KR20080059850A - 신규한 슈도알트로모나스 속 미생물 - Google Patents

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박동찬
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Abstract

본 발명은 신규한 슈도알트로모나스 속 Glu-1 (Pseudoalteromons sp. Glu-1) 균주, 이를 이용한 후코이다네이즈의 생산방법 및 이로부터 생산되는 후코이다네이즈에 관한 것이다. 또한 본 발명은 신규한 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주 및 이로부터 생산된 후코이다네이즈를 이용한 올리고후코이단의 생산방법 및 이로부터 생산되는 올리고후코이단에 관한 것이다. 본 발명의 슈도알트로모나스 속 Glu-1 (Pseudoalteromons sp. Glu-1) 균주가 생산하는 후코이다네이즈는 열 및 pH에 대하여 매우 안정적인 단백질로서, 미역포자엽 유래의 후코이단 (fucoidan)에 특이적으로 반응함으로써, 고분자의 후코이단에 비하여 생리적 활성이 월등한 올리고후코이단을 높을 효율로 생산 할 수 있으며, 이러한 올리고후코이단은 약제, 기능성 식품, 또는 음료의 첨가물 등으로서 산업적 활용도가 높다.
후코이다네이즈, 슈도알트로모나스 Glu-1, 후코이단, 올리고후코이단

Description

신규한 슈도알트로모나스 속 미생물, 이를 이용한 올리고후코이단의 생산 방법 및 그 산물{A NOVEL MICOORGANISM OF PSEUDOALTEROMONAS SP. AND METHOD FOR PRODUCING OLIGOFUCOIDAN USING THE SAME AND PRODUTS THEREOF}
도 1은 후코이단 분해효소를 분비하는 신규한 슈도알트로모나스 속 Glu-1의 전자현미경사진이다.
도 2는 후코이단 분해효소를 분비하는 신규 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주의 분류동정을 위한, 16S 라이보좀 DNA 염기서열 (도2a)과 이를 바탕으로 작성한 16S 라이보좀 RNA의 계통분류도(도2b)이다.
도 3은 슈도알트로모나스 Glu-1 균주가 생산 분비하는 후코이다네이즈를 정제한 후, 분자량과 등전점을 확인한 단백질 전기영동사진이다.
도 4는 정제된 후코이다네이즈의 최적반응 pH와 온도를 검토한 그래프이다.
도 5는 미역포자엽 유래 후코이단을 후코이다네이즈로 처리한 후, 이를 가수분해 시켜 얻은 올리고후코이단의 평균 분자량 및 고분자 후코이단을 수용성 겔 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명에 의해 제조된 올리고후코이단과 고분자후코이단의 구조적 유사성을 FT-IR 분석으로 비교한 사진이며, 화살표는 황산기가 결합되어 있는 부위를 표시한다.
본 발명은 후코이다네이즈를 생산하는 신규한 슈도알트로모나스 속 균주 및 이를 이용한 후코이다네이즈의 생산방법 및 그 산물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 신규한 슈도알트로모나스 속 균주 또는 이에 의해 생산된 후코이다네이즈를 이용한 올리고후코이단의 생산방법 및 그 산물에 관한 것이다.
우리나라 연안은 약 620여종의 각종 해조류가 다양하게 서식하고 있으며, 이중 다시마, 미역 등을 포함하는 130여종의 갈조류에는, 식품산업에 널리 사용되고 있는 기능성 다당류가 많이 존재하며, 그 대표적인 것으로 한천(agar), 알긴산(alginic acid), 카라기난(carrageenan), 그리고 최근 생리활성이 검증되고 있는 후코이단(fucoidan) 등이 있다.
이 중, 후코이단은 주성분으로 에스테르화 황산기를 가진 엘-후코오스(L-Fucose) 및 소량의 갈락토오스(Galactose), 자일로오스(Xylose) 및 글루쿠론산(Glucuronic acid) 등을 함유하는 복합 황산화 다당류이다. 이러한 푸코이단은 따라서 황산화푸코스다당으로도 불리며, 중량 평균분자량 40,000-2,000,000 달톤(Dalton, Da)의, 점성이 있는 고분자 형태로서, 항암기능, 항바이러스기능, 항종양기능(암세포사멸(apoptosis)), 면역증강 기능, 혈당상승 억제 및 혈액응고 저지작용, 중성지방 및 콜레스테롤 저하작용, 그리고 항산화 작용 및 위궤양 치유 촉진 작용 등 다양한 생리적 기능을 하는 것으로 알려져 있다 (Scand . J. Urol . Nephrol., 40(1), 2006; Am . J. Hematol ., 78(1), 2005; Journal of the Korean Chemical Society, 46(2); 월간 식품산업 11월호 특집기사, 2005).
이러한 후코이단은 그 다양한 생리적 활성으로 인하여 각광을 받고 있는, 개발 초기 단계의 기능성 식품소재로서, 현재 시중의 후코이단은 갈조류로부터 열수추출한 점성이 높은 고분자 형태가 주를 이루고 있다.
그러나 이러한 고분자 후코이단의 경우, 광범위한 기능성에도 불구하고, 높은 분자량, 점성 및 낮은 수용성으로 인해 인체 흡수율이 매우 낮아 실제 생체내에서의 생리적 활성이 현저히 저하되는 것을 물론, 원료의 다양성과 제조공법의 변이 등에 따른 품질의 비균일성으로 인하여, 제품화의 한계 등의 문제점을 가지고 있다.
