CN112831485A

CN112831485A - 一种低温活性改良的外切菊粉酶突变体MutDR121EH9

Info

Publication number: CN112831485A
Application number: CN202110041629.0A
Authority: CN
Inventors: 张蕊; 周峻沛; 黄遵锡; 岑潇龙; 许波; 韩楠玉; 唐湘华; 李俊俊; 吴倩; 高艳秀
Original assignee: Yunnan Normal University
Current assignee: Yunnan Normal University
Priority date: 2021-01-13
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2041-01-13
Also published as: CN112831485B

Abstract

本发明公开了一种低温活性改良的外切菊粉酶突变体MutDR121EH9，该突变体MutDR121EH9具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其热活性和热稳定性发生了改变，在低温下具有更高的活性，而热稳定性降低，低温活性变高有利于在低温反应时减少酶的用量或缩短反应时间，热稳定性变差有利于通过热处理控制酶的反应过程。野生酶InuAMN8的最适温度为35℃，突变酶MutDR121EH9的最适温度为20℃；50℃处理后，野生酶InuAMN8保持81％以上的酶活性，突变酶MutDR121EH9的酶活从32％降至14％。本发明的突变体MutDR121EH9可应用于食品、酿酒和洗涤等行业。

Description

一种低温活性改良的外切菊粉酶突变体MutDR121EH9

技术领域

本发明涉及一种外切菊粉酶突变体，具体涉及一种低温活性改良的外切菊粉酶突变体MutDR121EH9。

背景技术

菊芋在我国的大部分地区都可以种植，是一种高密度的非粮能源作物，耐旱、耐贫瘠、耐盐碱、产量高。菊芋块茎的干物质中，菊粉含量可高达70％，这些特点使菊芋的有效利用成为关注的焦点。

菊粉是由果糖聚合而成的多糖，经外切菊粉酶水解，可得到糖含量高达95％的果糖浆。果糖广泛用于食品、医药、生物能源等行业，可作为天然甜味剂替代蔗糖，可以供糖尿病患者食用，可作为原料用来生产生物乙醇等。因而，外切菊粉酶可应用于食品、酿酒和生物能源等行业中(Singh RS et al.International Journal ofBiologicalMacromolecules,2017,96:312–322)。

具有低温活性的酶制剂可应用于低温生境和低温加工过程，如清酒和葡萄酒的发酵温度、水产养殖环境、洗涤、污水处理通常在<25℃的低温下进行。另外，低温下的处理(如果汁澄清)可防止微生物的污染、营养损失和食品品质降低，将中温或者高温处理方式转为低温处理方式还可起到降低能耗的作用(Cavicchioli et al.Microbial Biotechnology,2011,4(4):449–460)。因此，提高酶在低温下的催化活性将有利于酶在食品、酿酒和洗涤等行业中的应用。

为了能方便有效地控制酶的催化反应，需要容易热变性的酶；同时，为了使酶的使用更具安全性，需要酶经过简单地处理后就容易降解，而热变性使酶容易暴露蛋白酶酶切位点，导致酶容易被降解。因此，获得容易热变性的突变酶，将有利于酶在食品、酿酒和洗涤等行业中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种低温活性改良的外切菊粉酶突变体MutDR121EH9，该突变酶MutDR121EH9在低温下具有更高的活性，而热稳定性降低，低温活性变高有利于在低温反应时减少酶的用量或缩短反应时间。

为了达到上述目的，本发明提供了一种低温活性改良的外切菊粉酶突变体MutDR121EH9，该突变体MutDR121EH9具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。与GenBank记录的外切菊粉酶序列AGC01505(SEQ ID NO.3)相比，MutDR121EH9有一段序列与其不同，即AGC01505的第121位至128位氨基酸为DAAPLPGR，而MutDR121EH9的第121位至129位氨基酸为EEDRKTGLH。

本发明的突变体MutDR121EH9的最适温度为20℃，在0℃、10℃、35℃、40℃和50℃时分别具有43％、55％、72％、38％和16％的酶活；45℃处理10–60min后，MutDR121EH9的酶活保持在80％左右；50℃处理10–60min后，MutDR121EH9的酶活从32％降至14％。

本发明的另一目的是提供所述的突变体MutDR121EH9的编码基因mutDR121EH9。

优选地，所述编码基因mutDR121EH9具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供包含所述的编码基因mutDR121EH9的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含所述的编码基因mutDR121EH9的重组菌。

