JP2010022280A - 新規微生物、イヌリナーゼ、イヌリン分解剤、イヌロオリゴ糖の製造方法及びイヌリナーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】イヌリンを原料として、容易にイヌロオリゴ糖、特にイヌロテトラオースを製造する手段を提供する。
【解決手段】マイクロバクテリウム ｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＹＫ−０１（ＦＥＲＭ Ｐ−２１５９３）株；マイクロバクテリウム ｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＹＫ−０１（ＦＥＲＭ Ｐ−２１５９３）株由来であるイヌリナーゼ；以下に示す理化学的性質を有するイヌリナーゼ。（１）イヌリンに作用して直鎖状のイヌロオリゴ糖を生成し、この時の生成物の量を、イヌロテトラオース＞イヌロトリオース＞イヌロビオース、フルクトースとする。（２）至適ｐＨが６〜８．５である。（３）至適温度が４５〜５５℃である。（４）５０℃以下で安定である。（５）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定された分子量が約１２８０００である。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規微生物、イヌリナーゼ、これらを有効成分とするイヌリン分解剤、前記新規微生物又はイヌリナーゼを使用するイヌロオリゴ糖の製造方法、及び前記新規微生物を使用するイヌリナーゼの製造方法に関する。

植物が合成する貯蔵多糖は多様であり、グルカン、フルクタン、マンナン等の存在が知られている。その中でも、グルカンの一種であるデンプンを貯蔵多糖とする植物が最も多く存在するが、これに次いで多いのが、フルクタンの一種であるイヌリンを貯蔵多糖とする植物である。イヌリンを貯蔵多糖とする植物としては、例えば、ヒガンバナ科、キキョウ科又はキク科の植物が挙げられる。イヌリンは、スクロースのフルクトース残基に３０〜４０分子のフルクトースがβ−２，１結合した直鎖状の多糖である。
一方、多糖はオリゴ糖の製造原料として有用であり、オリゴ糖は機能性食品をはじめとする様々な用途が期待されている。そこで、イヌリンを利用したオリゴ糖の製造方法についても、環状オリゴ糖と直鎖状オリゴ糖の両面から検討されている。

環状オリゴ糖は、分子内糖転移酵素の作用で、イヌリンのフルクトシド結合が切断されると同時に、これがイヌリンの末端フルクトシド残基に転移することで生成することが知られている。具体的には、アースロバクター ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）に属する微生物によって産生されるイヌリンフルクトトランスフェラーゼを使用して、ジフルクトースジアンハイドライドＩＩＩ（ＤＦＡＩＩＩ）を製造する方法（非特許文献１及び２参照）、バチルス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ） ＯＫＭＺ３１Ｂ株が産生するシクロイヌロオリゴ糖生成酵素（ＣＦＴａｓｅ）を使用して、イヌリンから、６〜８分子のフルクトースがβ−２，１結合した環状イヌロオリゴ糖を製造する方法（非特許文献３及び特許文献１参照）、イヌリン及び０．０１〜１．０％の有機窒素源を含む培地を使用して環状イヌロオリゴ糖を製造する方法（特許文献２参照）が開示されている。

一方、直鎖状オリゴ糖は、イヌリナーゼでイヌリンを分解することで得られる。イヌリナーゼには、その反応様式からエンド型とエキソ型があり、直鎖状オリゴ糖を効率よく生成するためには、エンド型イヌリナーゼをできるだけ多く、かつエキソ型イヌリナーゼをできるだけ少なくした条件で反応させることが重要である。
このような課題に対して、ペニシリナム パープロジェナム ヴァル ルブリ−スクレロティウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ ｖａｒ． ｒｕｂｒｉ−ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）（ＦＥＲＭ Ｐ−８７０５）を培養して得られるイヌリナーゼを、陽イオン交換体でエンド型イヌリナーゼとエキソ型イヌリナーゼとに分離して、エンド型イヌリナーゼを得る方法（特許文献３参照）が開示されている。しかし、この方法は、精製方法が特殊なため設備投資が必要であり、さらにオリゴ糖の製造に長時間を要し、コスト上昇が不可避であるという問題点があった。
また、このような精製を必要としない方法として、ペニシリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物が産生するイヌリナーゼを利用する方法（特許文献４参照）が開示されている。しかし、この方法でも培地組成によっては、産生される主要なイヌリナーゼがエキソ型になったり、イヌリナーゼがエキソ型からエンド型に変化するまでに長時間を要するという問題点があった。
また、キクイモ塊茎やチコリ地下部などのイヌリン含有植物体を炭素源として、マルトースとリン酸アンモニウムを添加し、リン酸カリウムを添加しない培地を使用してイヌリナーゼ産生菌を培養し、エンド型イヌリナーゼを得る方法（特許文献５参照）や、同培地に、さらにミネラルとしてマグネシウム及び亜鉛を添加した培地を使用する方法（特許文献６参照）が開示されているが、いずれの方法でも、使用できる培地の組成が限られるという問題点があった。
そして何より、ここまでに挙げた従来技術では、所望の特定の重合度を有するオリゴ糖を効率的に得ることが困難であるという問題点あった。
これに対し、バチルス ｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＫ−４６４５株が産生する酵素を使用して、イヌロテトラオースを製造する方法（特許文献７参照）が開示されている。
特開平０２−２５５０８５号公報 特開平０６−１４１８５６号公報 特開平０３−０８３５８１号公報 特開昭６２−２２８２９３号公報 特開平０３−１９８７７４号公報 特開平０４−１９０７８９号公報 特開昭６２−２３２３８０号公報 Ｔ．Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，３９７，１５３（１９７５） Ｎｅｗ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ２００５，Ｖｏｌ．４７，Ｎｏ．３ Ｍ．Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｔ．Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｔ．Ｋｕｒａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｔａｍｕｒａ ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｚｕｔａｎｉ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９２，８３−９０（１９８９）