반면, 고분자 후코이단의 분해산물인 올리고후코이단, 특히 평균 분자량 4,000 Da의 올리고후코이단은 고분자 후코이단에 비하여 실제 생체내에서의 생리적 활성이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 예를 들면 올리고 후코이단은 혈액 중에 존재하는 황산성 다당인 헤파린(heparin)과 구조 및 작용이 매우 유사하여 항혈액응고 및 혈액정화 활성을 가지며, 세포사멸(apoptosis)을 유도하여 종양세포의 증식을 저해하는 효과가 있어 항암 및 항염치료에도 유용한 것으로 보고되었다 (Biochemical Pharmacololgy (2003) 65: 173-178, Ecotoxicol. Environ. Safety (2000), 45: 208-227). 또한 내피전구세포(epithelial progenitor cell)의 혈관신생을 촉진하는 효과(Biochemical Pharmacology (2005) 70:1167-1175)로 심혈관 질 환 및 관절염 치료 등에 활용될 수 있는 것으로도 알려져 있다. 이와 같은 생리적 활성을 감안하면, 올리고후코이단은 약제학적 조성물과 기능성 식품 또는 음료 등으로의 활용분야에 광범위하게 제공될 수 있을 것으로 예상된다.
따라서, 고분자 후코이단을 저분자화 할 수 있는 기술은, 고분자 후코이단이 갖는 물성적 단점을 개선시켜 그 효과를 극대화시킴으로써, 고분자 후코이단의 용도 확대 및 부가가치를 극대화할 수 있는 산업화를 위한 핵심 기술로서, 시급한 개발이 필요하다.
현재까지 공지된 후코이단을 저분자화하는 방법은 크게 화학적 가수분해법과 효소를 이용한 효소 가수분해법이 있으며, 특히 효소 가수분해법을 사용한 후코이단의 산업화는 아주 초기단계이다.
염산 등을 이용하는 화학적 가수분해법은 후코이단의 글리코사이드 결합을 절단하여 저분자량의 후코이단을 주로 생성하며, 강산을 포함한 유독한 다량의 화학약품의 사용으로 인해, 제거과정이 미비할 경우, 인체에 유해한 문제가 있으며, 화학적으로 후코이단을 분해시키기 때문에 생리활성이 높은 저중합도의 활성형 올리고후코이단을 선택적으로 생산하는 것이 매우 어려워 아직 산업화에 적용되지 못하고 있다.
따라서 고분자 후코이단을 저중합도의 활성형 올리고머로 생산할 수 있는 기질 특이적 효소를 사용하는 효소적 가수분해방법의 사용이 보다 바람직하나, 이 또한, 적절한 효소의 부재로 인하여 그 사용이 매우 제한적이다.
고분자 후코이단의 효소적 가수분해에는 후코시데이즈(fucosidase)와 후코이 다네이즈(fucoidanase)의 2 종류의 효소 사용을 고려할 수 있다.
그러나, 미생물 유래의 이러한 효소 중, 후코시데이즈는 고분자 후코이단의 말단 글리코사이드 결합을 절단하여 후코오스 단당을 생성하는 효소로서, 저중합도의 활성형 올리고후코이단의 선택적 생산이 가능하지 않다.
후코이다네이즈는 고분자 후코이단의 중간부분을 전달할 수 있는 엔도(endo형) 효소로, 분해산물로서 저분자화된 올리고후코이단을 생성할 수 있으며, 현재가지는 Vibrio sp. N-5 (Biosci. Biotechnol. Biochem. (1992) 56; 1829-1834), 전복류인 Haliotis sp (Arch. Biochem. Biophys. (1967) 118; 172-177) 유래의 2 종류가 알려져 있다. 그러나, 상기 균주 및 연체동물 등에서 생산되는 후코이다네이즈의 경우 효소반응을 통해 올리고후코이단을 생성하는 수율이 최대 31%로 매우 낮을 뿐만 아니라 균주자체의 안전성이나 연체동물에서의 대량생산 등의 애로점으로 인해 아직 산업적으로 활용되지 못하고 있는 실정이다.
따라서, 상기와 같은 효소적 방법에 의한 활성형 올리고후코이단을 산업적으로 다량 생산하기 위해서는 인체에서의 사용을 위한 안정성이 확보됨을 물론, 고분자 후코이단을 고효율로 분해할 수 있는 기질 특이적 후코이다네이즈를 분비하는 생산균주의 확보가 선결되어야 한다.
이에, 본 발명은 상기와 같은 올리고후코이단 생산의 문제점을 감안하여, 올리고후코이단의 대량생산을 가능하게 하는, 후코이다네이즈를 생산 분비할 수 있는 미생물 균주, 이를 이용한 후코이다네이즈의 생산방법과 그 산물, 및 상기 균주 및 산물을 이용한 올리고후코이단의 생산방법 및 이로부터 생산되는 올리고후코이단의 제공을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적 달성을 위해, 본 발명은 후코이단에 대하여 특이적 분해활성을 갖는 후코이다네이즈를 생산하며, 도 2a에 기재된 16S rRNA 염기서열을 갖는 슈도알트로모나스 속 Glu-1 (Pseudoalteromonas sp. Glu-1) 균주를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주가 기탁번호 KCTC 10905BP인 균주를 제공한다.
본 발명은 또한, 미역 포자엽 유래의 후코이단에 특이적인 후코이다네이즈를 생산하는 균주를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주의 배양물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주 또는 그 배양물을 사용한, 후코이다네이즈의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법에 따라 제조된 후코이다네이즈를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 후코이다네이즈는 후코이단 분해능을 갖는 (a) 내지 (e)의 특징을 갖는 후코이다네이즈를 제공한다:
(a) 최적온도 30℃ 내지 50℃;
(b) 최적 pH 6.0 내지 8.0
(c) 온도 40℃ 및 pH 7.0에서 72시간 이상 안정;
(d) 등전점 pH 4.7
(e)소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법 (SDS-PAGE) 측정 분자량 70 kDa.
본 발명은 또한 미역 포자엽 유래의 후코이단에 특이적인 후코이다네이즈를 제공한다.