本发明的另一目的是提供所述的突变体MutDR121EH9的制备方法，该方法包含：将具有如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的野生外切菊粉酶基因inuAMN8和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含inuAMN8的重组表达质粒pEasy-E1-inuAMN8；以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板，以如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的突变引物，通过PCR扩增得到包含mutDR121EH9的重组表达质粒pEasy-E1-mutDR121EH9；将重组表达质粒pEasy-E1-mutDR121EH9转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含mutDR121EH9的重组菌株；培养重组菌株，诱导重组外切菊粉酶突变体MutDR121EH9表达，以获得重组外切菊粉酶突变体MutDR121EH9。

优选地，所述包含mutDR121EH9的重组菌株的制备为，将所述重组表达质粒pEasy-E1-mutDR121EH9经DpnI酶消化，利用Mut

II Fast Mutagenesis Kit试剂盒将消化产物进行连接，再通过热激方式转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。

优选地，所述诱导采用IPTG进行诱导。

优选地，所述重组外切菊粉酶突变体MutDR121EH9表达的产物经Nickel-NTAAgarose和0–500mM的咪唑分别亲和和纯化，获得重组外切菊粉酶突变体MutDR121EH9。

本发明的另一目的是提供所述的突变体MutDR121EH9在食品、酿酒及洗涤中的应用。

本发明的低温活性改良的外切菊粉酶突变体MutDR121EH9，具有以下优点：

与野生酶InuAMN8相比，突变酶MutDR121EH9的热活性和热稳定性发生了改变，突变酶MutDR121EH9在低温下具有更高的活性，而热稳定性降低，低温活性变高有利于在低温反应时减少酶的用量或缩短反应时间，热稳定性变差有利于通过热处理控制酶的反应过程。野生酶InuAMN8的最适温度为35℃，在0℃、10℃、20℃、40℃和50℃时分别具有15％、32％、58％、94％和40％的酶活；突变酶MutDR121EH9的最适温度为20℃，在0℃、10℃、35℃、40℃和50℃时分别具有43％、55％、72％、38％和16％的酶活；45℃处理10–60min后，野生酶InuAMN8保持85％以上的酶活性，突变酶MutDR121EH9的酶活保持在80％左右；50℃处理10–60min后，野生酶InuAMN8保持81％以上的酶活性，突变酶MutDR121EH9的酶活从32％降至14％。本发明的低温外切菊粉酶突变体MutDR121EH9可应用于食品、酿酒和洗涤等行业。

附图说明

图1为野生酶InuAMN8和突变酶MutDR121EH9的SDS-PAGE分析。

图2为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutDR121EH9的热活性。

图3为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutDR121EH9在45℃时的稳定性。

图4为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutDR121EH9在50℃时的稳定性。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中的实验材料和试剂：

1、菌株及载体

大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和表达载体pEasy-E1可购自北京全式金生物技术有限公司；节杆菌(Arthrobacter sp.)由云南师范大学提供，保藏于云南省微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为YMF 4.00006。

2、酶类及其它生化试剂

Nickel-NTAAgarose购自QIAGEN公司，DNA聚合酶、dNTP及Mut

II FastMutagenesis Kit试剂盒购自南京诺维赞公司，菊粉购自Alfa Aesar公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基

LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1野生酶InuAMN8表达载体的构建和转化

(1)提取节杆菌基因组DNA：将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，然后按照细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)说明书提取节杆菌基因组DNA，置于-20℃备用。

(2)根据GenBank记录的外切菊粉酶核苷酸序列JQ863111(SEQ ID NO.4)，设计引物5'-ATGAATTCATTGACGACGGC-3'(SEQ ID NO.5)和5'-TCAACGGCCGACGACGTCGA-3'(SEQ IDNO.6)，以节杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应参数为：95℃变性5min；然后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环后72℃保温5min。PCR结果得到野生外切菊粉酶InuAMN8的编码基因inuAMN8。根据外切菊粉酶核苷酸序列JQ863111，inuAMN8也可以通过基因合成得到。

(3)将外切菊粉酶基因inuAMN8和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含inuAMN8的重组表达质粒pEasy-E1-inuAMN8。

(4)通过热激方式，将pEasy-E1-inuAMN8转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含inuAMN8的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/inuAMN8。