しかし、特許文献７に記載の方法でも、イヌロテトラオースの産生効率が低いという問題点があった。また、菌体から酵素を抽出して利用する場合には、酵素が菌体の細胞壁に存在するので、細胞を破砕して細胞壁を集めた画分から酵素を抽出して精製する必要があり、精製酵素の入手に非常に手間がかかるという問題点があった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、イヌリンを原料として、容易にイヌロオリゴ糖、特にイヌロテトラオースを製造する手段を提供することを課題とする。

上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、マイクロバクテリウム ｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＹＫ−０１（ＦＥＲＭ Ｐ−２１５９３）株である。
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の微生物をイヌリン共存下で培養する工程を有するイヌロオリゴ糖の製造方法である。
請求項３に記載の発明は、マイクロバクテリウム ｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＹＫ−０１（ＦＥＲＭ Ｐ−２１５９３）株由来であるイヌリナーゼである。
請求項４に記載の発明は、以下に示す理化学的性質を有するイヌリナーゼである。（１）イヌリンに作用して直鎖状のイヌロオリゴ糖を生成し、この時の生成物の量を、イヌロテトラオース＞イヌロトリオース＞イヌロビオース、フルクトースとする。（２）至適ｐＨが６〜８．５である。（３）至適温度が４５〜５５℃である。（４）５０℃以下で安定である。（５）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定された分子量が約１２８０００である。
請求項５に記載の発明は、イヌロテトラオースの生成量を、イヌロトリオースの生成量の４倍以上（質量比）とする請求項３又は４に記載のイヌリナーゼである。
請求項６に記載の発明は、請求項３〜５のいずれか一項に記載のイヌリナーゼをイヌリンに作用させるイヌロオリゴ糖の製造方法である。
請求項７に記載の発明は、請求項１に記載の微生物を有効成分とするイヌリン分解剤である。
請求項８に記載の発明は、請求項３〜５のいずれか一項に記載のイヌリナーゼを有効成分とするイヌリン分解剤である。
請求項９に記載の発明は、請求項１に記載の微生物を培養し、得られた培養物から水溶性成分を抽出する工程を有するイヌリナーゼの製造方法である。

本発明によれば、イヌリンを原料として、容易にイヌロオリゴ糖を製造できる。特に、イヌロテトラオース及びイヌロトリオースを優先的に生成させることができ、イヌロテトラオースを最も効率的に製造できる。したがって、本発明は、機能性食品をはじめとする各種飲食品等への、イヌロオリゴ糖の新たな用途を提供する。

以下、本発明について、詳しく説明する。
なお、本発明において、「イヌロオリゴ糖」とは、フルクトースがβ−１，２結合で連結した構造を有するオリゴ糖のことを指し、そのうちの２糖オリゴ糖を「イヌロビオース」、３糖オリゴ糖を「イヌロトリオース」、４糖オリゴ糖を「イヌロテトラオース」と言う。
また、以下において、「マイクロバクテリウム ｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＹＫ−０１（ＦＥＲＭ Ｐ−２１５９３）株」は、「マイクロバクテリウム ｓｐ．ＹＫ−０１株」と略記する。

＜マイクロバクテリウム ｓｐ．ＹＫ−０１株の取得＞
マイクロバクテリウム ｓｐ．ＹＫ−０１株は下記方法で取得した。
大阪府柏原市旭ケ丘山中の土壌１ｇを１００ｍｌの滅菌水に懸濁したものを静置した。その上澄み液１ｍｌに滅菌水を加えて、１０００倍希釈液を調製した。その希釈液をパスツールピペットで吸い取り、下記平板培地の中央に一滴滴下して、全面に広げ、３０℃で２日間培養した。生じたコロニーを下記斜面培地に移植し、３０℃で２日間培養した。
（平板培地及び斜面培地）
平板培地及び斜面培地は、酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）０．１ｗ／ｖ％、硝酸ナトリウム０．２ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、塩化カリウム０．０５ｗ／ｖ％、リン酸二水素カリウム０．０５ｗ／ｖ％を含む培地を、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整し、イヌリン（和光純薬工業株式会社製）２ｗ／ｖ％、寒天（和光純薬工業株式会社製）３ｗ／ｖ％を加えて、１２１℃で１５分間滅菌処理することで調製した。