본 발명은 또한, 슈도알트로모나스 속 균주, 그 배양물 또는 이들에 의해 생산된 후코이다네이즈를 이용한 올리고후코이단의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 따라 제조된 올리고후코이단을 제공한다.
본 발명은 또한 중량 평균 분자량이 약 1,700 Da이며, 후코이단이 생리적 활성을 나타내는 데 매우 중요한 지표로 알려진 황산기 함량이(Biochem Pharmacol, 65, 2003), Dogsan법 (Biochem J. (1962) 84: 106 ~ 110)에 따라 측정하였을 경우, 25%~35%인 것을 특징으로 하는 올리고후코이단을 제공한다.
본 발명은 또한 올리고후코이단의 구성원소 함량을 원소분석기(Elemental Analyzer, EA1108, Fisons instrument, Italy)를 이용하여 분석하였을 경우 탄소(C) 25~26%, 수소(H) 4~5%, 산소(O) 48~49%, 질소(N) 0.2~1%, 황(S) 8~9%인 것을 특징으로 하는, 올리고후코이단을 제공한다.
본 발명의 올리고후코이단은 분자량이 각각 8,700~8,900 Da, 1,000~1,200 Da, 및 135~145 Da 후코이단의 혼합물이며, 특히, 상기 각 후코이단의 비는 10~15:55~60:30~35인 올리고후코이단을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 올리고후코이단을 효율적으로 생산할 수 있는, 후코이다네이즈를 다량 분비하는 새로운 해양세균을 찾고자, 해수로부터 시료를 채취하고, 미생물을 분리하여 후코이단 분해능을 가진 미생물을 탐색한 결과, 후코이단에 특이적으로 반응하여, 올리고후코이단 생산 수율이 48%로서 종래 균주가 생산하던 최고수율(31%, 배경기술 참조)보다 현저히 향상된 신규한 후코이단 분해균주를 최종적으로 선별하였다.
선별된 해양세균 Glu-1을 주사전자현미경으로 형태를 관찰한 결과 (도1 ), 막대형으로 측면에 편모를 갖고 있었으며 크기는 길이가 1.4㎛, 너비가 0.8㎛였다. 또한 Glu-13의 분류동정을 목적으로 형태, 생화학 및 생리적 특징을 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 제시된 방법에 따라 조사하였다 (표 1 참조).
본 발명의 균주는 형태적, 생리적, 생화학적 특성과 16S 라이보좀 DNA 유전자의 뉴클레오티드 서열분석에 기초한 분류법을 사용하여 동정한 결과 (도 2 참조), 슈도알트로모나스 속에 속하는 신균주로 확인되었으며, 이를 슈도알트로모나스 속 Glu-1(Pseudoalteromonas sp. Glu-1)로 명명하고, 이를 부다페스트조약에 의거, 2006년 2월 1일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행 (Korean Collection for Type Culture (KCTC), 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 소재)에 기탁번호 KCTC10905BP로 기탁하였다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 후코이단에 대하여 특이적 분해활성을 갖는 후코이다네이즈를 생산하며, 도 2에 기재된 16S rRNA 염기서열을 갖는 슈도알트로모나스 속 Glu-1 (Pseudoalteromonas sp. Glu-1) 균주를 제공한다. 본 발명의 한 구현예에서, 상기 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주가 기탁번호 KCTC 10905BP인 균주이다.
선별된 해양세균 Glu-1의 명확한 분류, 동정을 위한 16S 라이보좀(ribosome) DNA 단편의 염기서열 (도 2a) 및 이를 다른 균주와 비교한 결과(도 2b), Glu-1은 Pseudoalteromonas 속 균주와 근접함을 확인할 수 있었으며, 특히 가장 연관성이 있는 것으로 분석된 슈토알트로모나스 아틀란티카 (Pseudoaltromonas atlantica)와는 97.1%의 상동성을 보임으로서 Pseudoalteromonas sp. 의 신규 균주로 판단하였다.
본 발명의 미생물은 슈도알트로모나스 속 미생물의 통상적인 배양방법에 의해 대량으로 배양될 수 있다 (Appl. Environ. Microbiol. (2000) 66; 4334 ~ 4339) 배양배지로는 인공해수에 탄소원 및 질소원을 첨가한 배지를 사용할 수 있으며, 필요에 따라 해조류가 첨가된 배지를 사용할 수 있다 예컨대 펩톤, 이스트 추출물, 아가 및 미역귀 분말이 함유된 배지에서 통상의 슈도알트로모나스 속 미생물에 적용되는 배양조건에서 배양할 수 있다. 예컨대 20℃ 내지 40℃의 온도에서 24시간 내지 80시간 정도 배양할 수 있으나, 이로 한정하는 것은 아니다. 특히 28℃ 내지 32℃의 온도에서 40 내지 50 시간동안 배양할 수 있다 (Korean J. Biotechnol. Bioeng.(1997) 12; 228-235).
이러한 액체 배지 중의 미생물의 배양물을 배양여액과 균주로 분리하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 배양물, 배양액 및 농축된 균주는 통상적인 방법에 따라 냉동 또는 냉동건조하여 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 신규한 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주 또는 기탁번호 KCTC 10905B로 기탁된 균주의 배양물을 제공한다. 본 명세서에 사용된 용어 "배양물"은 후코이다네이즈 활성을 갖는 한, 고체 또는 액체상 배지 중의 균주를 포함하는 배양물 자체, 배양물의 농축액, 이로부터 분리된 배양여액, 균주 및 균주의 파쇄물을 모두 포함하는 개념이다. 상기 배양여액은 액체상의 배양물으로부터 균주를 제거한 상등액 또는 상층액을 의미하며, 배양여액을 수득하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 원심분리 등의 방법을 사용할 수 있다. 상기 파쇄물이란, 본 발명의 균주를 초음파 등의 공지의 방법으로 파쇄시킨 것을 의미한다.