实施例2突变酶MutDR121EH9表达载体的构建和转化

(1)设计引物5'-TGAAGAAGACCGAAAGACGGGCCTGCACCAGGCGCAGTCGCTCGCC-3'(SEQID NO.7)和5'-TGGTGCAGGCCCGTCTTTCGGTCTTCTTCACTGTAGGCACTG-3'(SEQ ID NO.8)，以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板进行PCR扩增，PCR反应参数为：95℃变性30sec；然后95℃变性15sec，70℃退火15sec，72℃延伸3min 30sec，30个循环后72℃保温5min。PCR结果得到包含mutDR121EH9(SEQ ID NO.2)的重组表达线性化质粒pEasy-E1-mutDR121EH9。mutDR121EH9和pEasy-E1-mutDR121EH9也可以通过基因合成得到。

(2)在50μL线性化质粒pEasy-E1-mutDR121EH9的PCR产物中，加入1μL DpnI酶，于37℃消化1h。

(3)利用Mut

II Fast Mutagenesis Kit试剂盒，将步骤(2)中的消化产物置于37℃下连接30min。

(4)将步骤(3)中的连接产物通过热激方式转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得包含mutDR121EH9的重组菌株BL21(DE3)/mutDR121EH9。

实施例3重组野生酶InuAMN8和突变酶MutDR121EH9的制备

(1)将重组菌株BL21(DE3)/inuAMN8和BL21(DE3)/mutDR121EH9以0.1％的接种量分别接种于LB(含100μg mL^-1Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。

(2)然后将此活化的菌液以1％接种量分别接种到新鲜的LB(含100μg mL^-1Amp)培养液中，快速振荡培养约2–3h(OD600达到0.6-1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH＝7.0McIlvainebuffer悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose和0–500mM的咪唑分别亲和和纯化目的蛋白。

(3)SDS-PAGE结果(图1，M：蛋白质Marker)表明，重组InuAMN8(SEQ ID NO.3)和MutDR121EH9(SEQ ID NO.1)都获得了纯化，产物为单一条带。

实施例4纯化的重组野生酶InuAMN8和突变酶MutDR121EH9的性质测定

1、纯化的重组野生酶InuAMN8和突变酶MutDR121EH9的活性分析

活性测定方法采用3,5－二硝基水杨酸(DNS)法：将底物菊粉溶于缓冲液中，使其终浓度为0.5％(w/v)；反应体系含50μL适量酶液，450μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加750μL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值；1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖(以果糖计)所需的酶量。

2、纯化的重组野生酶InuAMN8和突变酶MutDR121EH9的热活性测定

在pH＝7.0的缓冲液中，于0–60℃下进行酶促反应。以菊粉为底物，反应10min，测定重组野生酶InuAMN8和突变酶MutDR121EH9的酶学性质。

结果表明：野生酶InuAMN8的最适温度为35℃，在0℃、10℃、20℃、40℃和50℃时分别具有15％、32％、58％、94％和40％的酶活；突变酶MutDR121EH9的最适温度为20℃，在0℃、10℃、35℃、40℃和50℃时分别具有43％、55％、72％、38％和16％的酶活(图2)。

3、纯化的重组野生酶InuAMN8和突变酶MutDR121EH9的热稳定性测定

将同样酶量的酶液分别置于45℃和50℃处理10–60min后，在pH＝7.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以菊粉为底物，反应10min，测定重组野生酶InuAMN8和突变酶MutDR121EH9的酶学性质。

结果表明：45℃处理10–60min后，野生酶InuAMN8保持85％以上的酶活性，突变酶MutDR121EH9的酶活保持在80％左右(图3)；50℃处理10–60min后，野生酶InuAMN8保持81％以上的酶活性，突变酶MutDR121EH9的酶活从32％降至14％(图4)。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 云南师范大学

<120> 一种低温活性改良的外切菊粉酶突变体MutDR121EH9

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 506

<212> PRT

<213> 突变酶(MutDR121EH9)

<400> 1

Met Asn Ser Leu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp

1 5 10 15

Gln Tyr Arg Pro Ala Phe His Tyr Thr Ala Glu Arg Asn Trp Leu Asn

20 25 30

Asp Pro Asn Gly Leu Val Tyr Leu Asn Gly Thr Tyr His Leu Phe Tyr

35 40 45

Gln His Asn Pro Phe Gly Ala Asp Trp Gly Asn Met Ser Trp Gly His

50 55 60

Ala Thr Ser Arg Asp Leu Leu His Trp Asp Glu Gln Pro Val Ala Ile

65 70 75 80

Pro Cys Asp Glu His Glu Ala Ile Phe Ser Gly Ser Ala Val Phe Asp

85 90 95

Gln His Asn Thr Ser Gly Leu Gly Thr Ala Ala Asn Pro Pro Leu Val

100 105 110

Ala Ile Tyr Thr Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Asp Arg Lys Thr Gly Leu