分離した菌株を斜面培地から２ｍｌの下記液体培地に移植し、３０℃で２日間振とう培養した。培養液を遠心分離して得た上清を、下記方法で薄層クロマトグラフィーに供し、発色液を噴霧加熱して生じる糖のスポットから、培養液中のイヌリンの分解パターンを確認し、イヌロテトラオースの生成が確認された本菌株を取得した。
（液体培地）
液体培地は、酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）０．１ｗ／ｖ％、硝酸ナトリウム０．２ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、塩化カリウム０．０５ｗ／ｖ％、リン酸二水素カリウム０．０５ｗ／ｖ％を含む培地を、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整し、イヌリン（和光純薬工業株式会社製）２ｗ／ｖ％を加えて、１２１℃で１５分間滅菌処理することで調製した。
（薄層クロマトグラフィー）
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は以下の方法で行った。
薄層クロマトグラフィープレート（ＨＰ−Ｋ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ、ワットマン社製）を使用し、展開溶媒として、２−プロパノール：１−ブタノール：蒸留水＝１２：３：４(Ｖ／Ｖ／Ｖ)を使用した。
各培養液の上清１．０μｌをスポットして上昇法による展開を行い、ドライヤーで乾燥後、ｎａｐｈｔｈｏｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ硫酸試薬（Ｍ．Ｃｈｅｂｒｅｇｚａｂｈｅｒ， Ｓ．Ｒｕｆｉｍｉ，Ｂ．Ｍｏｎａｂｌｂｉ ａｎｄ Ｍ．Ｌａｔｏ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１２７，１３３−１６２（１９７６））を噴霧し、１１０℃で５分間加熱して糖を発色させた。

＜マイクロバクテリウム ｓｐ．ＹＫ−０１（ＦＥＲＭ Ｐ−２１５９３）株の同定＞
［形態的性質］
滅菌した下記寒天培地に、本菌株を一白金耳接種し、３０℃で２日間培養し、コロニーを顕微鏡観察することにより形態的性質を確認した。結果を表１及び２に示す。
（寒天培地）
寒天培地は、酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）０．１ｗ／ｖ％、硝酸ナトリウム０．２ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、塩化カリウム０．０５ｗ／ｖ％、リン酸二水素カリウム０．０５ｗ／ｖ％を含む培地を、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整し、その後寒天（和光純薬工業株式会社製）１．５ｗ／ｖ％、イヌリン（和光純薬工業株式会社製）１．５ｗ／ｖ％を加えて、１２１℃で１５分間滅菌処理することで調製した。

［生理学的性質］
本菌株の生理学的性質を公知の方法により評価した。結果を表３に示す。

［塩基配列］
本菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列（部分配列）を公知の方法で決定した。決定した塩基配列のうち、５’末端（１番目）から１４８２番目までの塩基配列を配列番号１に示す。
この決定した塩基配列について、ＭｉｃｒｏＳｅｑ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｆｕｌｌ Ｇｅｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙを用いて相同性検索を行った。
その結果、本菌株の配列番号１に示す塩基配列は、相同率９９．７２％でマイクロバクテリウム トリコテセノリティクム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に対し、最も高い相同性を示した。また、国際塩基配列データベースを用いた相同性検索の結果、本菌株の配列番号１に示す塩基配列は、マイクロバクテリウム トリコテセノリティクムの基準株であるＤＳＭ８６０８株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に対し、相同率９８．７％の相同性を示した。さらに、両データベースを用いた検索の結果で、本菌株の配列番号１に示す塩基配列と高い相同性を示した１６ＳｒＤＮＡの塩基配列の大半は、マイクロバクテリウム属に属する菌 株由来の配列であった。
上記のように、本菌株は、運動性を持たないグラム陽性の短桿菌で、コロニー色は黄色を呈し、カタラーゼ反応は陽性、オキシダーゼ反応は陰性を示した。これら性状はマイクロバクテリウム トリコテセノリティクムの一般的な性状と一致している。一方で、両菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列は一致しておらず、さらに本菌株はＴｗｅｅｎ８０を加水分解せず、硫化水素を産生しない等、生理学的性質が、一般的なマイクロバクテリウム トリコテセノリティクムとは異なっていた（Ｙｏｋｏｔａ Ａ．, Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｍ., Ｓａｋａｎｅ Ｔ. ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ Ｎ.：Ｐｒｏｐｏｓａｌ ｏｆ ｓｉｘ ｎｅｗ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ Ｏｍｅｌｉａｎｓｋｉ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｓ Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ ｃｏｍｂ. Ｎｏｖ. Ｉｎｔ. Ｊ. Ｓｙｓｔ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ., １９９３, ４３, ５５５−５６４.参照）。
以上より、本菌株は、マイクロバクテリウム属に属し、マイクロバクテリウム トリコテセノリティクムに近縁ではあるが、異なる菌株であると判断された。

本発明のマイクロバクテリウム ｓｐ．ＹＫ−０１株は、平成２０年６月９日付けで受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１５９３として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託されている。