본 발명의 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주는 후코이단에 특이적으로 반응하여 이를 올리고후코이단으로 분해할 수 있는 후코이다네이즈를 생산한다. 본 발명의 슈도알트로모나스 속 균주를 이용하여 올리고후코이단의 생산에 사용될 수 있는 기질은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 해조류가 바람직하다. 상기 해조류는 다시마 (Laminaria japonica), 미역 포자엽 또는 미역 귀 (Undaria pinnatifida Sporophyll), 파디나 아보레센스 (Padina arborescens), 푸쿠스 에바네센스(Fucus evanescens), 히만툴리아 (Himanthulia), 비푸카리아(Bifucaria) 및 푸쿠스 베시쿨로서스(Fucus vesiculosus) 등을 포함하며, 특히 다시마 및 미역포자엽, 더욱 특히 는 미역 포자엽을 기질로 사용할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 균주는 미역 포자엽 유래의 후코이단에 특이적인 후코이다네이즈를 생산한다.
또한, 본 발명의 후코이다네이즈를 생산하는 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주는 후코이다네즈를 세포외로 분비하는 특성이 있으며, 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주로부터 생성되는 후코이단 생산활성이 있는 분획물은 상기 미생물의 세포외 및 세포내 분획물을 모두 포함하는 것으로서, 슈도알트로모나스 속 Glu-1 배양물은 물론, 그 배양여액, 균주의 파쇄물 및 배양여액으로부터 분리된 후코이다네즈가 올리고후코이단의 생산에 이용될 수 있다.
따라서, 또다른 양태에서 본 발명은 본 발명의 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주 또는 그 배양물을 이용한 후코이다네이즈의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 상술한 바와 같은 균주 성장 조건에서 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주를 배양하는 단계; (ii) 상기 균주로부터 균체를 제거하고 배양물을 수득 하는 단계; (iii) 상기 배양물 또는 분획물로부터 후코이다네이즈를 분리 한 후 필요에 따라 정제하는 단계를 포함한다. 균주의 배양 조건은 상술한 바와 같으며, 상술한 기재 및 당업계의 지식을 고려하여 당업자의 입장에서 용이하게 결정될 수 있으며, 단계 (ii)의 균체를 제거하고 분획물을 수득하는 단계와 단계 (iii)의 분획물로부터 목적 단백질을 분리 또는 정제하는 단계는 당업계의 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면 실시예 2에 기재된 방법 또는 참고문헌 (예를 들면, Korean J. Biotechnol. Bioeng.(1997) 12; 228-235)에 기재된 방법을 사용하여 실시될 수 있으나, 이로 한정하는 것은 아니다. 후코이다네이즈는 통상의 방법에 의해 정제 될 수 있으며, 예를 들면, 한외여과법 (ultra-filtraion) 및 Sepadex@-75 과 같은 이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용하여 분리, 정제될 수 있다 (Daniel et al., Protein Methods, Wiley-Liss Inc., NY, 1991).
따라서, 다른 양태에서 본 발명은 상기 방법에 따라 분리된 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주, 특히 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주(기탁번호 KCTC 10905BP) 유래의 후코이다네이즈를 제공한다. 본 발명의 한 구현예에서, 상기 후코이다네이즈는 후코이단 분해능을 가지며, 하기 (a) 내지 (e)의 특징을 갖는 것을 특징으로 한다:
(a) 최적온도 30℃ 내지 50℃;
(b) 최적 pH 6.0 내지 8.0
(c) 온도 40℃ 및 pH 7.0에서 72시간 이상 안정;
(d) 등전점 pH 4.7
(e)소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법 (SDS-PAGE) 측정 분자량 70 kDa.
본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 분리 정제된 후코이다네이즈는 후코이단, 특히 미역포자엽 유래의 후코이단에 대한 특이적 분해능을 가지며, pH 7.0과 40℃ 에서 가장 높은 활성을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 신규한 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주, 특히 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주(기탁번호 KCTC 10905BP)의 배양물 또는 이로부터 분리된 후코이다네이즈 중 하나 이상을 사용한, 고분자 후코이단으로부터 올리고후 코이단를 제조하는 방법 및 이로부터 제조된 올리고후코이단을 제공한다.