115 120 125

His Gln Ala Gln Ser Leu Ala Tyr Ser Leu Asp Glu Gly Arg Thr Trp

130 135 140

Thr Lys Tyr His Gly Asn Pro Val Leu Asp Arg Ala Ser Ala Asp Phe

145 150 155 160

Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp Tyr Asp Gly Gly Ala Gly Ser Tyr Trp

165 170 175

Val Met Val Ala Val Glu Ala Val Gln Arg Gln Val Val Leu Tyr Lys

180 185 190

Ser Ala Asp Leu Lys Ala Trp Glu His Leu Ser Thr Phe Gly Pro Ala

195 200 205

Asn Ala Thr Gly Gly Val Trp Glu Cys Pro Asp Leu Phe Glu Leu Pro

210 215 220

Val Asp Gly Asn Pro Glu Asp Asn Arg Trp Val Leu Ile Val Asn Ile

225 230 235 240

Asn Pro Gly Gly Ile Ala Gly Gly Ser Ala Gly Gln Tyr Phe Val Gly

245 250 255

Glu Phe Asp Gly Val Ala Phe His Ser Gly Ser Thr Val Thr Glu Gly

260 265 270

Leu Gln Lys Asp Ser Ser Arg Met Arg Glu Tyr Gly Trp Leu Asp Trp

275 280 285

Gly Arg Asp Tyr Tyr Ala Ala Val Ser Phe Ser Asn Val Pro Asp Gly

290 295 300

Arg Arg Ile Met Ile Gly Trp Met Asn Asn Trp Asp Tyr Ala Arg Glu

305 310 315 320

Thr Pro Thr Gly Gly Trp Arg Ser Ala Met Ser Leu Pro Arg Glu Val

325 330 335

Ser Leu Thr Arg Val Asp Gly Lys Val Met Leu Arg Gln Gln Ala Ile

340 345 350

Asp Pro Leu Pro Glu Arg Glu Thr Gly His Val Arg Leu Gly Pro Gln

355 360 365

Pro Leu Ala Ser Gly Val Leu Asp Val Pro Ala Ala Ala Ser Val Ala

370 375 380

Arg Ile Asp Val Glu Leu Glu Pro Gly Ala Ala Ala Gly Val Gly Leu

385 390 395 400

Val Leu Arg Ala Gly Asp Asp Glu Arg Thr Val Leu Arg Tyr Asp Thr

405 410 415

Ser Asp Gly Met Leu Arg Leu Asp Arg Arg Glu Ser Gly Gln Val Ala

420 425 430

Phe His Glu Thr Phe Pro Ser Ile Glu Ala Met Ala Val Pro Leu Gln

435 440 445

Gly Gly Arg Leu Arg Leu Arg Val Tyr Leu Asp Arg Cys Ser Val Glu

450 455 460

Val Phe Ala Gln Asp Gly Leu Ala Thr Leu Thr Asp Leu Val Phe Pro

465 470 475 480

Gly Glu Ala Ser Thr Gly Leu Ala Ile Phe Ala Glu Gly Glu Gly Ala

485 490 495

His Leu Val Val Leu Asp Val Val Gly Arg

500 505

<210> 2

<211> 1521

<212> DNA

<213> 突变酶基因(mutDR121EH9)

<400> 2

atgaattcat tgacgacggc ggcgggcgcc acgttggctg ccaccgacca gtaccggccc 60

gcgttccact acaccgccga acggaactgg ttgaacgatc cgaacgggct ggtgtacctc 120

aacggcacct accacctctt ctaccagcac aacccgttcg gcgctgactg gggcaacatg 180

tcctgggggc acgccacctc gcgggacctg ctgcactggg acgagcagcc cgtggccatt 240

ccgtgcgacg aacacgaggc catcttctcc ggctcggcgg tattcgatca gcacaacacc 300

agcggcctcg gcacagcggc caatcccccg ctggtggcca tttacaccag tgcctacagt 360

gaagaagacc gaaagacggg cctgcaccag gcgcagtcgc tcgcctacag cctcgacgaa 420

ggccggacct ggaccaagta ccacggcaat cccgtgctgg accgcgcgtc cgctgacttc 480

cgcgatccaa aggttttttg gtacgacggc ggcgccggaa gttactgggt gatggtcgcc 540

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ctcgacgtcg tcggccgttg a 1521