マイクロバクテリウム ｓｐ．ＹＫ−０１株は、イヌリナーゼを産生する。当該イヌリナーゼは、イヌリンに作用してこれを分解し、直鎖状のイヌロオリゴ糖を生成するが、主生成物はイヌロテトラオース及びイヌロトリオースであり、イヌロビオース及びフルクトースをほとんど生成しない。そして、特にイヌロテトラオースの生成比率が高い点に特徴があり、イヌロテトラオース／イヌロトリオース（ｗ／ｗ、質量比）の比率を４倍以上にすることが可能である。
すなわち、前記イヌリナーゼは、
（Ａ）イヌリンに作用した時の生成物の量を、イヌロテトラオース＞イヌロトリオース＞イヌロビオース、フルクトースとする
理化学的性質を有する。
このように直鎖状のイヌロオリゴ糖を優先的に生成し、特に、「イヌロテトラオース」を高い比率で生成するイヌリナーゼを産生する微生物として、マイクロバクテリウム属に属するものは従来知られていない。
このように、本発明は、イヌリンに作用した時の生成物の量を、イヌロテトラオース＞イヌロトリオース＞イヌロビオース、フルクトースとするマイクロバクテリウム属に属する微生物を初めて提供するものである。かかる微生物を、以下、本発明の微生物と言う。

さらに、マイクロバクテリウム ｓｐ．ＹＫ−０１株由来のイヌリナーゼは、以下に示す理化学的性質を有する。
（Ｂ）至適ｐＨは６〜８．５であり、ｐＨ７．５程度で最も高い活性を示す。
（Ｃ）至適温度は４５〜５５℃であり、５０℃程度で最も高い活性を示す。
（Ｄ）５０℃以下で安定であり、３０℃程度で最も高い安定性を示す。
（Ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定された分子量が約１２８０００である。
また、前記イヌリナーゼは、イヌリンに作用させて得られる生成物の分布から、エキソ型であると推測される。

前記イヌリナーゼは、本発明の微生物を培養し、得られた培養物から水溶性成分を抽出することで得られる。
例えば、マイクロバクテリウム ｓｐ．ＹＫ−０１株は、イヌリンを含有する培地で培養することが好ましい。そして、培地中のイヌリンの含有量は、０．５〜５ｗ／ｖ％であることが好ましく、１〜３ｗ／ｖ％であることがより好ましい。培地は、液体培地及び固形培地のいずれでも良い。
培養方法は、培地の種類に応じて、静置培養、振とう培養、撹拌培養等から適宜選択すれば良い。
培養温度は、２０〜４０℃であることが好ましく、２５〜３５℃であることがより好ましい。
培養時間は、培養温度に応じて適宜調整すれば良いが、通常好ましくは２４〜７２時間、より好ましく３６〜６０時間程度で十分である。

得られた培養物からは、公知の手法で水溶性成分を抽出すれば良く、その方法は特に限定されない。マイクロバクテリウム ｓｐ．ＹＫ−０１株は、産生したイヌリナーゼを菌体外へ分泌していると考えられ、菌体を破砕することなく、容易にイヌリナーゼを取り出すことができる。例えば、培養物を菌体ごと遠心分離して、上清を分離する手法でイヌリナーゼを含有する粗酵素液が得られる。

イヌリナーゼを含有する粗酵素液は、目的に応じて適宜精製に供して、精製酵素液としても良い。精製方法は特に限定されず、公知の手法を単独で又は複数種類併用して精製すれば良い。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーや、精密ろ過膜、限外ろ過膜等の各種分離膜を使用した精製方法が例示できる。
イヌリナーゼは、精製酵素液をさらに凍結乾燥等に供して、粉体として取り出してから使用しても良いし、精製酵素液としてそのまま使用しても良い。

本発明の微生物、その培養物、又は前記理化学的性質を有するイヌリナーゼ等、イヌリナーゼ活性を有するものは、これを有効成分とするイヌリン分解剤の調製に好適である。なお、前記培養物は、イヌリナーゼを含有している限り、本発明の微生物の生死は問わない。
前記イヌリン分解剤には、その効果を妨げない範囲内において、前記有効成分以外にその他の成分を含有させても良い。

イヌリンを分解してイヌロオリゴ糖を製造する場合には、例えば、本発明の微生物をイヌリン共存下で培養するか、又は前記理化学的性質を有するイヌリナーゼをイヌリンに作用させれば良い。これにより、上記のように、イヌロビオース及びフルクトースをほとんど含有せず、イヌロテトラオース及びイヌロトリオースの混合物を主成分とするイヌロオリゴ糖が得られる。

本発明の微生物をイヌリン共存下で培養して得られた培養物、又は前記理化学的性質を有するイヌリナーゼをイヌリンに作用させて得られた反応生成物は、いずれも、目的に応じてそのまま使用しても良いし、適宜後処理してから使用しても良い。さらに、液状のまま使用しても良いし、乾燥させて固形物又は粉体としてから使用しても良い。
後処理の方法は特に限定されず、中和、抽出、ろ過、遠心分離、濃縮、各種クロマトグラフィー、各種分離膜を使用した精製等、公知の手法を単独で又は複数種類併用して行えば良い。また乾燥法としては、送風乾燥、加熱乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥等、公知の手法から適宜選択すれば良い。

