JP4073787B2 - 硫酸化フコグルクロノマンナン - Google Patents
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Description
本発明は糖鎖工学分野において有用な硫酸化フコグルクロノマンナンを分解する酵素、該酵素の製造方法、並びに糖鎖工学用試薬として有用な分子種の少ないフコイダン画分及び硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖及びそれらの製造方法に関する。
背景技術
褐藻類には何種類もの硫酸化多糖が含まれている。これらの硫酸化多糖はフコイダンあるいはフコイジンと総称されることが多いが、その構造は由来となる海藻により異なる。例えば、ヒバマタ目海藻、ガゴメ、マコンブ、オキナワモズク、モズク、ワカメメカブそれぞれから抽出される硫酸化多糖は異なる構造を持つ。また、一般に一種の海藻から硫酸化多糖画分を調製すると、数種の分子種の硫酸化多糖が混在している。
これまでに構造が決定された硫酸化多糖の分子種としては、硫酸化フカン、硫酸化フコグルクロノマンナン、硫酸化フコガラクタン、硫酸化グルクロノフカン等が挙げられる。硫酸化フカン画分には強い抗凝血活性、硫酸化フコグルクロノマンナン画分には癌細胞に対するアポトーシス誘導活性が報告されている等、硫酸化多糖は一般に何らかの生物活性を持つことが多い。そのため、硫酸化多糖を医薬品として開発する試みがなされている。
硫酸化多糖を医薬品として開発する際、その構造を決定する必要が生じるが、その硫酸化多糖を分解する酵素を用いれば構造を決定する際に非常に有利である。しかし褐藻類の硫酸化多糖を分解する酵素は市販されておらず、しかも褐藻類の硫酸化多糖は海藻の種によって異なるため、硫酸化多糖の構造を決めるにはその硫酸化多糖を特異的に分解する酵素が必要となる。
ヒバマタ目海藻由来硫酸化多糖混合物は抗凝血作用、クラミジアの子宮表皮細胞への定着阻害作用、アレルギー反応抑制作用、移植臓器の拒絶抑制作用などを持つことが報告されている。これらの活性と構造の関係を解明するためヒバマタ目海藻由来フコイダンの構造が研究されているが、物理化学的な分析によりその平均的な構造が提唱されているに過ぎない。
また、ヒバマタ目海藻から硫酸化多糖混合物画分を調製すると、数種の分子種の硫酸化多糖が混在している。一般に、目的とする生物活性を担う分子種以外の硫酸化多糖は不必要であり、時には不必要な分子種が副作用を誘発させるだけの場合もある。
また、構造的に再現性よくヒバマタ目海藻由来硫酸化多糖のオリゴ糖を調製できれば生物活性と構造の関係を解明する際非常に有用である。例えば、国際公開第96/34004号パンフレットに記載の褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分に含まれる硫酸化フコグルクロノマンナンを分解してオリゴ糖を生成させる酵素が知られている。この酵素はコンブ目褐藻類の硫酸化フコグルクロノマンナンによく作用して硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を生成させるが、ヒバマタ目褐藻類の硫酸化フコグルクロノマンナンにはほとんど作用しない。
以上のことから、ヒバマタ目褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分に含まれる分子種のそれぞれを特異的に分解する酵素、より均一な分子種からなるフコイダン画分、酵素的に製造した構造が均一なオリゴ糖、及びそれらの製造方法が求められていた。
発明の目的
本発明の目的は、糖鎖工学的に有用なヒバマタ目海藻由来硫酸化フコグルクロノマンナンを効率よく分解する酵素、該酵素の製造方法、及び硫酸化フコグルクロノマンナンに該酵素を作用させて得られるオリゴ糖及びその製造方法を提供することにある。また、本発明の目的は、褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分から硫酸化フコグルクロノマンナンを除去した画分及びその製造方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、フコフィラス属に属する細菌の1菌株、フコフィラス フコイダノリィティカス(Fucophilus fucoidanolyticus)SI−1234株が、新規な硫酸化フコグルクロノマンナン分解酵素を生産することを見出し、該酵素の製造方法を見出した。また、該酵素を利用してヒバマタ目褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分から硫酸化フコグルクロノマンナンを分解除去してフコイダン画分の純度を上げられることも見出した。また、該酵素を利用してヒバマタ目褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分から構造の均一な新規な硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第1の発明は、下記一般式(I)又は(II)で表される硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖又はその塩に関する。
(Rは、H又はSO3Hである。)
(Rは、H又はSO3Hである。)
本発明の第2の発明は、下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼに関する:
(I)作用:ヒバマタ目海藻由来硫酸化フコグルクロノマンナンに作用してα−D−マンノシル結合を脱離的に切断し、不飽和グルクロン酸基を持つオリゴ糖を生成させる;
(II)至適pH:本酵素の至適pHは約6.5〜8.0である;および
(III)至適温度:本酵素の至適温度は約30℃〜40℃である。
本発明の第2の発明の酵素は、硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ生産能を有するフコフィラス属細菌を培養する工程およびその培養物から該酵素を採取する工程を包含する方法によって得ることができる。
本発明の第1の発明の糖化合物又はその塩は、本発明の第2の発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼをヒバマタ目海藻由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分に作用させる工程を包含することを特徴とする糖化合物の製造方法によって調製することができる。
本発明の第3の発明は、褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分に本発明の第2の発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを作用させて低分子化した硫酸化フコグルクロノマンナンを除去する工程を包含する方法によって得られることを特徴とするフコイダン画分に関する。
本発明の第3の発明のフコイダン画分は、褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分に本発明の第2の発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを作用させる工程およびフコイダン画分を採取する工程を包含することを特徴とするフコイダン画分の製造方法によって調製する事ができる。
本発明の第4の発明は、本発明の第2の発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを含むことを特徴とする糖質工学用試薬に関する。
本発明の第5の発明は、下記一般式(X)で表される硫酸化フコグルクロノマンナンからなる多糖類に関する。
