KR101654810B1

KR101654810B1 - 신규미생물 비브리오 스플린디더스 ｂｓｔ３９８ 및 이를 이용한 저분자 히알루론산의 제조방법

Info

Publication number: KR101654810B1
Application number: KR1020110031094A
Authority: KR
Inventors: 박주웅; 신운섭
Original assignee: 바이오스트림테크놀러지스(주)
Priority date: 2011-04-05
Filing date: 2011-04-05
Publication date: 2016-09-07
Also published as: KR20120113400A

Abstract

본 발명은 히알루론산 분해효소를 생산하는 신규 미생물 Vibrio splindidus BST398에 관한 것이다. 본 발명의 미생물은 해양 미생물로서, 이 미생물의 배양액 혹은 발효액은 강력한 히알루론산을 분해하여 저분자 히알루론산의 제조방법에 관한 것이다.

Description

신규미생물 비브리오 스플린디더스 ＢＳＴ３９８ 및 이를 이용한 저분자 히알루론산의 제조방법{Vibrio splindidus BST398 and Methods for Preparing Hyaluronic Acid with Low Molecular Weights}

본 발명은 신규 미생물 비브리오 스플린디더스 (Vibrio splindidus) BST398에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 신규 해양 미생물로부터 생산된 히알루론산 분해효소를 포함하는 미생물 배양액 혹은 발효액을 이용하여 고분자 히알루론산을 분해하여 저분자 히알루론산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 동물 등의 피부에 많이 존재하는 생체 합성 천연물질로서 분자량이 수십만에서 수백만 달톤(Da)으로 반복단위인 글루쿠론산 (glucuronic acid)과 N-아세틸 글루코사민(N-acetyl-glucosamine)이 (1 → 3)과 (1 → 4)로 번갈아 결합 되어 있는 무색의 고점도 다당류이다. 히알루론산은 수산화기(-OH)가 많기 때문에 친수성이 높고, 매우 높은 점성이 있어 세포를 서로 접촉시키며, 관절을 부드럽게 하고, 피부, 장기 또는 세포 사이를 결합하거나 지탱하는 역할을 한다. 따라서 히알루론산은 보습효과를 가지며, 물리적 마찰에 대한 윤활효과가 우수하여 의약품으로는 관절윤활제와 장기유착방지제로 또한 성형외과에서는 필러(filler)로 사용되고 있으며, 화장품으로는 보습제로 많이 사용된다. 그러나 히알루론산은 식품과 화장품 용도로 사용되는 일반적인 수만에서 수백만의 고분자 히알루론산은 체내 흡수 및 피부 내로의 흡수가 용이하지 않아 그 효과를 충분히 나타내지 못하는 단점이 있다. 따라서 산 또는 알카리 처리, 열처리, 효소 처리, 물리적 처리 등의 다양한 방법에 의해 저분자화 하는 기술이 개발되고 있다.

저분자 히알루론산 제조방법으로는 고분자 히알루론산을 수용액 또는 혼합용매 중에서 이온교환수지를 첨가한 후 고온(70 ~100℃)에서 24 ~ 120시간 반응하여 얻는 방법[한국특허등록 제10-0665916호(2007년)],산처리 방법[한국특허공개 제10-2008-0097477호(2008년)], 분해촉매 즉 열분해 촉매와 광분해 촉매를 사용하여 저분자 다당류 및 올리고당을 제조하는 방법[한국특허등록 제10-0369517호(2003년)], 에탄올 상에 히알루론산을 분산하고 황산 또는 염산을 가하여 상온에서 저분자화 하는 방법[한국특허공개 제10-2010-0079362 호(2010년)], 물리적인 처리 방법은 초음파 처리[Kohmeri et al. Depolymerization of hyaluronic acid by sonication, Glycoconjugate J. 10: 435-439(1993)], 마찰응단(shear stress)에 의한 방법[Kim at el., Purification and control of low molecular weight hyaluronic acid, Theories and application of Chem. Eng. 8(2); 4069-4072(2002)]등이 있다. 그리고 효소 처리에 의한 제조 방법으로는 소 고환 유래의 효소인 히알루로니데이즈(hyaluronidase)를 사용하여 4당부터 52당의 올리고당을 얻었다[Akira at el., Large-sacale preparation, purification, and characterization of hyaluronan oiligosaccharides from 4-mers to 52 mers, Glycobioligy 12(7); 421-426(2002)] 또한 Streptomyces hyalurolyticus에서 생산되는 효소는 4당(tetrasaccharides) 혹은 6당(hexasaccharides)의 저분자 히알루론산을 생산하였으며[Shimana at el., Degradation process of hyaluronic acid by Streptomyces hyaluronidase, J. Biochem. 88(4); 1015-1023(1980)], 이 효소를 이용하여 안과치료제를 개발하고 있다[USP6,902,548B1(2005)]. 그 밖에 스타필로코커스(Staphylococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속의 미생물 유래의 것도 알려져 있다[Park at el,. Exploration of the action pattern of Streptomyces hyaluronate lyase using high-resolution capillary electrophoresis, Biochem. Biophys. Acta, 1337; 217-226(1997)].그리고 페니실리움(Penicillium) 속의 미생물이 생산하는 효소에 의한 저분자화 히알루론산의 제조 방법도 있다[일본특허공개2007-254725(2007년)]. 하지만, 상기 방법 즉 물리적, 화학적 처리방법은 효율이 낮고 색상의 변화가 생기며, 또한 효소를 처리하는 방법으로는 고가의 효소와 병원성균에서 생산되는 효소 처리의 문제점 등으로 효과적인 방법의 개발이 필요한 실정이다.