以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例における濃度の単位「ｍｇ％」とは、溶液１００ｍｌ中に含まれる溶質のｍｇ単位の量を表し、単位「ｍｇ／１００ｍｌ」と同義である。

［実施例１］
＜マイクロバクテリウム ｓｐ．ＹＫ−０１株を使用した発酵によるオリゴ糖の生成＞
（培養液の調製）
酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）０．１ｗ／ｖ％、硝酸ナトリウム０．２ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、塩化カリウム０．０５ｗ／ｖ％、リン酸二水素カリウム０．０５ｗ／ｖ％を含む培地を、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整し、イヌリン（和光純薬工業株式会社製）２ｗ／ｖ％を加えて、１２１℃で１５分間滅菌処理した。
次いで、この滅菌培地に、本菌株を一白金耳接種し、３０℃で２日間振とう培養を行い、得られた培養液を前培養液とした。
さらに、前記滅菌培地１０ｍＬに、前記前培養液を１０μｌ加え、３０℃で２４時間振とう培養を行い、培養液を調製した。
次いで、この培養液をＤＩＳＭＩＣ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅフィルター ０．４５μｍ（Ａｄｖａｎｔｅｃ社製）を使用して濾過し、分析試料を得た。
得られた分析試料を、下記条件で高速液体クロマトグラフィーにより分析した。

分析条件；
カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０２．５ ＨＱ（３００×７．８ｍｍ）（Ｓｈｏｄｅｘ製）を直列で２本連結
カラム温度：４０℃
移動層：０．１Ｍ ＮａＮＯ_３水溶液
検出器：示差屈折計（ＲＩＤ−１０Ａ、株式会社島津製作所製）

（分析結果）
分析の結果、分析試料中には、フルクトースが１３．８９ｍｇ％、イヌロビオースが４１．２０ｍｇ％、イヌロトリオースが２２０．７０ｍｇ％、イヌロテトラオースが９９３．３３ｍｇ％の濃度で含まれていた。すなわち、イヌロテトラオース／イヌロトリオース（ｗ／ｗ、質量比）の比率は４．５であった。また、下記式（１）で算出される、イヌリンからの４糖以下の糖の生成率は、５８．７％であった。

〔４糖以下の糖の生成率（％）〕＝{〔フルクトース濃度（ｍｇ％）〕＋〔イヌロビオース濃度（ｍｇ％）〕+〔イヌロトリオースオリゴ糖濃度（ｍｇ％）〕＋〔イヌロテトラオースオリゴ糖濃度（ｍｇ％）〕}／２０００（ｍｇ％）×１００
・・・（１）

［実施例２］
＜マイクロバクテリウム ｓｐ．ＹＫ−０１株からの酵素の抽出＞
（培地の調製）
酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）０．１ｗ／ｖ％、硝酸ナトリウム０．２ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、塩化カリウム０．０５ｗ／ｖ％、リン酸二水素カリウム０．０５ｗ／ｖ％を含む培地を、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整し、イヌリン（和光純薬工業株式会社製）２ｗ／ｖ％を加えて、１２１℃で１５分間滅菌処理した。

（粗酵素液の調製）
前記滅菌培地に本菌株を一白金耳摂取し、３０℃で２日間振とう培養を行った。
振とう培養終了後、培養液３００ｍｌを遠心分離装置（ｈｉｍａｃ ＣＦ１５Ｄ、日立工機株式会社製）を使用して８０００ｒｐｍ、４℃の条件で２０分間遠心分離し、得られた上清を透析用セルロースチューブ（Ｖｉｓｋａｓｅ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）を使用して、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して一晩透析処理を行った。この透析処理で得られた試料を粗酵素液とした。そして、得られた粗酵素液について、後述の方法で酵素活性を測定した。

（精製酵素液（Ｉ）の調製）
前記粗酵素液を、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したイオン交換クロマトグラフィーカラム（ＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、φ１６ｍｍ×２４０ｍｍ、東ソー株式会社製）の上端より流し込んで、成分を吸着させた。
次いで、塩化ナトリウムの濃度を０Ｍから０．５Ｍまで直線的に変化させる、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した濃度勾配法によって、酵素を溶出させた。この時、デジタルビーム分光光度計ＵＶ−１２００型（株式会社島津製作所製）を使用して、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定することで、溶出タンパク質を検出した。各画分（フラクション）の吸光度の測定結果を、塩化ナトリウムの濃度と共に図１に示す。
さらに、後述の方法で、得られた各画分の酵素活性を測定し、活性画分である精製酵素液（Ｉ）を得た。この時の５００ｎｍにおける吸光度の測定結果を、図１にあわせて示す。図１の５００ｎｍにおける吸光度の測定結果から、十分な酵素活性を示した活性画分は、フラクションＮｏ．２８〜３２のものであり、これらを精製酵素液（Ｉ）とした。