<210> 3

<211> 505

<212> PRT

<213> 野生酶InuAMN8(AGC01505)

<400> 3

Met Asn Ser Leu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp

1 5 10 15

Gln Tyr Arg Pro Ala Phe His Tyr Thr Ala Glu Arg Asn Trp Leu Asn

20 25 30

Asp Pro Asn Gly Leu Val Tyr Leu Asn Gly Thr Tyr His Leu Phe Tyr

35 40 45

Gln His Asn Pro Phe Gly Ala Asp Trp Gly Asn Met Ser Trp Gly His

50 55 60

Ala Thr Ser Arg Asp Leu Leu His Trp Asp Glu Gln Pro Val Ala Ile

65 70 75 80

Pro Cys Asp Glu His Glu Ala Ile Phe Ser Gly Ser Ala Val Phe Asp

85 90 95

Gln His Asn Thr Ser Gly Leu Gly Thr Ala Ala Asn Pro Pro Leu Val

100 105 110

Ala Ile Tyr Thr Ser Ala Tyr Ser Asp Ala Ala Pro Leu Pro Gly Arg

115 120 125

Gln Ala Gln Ser Leu Ala Tyr Ser Leu Asp Glu Gly Arg Thr Trp Thr

130 135 140

Lys Tyr His Gly Asn Pro Val Leu Asp Arg Ala Ser Ala Asp Phe Arg

145 150 155 160

Asp Pro Lys Val Phe Trp Tyr Asp Gly Gly Ala Gly Ser Tyr Trp Val

165 170 175

Met Val Ala Val Glu Ala Val Gln Arg Gln Val Val Leu Tyr Lys Ser

180 185 190

Ala Asp Leu Lys Ala Trp Glu His Leu Ser Thr Phe Gly Pro Ala Asn

195 200 205

Ala Thr Gly Gly Val Trp Glu Cys Pro Asp Leu Phe Glu Leu Pro Val

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Asp Gly Asn Pro Glu Asp Asn Arg Trp Val Leu Ile Val Asn Ile Asn

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Pro Gly Gly Ile Ala Gly Gly Ser Ala Gly Gln Tyr Phe Val Gly Glu

245 250 255

Phe Asp Gly Val Ala Phe His Ser Gly Ser Thr Val Thr Glu Gly Leu

260 265 270

Gln Lys Asp Ser Ser Arg Met Arg Glu Tyr Gly Trp Leu Asp Trp Gly

275 280 285

Arg Asp Tyr Tyr Ala Ala Val Ser Phe Ser Asn Val Pro Asp Gly Arg

290 295 300

Arg Ile Met Ile Gly Trp Met Asn Asn Trp Asp Tyr Ala Arg Glu Thr

305 310 315 320

Pro Thr Gly Gly Trp Arg Ser Ala Met Ser Leu Pro Arg Glu Val Ser

325 330 335

Leu Thr Arg Val Asp Gly Lys Val Met Leu Arg Gln Gln Ala Ile Asp

340 345 350

Pro Leu Pro Glu Arg Glu Thr Gly His Val Arg Leu Gly Pro Gln Pro

355 360 365

Leu Ala Ser Gly Val Leu Asp Val Pro Ala Ala Ala Ser Val Ala Arg

370 375 380

Ile Asp Val Glu Leu Glu Pro Gly Ala Ala Ala Gly Val Gly Leu Val

385 390 395 400

Leu Arg Ala Gly Asp Asp Glu Arg Thr Val Leu Arg Tyr Asp Thr Ser

405 410 415

Asp Gly Met Leu Arg Leu Asp Arg Arg Glu Ser Gly Gln Val Ala Phe

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Gly Arg Leu Arg Leu Arg Val Tyr Leu Asp Arg Cys Ser Val Glu Val

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Phe Ala Gln Asp Gly Leu Ala Thr Leu Thr Asp Leu Val Phe Pro Gly

465 470 475 480

Glu Ala Ser Thr Gly Leu Ala Ile Phe Ala Glu Gly Glu Gly Ala His

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Leu Val Val Leu Asp Val Val Gly Arg

500 505

<210> 4

<211> 1518

<212> DNA

<213> 野生酶基因inuAMN8(JQ863111)