(式中、Rは、H又はSO3Hであり、R2は、H又はSO3H又は下記一般式(XI)である。nは1以上の整数である。)
(式中、Rは、H又はSO3Hである。)
本発明の第6の発明は、下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸化フコグルクロノマンナン又はその塩に関する:
(1)構成糖:フコース、マンノース及びグルクロン酸を含有し、
(2)請求項2記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼにより低分子化され、下記一般式(I)又は(II)で表される化合物より選択される1種類以上の化合物が生成する:
(Rは、H又はSO3Hである。)
(Rは、H又はSO3Hである。)
発明の詳細な説明
以下本発明に関して具体的に説明する。
本明細書において、硫酸化フコグルクロノマンナンとは褐藻類に含まれる硫酸化多糖で、その構成糖がフコース、マンノース及びグルクロン酸からなるもののことをいう。また、硫酸化フコグルクロノマンナンに本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを作用させると、前記一般式(I)及び/又は(II)で表される化学構造の物質が得られる。当該硫酸化フコグルクロノマンナンの由来は特に限定されるものではないが、例えば、Fucus vesiculosus、Ascophyllum nodosumなどのヒバマタ目(Fucales)の褐藻類由来の硫酸化フコグルクロノマンナンが好適に使用できる。本明細書において硫酸化フコグルクロノマンナン画分とは硫酸化フコグルクロノマンナンを含有する画分をいう。
本明細書において硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼとは、褐藻類由来硫酸化フコグルクロノマンナンに作用してマンノースとグルクロン酸の間のα−D−マンノシル結合を脱離的に切断し、不飽和グルクロン酸基を持つオリゴ糖を生成させる酵素のことをいう。
本明細書において糖化合物とは、硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖のことであり、硫酸化フコグルクロノマンナンに本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを作用させて得られるオリゴ糖で、還元性末端糖がマンノースであるものが含まれる。
本明細書において硫酸化フコグルクロノマンナンを製造する際にはまず、褐藻類に含まれる水溶性成分を抽出する。その際硫酸化フコグルクロノマンナンの低分子化を防ぐためには、抽出の際のpHは4〜9、温度は100℃以下が好ましい。また、上記抽出液中のアミノ酸や低分子性の色素等は限外ろ過で効率良く除去できる。疎水性物質の除去には活性炭処理等も有効である。
このようにして褐藻類の硫酸化多糖混合物画分が得られる。該画分を硫酸化フコグルクロノマンナン画分として例えば本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの基質として使用できる。硫酸化フコグルクロノマンナン画分を陰イオン交換カラムで分離すればより純度の高い硫酸化フコグルクロノマンナンを得られる。上記の硫酸化多糖混合物画分も陰イオン交換カラムで精製した硫酸化フコグルクロノマンナンもともに本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを精製する際の活性測定用基質、及び本発明の分子種の少ないフコイダン画分及び硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖製造時の原料として使用できる。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの製造に使用される細菌としては、硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを生産する細菌であれば特に限定はないが例えば、フコフィラス フコイダノリティカス (Fucophilus fucoidanolyticus) SI−1234株が挙げられる。
なお、上記のフコフィラス フコイダノリティカス SI−1234株はナマコの腸内より本発明者らが新たに探索して得た細菌で、その菌学的性質は次のとおりである。
a. 形態的性質
(1)本菌は直径1.2〜1.6μmの球菌である。
(2)胞子の有無 なし
(3)グラム染色性 陰性
b. 生理的性質
(1)生育温度 25℃で生育する。
(2)酸素に対する態度 好気性
(3)カタラーゼ 陽性
(4)オキシダーゼ 陰性
(5)塩類要求性
0%食塩培地での生育 陰性
1%食塩培地での生育 陰性
海水培地での生育 陽性
(6)キノン系 メナキノン7
(7)菌体内DNAのGC含量 52%
(8)OF−テスト 酸を生成しない
(9)集落の色調 特徴的な集落色素を生成せず
(10)運動性 陰性
(11)滑走性 陰性
(12)鞭毛 なし
本菌株は、バージーズ マニュアル オブ ディターミネィティブ バクテリオロジー(Bergey’s manual of determinative bacteriology)、第9巻(1994)に記載の基本分類によればグループ4(グラム陰性好気性桿菌及び球菌)に分類される。しかし本菌株は、電子伝達鎖にメナキノン7を有し、GC含量が52%という点でグループ4に属する菌と大いに異なる。
そこで、本菌株の16S rRNAをコードするDNA(16S rDNA)の塩基配列を決定(配列表の配列番号1)し、既知の細菌と相同性を比較したところ16S rDNAの全域(約1500塩基)にわたって相同性の高い既知菌株は存在しなかった。16S rDNAの全配列の相同性が90%以下の場合、両細菌の属が同じであることはない。そこで、本発明者らは、本菌株は既知の属に属さない新属の細菌であると断定し、本菌株をフコフィラス フコイダノリィティカス SI−1234と命名した。従って、16S rDNAの塩基配列より、フコフィラス フコイダノリィティカス SI−1234と同属と判断される細菌から得られた硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼも本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼに含まれる。
なお、上記菌株は Fucophilus fucoidanolyticus SI−1234と表示され、ブタペスト条約のもと、〒305−8566日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成11年8月18日より(移管日:平成13年3月7日)、受託番号FERM BP−7495として寄託されている。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを生産する細菌を培養するにあたり、培地に加える栄養源は使用する微生物が利用し、該酵素を生産するものであればよく、炭素源としては、例えば、硫酸化フコグルクロノマンナン、Fucus vesiculosusやAscophylum nodosum等の海藻、アルギン酸、ラミナラン、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム、尿素、尿酸等が適当である。その他にナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛等の塩化物、リン酸塩、硫酸塩等を加えてもよい。なお、一般に海水から採取した微生物は、海水あるいは市販の人工海水中で極めて生育し易い。