보다 상세하게는 상기 방법은 (a) 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주유래의 후코이다네이즈와 고분자 후코이단을 반응시켜 올리고후코이단을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 올리고후코이단액을 정제하여 올리고후코이단을 수득하는 단계를 포함한다
본 발명의 한 구현예에서, 단계 (a)의 후코이다네이즈는 본 발명의 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주, 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주(기탁번호 KCTC 10905BP)의 배양물 또는 이로부터 분리된 것을 사용할 수 있다. 사용되는 후코이다네이즈의 활성을 갖는 배양물 등의 양은 사용하는 기질의 농도, 종류, 반응시간 및 반응온도 등을 포함하는 반응 조건 등에 따라서, 100 unit/ml 내지 1000 unit/ml의 범위내에서 적절하게 선택하여 사용할 수 있으며, 이는 당업자에게 명확한 것이다. 단계 (a)의 고분자 후코이단이란, 배경기술에 설명된 바와 같이, 미역 등을 포함하는 해조류로부터 추출된 상태의 후코이단을 의미한다. 본 발명의 한 구현예에서, 상기 고분자 후코이단은 중량 평균 분자량이 50,000 Da이상의 점성이 있는 고분자 형태의 후코이단을 의미하는 것이다. 본 발명의 다른 구현예에서, 고분자 후코이단은 갈조류 또는 홍조류, 특히, 다시마 및 미역포자엽, 및 더욱 특히는 미역포자엽 유래일 수 있다. 이러한 해조류로부터 고분자 후코이단을 추출하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 다당 해제, 예컨대 마이크로박테리움 속 (Microbacterium sp)을 균주 사용하여 분해한 후, 염 및 알긴산을 제거하거나, 이들 모두를 통합하여 수행할 수도 있다. 갈조류 및 해조류는 고염분 및 고점성의 특성을 갖고 있어, 실제 생산과정에 사용 시, 목적산물의 추출효율을 떨어뜨리는 경우가 있으므로, 탈염 공정을 수행하는 것이 바람직하며, 이는 통상의 공지된 방법, 예를 들면, 90℃ 내지 100℃의 열수로 수세하여 제거할 수 있으며 알긴산의 제거는 알긴산의 등전침전방법, 또는 알긴산과 침전을 형성할 수 있는 염을 첨가하여 제거하는 방법과 같은 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 에틸알콜 및 염화칼슘을 해조류 분해물에 첨가하여 알긴산을 침전시키고 여과하여 알긴산을 제거 한 후, 여액을 회수하여 수차례 한외여과하여 탈염 및 농축한다. 이 경우, 단계 (a)에서 후코이다네이즈에 의한 고분자후코이단의 효율적인 분해작용을 위해 상기 알긴산 및 염이 제거된 분해물에 정제수를 가하여 해조류 분해물 내 고형물의 함량을 적절히(약 5 Brix (60cP 정도의 점도) 내지 10 Brix(80cP 정도의 점도)조정할 수 있다
본 발명의 한 구현예에서, 단계 (a)의 반응은 200 units/ml의 후코이다네이즈를 2% (w/v)의 미역포자엽 유래 고분자 후코이단과 100mM Tris-HCl (pH 7.0) 완충용액에서 40℃에서 24시간 동안 진행할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 단계 (b)에서, 단계 (a)에서 생성된 올리고후코이단은 하기와 같은 방법으로 회수될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 예를 들면, 단계 (a)의 반응물을 분자량 10,000 Da을 갖는 한외여과막에 통과시켜 10,000Da 이하의 여액을 -70℃에서 24 시간동안 얼려서 동결 건조하여 분말형태로 회수할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용한 경우, 48%의 높은 수율로 올리고후코이단을 생산하였으며, 이는 종전의 방법을 사용하여 수득한 31%의 수율과 비교하여(Vibrio sp. N-5 (Biosci. Biotechnol. Biochem. (1992) 56; 1829-1834, Haliotis sp (Arch. Biochem. Biophys. (1967) 118; 172-177) 현저히 향상된 것이다. 나아가, 당업자라면, 생성된 올리고후코이단의 양 및 크기는 분해시간, 효소의 양, 온도 등의 조건에 따라 가변적일 수 있다는 것을 인식할 수 있으며, 생성된 올리고후코이단의 양 및 크기는 당업계의 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다 (Kor. J. Microbiol. Biotechnol. (2004) 32; 362-365).
따라서, 본 발명은 또한 상기 올리고후코이단의 제조방법에 의해 제조된 올리고 후코이단을 제공한다. 본 발명의 한 구현예에서, 상기 방법을 수행하여 회수된 후코이단은 8,700~8,900 Da, 1,000~1,200 Da 및 135~145 Da 분자량을 갖는 후코이단의 혼합물이다. 다른 구현예에서, 상기 각 분획의 비는 10~15:55~60:30~35이며, 특히 11.6%, 56.5%, 31.9% 이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 올리고후코이단은 8,829Da, 1,104Da, 139Da의 분자량의 3가지 피크가 혼합된, 전체 평균 분자량 약 1,700Da의 저분자화 올리고후코이단이다 (도 5 참조). 이러한 후코이단은 종래 열수 추출법, 화학적 가수분해법을 사용하여 생산된 것과 비교하여, 그 중합도가 현저히 낮은 초저분자 후코이단으로서, 이는 본 발명의 방법이 저중합도의 올리고후코이단을 선택적으로 생산할 수 있음을 증명하는 것이다.
나아가, 구조적 특성을 퓨리에변환 적외선분광계 (FT-IR)을 통해 분석한 결과, 본 발명의 올리고후코이단은 후코이단의 주요 기능기 부분인 황산기 결합부위가 보존되어 있음을 확인하여, 고분자와의 구조적 유사성을 확인하였다 (도 6). 또한 본 발명의 올리고후코이단은, 원소분석을 통하여, 특히 생리활성에 중요한 역 할을 한다고 알려진(Biochem Pharmacol, 65, 2003) 황산이온함량이 고분자 후코이단에 비하여, 1.6배로 증가됨을 확인하였으며, 이는 본 발명의 올리고후코이단의 생체내에서의 활성의 우수성을 증명하는 것이다. 본 발명의 한 구현예에서, 본 발명의 올리고후코이단은, 전체 구성당체 중 황산기가 포함된 당체의 량을 측정하는 Dogsan법(Biochem J. (1962) 84: 106 ~ 110)에 따라 황산기 함량을 측정하였을 경우 20 내지 35%의 황산기 함량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 원소분석기를 통해 구성원소의 절대적 함량을 측정하였을 경우, 본 발명의 올리고후코이단의 경우 절대적 원소함량은 탄소(C) 25~26%, 수소(H) 4~5%, 산소(O) 48~49%, 질소(N) 0.2~1%, 황(S) 8~9%이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아님은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> 후코이다네이즈를 생산하는 해양세균의 선별, 분류, 동정 및 특성의 규명.