（精製酵素液（ＩＩ）の調製）
得られた精製酵素液（Ｉ）を、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したゲル濾過クロマトグラフィーカラム（ＨｉＴｒａｐＱ、５ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）の上端より流し込んで、成分を吸着させた。
次いで、塩化ナトリウムの濃度を０．３Ｍから０．５Ｍに直線的に変化させる、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した濃度勾配法によって、酵素を溶出させた。この時の溶出タンパク質の検出は、前記精製酵素液（Ｉ）の調製時と同様の方法で行った。各画分（フラクション）の吸光度の測定結果を、塩化ナトリウムの濃度と共に図２に示す。
さらに、前記精製酵素液（Ｉ）の場合と同様の方法で、得られた各画分の酵素活性を測定し、活性画分である精製酵素液（ＩＩ）を得た。この時の５００ｎｍにおける吸光度の測定結果を、図２にあわせて示す。図２の５００ｎｍにおける吸光度の測定結果から、十分な酵素活性を示した活性画分は、フラクションＮｏ．１４〜１７のものであり、これらを精製酵素液（ＩＩ）とした。

（精製酵素液（ＩＩＩ）の調製）
得られた精製酵素液（ＩＩ）を、さらに限外ろ過ユニット（モルカットＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を使用して５ｍｌまで濃縮し、スクロース０．５ｇを添加した。
これを、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したゲル濾過クロマトグラフィーカラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲ、φ２６ｍｍ×５５０ｍｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）の上端より流し込んで、成分を吸着させた。
次いで、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で酵素を溶出させた。この時の溶出タンパク質の検出は、前記精製酵素液（Ｉ）の調製時と同様の方法で行った。各画分（フラクション）の吸光度の測定結果を図３に示す。
さらに、前記精製酵素液（Ｉ）の場合と同様の方法で、得られた各画分の酵素活性を測定し、活性画分である精製酵素液（ＩＩＩ）を得た。この時の５００ｎｍにおける吸光度の測定結果を、図３にあわせて示す。図３の５００ｎｍにおける吸光度の測定結果から、十分な酵素活性を示した活性画分は、フラクションＮｏ．５０〜５７のものであり、これらを精製酵素液（ＩＩＩ）とした。

（総タンパク質量の定量）
標準タンパク質として牛血清γ−グロブリンを使用するブラッドフォード法により、前記粗酵素液、精製酵素液（Ｉ）、精製酵素液（ＩＩ）及び精製酵素液（ＩＩＩ）の５９５ｎｍにおける吸光度を測定することで、これら各酵素液中の総タンパク質量（ｍｇ）を定量した。結果を表４に示す。

（酵素活性、総活性、比活性及び収率の測定）
前記粗酵素液、並びに前記精製酵素液（Ｉ）、精製酵素液（ＩＩ）及び精製酵素液（ＩＩＩ）の調製工程における各画分（酵素液）について、酵素反応で生成する還元糖を３，５−Ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ法（ＤＮＳ法）で測定することにより、酵素活性を測定した。具体的には、以下の通りである。
測定対象の各酵素液０．１ｍｌに、０．０２５Ｍリン酸緩衝液０．４ｍｌを加え、３０℃で２分間インキュベーションした後、２．０ｗ／ｖ％イヌリン溶液０．５ｍｌ加えて、３０℃で３０分間反応させた。
次いで、ＤＮＳ試薬１．０ｍｌを加えて酵素反応を停止させ、５分間煮沸して反応液を発色させた。
そして、発色させた反応液を水冷した後、これに蒸留水８．０ｍｌを加えて希釈することで測定サンプルを調製し、デジタルビーム分光光度計ＵＶ−１２００型（株式会社島津製作所製）を使用して、前記測定サンプルの５００ｎｍにおける吸光度を測定した。
そして、標準サンプルとして、濃度が０〜２．７μｍｏｌ／ｍｌであるフルクトース溶液を使用して検量線を作成しておき、前記吸光度の測定値と下記式（２）とから、各酵素液１ｍＬあたりの酵素活性を算出した。なお、以下に示す酵素活性の単位「ｕｎｉｔ」は、1分間に１μｍｏｌのフルクトースを還元する還元力に相当する酵素活性を示す。
そして、測定した酵素活性から、下記式（３）により総活性を、下記式（４）により比活性を、下記式（５）により収率をそれぞれ算出した。結果を表４に示す。

〔酵素液１ｍｌあたりの酵素活性（ｕｎｉｔ／ｍｌ）〕＝｛〔測定サンプルの吸光度〕−〔反応時間０分の反応液の吸光度〕｝／〔検量線の傾き〕×１０／３０
・・・（２）
〔総活性（ｕｎｉｔ）〕＝〔酵素液１ｍｌあたりの酵素活性（ｕｎｉｔ／ｍｌ）〕×〔酵素液量（ｍｌ）〕
・・・（３）
〔比活性（ｕｎｉｔ／ｍｇ）〕＝〔総活性（ｕｎｉｔ）〕／〔タンパク質量（ｍｇ）〕
・・・（４）
〔収率（％）〕＝〔精製酵素液の総活性〕／〔粗酵素液の総活性〕×１００
・・・（５）

