CN113151120B

CN113151120B - 硫氧化细菌及其应用

Info

Publication number: CN113151120B
Application number: CN202110636361.5A
Authority: CN
Inventors: 冯大伟; 宋宛霖; 李丁军; 姚振领; 张建柏
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2021-06-08
Filing date: 2021-06-08
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2041-06-08
Also published as: CN113151120A

Abstract

本发明涉及环境处理领域，具体涉及一种硫氧化细菌及其应用。硫氧化细菌为假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）LZB5‑2，已于2021年1月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为：CGMCC NO.21762，分类命名：假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.。本发明利用微生物把无法直接利用的污泥及污水废弃物等进行综合利用，还可应用在水产品养殖中。

Description

硫氧化细菌及其应用

技术领域

本发明涉及环境处理领域，具体涉及一种硫氧化细菌及其应用。

背景技术

随着我国对环境保护的日渐重视和对污水处理的巨大投入，城镇污水得到了有效的收集和处理，在此过程中产生了大量的市政污泥。污泥含有病原体、寄生虫、重金属和难降解有机物、致癌有机物等多种有毒物质，可造成严重的环境污染。同时城镇污泥中富含有N，P，K，Ca等元素，无害化处理后的污泥能够改善土壤理化性质，提升农作物产量，具有一定的农业应用价值。污泥处理处置包括污泥处理和污泥处置，目的是对污泥进行无害化处理，避免对环境造成危害。污泥处理的过程是污泥减量化、无害化和稳定化的过程，而污泥处置是将污泥置于自然环境或者再利用的过程。

就污泥处置而言，污泥处置方式的选择应因地制宜，在土地利用方面，污泥土地利用投资少、能耗低，但是污泥中的重金属等有毒有害物质是限制性因素；在卫生填埋方面，污泥可能造成地下水污染；在建材利用方面，存在臭气影响居住环境的问题。

据研究，污泥处理系统中臭气浓度是污水处理系统中臭气浓度的2~3倍。臭气产生原因是硫酸盐被还原为 H₂S，有机物被分解为如醇、醛等中间产物，另外污水流经格栅时，大颗粒漂浮物中含有大量有机物，被格栅拦截造成污染物堆积，发酵产生多种恶臭气体。因此，污泥存在臭气，在利用处理过程中，亟需解决此问题。

目前除臭方法有物理法，化学法，生物法。

活性炭吸附法是目前应用最为广泛的物理脱臭方法，能够有效地去除吲哚、硫化物等多种物质。然而活性炭材料成本较高，吸附容量有限，饱和点难掌握，且恶臭气体的成分、温度、湿度和含尘量等因素对活性炭的吸附能力影响很大。

化学吸收法，又称化学洗涤法，湿式吸收氧化法等，是结合酸碱中和反应以及氧化反应的原理，利用吸收塔作为反应装置除臭的方法，是化学脱臭法中最为普遍的应用方法。化学吸收法的优势在于具有很强的操作弹性，能通过控制药液投加量与投加速率达到最佳除臭反应条件。其局限性在于：化学吸收法需要加入一系列化学试剂，对污水处理构筑物中如除臭装置、各个管道产生腐蚀现象；强酸或强碱使用时需要考虑操作安全性因素，吸收后产生的废液容易产生二次污染。

生物法是当下实际工程最成熟普遍使用的方法，除臭主体核心部件是微生物填料层，其不仅为微生物提供生长附着点，同时为微生物提供充足的营养物质保证其活性，包括碳源，微量元素，另外填料层需保持微生物生长环境的相对稳定性，包括湿度、含氧量、pH值。常用填料包括干草、干枯树皮、果壳、碎石、泥炭等具有生物活性的填料，从而达到除臭目的。具有能耗小、投资灵活、几乎无二次污染等优点，在未来污水除臭领域具有良好的应用前景。

硫氧化细菌在生长过程中能够利用可溶或溶解的硫化物，从中获得能量，并且将硫化物氧化为硫，再将硫氧化为硫酸盐。硫氧化菌在硫循环中扮演着重要角色，是自然界中硫的主导者。硫氧化细菌在工业废水的治理中起着重要作用。因此可利用硫氧化细菌的氧化作用将环境中的还原性硫化物转化为硫酸盐，从而达到改善环境的目的，但硫化物氧化的终产物为硫酸，具有一定的环境污染，若环境中存在有机物，容易被重新还原为硫化物，并不稳定，进而需要获得更稳定、效果更突出的硫氧化细菌。

发明内容

本发明目的在于提供一种硫氧化细菌及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一株硫氧化细菌，硫氧化细菌为假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）LZB5-2，已于2021年1月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为：CGMCC NO.21762，分类命名：假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.。