また、培養条件は使用する微生物、培地組成等に応じ、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの生産量が最大になるように設定するが、一般に培養温度は15〜30℃、培地のpHは5〜9がよく、5〜72時間の通気攪拌培養で本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの生産量は最高に達する。培養終了後、遠心分離で菌体と培養上清に分画し、それぞれから本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを得ることができる。
上記のフコフィラス フコイダノリィティカス SI−1234を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常の細胞破砕手段、例えば超音波処理で菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。次いでこの抽出液から通常の精製手段により精製酵素標品を得られる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水カラムクロマト、ゲルろ過等により精製し、実質的に他の硫酸化フコース含有多糖分解酵素を含まない純化された本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを得られる。
また、上述の培養上清中にも本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼが大量に存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段で精製できる。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの理化学的性質は以下の通りである。
(I)作用:硫酸化フコグルクロノマンナンに作用して、α−D−マンノシル結合を脱離的に切断し不飽和グルクロン酸基を持つオリゴ糖を生成させる。
(II)至適pH:本酵素の至適pHは約6.5〜8.0付近にある(図1)。
すなわち図1は本酵素の反応時のpHと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性(%)、横軸はpHを示す。
(III)至適温度:本酵素の至適温度は約30℃〜40℃付近にある(図2)。
すなわち、図2は本酵素の反応時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性(%)、横軸は温度(℃)を示す。
(IV)分子量:本酵素の分子量は、ゲルろ過法で測定した場合、約50〜60万である。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼは、硫酸化フコグルクロノマンナン分解活性を測定して確認でき、生産菌の無細胞抽出液でも、各種カラムクロマトで精製後の酵素溶液でも確認できる。
フコフィラス フコイダノリィティカス SI−1234株は硫酸化フコグルクロノマンナンを資化する微生物であり、硫酸化フコグルクロノマンナンを分解するために菌体内及び菌体外に本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを生産する。
本明細書において褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分とは、褐藻類から抽出したフコースを含有する硫酸化多糖混合物(褐藻類由来フコイダン)を含む画分のことをいう。
本発明によれば、上記硫酸化多糖混合物画分に含まれる硫酸化フコグルクロノマンナンを酵素で分解後除去することによって分子種の少ないフコイダン画分を得ることができる。
上記分子種の少ないフコイダン画分を得るには、褐藻類から抽出した硫酸化多糖混合物画分に硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを作用させて、低分子化した硫酸化フコグルクロノマンナンすなわち硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を例えば限外ろ過、ゲルろ過、陰イオン交換カラム処理等で除去すればよい。必要に応じて脱塩、凍結乾燥等の処理をしてもよい。
例えばヒバマタ目海藻由来硫酸化多糖混合物画分には硫酸化フカンの他に硫酸化フコグルクロノマンナン等数種の硫酸化多糖が含まれているが、硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼで硫酸化フコグルクロノマンナンを分解除去し、分子種の少ないフコイダン画分を調製できる。分子種の少ないフコイダン画分及び硫酸化フコグルクロノマンナンの分解で生成した硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖は糖鎖工学用試薬として有用である。
本発明の分子種の少ないフコイダン画分を調製する際、褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中の当該硫酸化多糖混合物画分の濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、分解に用いる本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの量等を考慮して選定すればよい。該硫酸化多糖混合物画分の溶解液は、水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液のpHは通常中性付近で、酵素反応は通常30℃付近で行う。分子種の少ないフコイダン画分は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、限外ろ過等で精製してもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理、凍結乾燥処理もできる。
本発明の分子種の少ないフコイダン画分に含まれる物質は、硫酸基及び/又はカルボキシル基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形成する。本発明の分子種の少ないフコイダン画分に含まれる物質は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウム、カリウム及び/又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス50W等の陽イオン交換樹脂を利用して遊離の本発明の分子種の少ないフコイダン画分に含まれる物質に導ける。また、これらは、必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩に交換できる。
本発明の分子種の少ないフコイダン画分に含まれる物質は、薬学的に許容される塩、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属、アンモニウム、亜鉛等の塩とすることができる。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖は、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを硫酸化フコグルクロノマンナン、若しくは硫酸化フコグルクロノマンナン含有物に作用させて調製できる。硫酸化フコグルクロノマンナン含有物としては、例えば硫酸化フコグルクロノマンナンの部分精製品、褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分、褐藻類の水性溶媒抽出物、若しくは褐藻類藻体が好適に使用できる。