（精製酵素の分子量の測定）
精製酵素液（ＩＩＩ）に含まれる酵素（イヌリナーゼ）の分子量を、以下に示すポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した。
すなわち、精製酵素液（ＩＩＩ）０．０１ｍｌに、ＳＤＳ電気泳動サンプル緩衝液０．０１ｍｌを加え、１００℃で２分間処理したものを測定試料とし、２０ｍＡの定電流で電気泳動を行った。電気泳動は、Ｌａｅｍｍｌｉらの方法（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０）参照）に従い、アクリルアミド濃度１０％のゲル（ポリアクリルアミド・プレキャストゲルＰＡＧＥＬ、アトー株式会社製）を使用して行った。
その結果、精製酵素液（ＩＩＩ）に含まれる酵素は、単一バンドを示し、その移動度を分子量マーカータンパク質の移動度と比較して分子量を求めたところ、推定分子量は１２８０００であった。この時の電気泳動像を図４に示す。図４中、左側レーンのバンドが分子量マーカータンパク質であり、矢印で示した右側レーンのバンドが精製酵素液（ＩＩＩ）に含まれる酵素である。

［実施例３］
＜マイクロバクテリウム ｓｐ．ＹＫ−０１株由来のイヌリナーゼを使用したオリゴ糖の生成＞
（精製酵素液（ＩＩＩ）によるオリゴ糖の生成）
精製酵素液（ＩＩＩ）０．４ｍｌに５．０ｗ/ｖ％イヌリン溶液０．１ｍｌを加え、３０℃で０分、５分、１０分、２０分、３０分、６０分、９０分及び１２０分、それぞれ反応させた後、反応液を２分間煮沸して、反応を停止させた。

（オリゴ糖の分析）
反応停止後の上記各反応液０．２ｍｌに、アセトニトリル０．３ｍｌを加えて、未反応のイヌリンを析出させた。次いで、遠心分離装置（ｈｉｍａｃ ＣＦ１５Ｄ、日立工機株式会社製）を使用して、この反応液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心処理し、得られた上澄み５μｌを分析試料とした。そして得られた分析試料を、下記条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。分析結果を表５に示す。表５中、イヌロトリオース及びイヌロテトラオースの「濃度」は、標準サンプルで作成した検量線を使用して定量した。また、イヌロトリオース及びイヌロテトラオースの「生成率」は、下記式（６）により算出した。

ＨＰＬＣ分析条件；
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＮＨ２ ＳＧ８０ Ｓ−５μｍ（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）（株式会社資生堂製）
カラム温度：常温
移動層：アセトニトリル／水＝６５／３５（ｖ／ｖ）
検出器：示差屈折計（ＲＩＤ−６Ａ、株式会社島津製作所製）

〔生成率（％）〕＝{〔イヌロトリオース濃度（ｍｇ％）〕+〔イヌロテトラオース濃度（ｍｇ％）〕}／４００（ｍｇ％）×１００
・・・（６）

また、上記各反応液を下記条件で薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析した。ＴＬＣ展開像を図５に示す。図５中、「Ｆ」はフルクトース、「Ｆ２」はイヌロビオース、「Ｆ３」はイヌロトリオース、「Ｆ４」はイヌロテトラオースにそれぞれ相当するスポットである。また、「Ｓｔ」は、フルクトース、イヌロビオース、イヌロトリオース及びイヌロテトラオースを含有する標準サンプルである。さらに、「０」〜「１２０」は、該当する反応時間（分）の分析試料を示す。

ＴＬＣ分析条件；
シリカゲルプレート（ＨＰ−Ｋ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ、ワットマンジャパン株式会社製）上に、上記各反応液を１．０μｌずつスポットし、展開溶媒として２−プロパノール／１−ブタノール／水＝１２／３／４（ｖ／ｖ／ｖ）を使用して上昇法によって展開し、ドライヤーで乾燥後、ナフトレソルシノール硫酸試薬を噴霧して、１１０℃で５分間加熱することで糖を発色させた。

（分析結果）
ＨＰＬＣ分析の結果、表５から明らかなように、分析試料中には主生成物としてイヌロトリオースとイヌロテトラオースが含まれており、フルクトース及びイヌロビオースは含まれていないことが確認された。また、イヌロテトラオースの量は、反応時間６０分以降ではほぼ一定であった。また、例えば反応時間６０分の段階で、イヌロテトラオースはイヌロトリオースの約６倍の量であるなど、酵素反応の生成物の中ではイヌロテトラオースの比率が極めて高いことが確認された。

また、ＴＬＣ分析の結果、図５から明らかなように、反応時間０分を除く上記各反応液では、フルクトース及びイヌロビオースに相当するスポットは検出されず、イヌロトリオース及びイヌロテトラオースに相当するスポットが検出された。さらに、イヌロテトラオースに相当するスポットの方が、イヌロトリオースに相当するスポットよりも濃度が顕著に高かった。すなわち、反応時間０分を除く上記各反応液中には、主生成物としてイヌロトリオース及びイヌロテトラオースが含まれ、フルクトース及びイヌロビオースは含まれず、イヌロトリオースよりもイヌロテトラオースの比率が極めて高いことが示され、ＨＰＬＣ分析結果を支持する結果が得られた。