所述菌株LZB5-2培养于硫代硫酸根为底物的无机盐基础培养液中，在30 ℃下培养保存。

一种硫氧化细菌的应用，所述菌株在去除环境中臭气中的应用。

一种除臭制剂，除臭制剂为含所述菌株LZB5-2。

所述除臭制剂含有该菌株的培养物、培养菌悬液或发酵液。

所述除臭制剂中菌株LZB5-2培养OD_600nm至0.22。

一种无臭气有机肥，有机肥中含所述菌株LZB5-2。

所述有机肥为将所述菌株LZB5-2添加至有机质中发酵获得。

所述有机肥按重量份数计，污泥50~70，稻壳粉15~30，菌菇渣10~30，小木块5-10，所述菌株0.2-0.5。

所述污泥为污水厂收集污泥。

一种无臭气有机肥的应用，所述无臭气有机肥在促进作物种子萌发中的应用。

本发明所具有的优点：

本发明菌株分离自自然海域，所获得的菌株能够很好适应海域沉积物环境，高效发挥脱硫功能，并且不会对环境二次污染，进而能够去除环境中臭气，同时，该菌株还可把无法直接利用的污泥及污水废弃物等进行综合利用。本发明的菌株不仅能解决污泥或者污水等废弃物的环境问题，更能促进二次利用，从根本上解决污染。所述菌株亦可应用在水产品养殖中。健康的水质是海水养殖的基础，当注入的污染物超出水体自净容量时，则会造成水环境的持久性污染。在海水养殖区，硫化物已经成为仅次于氨氮的强烈生物毒性污染物。水体中含硫有机质经微生物分解还原成H₂S无机硫化物及可溶性硫化物，有机质的含量越高，生成的硫化物含量也越高。水体中硫化物可与水产动物血液中的血红蛋白结合产生硫血红蛋白，降低机体中血液的携氧能力，对水产动物危害很大。

附图说明

图1为本发明实施例获得菌株发育树分析图。

图2为本发明实施例获得菌株与空白培养基硫代硫酸钠浓度曲线图。

图3为本发明实施例堆肥温度变化图。

图4为本发明实施例气味变化图。

图5为本发明实施例小麦发芽率图。

图6为本发明实验过程中舟山市气温变化图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

实施例1

假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）LZB5-2的分离及鉴定

1、菌株的分离

从莱州湾采集海水沉积物里分离得到，而后经2216E培养基经划线分离得到菌株LZB5-2。

2、菌株的鉴定

2.1、形态学鉴定

将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述分离并纯化得到的菌株LZB5-2进行鉴定，其为白色半透明状态，边缘光滑，该菌株为革兰氏阴性菌。

2.2、16S rDNA序列同源性分析

采用菌落PCR方法扩增所得菌株LZB5-2的16S rDNA片段。对16S rRNA基因片段进行扩增并克隆测序，结果表明，菌株LZB5-2的16S rDNA具有序列表中序列1的核苷酸序列。菌株LZB5-2的16SrDNA进行序列比对，参见图1菌株发育树分析图。

序列1

GAAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACATGCCTTGAGGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGAGCCTCGGTTCTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTACCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACTTGCGAGAGTAAGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGATAGTCTAACCCTCGGGAGGACGTTACCACGGAGGATCAACGG

该假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）LZB5-2已于2021年1月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为：CGMCCNO.21762，分类命名：假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.。

实施例2

1.菌种的培养方法

采用2216E培养基培养（购置成品培养基）LZB5-2菌株，培养条件30℃。

2.硫化钠降解过程中中间代谢物分析

1）将上述保藏菌株转接至以硫代硫酸钠为底物的平板上；

2）将纯化好的保藏菌株以5wt%的接种量回接于以硫代硫酸根为底物的无机盐基础培养液中，验证其是否有降解能力，若出现混浊，则该菌液可用于下一步操作，具体为：

在盛有150 mL无机盐基础培养液的锥形瓶中，接入15 mL菌液（当菌液OD600nm=0.22时即菌液浓度约为0.44ⅹ10^9 cfu/ml），置于30 ℃、 160 r/min摇床培养，在培养过程中定时取样，每12小时从摇床中取样，以用于测定（参见图2）。

上述硫代硫酸根为底物的无机盐基础培养液，培养基配方：硫代硫酸钠 8g、KH₂PO₄1.2g、K₂HPO₄ 1.2g、NH₄Cl₂·6H₂O 0.4g、MgCl₂·6H₂O 0.2g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、琼脂 15g、海水 1L。