상기 종래의 기술의 문제점은 화학적, 물리적인 방법으로는 일정한 분자량 크기로 생산 효율이 낮고 색상의 변화가 생기며, 동물 유래의 소, 양의 고환으로부터 얻은 히알루로니데이즈(hyaluronidase) 효소의 가격이 매우 고가이며, 이 효소는 의약품으로 사용 중이다. 그리고 스트렙토마이세스 히알루로라이티커스(Streptomyces hyalurolyticus)에서 생산되는 효소도 매우 고가이며 연구용 시약으로만 이용되고 있다. 현재까지 이들 효소들은 연구 및 저분자의 분석법, 의약용 효소의 개발 등에 대한 기술은 있지만 효소 공법에 의한 저분자 히알루론산의 산업화 및 제품화는 없다.

본 발명은 신규 미생물 비브리오 스플린디더스 (Vibrio splindidus) BST398에 관한 것이며, 또한 본 발명은 상기 신규 해양 미생물로부터 생산된 히알루론산 분해효소를 포함하는 미생물 배양액 혹은 발효액을 이용하여 고분자 히알루론산을 분해하여 저분자 히알루론산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 저분자 히알루론산은 기존의 방법에 비해 히알루론산 분해효소를 사용하므로 기존의 강산과 고온 및 장시간 반응되므로 원료 자체의 변색 및 저분자 히알루론산 생산 공정의 어려움을 개선하여 하고자 한다. 따라서 효소 분해 방법은 30℃이하 중성조건에서 30분 내지 2시간 동안 온화한 조건에서 반응하므로 원료의 변색이 없으며 분해 반응 후 한외여과장치 분자량 10KDa으로 여과하여 분해효소와 불순물을 제거하고, 나노여과장치로 탈염 및 농축하므로 고 품질화가 이루어지게 된다.

또한 화학적, 물리적인 방법에 저분자화 공정에서 난점으로 지적되는 고분자 히알루론산 즉 절대평균분자량이 300,000Da 미만이거나 3,000,000Da을 초과하면 제조상의 어려움으로 인해 사용의 문제점이있지만 효소분해 방법으로 저분자화 공정에는 절대분자량의 크기와 무관하게 진행될 수 있다.

본 발명에서는 비브리오 스필린디더스(Vibrio splindidus) BST398를 영양 액체 배지에 1% 내지 3%의 염화나트륨과 분해효소를 유도하기 위해 히알루론산을 01% 내지 0.5%로 첨가한 배지를 사용한다. 본 균주는 25℃에서 2내지 3일간 배양한 후 원심분리(5,000g)하여 균체를 제거하고, 상층액을 회수하여 조효소액으로 사용한다.

본 발명에서 효소반응 조건은 기질인 고분자 히알루론산의 농도는 0.5% 내지 1%를 0.1M 트리스 염산 완충액(pH7.0)에 녹이고, 효소액은 기질액의 1% 내지 5%을 첨가하여 30℃에서 30분 내지 2시간을 반응 한 후 한와여과장치로 효소와 불순물을 제거하고, 나노여과기로 탈염 및 농축한 후 동결 건조하여 저분자 히알루론산 즉 이당류와 올리고당을 얻을 수 있다.

따라서 고분자 히알루론산은 피부 표면에 필름을 형성하여 수분 손실을 막아주는 효과는 있지만 저분자 히알루론산은 카코-2 세포(Caco-2 cell)을 이용한 세포층 투과실험에서 고분자 히알루론산이 거의 투과하지 못하는 세포층을 16.0%까지 투과하였다고 보고하였다[Kim et al., Preparation of oligo hyaluronic acid by hydrolysis and its application as a cosmetic ingredient, 대한화장품학회지, 33(3), 189-196(2007)].

상기 결과물인 본 발명의 저분자 히알루론산은 품질 면에서 우수한 고품질의 원료로 물리적으로 점도가 낮으며 이당류 및 올리고당이므로 흡수도가 향상되어 고농도의 음료 및 화장품의 원료로 활용이 가능하다.