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を調製する際、硫酸化フコグルクロノマンナン、若しくは硫酸化フコグルクロノマンナン含有物の溶解は常法で行えばよく、溶解液中の硫酸化フコグルクロノマンナン、若しくは硫酸化フコグルクロノマンナン含有物の濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、反応に使用する本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの量等を考慮して選定すればよい。硫酸化フコグルクロノマンナンの溶解液としては、水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液のpHは通常中性付近で、酵素反応は通常30℃付近で行う。反応に使用する本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの使用量、反応液の組成、反応時間等の調整により、硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖の分子量を調整できる。この様にして得られた本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を分子量分画あるいは陰イオン交換カラムで分画して、更に均一な分子量の本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を調製できる。分子量分画は定法、例えばゲルろ過法や限外ろ過法を使用すればよい。低分子化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭処理等の精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理、凍結乾燥処理もできる。これらの方法で、後述のごとく、NMR分析で構造決定可能な均一な構造の本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を得られる。例えばこの硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖は以下の式(I)又は(II)で表される化合物が挙げられる。本発明を特に限定するものではないが、好適には、下記式(I)、(II)においてRは少なくとも1つのSO3Hである。
(Rは、H又はSO3Hである。)
(Rは、H又はSO3Hである。)
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖は、硫酸基及びカルボキシル基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形成する。本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウム、カリウム及び/又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス50W等の陽イオン交換樹脂を利用して遊離の本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖に導ける。また、これらは、必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩に交換できる。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖は、薬学的に許容される塩、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属、アンモニウム、亜鉛等の塩とすることができる。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼは硫酸化フコグルクロノマンナンを低分子化するため硫酸化フコグルクロノマンナンの構造解析に使用できる。また、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖は糖鎖工学用試薬として使用できる。例えば、特公平5−65108号公報記載の方法により2−アミノピリジル化(PA化)を行い、後述のごとく該オリゴ糖のPA化物を調製すれば、フコフラノシダーゼや5−硫酸化フコフラノシダーゼの基質として使用できるなど糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質を提供することができる。
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンは、グルクロン酸とマンノースが交互に結合した糖鎖のマンノースからフコースの側鎖が伸びている構造を持つ多糖である。この多糖は、2価の陽イオンによる架橋などにより重合している事も多いが、それらを切断した場合の分子量は、特に限定はされないが、5000〜200万の範囲、さらに好ましくは、1万〜100万の範囲である。特に限定はされないが例えば、下記一般式(X)で表されるものが例示される。下記一般式(X)において、nは、1以上の整数であり、好ましくは、5〜2000の範囲、さらに好ましくは10〜1000の範囲である。
(式中、Rは、H又はSO3Hであり、R2は、H又はSO3H又は下記一般式(XI)である。nは1以上の整数である。)
(式中、Rは、H又はSO3Hである。)
実施例
以下に本発明を実施例をもって具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
参考例1 Fucus vesiculosus由来硫酸化多糖混合物画分の調製
乾燥したFucus vesiculosus藻体を粉砕し、その1kgを10リットルの80%エタノールに懸濁し、25℃で3時間攪拌後ろ過、洗浄し残渣を得た。その残渣を30リットルの100mM塩化ナトリウムを含む30mMリン酸緩衝液(pH6.5)中に懸濁し、95℃で2時間処理後、30℃に冷却し、100gの活性炭、3000Uのアルギン酸リアーゼ(ナガセ生化学工業製)、及び3.75リットルのエタノールを添加し24時間攪拌後、遠心分離して上清を得た。その上清を排除分子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で4リットルに濃縮後、100mM塩化ナトリウムで溶媒を置換した。この溶液を5℃まで冷却し、0.5N塩酸でpHを2.0とし、生じた沈殿を遠心分離で除去し、上清を得た。その上清のpHを1N水酸化ナトリウムで8.0とし、上記の限外ろ過機で2リットルに濃縮後、20mM塩化ナトリウムで溶媒を置換し、遠心分離で不溶物を除去後、凍結乾燥して80gのFucus vesiculosus由来硫酸化多糖混合物画分を得た。
参考例2 Ascophyllum nodosum由来硫酸化多糖混合物画分の調製
市販のAscophyllum hodosum粉末1kgから、参考例1と同様の方法で100gのAscophyllum nodosum由来硫酸化多糖混合物画分を得た。
参考例3 ガゴメコンブ由来硫酸化多糖混合物画分の調製
市販の乾燥ガゴメコンブをカッターミル(増幸産業製)で破砕してチップとし、1kgのチップから、参考例1と同様の方法で38gのガゴメコンブ由来硫酸化多糖混合物画分を得た。
参考例4 Fucus vesiculosus由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分の調製
7gの参考例1記載のFucus vesiculosus由来硫酸化多糖混合物画分を700mlの100mM塩化ナトリウムを含む20mMイミダゾール塩酸緩衝液(pH6.0)に溶解し、同緩衝液で平衡化させた5リットルのDEAE−セルロファインA−800にかけた。試料を流した後、10リットルの同緩衝液で洗浄し、100〜1600mMの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、分取(500ml)した。各画分に含まれる総糖量をフェノール硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール硫酸法で測定した。溶出塩化ナトリウム濃度200−700mMの画分を、限外ろ過(排除分子量10万)で濃縮、脱塩後凍結乾燥し、1.3gのFucus vesiculosus由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分を得た。