한반도의 동해, 남해안의 연안해역의 해수와 홍조류, 갈조류, 하천수, 그리고 해변의 모래에서 채취한 297개의 시료를 다음의 조성을 갖는 멸균된 해수에 희석하여 고분자 후코이단 (대한민국 전라남도 완도소재의 해원바이오텍에서 구입)을 0.2 % w/w 첨가된 고체 배지(증류수 1L에 NH4Cl 1.0g, Na2HPO4 4.8g, KH2PO4 4.4g, NaCl 20g, MgSO4?7H2O 5.5g, CaCl2 0.1g, FeSO4?7H2O 0.002g, agar 16g) 에 도말하여 30℃에서 2일 동안 배양한 후, 배지 상에 생육이 좋은 집락에서 균을 1차적으로 순수 분리하였다. 1차 분리된 단일 집락은 해양 세균의 효소생산용 기본배지로 알려진 Modified Marine Medium (MMM)(J. Biotechnol . Bioeng.(1999) 14: 96-102) 액체 배지에 접종하여 2일간 배양한 후, 배양액을 원심분리하고, 상층액을 탁도저해법(Applied and Environmental Microbiology (1990), Sept.; 2939~2940)을 사용하여, 고분자 후코이단에 처리하여 분해능이 높은 것에 따라 고분자 후코이단의 탁도가 가장 낮아진 후코이단 분해 균주 Glu-1을 최종적으로 선별하였다.
선별된 해양세균 Glu-1을 공지의 방법대로 주사 전자현미경으로 세균의 형태적 특성을 관찰하였으며, 결과는 도 1에 있다. 본 균주는 막대형으로 측면에 편모를 갖고 있었으며 크기는 길이가 1.4㎛, 너비가 0.8㎛였다. 또한 Glu-13의 분류동정을 목적으로 형태, 생화학 및 생리적 특징을 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 제시된 방법에 따라 조사하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. 해양세균 Glu-1은 그람 음성, 통성 혐기성 세균으로 균체 생육을 위하여 해수와 염화나트륨을 요구하는 해양 호염성 세균이었다. 그리고 인돌(indole), 메틸레드(methyl red) 시험에 양성반응을 보였으며 Voges-Prokauer 시험에서 음성 반응을 보였다. 따라서 상기 균주 Glu-1은 슈도모나다시에(Pseudomonadaceae)과에 속하는 것으로 판단된다.
후코이단 분해능을 가진 신규 미생물 Glu-1의 형태, 생화학 생리적 특징
항 목 결 과 항 목 결 과
Gram staining ― Oxidase ＋
Form rod Urease ＋
Size 0.8㎛×1.4㎛ Oxidation/Fermentation test O
Motility motile Voges-Prokauer test ―
Nutrient broth ＋ Acid production by glucose ＋
Glucose nutrient broth ＋ Indole formation ＋
Anaerobic growth ＋ PHB accumulation ―
Catalase ＋ KCN test ＋
Repuired artificial sea water for growth ＋
Hydrolysis of casein, gelatin, agar, agarose, carragenan ―
Utilization of citrate, cellobiose, galactose, glucose, lactose, maltose, raffinose, ribose, and sucrose. ＋
이어서, 상기 선별된 해양세균 Glu-1의 명확한 분류, 동정을 위하여 16S 라이보좀(ribosome) DNA 단편을 공지의 방법대로 중합효소 증폭법 (Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 Glu-1의 염색체 DNA로부터 증폭한 후, 증폭된 16S 라이보좀 DNA 단편의 염기서열을 결정하였다. 16S 라이보좀 DNA 단편의 증폭에 사용한 프라이머는 5'-Primer TAACAC ATGCAAGTC와 3'-Primer GACGGGCGGTGTGTAC을 사용하였으며, 증폭된 DNA 단편을 pGEM-T Easy 벡터(Promega, U.S.A)에 삽입한 후, Sambrook 등에 기재된 방법을 이용하여 E. coli DH5α로 형질전환 시킨 후 분석에 사용하였다.
균주로부터 염색체의 분리, PCR, 및 염기서열의 결정에 사용된 시약은 Sigma사로부터 구입하였으며, 유전자 조작법은 사용자의 지시 및 분자 클로닝실험조작법에 관한 서적(예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harabor Laboratory Press, NY, 2001)을 참고하여 실시하였다.
상기와 같이 결정된 염기서열을 이용하여 16S 라이보좀 DNA의 계통 분류 분석을 실시하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2(b)에서 보는 바와 같이 가장 연관성이 있는 것으로 분석된 슈도알트로모나스 아틀리카와는 상동성이 97.1%로 신규 해양세균 Glu-1은 슈도알트로모나스 속에 속하는 새로운 종의 미생물로 동정되었으며 이를 슈도알트로모나스 sp. Glu-1으로 최종 명명하였다. 상기 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10905BP로 2006년 2월 1일자로 기탁하였다.
< 실시예 2> 신규 해양세균 슈도알트로모나스 sp . Glu - 1으로부터 후코이다네이즈 생산 및 분리 정제
신규 해양세균 슈도알트로모나스 sp. Glu-1을 건조균체량 기준 0.5g을 100 ml의 해수에 폴리펩톤 1 g, 효모 추출물, 0.1 g, 미역포자엽 유래 후코이단 (해원바이오텍) 0.3g을 첨가한 액체배지에서 접종한 후, 30℃에서 36시간 동안 현탁 배양하였다. 이어, 미생물 균체를 원심분리로 제거한 후, 상등액을 후코이다네이즈 조효소액으로 사용하였다.
후코이다네이즈 조효소액에서 분자량 30,000 Da이하의 단백질은 공지의 방법을 사용하여, 한외여과방법을 사용하여 분리하였고 나머지 단백질은 Sepadex@- 75 칼럼(Sigma Chemical Co. USA) 제조자의 권고 방법대로 이용하여 겔 여과 크로마토그래피로 분리, 정제하였다. 특히 슈도알트로모나스 sp. Glu-1의 경우 세포밖으로 분비하는 기타 다른 단백질이 기존에 알려진 균들에 비해 적었기 때문에 분리 정제 과정이 용이한 장점을 가진다.