测定过程为：将接菌锥形瓶，置于超净工作台内静置沉淀 3 min 后，用移液枪各取 1mL 培养液到 1.5 mL 灭菌离心管中，用以测定各时间点培养液的 OD₆₀₀。其余液体用移液枪吸取到灭菌后的 50 mL 离心管中，在 5000 rpm 条件下离心10 min，取上清，再用0.45um 的滤膜抽滤，抽滤所得液体用以测定各时间点培养液的 pH 值和液相中（硫酸根、亚硫酸根、硫代硫酸根）的浓度随时间的变化情况，同时以不接菌的培养基作为对照。

上述硫代硫酸钠浓度采用碘量法进行检测步骤如下：

（1）配制稀释溶液，取1ml的培养液于碘量瓶中，用蒸馏水稀释至50ml（稀释50倍）

（2）碘量瓶中加2ml 17.5mol/L的醋酸和1ml 1%的淀粉溶液

（3）用0.01 mol/L的碘标准溶液滴定至出现不消失的蓝色为止，用滴定所消耗的碘量来计算S₂O₃ ^2-的含量。

（4）以1ml蒸馏水代替培养液作空白试验。

计算公式：Y=(V-V0）*C*M*X1000/50

其中：Y为所含S₂O₃ ^2-的量，单位是g/L

C为滴定的碘标准溶液浓度（0.01mol/L）

M为S₂O₃ ^2-的分子量（112g/mol）

V为滴定样品所消耗的碘液体积

V0为滴定蒸馏水所消耗的碘液体积

由图2可见，测定硫氧化菌代表菌株培养过程底物变化是，菌株随着培养时间的增加，硫化物浓度逐渐下降，而对照组始终不变。

I₂+2S₂O₃ ^2- →2I^-+S₄O₆ ^2-

实验菌种的硫降解率为：87.50%-93.75%

实施例3 有机肥制备：

1）原料：按照表1中记载的成分进行混合原料，混合后起始水分控制（60±1）%；而后采用好氧堆肥方式发酵，具体选择覆膜发酵工艺，将发酵后的产物冷却至室温，并将其进行消毒、杀菌后包装，制得成品。

表1 原料清单

表1中污泥为舟山城市污水处理厂污泥，具体为浙江省舟山市定海区白泉镇（经度122.19，纬度30.10°）且，该地温度变化如图6所示，舟山市岛北污水处理厂，菌菇渣，可按照常规记载进行收集，而后粉碎40目待用。小木块为1-2cm的小木块。菌剂为上述获得菌液，待用，即菌液浓度约为0.44ⅹ10^9 cfu/ml。

2）好氧发酵所需其它配套条件

①发酵堆长13米，宽4米，高1.6±0.1米，约60m³发酵体积，单个堆混合后物料重量38-40吨；

②发酵风管使用2排风管，2排风管通风长度10米；

③发酵区域使用油漆进行画出边界，确认堆位距离，油漆线内，为实际发酵堆长；

控制系统电力需求为三相380V,单台最大功率3.7KW。

3）发酵过程控制

（1）发酵原料混合后物料可以看到明显的蓬松状态，没有成团的大块。

（2）混料时单堆加入各种成分。

（3）建堆1-2两天先不盖气流膜（气流膜使用灌沙PE管+沙袋压边），每天4-6次观察记录堆体温度，全堆温度起来后，并比较均一后，盖上气流膜。

（4）每天至少4次以上观察温度，风量根据温度情况自动调节，人工进行适量干预。

4）发酵完成

预计单堆发酵30天左右，打开气流膜检查堆体情况，按照发酵腐熟标准如表2所示，对发酵获得物料综合取样进行检测（参见图3），确认发酵结束。

表2 发酵腐熟标准

由图3可见，由于添加了专用微生物菌剂，发酵过程启动迅速，发酵开始第3天就开始进入高温发酵过程，高温发酵过程基本维持在60℃以上。发酵温度先是快速升高后又逐步下降，到发酵第12天时发酵温度降低至最低点后又逐步升高，对照实验过程中舟山当地气温变化情况，发现舟山市的气温也有一个明显下降过程，在发酵第12天时下降至低点后又逐步回升，所以发酵温度先升高后降低可能是因为受到了当地天气变化的影响。从发酵过程中的温度变化指标来看，温度虽然后起伏，但整体维持在高温发酵状态，这表明覆膜发酵方法加上充足的发酵通气供给，能够很好的让污泥等有机物料，另外发酵过程一直可以维持高温也和物料有机质含量高有关。

对上述堆肥发酵获得有机肥进行指标检测

(1)气味指标

采用感官评测法，根据预先设定的好氧发酵气味评价标准，由3人以上气味评测小组在距离发酵现场1米、10米、50米、100米和200米的位置现场评测打分来评价发酵现场的气味情况(参见图4)，气味评价标准如下表3所示。