参考例5 Ascophyllum nodosum由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分の調製
7gの参考例2記載のAscophyllum nodosum由来硫酸化多糖混合物画分から、参考例4と同様の方法で1.1gのAscophyllum nodosum由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分を得た。
参考例6 ガゴメコンブ由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分の調製
7gの参考例3記載のガゴメコンブ由来硫酸化多糖混合物画分を700mlの150mM塩化ナトリウムを含む20mMイミダゾール塩酸緩衝液(pH8.0)に溶解し、同緩衝液で平衡化させた5リットルのDEAE−セルロファインA−800にかけた。試料を流した後、10リットルの同緩衝液で洗浄し、150〜1950mMの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、分取(500ml)した。溶出画分に含まれる総糖量をフェノール硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール硫酸法で測定した。溶出塩化ナトリウム濃度350−490mMの画分を限外ろ過(排除分子量10万)で濃縮、脱塩後凍結乾燥し、1.32gのガゴメコンブ由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分を得た。
参考例7 硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ活性測定方法
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼは硫酸化フコグルクロノマンナンに作用すると、不飽和グルクロン酸基を持つオリゴ糖を生成させるため、232nmの吸光度が増加する。これを利用して下記の方法で硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの活性を測定した。また、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼはFucus vesiculosus及びAscophylum nodosum由来硫酸化フコグルクロノマンナンに作用するが、ガゴメコンブ由来硫酸化フコグルクロノマンナンにも作用するので活性の測定には調製がより容易なガゴメコンブ由来硫酸化フコグルクロノマンナンを基質に用いた。
すなわち、50μlの2.5%の参考例6記載のガゴメコンブ由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分溶液と、50μlの100mMリン酸緩衝液(pH7.5)と、10μlの4M塩化ナトリウムと10μlの本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼとを混合し、37℃で3時間反応させた後、反応液105μlを2mlの冷水で希釈しその232nmの吸光度を測定した。対照として、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの代わりに、その酵素溶液の溶媒を用いて反応させたもの及び硫酸化フコグルクロノマンナン画分の代わりに水を用いて反応させたものを同様に分析した。
1単位の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ活性は上記反応系において1分間に1μmolの不飽和グルクロン酸基を生成する酵素量とした。該酵素の活性は下記式により求めた。
Δ232×2.105/5.5/180/0.01=U/ml
Δ232:232nmにおける吸光度の増加量
2.105:吸光度を測定した試料の液量(ml)
5.5:不飽和グルクロン酸基のmM分子吸光係数
180:反応時間(分)
0.01:酵素液量(ml)
また、タンパク質の定量は、酵素液の280nmの吸光度を測定することにより行ない、その際1mg/mlの蛋白質溶液の吸光度を1.0として計算した。
実施例1 硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの調製
フコフィラス フコイダノリィティカス SI−1234を参考例1に記載のFucus vesiculosus由来硫酸化多糖混合物画分0.2%とペプトン1%を含む人工海水(ジャマリンラボラトリー製)(pH8.0)からなる培地600mlを120℃、20分間オートクレーブ処理した培地に接種し、24℃で72時間培養して種培養液とした。参考例1に記載のFucus vesiculosus由来硫酸化多糖混合物画分0.2%、ペプトン1%、及び消泡剤(KM70、信越化学工業製)を含む人工海水(ジャマリンラボラトリー製)pH8.0からなる培地20リットルを30リットルのジャーファーメンターに入れ、120℃、20分間処理した培地に、上記の種培養液を接種し、毎分125回転の回転速度で、24℃で48時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。
この菌体を600mlの400mM塩化ナトリウムと10mM塩化カルシウムを含む20mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH7.0)に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して上清を得た。この上清を同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清、すなわち、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ粗酵素溶液を得た。
なお、上記の培養上清と粗酵素溶液に含まれる、硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ活性を測定した結果、培養液上清には培地1mlあたり1mU、菌体抽出液には培地1mlあたり2mUの活性が検出された。
実施例2 硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ粗酵素溶液を用いた硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析(1)
(1)調製
参考例1記載のFucus vesiculosus由来硫酸化多糖混合物画分に実施例1記載の粗酵素溶液を作用させ本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を調製した。すなわち、5gのFucus vesiculosus由来硫酸化多糖画分を500mlの300mM塩化ナトリウム及び50mM塩化カルシウムを含む25mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH7.0)に溶解後、50mlの実施例1記載の粗酵素溶液を加え、25℃で4日間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清を排除分子量1万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置にかけ、分子量1万以下のオリゴ糖画分を回収し、硫酸化フコグルクロノマンナン酵素消化物画分1とした。