정제된 후코이다네이즈의 분획을 100 mM 트리스-염산 (pH 7.0) 완충액에서 투석한 후 하기와 같이, 효소활성측정, 단백질 정량, 그리고 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동을 실시하여 회수율과 정제도를 확인한 결과, 정제도는 15.6배였으며 회수율은 45.5%였다.
< 실시예 3> 정제된 후코이다네이즈의 효소적 특성
(1) 분자량과 등전점
정제된 후코이다네이즈의 분자량과 등전점을 2차원 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법으로 측정하였다(Sambrook ibid). 정제된 후코이다네이즈를 pH 3~10 범위를 가지는 IPG Ready strip (Biorad, Califonia, USA)을 이용하여 등전점을 결정하였고, 다시 10% 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 분자량을 측정하였다. 그 결과 도 3과 같이 효소의 분자량은 약 70,000 Da이며 등전점은 약 pH 4.7로 나타났다.
(2) 최적 반응 pH 및 온도
최적 반응 pH를 관찰하기 위해, 적정 pH의 완충용액에 동일한 농도의 후코이단((주)해원바이오텍 구입)과 200units/ml의 정제된 후코이다네이즈를 1:1(v/v)로 혼합시켜 40℃에서 30분간 반응시켜 후코이다네이즈의 활성을 측정하였다. 결과는 도 4와 같다. 슈도알트로모나스 Glu-1이 분비하는 후코이다네이즈는 pH 6.0 내지 8.0의 범위에서 높은 상대적 활성을 유지하였으며, 7.0에서 가장 높은 반응성을 나타내었다 (도 4의 오른쪽 그래프).
100 mM 트리스-염산 (pH 7.0) 완충액에 200units/ml의 활성을 갖는 후코이다네이즈와 후코이단을 1:1(v/v)로 혼합시켜 30℃에서 60℃까지 5℃ 간격을 두고 30분간 반응하여 후코이다네이즈의 최적 반응 온도를 알아보았다. 결과는 도 4와 같다. 슈도알트로모나스 Glu-1의 후코이다네이즈는 30℃ 내지 50℃의 온도범위에서 높은 상대적 활성을 유지하였으며, 40℃에서 가장 높은 활성을 나타내었으며, 효소활성이 45℃까지 안정한 상태를 유지하였다 (도4의 왼쪽 그래프).
(3) 후코이다네이즈의 기질 특이성
후코이다네이즈의 기질 특이성을 조사하기 위해 다양한 종류의 다당류 아가, 알긴산, 카파-카라지난, 키틴, 펙틴, 자일란 (Sigma. co. USA)를 물에 녹여 2%(w/v)로 제조한 후, 200units/ml의 후코이다네이즈를 40℃에서 1시간 반응시킨 후, 후코이다네이즈 활성을 공지의 방법대로 측정하였으며(Biosci. Biotech. Biochem. (1992) 56: 1829-1834), 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다. 표 2에서 보는 바와 같이 슈도알트로모나스 Glu-1의 후코이다네이즈는 후코이다네이즈에 대하여 특이적 활성을 가지며, 해조류에 함유된 대표적 다당체인 알긴산(alginate), 한천(agar), 카라지난 (κ-carrageenan), 자이란(xylan)에 대해서 거의 활성을 보이지 않았다.
반면, 다시마류 (Laminaria japonica), 해초류(Fucus vesiculosus), 그리고 미역포자엽(Undaria pinnatifida) 유래의 후코이단을 기질로 앞선 실험과 동일한 조건으로 기질에 대한 특이성을 검토한 결과, 슈도알트로모나스 Glu-1의 후코이다네이즈는 미역포자엽 유래의 후코이단에 대하여 가장 높게 반응하는 특성이 확인되었다.
슈도알트로모나스 Glu-1이 분비하는 후코이다네이즈의 기질 특이성
기 질 후코이다네이즈의 상대 활성(%)
후코이단 (해원바이오텍(주)) 100.0
아가 0.0
알긴산 0.0
카파-카라지난 0.0
키틴 9.2
펙틴 4.7
자일란 0.0
다시마 유래 후코이단 32.5
해초류 유래 후코이단 60.8
미역포자엽 유래 후코이단 100.0
< 실시예 4> 본 발명의 후코이다네이즈를 이용한 생리 활성형 올리고후코이단의 제조
본 발명의 슈도알트로모나스 Glu-1이 생산하는 후코이다네이즈 200 units/ml과 증류수에 2% (w/v)농도의 후코이단((주)해원바이오텍)을 기질로 이용하여 100mM 트리스-염산 (pH 7.0) 완충용액에서 40℃에서 24 시간 반응시켰다. 반응 후 기질과 효소 반응액을 한외여과막(분자량 10,000Da, Millipore co. USA))을 이용하여, 막을 통과한 여액들은 -70℃에서 24시간 얼려서 동결 건조하여 분말을 48% 수율로 회수하였으며, 종전의 수율과 비교하여 현저하게 높은 것이다.
< 실시예 5> 생리활성형 올리고후코이단의 분자량 및 성분분석
실시예 4에서 수득한 올리고후코이단의 분자량의 측정을 위해, 컬럼(PL aquagel, OH30*2, Waters Co. Ltd.), RI 검출기 (waters 410 Differential Refractometer, Waters Co. Ltd.), 펌프(waters 515 HPLC pump, Waters Co. Ltd.), 및 오토샘플러(waters 717 plus Autosampler, Waters Co. Ltd.)를 갖춘 겔 투과 크로마토그래피(Waters Co. Ltd.)를 사용하여, pH 7 완충액, 35℃에서, 분당 1 ml의 유속으로, 폴리에틸렌글리콜(Poly ethylene glycol; PEG)을 표준시료로 하여 분자량을 분석하였다.