<400> 4

atgaattcat tgacgacggc ggcgggcgcc acgttggctg ccaccgacca gtaccggccc 60

gcgttccact acaccgccga acggaactgg ttgaacgatc cgaacgggct ggtgtacctc 120

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ccgtgcgacg aacacgaggc catcttctcc ggctcggcgg tattcgatca gcacaacacc 300

agcggcctcg gcacagcggc caatcccccg ctggtggcca tttacaccag tgcctacagt 360

gacgccgcgc cgcttccggg ccggcaggcg cagtcgctcg cctacagcct cgacgaaggc 420

cggacctgga ccaagtacca cggcaatccc gtgctggacc gcgcgtccgc tgacttccgc 480

gatccaaagg ttttttggta cgacggcggc gccggaagtt actgggtgat ggtcgccgtc 540

gaggcggtgc agcgccaggt agtgctgtac aagtcggccg acctgaaggc gtgggaacac 600

ctgagcacct ttggccctgc caacgccacc ggcggcgtct gggaatgccc ggacctgttt 660

gagctgcccg tggacgggaa tccggaggac aaccggtggg tcctcattgt gaacatcaac 720

ccgggcggca ttgccggcgg ctccgcggga cagtacttcg tgggagagtt cgacggcgtg 780

gcgttccatt ccggatcgac tgtcaccgag ggcctccaga aggacagcag ccggatgcgg 840

gagtacggct ggctggactg ggggcgggac tactacgccg ccgtttcgtt cagcaacgtg 900

ccggacgggc gccggatcat gatcggctgg atgaacaact gggactacgc ccgcgagacg 960

cccaccggcg gctggcgcag cgccatgtcc ctgccgcggg aggtgtcgct gacccgggta 1020

gacgggaaag tgatgcttcg gcagcaagcc attgatccgt tgccggagcg ggaaacaggg 1080

cacgtccggc tggggccgca gcccttggcg tccggcgttc tggacgttcc ggccgccgca 1140

tccgtggcgc ggatcgacgt tgagctggag ccgggcgctg ccgcgggagt gggactggtg 1200

cttcgggcgg gggacgatga gcggacggtc ctccgctacg acacttcgga cgggatgctg 1260

cggctggacc gccgcgaatc cgggcaggtt gccttccacg aaaccttccc gtcgatcgaa 1320

gccatggccg tgcccttgca gggaggccgg ctgcgcctgc gggtctacct ggaccgctgc 1380

tcggtggagg ttttcgccca ggacgggctc gccacgctca ctgacctggt gttccccggg 1440

gaggcgagca cgggcctggc catcttcgcc gaaggtgagg gggcgcacct cgtggtgctc 1500

gacgtcgtcg gccgttga 1518

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaattcat tgacgacggc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcaacggccg acgacgtcga 20

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgaagaagac cgaaagacgg gcctgcacca ggcgcagtcg ctcgcc 46

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggtgcaggc ccgtctttcg gtcttcttca ctgtaggcac tg 42

Claims

1.一种低温活性改良的外切菊粉酶突变体MutDR121EH9，其特征在于，该突变体MutDR121EH9具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的突变体MutDR121EH9的编码基因mutDR121EH9。

3.根据权利要求2所述的编码基因mutDR121EH9，其特征在于，所述编码基因mutDR121EH9具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.包含如权利要求2或3所述的编码基因mutDR121EH9的重组载体。

5.包含如权利要求2或3所述的编码基因mutDR121EH9的重组菌。

6.如权利要求1所述的突变体MutDR121EH9的制备方法，其特征在于，该方法包含：

将具有如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的野生外切菊粉酶基因inuAMN8和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含inuAMN8的重组表达质粒pEasy-E1-inuAMN8；

以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板，以如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的突变引物，通过PCR扩增得到包含mutDR121EH9的重组表达质粒pEasy-E1-mutDR121EH9；

将重组表达质粒pEasy-E1-mutDR121EH9转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含mutDR121EH9的重组菌株；

培养重组菌株，诱导重组外切菊粉酶突变体MutDR121EH9表达，以获得重组外切菊粉酶突变体MutDR121EH9。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述包含mutDR121EH9的重组菌株的制备为，将所述重组表达质粒pEasy-E1-mutDR121EH9经DpnI酶消化，利用Mut

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述诱导采用IPTG进行诱导。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述重组外切菊粉酶突变体MutDR121EH9表达的产物经Nickel-NTA Agarose和0–500mM的咪唑分别亲和和纯化，获得重组外切菊粉酶突变体MutDR121EH9。

10.如权利要求1所述的突变体MutDR121EH9在食品、酿酒及洗涤中的应用。