(2)精製
実施例2−(1)で得られた硫酸化フコグルクロノマンナン酵素消化物画分1を脱塩装置(マイクロアシライザーG3、旭化成工業製)で脱塩し、10mMとなるようにイミダゾールを、10mMとなるように塩化ナトリウムを添加し、10mM塩化ナトリウムを含む10mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH6.0)で平衡化した1リットルのDEAE−セルロファインA−800のカラムにかけ、2リットルの同じ緩衝液で洗浄後、10〜1200mMの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、分取した。各フラクションの232nmの吸光度を測定し、総糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その結果、洗浄の後半及び360mM塩化ナトリウムで溶出する部分に、232nmの吸光度と総糖量と総ウロン酸量が比例するピークが存在していたのでそれぞれのピーク部分を集めオリゴ糖1−(1)及び1−(2)画分とした。
オリゴ糖1−(1)画分に水を加えて、導電率を5mM塩化ナトリウムを含む10mMイミダゾール塩酸緩衝液(pH6.0)と同じにし、5mM塩化ナトリウムを含む10mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH6.0)で平衡化した30mlのDEAE−セルロファインA−800のカラムにかけ、60mlの同じ緩衝液で洗浄した。素通り画分を集め、エバポレーターで2.8mlに濃縮後、10%エタノールで平衡化させたセルロファインGCL−25のカラム(2×32cm)にかけ、10%エタノールで溶出して脱塩後、乾固した。こうして1.6mgの本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖1−(1)を得た。
オリゴ糖1−(2)画分に水を加えて、導電率を200mM塩化ナトリウムを含む10mMイミダゾール塩酸緩衝液(pH6.0)と同じにし、200mM塩化ナトリウムを含む10mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH6.0)で平衡化した20mlのDEAE−セルロファインA−800のカラムにかけ、40mlの同じ緩衝液で洗浄した。次に、200−500mMの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、240−320mM塩化ナトリウム溶出画分を集め、エバポレーターで1.0mlに濃縮後、10%エタノールで平衡化させたセルロファインGCL−25のカラム(2×32cm)にかけ、10%エタノールで溶出して脱塩後乾固した。こうして6.4mgの本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖1−(2)を得た。
(3)構造解析
実施例2−(2)で得られた本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖1−(1)及び1−(2)を2−アミノピリジンで蛍光標識し、還元末端糖及び糖組成の分析を行ったところ、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖1−(1)及び1−(2)の還元性末端糖はともにマンノースであった。また、中性糖組成は、ともにフコースとマンノースからなるものであった。次に、硫酸含量(塩化バリウムを用いた比濁法による)、ウロン酸含量(カルバゾール−硫酸法による)を測定し、質量分析装置(API−III、パーキンエルマー・サイエクス社製)で質量を分析した。また、JNM−α500型核磁気共鳴装置(日本電子社製)でNMR分析を行った。分析試料は定法により重水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、1H−検出異種核検出法であるHMBC法を用いて行った。1H−NMRの帰属にはDQF−COSY法及びHOHAHA法を用いた。
以下に本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖1−(1)及び1−(2)の物性を示す。
(a)本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖1−(1)の物性
質量分析及びNMR分析の帰属の結果を以下に示し、1H−NMRスペクトルを図3に、マススペクトルを図4にそれぞれ示した。図3において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図4において、縦軸は相対強度(%)を、横軸は、m/z値を示す。
分子量;484
MS m/z 483.3[M−H+]−
1H−NMRによる分析結果を表1に示す。
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式(III)の通りである。
(b)本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖1−(2)の物性
質量分析及びNMR分析の帰属の結果を以下に示し、1H−NMRスペクトルを図5に、マススペクトルを図6にそれぞれ示した。図5において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図6において、縦軸は相対強度(%)を、横軸は、m/z値を示す。
分子量;724
MS m/z 723.1[M−H+]−、766.7[M+2Na+−3H+]−、790.5[M+3Na+−4H+]−、360.9[M−2H+]2−、372.0[M+Na+−3H+]2−
1H−NMRによる分析結果を表2に示す。
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式(IV)の通りである。
実施例3 硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ粗酵素溶液を用いた硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析(2)
(1)調製
参考例4記載のFucus vesiculosus由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分に実施例1記載の粗酵素溶液を作用させ本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を調製した。すなわち、0.61gのFucus vesiculosus由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分を60mlの400mM塩化ナトリウムを含む20mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解後、300mM塩化ナトリウムと5mM EDTAと5mMアジ化ナトリウムを含む20mMイミダゾール塩酸緩衝液(pH7.0)に透析した実施例1記載の粗酵素溶液を6ml加え、25℃で7日間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清を限外ろ過(排除分子量1万)し、分子量1万以下のオリゴ糖画分を回収し、硫酸化フコグルクロノマンナン酵素消化物画分2とした。
(2)精製