［実施例４］
＜酵素活性のｐＨ依存性の確認＞
精製酵素液（ＩＩＩ）０．１ｍｌに、蒸留水０．３ｍｌと、ｐＨが４．０〜１０．０の間で０．５間隔に調整されたグリシン−トリス−クエン酸緩衝液０．１ｍｌを加えた試料を１３種調製し、この試料を３０℃で２分間インキュベーションした後、２．０ｗ／ｖ％イヌリン溶液０．５ｍｌを加えて、３０℃で３０分間反応させた。次いで、前記ＤＮＳ法により酵素活性を測定した。結果を図６に示す。
図６から明らかなように、精製酵素液（ＩＩＩ）は、ｐＨ７．５程度で最も高活性であることが確認された。

［実施例５］
＜酵素活性の温度依存性の確認＞
精製酵素液（ＩＩＩ）０．１ｍｌに、０．０２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加えた試料を９つ調製し、これら試料を２０〜６０℃間の５℃間隔で設定された９通りの温度でそれぞれ２分間インキュベーションした後、２．０ｗ／ｖ％イヌリン溶液０．５ｍｌを加えて、同様の２０〜６０℃の温度で３０分間反応させた。次いで、前記ＤＮＳ法により酵素活性を測定した。結果を図７に示す。図７中、「○」が本実施例のデータである。
図７から明らかなように、精製酵素液（ＩＩＩ）は、５０℃程度で最も高活性であることが確認された。

［実施例６］
＜酵素活性の温度安定性の確認＞
精製酵素液（ＩＩＩ）０．１ｍｌに、０．０２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加えた試料を９つ調製し、これら試料を２０〜６０℃間の５℃間隔で設定された９通りの温度でそれぞれ１０分間インキュベーションした後、氷冷した。次いで、これに２．０ｗ／ｖ％イヌリン溶液０．５ｍｌを加えて、３０℃で３０分間反応させた。次いで、前記ＤＮＳ法により酵素活性を測定した。結果を図７に示す。図７中、「●」が本実施例のデータである。
図７から明らかなように、精製酵素液（ＩＩＩ）は、５０℃程度まで安定であることが確認された。

本発明は、機能性食品をはじめとする各種飲食品の製造に利用可能である。

実施例２の精製酵素液（Ｉ）調製工程におけるイオン交換カラムクロマトグラフィーによる各画分の吸光度測定結果を示すグラフである。 実施例２の精製酵素液（ＩＩ）調製工程におけるゲル濾過カラムクロマトグラフィーによる各画分の吸光度測定結果を示すグラフである。 実施例２の精製酵素液（ＩＩＩ）調製工程におけるゲル濾過カラムクロマトグラフィーによる各画分の吸光度測定結果を示すグラフである。 実施例２における精製酵素液（ＩＩＩ）中のイヌリナーゼの電気泳動像である。 実施例３のイヌロオリゴ糖分析時におけるＴＬＣ展開像である。 実施例４における精製酵素液（ＩＩＩ）の酵素活性のｐＨ依存性のデータを示すグラフである。 実施例５における精製酵素液（ＩＩＩ）の酵素活性の温度依存性のデータ、及び実施例６における精製酵素液（ＩＩＩ）の酵素活性の温度安定性のデータをそれぞれ示すグラフである。

Claims (9)

1. マイクロバクテリウム ｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＹＫ−０１（ＦＥＲＭ Ｐ−２１５９３）株。
2. 請求項１に記載の微生物をイヌリン共存下で培養する工程を有するイヌロオリゴ糖の製造方法。
3. マイクロバクテリウム ｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＹＫ−０１（ＦＥＲＭ Ｐ−２１５９３）株由来であるイヌリナーゼ。
4. 以下に示す理化学的性質を有するイヌリナーゼ。
   （１）イヌリンに作用して直鎖状のイヌロオリゴ糖を生成し、この時の生成物の量を、イヌロテトラオース＞イヌロトリオース＞イヌロビオース、フルクトースとする。
   （２）至適ｐＨが６〜８．５である。
   （３）至適温度が４５〜５５℃である。
   （４）５０℃以下で安定である。
   （５）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定された分子量が約１２８０００である。
5. イヌロテトラオースの生成量を、イヌロトリオースの生成量の４倍以上（質量比）とする請求項３又は４に記載のイヌリナーゼ。
6. 請求項３〜５のいずれか一項に記載のイヌリナーゼをイヌリンに作用させるイヌロオリゴ糖の製造方法。
7. 請求項１に記載の微生物を有効成分とするイヌリン分解剤。
8. 請求項３〜５のいずれか一項に記載のイヌリナーゼを有効成分とするイヌリン分解剤。
9. 請求項１に記載の微生物を培養し、得られた培養物から水溶性成分を抽出する工程を有するイヌリナーゼの製造方法。

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