본 발명의 신규 미생물 비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398는 히알루론산 분해효소를 대량으로 생산하는 뛰어난 효과가 있는 균주로서, 본 발명의 비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398가 생산하는 히알루론산 분해효소는 동물유래 혹은 미생물 유래의 것과 동일한 성질을 나타내고 있고, 특히, 병원성 미생물과의 차이가 있고, 분해 활성이 높아 다양한 용도에 사용될 수 있는 장점이 있다. 특히 산 가수분해에 의해 불순물의 생성 등의 문제점과 높은 생산원가, 대량생산의 어려운 점을 극복하므로 의약품, 화장품, 의료용 소재 및 식품 등에 사용 가능한 저분자 히알루론산 및 그 염을 제조할 수 있다.

도 1은 비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398 균주의 그람 염색 현미경(x1k) 사진을 나타낸다.
도 2는 비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398 균주의 전자 현미경(SAM)(x5k) 사진을 나타낸다.
도 3은 비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398가 생산하는 분해효소와 히알루론산과의 반응시킨 후 HPLC 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 효소 반응 후 정제한 히알루론산 이당류의 말디-토프 질량분석기(maldi-tof Mass spectrometer)로 분자량을 나타낸다.

본 발명은 해양 미생물에 최소 영양성분인 히알루론산만을 첨가하여 생육하는 미생물을 선택하였다. 선별된 균주 중에서 히알루론산을 분해하는 우수한 균주를 상법에 따라 동정한 결과 비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) 속의 신균주로 판명되어 비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398라고 명명하고 2011년 3월 21일 생명공학연구원 생물자원센타에 기탁하였다(수탁번호 KCTC-11899BP).

본 발명을 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다.

1. 히알루론산 분해효소를 함유하는 균주의 동정

가장 강한 히알루론산 분해작용을 나타내는 비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398 균주를 동정하기 위하여 버지스 매뉴얼(Bergey's menual)에 따라 아래와 같이 수행하였다.

(실시예 1)

상기 균주의 동정을 위하여 APINE20 및 APICH50 키트(kit)를 이용하여 생화학적 성상 검사와 당 이용성을 조사하였다.(표 1 참조)

비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398 균주의 APINE 20 키트 검사(생화학적 검사)

Tests	Results
NO3-N02	+
No3-N2	+
indole production	+
glucose fermentation	+
arginine dihydrolase	-
urease	-
esculin hydrolysis(beta-glucosidase)	-
gelatin hydrolysis(protease)	+
4-nitrophenyl-D-galactopyranoside(beta-galactosidase)	+
D-glucose assimilation	+
L-arabinose assi	-
D-mannose assi	+
D-mannitol assi	+
N-acetyl-glucosamine assi	+
D-maltose assi	+
potassium gluconate assi	+
capric acid assi	-
adipic acid assi	-
malic acid assi	+
trisodium citrate assi	-
phenylacetic acid assi	-
oxidase cytochrome	+

비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398 균주의 APICH 50 키트 검사(당 이용성 검사)

Glycerol	+
Erythritol	-
D-arabinose	-
L-arabinose	-
D-ribose	+
D-xylose	-
L-xylose	-
D-adonitol	-
Methyl-D-xylopyranoside	-
D-galactose	+
D-glucose	+
D-fructose	+
D-mannose	+
L-sorbose	-
L-rhamnose	-
Dulcitol	-
Inositol	-
D-mannitol	+
D-sorbitol	-
methyl-D-mannopyranoside	-
methyl-D-glucopyranoside	-
N-acetylglucosamine	+
Amygdalin	-
Arbutin-	-
Esculin(ferric citrate)	+
Salicin	+
D-cellobiose	+
D-maltose	+
D-lactose(bovine origin)	+
D-melibiose	+
D-saccharose(sucrose)	-

D-trehalose	+
Inulin	-
D-melezitose	-
D-raffinose	-
Amidon(starch)	+
glycogen	+
Xylitol	-
Gentiobiose	-
D-turanose	-
D-lyxose	-
D-tagatose	-
D-fucose	-
L-fucose	-
D-arabitol	-
L-arabitol	-
potassium glucoNaTe	+
potassium 2-ketogluconate	-
potassium 5-ketogluconate	-

(실시예 2)

그람 염색을 하여 현미경으로 관찰 및 전자현미경(SAM) 관찰 결과 그람음성 간균이었다(도 1, 2 참조).

(실시예 3) 16 rDNA를 서열(sequencing) 검사

보다 정확한 동정을 위하여 16s rDNA를 대장균(E. coli) 16s rDNA 유니버설 프라이머(universal primer)를 이용하여 STB-398의 16s rDNA를 증폭하여 클로닝한 후 16 rDNA를 서열분석(sequencing)을 하였다.