表3 气味评价标准

由图4可见，只有在发酵初期，距离堆体1米范围内才具有较明显的气味，距离大于10米或者发酵中后期，没有闻到令人不愉快的气味。这说明发酵过程中气味控制较好。

（2）发芽指数

将上述获得有机肥经蒸馏水配置0.05mg/mL的液体样品，静置过夜，吸取2 mL上述过滤液，注入底部铺有滤纸的一次性培养皿中，每片滤纸上均匀放置10颗大小接近，颗粒饱满的小白菜种子，以等量蒸馏水为对照进行种子发芽实验，每组重复两次。将培养皿放置在20℃恒温箱内避光培养48小时，统计发芽率和种子根长，结果保留至整数（参见图5）。

发芽率及发芽指数计算公式如下：

式中：

GI：发芽指数，%；

GR：试样浸提液培养种子的发芽率，%；

L：试样浸提液培养种子的平均根长，cm；

：蒸馏水培养种子的发芽率，%；

：蒸馏水培养种子的平均根长，cm。

结果保留至整数。

由图5可见，按照有机肥的标准，污泥发酵产物的发芽率和发芽指数等指标，最终都完全符合农业应用的安全性要求，同时污泥发酵提取液也具有较明显的促进发芽的作用。按照有机肥的评测标准，发芽率和发芽指数指标测定结果表明，污泥发酵产物的安全性较好。

序列表

<110> 中国科学院烟台海岸带研究所

<120> 硫氧化细菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaagtagct tgctactttg ctgacgagcg gcggacgggt gagtaatgct tgggaacatg 60

ccttgaggtg ggggacaaca gttggaaacg actgctaata ccgcataatg tctacggacc 120

aaagggggct tcggctctcg cctttagatt ggcccaagtg ggattagcta gttggtgagg 180

taatggctca ccaaggcgac gatccctagc tggtttgaga ggatgatcag ccacactggg 240

actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg 300

caagcctgat gcagccatgc cgcgtgtgtg aagaaggcct tcgggttgta aagcactttc 360

agtcaggagg aaaggttagt agttaatacc tgctagctgt gacgttactg acagaagaag 420

caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag ggtgcgagcg ttaatcggaa 480

ttactgggcg taaagcgtac gcaggcggtt tgttaagcga gatgtgaaag ccccgggctc 540

aacctgggaa ctgcatttcg aactggcaaa ctagagtgtg atagagggtg gtagaatttc 600

aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg aaggaatacc gatggcgaag gcagccacct 660

gggtcaacac tgacgctcat gtacgaaagc gtggggagca aacgggatta gataccccgg 720

tagtccacgc cgtaaacgat gtctactaga agctcggagc ctcggttctg tttttcaaag 780

ctaacgcatt aagtagaccg cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt 840

gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct 900

tacctacact tgacatacag agaacttacc agagatggtt tggtgccttc gggaactctg 960

atacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1020

acgagcgcaa cccctatcct tagttgctag caggtaatgc tgagaactct aaggagactg 1080

ccggtgataa accggaggaa ggtggggacg acgtcaagtc atcatggccc ttacgtgtag 1140

ggctacacac gtgctacaat ggcgcataca gagtgctgcg aacttgcgag agtaagcgaa 1200

tcacttaaag tgcgtcgtag tccggattgg agtctgcaac tcgactccat gaagtcggaa 1260

tcgctagtaa tcgcgtatca gaatgacgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1320

gcccgtcaca ccatgggagt gggttgctcc agaagtagat agtctaaccc tcgggaggac 1380

gttaccacgg aggatcaacg g 1401

Claims

1.一株硫氧化细菌，其特征在于：所述菌株已于2021年1月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC NO.21762，分类命名为假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.。

2.一种权利要求1所述的硫氧化细菌的应用，其特征在于：所述菌株在去除环境中臭气中的应用。

3.一种除臭制剂，其特征在于：除臭制剂含权利要求1所述菌株。

4.按权利要求3所述的除臭制剂，其特征在于：所述除臭制剂含有该菌株的培养物。

5.按权利要求4所述的除臭制剂，其特征在于：所述除臭制剂中菌株培养OD_600nm至0.22。

6.一种无臭气有机肥，其特征在于：有机肥中含权利要求1所述菌株。

7.按权利要求6所述的无臭气有机肥，其特征在于：所述有机肥为将所述菌株添加至有机质中发酵获得。

8.按权利要求7所述的无臭气有机肥，其特征在于：所述有机肥按重量份数计，污泥50~70，稻壳粉15~30，菌菇渣10~30，小木块5-10，所述菌株0.2-0.5。

9.权利要求8所述无臭气有机肥的应用，其特征在于：所述无臭气有机肥在促进作物种子萌发中的应用。