그 결과 도 5에서 보는 바와 같이, 미역포자엽 유래 고분자 후코이단의 경우 평균분자량이 약 62,000Da으로 측정되었고, 올리고후코이단의 경우 8,829Da, 1,104Da, 139Da의 분자량을 나타내는 3가지 피크가 각각 11.6%, 56.5%, 31.9% 혼합되어 있었으며, 전체 평균 분자량은 약 1,700Da으로 확인되었다. 평균분자량 약 3,090 Da의 경우, 당이 8-14개 정도 결합(Carbohydrate Research(2001), 330: 529-535)되어 있으므로, 이를 근거로 본 발명의 올리고후코이단의 경우 당이 약 4~8개가 결합된 올리고머 형태임을 알 수 있다.
다음으로, 후쿠이단의 생리적 활성에 중요한 것으로 알려진, 구조적 특성을 퓨리에변환 적외선분광계(Fourier Transform Infrared Spectrometer. FT-IR)(독일, Bruker사 제품)를 제조자의 지시대로 사용하여 조사하였다. 결과는 도 6에 있으며, 후코이다나제와 반응 전후의 후코이단의 구조적 유사성을 조사하였다. 본 발명에 의해 제조된 올리고후코이단의 경우 고분자 후코이단과 FT-IR 분석에서 거의 유사한 결과로부터 저분자화에 따른 후코이단에 구조적 변형이 없음을 알 수 있으며, 특히 생리 활성에 있어서 중요한 역할을 하는 S=O 결합 부위 2곳이 보존되어 있음을 확인 할 수 있었으며 (도 6의 화살표로 표시된 부분), 이는 본 발명의 올리고후코이단의 후코이단 원래의 생리적 활성을 유지하고 있음을 증명하는 것이다.
또한 올리고후코이단의 주성분을 이루고 있는 원소 조성을 원소분석기 (Thermoquest Italia S.P.A, Italia)를 제조자의 지시대로 사용하여 비교하였다. 결과는 표 3에 기재하였다. 표 3에서 보듯이 올리고후코이단은 고분자 형태의 후코이단과 주된 원소의 함량이 거의 유사하게 나타났으며, 특히, 후코이단의 생리적 활성에 중요한 것으로 알려진 황산이온 함량이 약 1.6 배 증가된 것을 확인 할 수 있었으며, 이는 올리고후코이단의 생리적 활성이 고분자 후코이단에 필적하거나, 이보다 월등함을 증명하는 것이다.
올리고후코이단의 원소 함량 분석
원 소 함 량(%) 고분자후코이단 올리고후코이단
탄 소 26.7 25.2
수 소 4.9 4.4
산 소 48.3 48.4
질 소 0.8 0.6
황 5.6 8.7
본 발명의 해양세균 슈도알트로모나스 속 Glu-1는 지금까지 보고 된 바 없는 후코이단 분해효소를 분비하는 신규한 미생물로서, 본 균주가 분비하는 후코이다네이즈는 미역 포자엽 유래 후코이단에 특이적으로 반응하여 중량 평균분자량 약 1,700Da의 올리고후코이단을 생산한다. 따라서 본 발명의 후코이다네이즈는 생리적 활성이 높은 올리고후코이단의 생산에 적합하며, 생산된 올리고후코이단은 약제, 기능성 식품, 또는 음료 첨가물로 널리 활용 될 수 있다.

Claims (14)

  1. 후코이단에 대한 특이적 분해활성을 갖는 후코이다네이즈를 생산하며, 도 2a에 기재된 16S rRNA 염기서열을 갖는 슈도알트로모나스 속 Glu-1 (Pseudoalteromonas sp. Glu-1) 균주.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 슈도알트로모나스 속 Glu-1 균주는 기탁번호 KCTC 10905BP의 균주인 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 후코이단은 미역포자엽 유래인 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제 1 항에 따른 균주의 배양물.
  5. 제 1 항의 균주 또는 제 4 항에 따른 배양물을 사용한 후코이다네이즈의 제조 방법.
  6. 제 5 항에 따라 제조된, 후코이다네이즈.
  7. 제 6 항에 있어서, 후코이단 분해능을 갖는, 하기 (a) 내지 (e)의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는, 후코이다네이즈:
    (a) 최적온도 30℃ 내지 50℃;
    (b) 최적 pH 6.0 내지 8.0
    (c) 온도 40℃ 및 pH 7.0에서 72시간 이상 안정;
    (d) 등전점 pH 4.7
    (e) 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법 (SDS-PAGE) 측정 분자량 70 kDa.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 후코이다네이즈는 미역 포자엽 유래의 후코이단에 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 후코이다네이즈.
  9. 제 1 항에 따른 균주, 제 4 항에 따른 배양물 또는 제 6 항에 따른 후코이다네이즈 중 하나 이상을 이용한 올리고후코이단의 제조방법.
  10. 제 9 항에 따라 제조된 올리고후코이단.
  11. 제 10 항에 있어서, 중량 평균 분자량이 약 1,700 Da이며, 황산기 함량이 20%~35%인 것을 특징으로 하는 올리고후코이단.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 올리고후코이단의 구성원소 함량이 탄소(C) 25~26%, 수소(H) 4~5%, 산소(O) 48~49%, 질소(N) 0.2~1%, 황(S) 8~9%인 것을 특징으로 하는, 올리고후코이단.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 올리고후코이단은, 분자량이 각각 8,700~8,900 Da, 1,000~1,200 Da 및 135~145 Da 인 후코이단의 혼합물인 것을 특징으로 하는 올리고후코이단.
  14. 제 13 항에 있어서, 8,700~8,900 Da, 1,000~1,200 Da 및 135~145 Da 후코이단의 비는 각각 10~15 : 55~60 : 30~35인 것을 특징으로 하는 올리고후코이단.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101531974A (zh) * 2009-03-21 2009-09-16 国家海洋局第一海洋研究所 一株高效降解原油的北极细菌菌株及其应用
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