実施例3−(1)で得られた硫酸化フコグルクロノマンナン酵素消化物画分2を40mlに濃縮し、10%エタノールで平衡化させたセルロファインGCL−1000(4×87cm)にかけ、溶出液を10mlずつ分画した。第70−100画分を集め、脱塩装置(マイクロアシライザーG3、旭化成工業製)で脱塩後、10mMとなるようにイミダゾールを添加し、10mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH6.0)で平衡化した80mlのDEAE−セルロファインA−800のカラムにかけ、160mlの同じ緩衝液で洗浄後、0−800mMの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、分取した。各フラクションの232nmの吸光度を測定し、総糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その結果、232nmの吸光度と総糖量と総ウロン酸量が比例する明瞭なピークが5個検出されたのでそれぞれのピーク部分を集め、溶出塩濃度の低い順にオリゴ糖2−(1)〜(5)画分とした。
オリゴ糖2−(1)〜(5)画分をそれぞれエバポレーターで4mlに濃縮後、10%エタノールで平衡化させたセルロファインGCL−25のカラム(2×32cm)にかけ、10%エタノールで溶出して脱塩後、乾固した。こうして3.5mg、3.9mg、1.9mg、1.7mg、0.9mgの本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(1)〜(5)を得た。
(3)構造解析
実施例3−(2)で得られた本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(1)〜(5)を、2−アミノピリジンで蛍光標識し、還元末端糖及び糖組成の分析を行ったところ、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(1)〜(5)の還元性末端糖は総てマンノースであった。また、中性糖組成は、総てフコースとマンノースからなるものであった。次に、硫酸含量(塩化バリウムを用いた比濁法による)、ウロン酸含量(カルバゾール−硫酸法による)を測定し、質量分析装置(API−III、パーキンエルマー・サイエクス社製)で質量を分析した。また、JNM−α500型核磁気共鳴装置(日本電子社製)でNMR分析を行った。分析試料は定法により重水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、1H−検出異種核検出法であるHMBC法を用いて行った。1H−NMRの帰属にはDQF−COSY法及びHOHAHA法を用いた。
以下に本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(1)〜(5)の物性を示す。
(a)本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(1)の物性
上記分析の結果、本物質は本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖1−(1)と同じ物質であることが判明した。
(b)本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(2)の物性
質量分析及びNMR分析の帰属の結果を以下に示し、1H−NMRスペクトルを図7に、マススペクトルを図8にそれぞれ示した。図7において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図8において、縦軸は相対強度(%)を、横軸は、m/z値を示す。
分子量;564
MS m/z 563.0[M−H+]−、585.0[M+Na+−2H+]− 281.0[M−2H+]2−
1H−NMRによる分析結果を表3に示す。
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式(V)の通りである。
(c)本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(3)の物性
質量分析及びNMR分析の帰属の結果を以下に示し、1H−NMRスペクトルを図9に、マススペクトルを図10にそれぞれ示した。図9において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図10において、縦軸は相対強度(%)を、横軸は、m/z値を示す。
分子量;644
MS m/z 321.3[M−2H+]2−
1H−NMRによる分析結果を表4に示す。
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式(VI)の通りである。
(d)本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(4)の物性
質量分析及びNMR分析の帰属の結果を以下に示し、1H−NMRスペクトルを図11に、マススペクトルを図12にそれぞれ示した。図11において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図12において、縦軸は相対強度(%)を、横軸は、m/z値を示す。
分子量;870
MS m/z 456.1[M+2Na−4H+]2−、445.0[M+Na+−3H+]2−
1H−NMRによる分析結果を表5〜6に示す。
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式(VII)の通りである。
(e)本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(5)の物性
質量分析及びNMR分析の帰属の結果を以下に示し、1H−NMRスペクトルを図13に、マススペクトルを図14にそれぞれ示した。図13において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値(ppm)を示す。また、図14において、縦軸は相対強度(%)を、横軸は、m/z値を示す。
分子量;950
MS m/z 1037.0[M+4Na−5H+]−、506.9[M+3Na−5H+]2−、495.8[M+2Na+−4H+]2−
1H−NMRによる分析結果を表7〜8に示す。
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式(VIII)の通りである。
実施例4 組換え硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを用いた硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析
(1)調製
参考例4記載の硫酸化フコグルクロノマンナン画分に、国際公開第WO99/11797号パンフレット記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの遺伝子を大腸菌に組み込んで生産させた組換え硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを作用させ、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を調製した。すなわち、0.4gのFucus vesiculosus由来硫酸化フコグルクロノマンナン画分を40mlの400mM塩化ナトリウムを含む20mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH7.0)に溶解後、5mlの組換え硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ溶液(66U相当)を加え、25℃で25時間反応させた。反応液を10%エタノールで平衡化させたセルロファインGCL−1000のカラム(4×87cm)にかけ、1画分あたり9.5mlで分取した。溶出画分のうち第83−120画分を集め、硫酸化フコグルクロノマンナン酵素消化物画分3とした。
(2)精製
