAAAAACCTTTGGATC 3'，通过PCR扩增得到包含mutG169Δ4的重组表达质粒pEasy-E1-mutG169Δ4；

3)将重组表达质粒pEasy-E1-mutG169Δ4转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含mutG169Δ4的重组菌株；

4)培养重组菌株，诱导重组外切菊粉酶突变体MutG169Δ4表达；

5)回收并纯化所表达的重组外切菊粉酶突变体MutG169Δ4；

6)活性测定。

6.权利要求1所述的突变体MutG169Δ4在食品、酿酒及洗涤用品制备中的应用。

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