STB-398의 16s rDNA는 1543 bp이었으며 이를 유전자은행(gene bank)에서 유사성(similarity)을 분석한 결과 비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) LGP32(FM954972.2)와 99% 일치하였다.

PCR 프라이머(Primer): 유니버설 프라이머(universal primer)

클로닝 벡터(Cloning vector): pGEM T 이지 벡터(easy vector(promega))

형질변형(Transformation): 대장균(E coli.) JM109

서열분석 결과(sequencing result):

GAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAACGACACTAACAATCCTTCGGGTGCGTTAATGGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCTTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATAATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAAGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTTGTGAGGAAGGGTGTGTAGTTAATAGCGTTATCTCTTGACGTTAGCAACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTCATTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACTGCATTTGAAACTGGTGAACTAGAGTGCTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGACACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAAGCCAGCGGAGACGCAGGTGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTGGGTAGTTTAACCTTTCGGGGAGGACGCTCACCACTTTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAAGTAGCCCTAGGGGAACCTGGGGCTGGATCACCTCCTTTCT

1543 bp

2. 비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398가 생산하는 히알루론산 분해 효소의 특성

(실시예 4) 기질에 의한 유도 효과

비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398 균주를 염화나트륨이 첨가된 영양 배지에서 호기적으로 배양하면서 효소활성을 측정한 결과 효소 활성이 없었다. 그러나 히알루론산을 0.1% 내지 0.5% 첨가한 경우 효소 활성을 나타냈다. 따라서 비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398 균주가 생산하는 히알루론산 분해효소는 유도 효소로 볼 수 있다.

(실시예 5) 히알루론산 분해 효소의 회수

균을 배양하여 5,000g에서 원심분리하여 균체를 제거하고, 상층액을 모아 조효소원으로 사용하였다.

(실시예 6) 비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398가 생산하는 히알루론산 분해효소에 의한 저분자 히알루론산 분석

효소 반응조건은 30℃에서 0.1M 트리스염산 완충액(pH7.0)에 기질을 0.5 내지 1.0%로 녹였고, 효소의 농도는 단백질로서 10ug/ml이였다. 반응시간은 점도계를 이용하여 점도를 측정해가면서 반응이 완전할 때까지 진행하였다. 효소의 반응이 완전히 진행되었을 때 반응물의 분석은 고속액체크로마토그라프(HPLC)를 이용하여 실시하였다. 그리고 정제한 히알루론산의 이당류라고 생각되는 주 생성물을 모아서 염을 제거하고 동결 건조시켜 얻어진 시료를 말디-토프 질량분석기(maldi-tof Mass spectrometer)으로 구조을 분석하였다.(도 4 참조)

고분자 히알루론산을 비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398 유래 효소로 처리한 후 얻어진 저분자 히알루론산을 말디-토프 질량분석기(maldi-tof Mass spectrometer)로 분석한 결과 424의 주 피크를 관찰할 수 있었으며(도 4), 226 이하의 피크는 고분자 히알루론산을 말디-토프 질량분석기(maldi-tof Mass spectrometer)로 분석할 때도 관찰되었음으로 본 히알루론산 분해효소는 고분자 히아루론산을 최종 2당류로 분해함을 확인할 수 있었다. 이때 대조로 소 고환 유래 히알루론산분해효소(sigma)로 히알루론산을 분해하였을 때도 똑같이 424의 주 피크를 관찰 할 수 있었다.

(실험예 1)

HPLC를 이용한 저분자 히알루론산의 분석

HPLC를 이용한 저분자 히알루론산의 분석은 아키라(Akira) 등의 방법에 따라서 수행하였다[Akira at el., Large-sacale preparation, purification, and characterization of hyaluronan oiligosaccharides from 4-mers to 52 mers, Glycobioligy 12(7); 421-426(2002)]. HPLC(Diodex)기기를 사용하여 YMC-NH2 컬럼을 사용하고, 용매로는 0.8M 인산 완충용액을 0.04M로터 0.8M까지 선형농도구배로 용출하였다. 유속은 1ml/min, 컬럼 온도는 30℃, 210nm에서 검출하여 분석하였다.(도 3 참조).

Claims

신규 미생물 비브리오 스플린디더스(Vibrio splindidus) BST398(수탁번호 KCTC 11899BP).
삭제
제1항의 비브리오 스플린디더스 BST398(수탁번호 KCTC 11899BP)의 배양액 또는 발효액.
1) 제3항의 배양액 또는 발효액을 히알루론산에 첨가하여 히알루론산을 분해하는 단계;
2) 분해된 히알루론산을 여과하는 단계; 및
3) 상기 여과물을 탈염 및 농축하는 단계를 포함하는, 분자량 10 kDa 이하의 히알루론산을 제조하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 단계 1)의 분해는 30℃ 이하에서 30분 내지 2시간 동안 이루어지는 것인, 방법.