実施例4−(1)で得られた硫酸化フコグルクロノマンナン酵素消化物画分3を脱塩装置(マイクロアシライザーG3、旭化成工業製)で脱塩し、10mMとなるようにイミダゾールを添加し、10mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH6.0)で平衡化した20mlのDEAE−セルロファインA−800のカラムにかけ、40mlの同じ緩衝液で洗浄後、0〜800mMの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させた。各フラクションの232nmの吸光度を測定し、総糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その結果、200mM及び300mM塩化ナトリウムで溶出される部分に、232nmの吸光度と総糖量と総ウロン酸量が比例するピークが検出されたのでそれぞれのピーク部分を集めオリゴ糖3−(1)及び3−(2)画分とした。
オリゴ糖3−(1)画分をエバポレーターにより1mlに濃縮後、10%エタノールで平衡化させたセルロファインGCL−25のカラム(1.2×30cm)にかけ、10%エタノールで溶出して脱塩後、乾固した。こうして0.7mgの本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖3−(1)を得た。
オリゴ糖3−(2)画分をエバポレーターにより1.0mlに濃縮後、10%エタノールで平衡化させたセルロファインGCL−25のカラム(1.2×30cm)にかけ、10%エタノールで溶出して脱塩後乾固した。こうして1.6mgの本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖3−(2)を得た。
(3)構造解析
実施例4−(2)で得られた本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖3−(1)及び3−(2)について、2−アミノピリジンで蛍光標識し、還元末端糖及び糖組成の分析を行ったところ、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖3−(1)及び3−(2)の還元性末端糖はともにマンノースであった。また、中性糖組成は、ともにフコースとマンノースからなるものであった。次に、硫酸含量(塩化バリウムを用いた比濁法による)、ウロン酸含量(カルバゾール−硫酸法による)を測定し、質量分析装置(API−III、パーキンエルマー・サイエクス社製)で質量を分析した。また、JNM−α500型核磁気共鳴装置(日本電子社製)でNMR分析を行った。分析試料は定法により重水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、1H−検出異種核検出法であるHMBC法を用いて行った。1H−NMRの帰属にはDQF−COSY法及びHOHAHA法を用いた。
以下に本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖3−(1)及び3−(2)の物性を示す。
(a)本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖3−(1)の物性
上記分析の結果、本物質は、既に報告されているオリゴ糖と同じ構造であることが判明した。
その構造を下記式(IX)に示す。
(b) 本発明の硫酸化グルクロノマンナンオリゴ糖3−(2)の物性
上記分析の結果、本物質は本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(3)と同じ物質であることが判明した。
実施例3と実施例4を比較すると、実施例4では、使用した硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼは200倍以上であるが、基質重量に対するオリゴ糖の生成効率が1/5未満である。また、実施例3では6種類のオリゴ糖が得られているが、実施例4では2種類のオリゴ糖が得られたのみである。すなわち、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼはFucus vesiculosus 由来硫酸化フコグルクロノマンナンを効率良く分解するが、実施例4で使用したリコンビナント硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの場合はFucus vesiculosus由来硫酸化フコグルクロノマンナンをあまり分解することができない。
実施例5 本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの分子量の測定
実施例1記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの粗酵素溶液を、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化カルシウム、及び5mMアジ化ナトリウムを含む10mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したセファクリルS−200のカラム(4.4×100cm)でゲルろ過し、溶出液を13.5mlずつ分取した。参考例7記載と同様の方法で、各フラクションの本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの活性を測定した。こうして、決定された本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの分子量は約50〜60万であった。
実施例6 分子種の少ないフコイダン画分の製造
参考例1記載のFucus vesiculosus由来硫酸化多糖混合物画分を用いて分子種の少ないフコイダン画分を調製するため、500mlの50mMリン酸緩衝液(pH7.0)、50mlの4M塩化ナトリウム、10mlの実施例1記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ粗酵素溶液、5gの参考例1記載のFucus vesiculosus由来硫酸化多糖画分を混合後、25℃で5日間反応させた。分解された硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖を透析で除去し、硫酸化多糖画分から硫酸化フコグルクロノマンナンを除去した本発明の分子種の少ないフコイダン画分を調製した。
実施例7 硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの作用部位の構造
本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼにより、生成されるオリゴ糖の還元性末端糖は総てマンノースで、非還元性末端には不飽和グルクロン酸があり、反応の進行とともに232nmの吸光度が増加することから、本酵素は、国際公開第96/34004号パンフレット記載のように、硫酸化フコグルクロノマンナンのマンノースとグルクロン酸の間のマンノシル結合を脱離的に切断する酵素であると推定された。
推定通りの酵素であれば、Fucus vesiculosus由来フコイダンにはグルクロン酸とマンノースが交互に結合した糖鎖のマンノースからフコースの側鎖が伸びている構造を持つ多糖(硫酸化フコグルクロノマンナン)が存在することになる。褐藻類由来硫酸化他等混合物からマンノースとグルクロン酸からなる多糖(グルクロノマンナン)を得る方法として、シュウ酸処理が知られている(Carbohydrate Research,vol.125,283−290(1984))。そこでFucus vesiculosusにも推定通り硫酸化フコグルクロノマンナンが含まれているかどうかを確かめるため、本方法を参考にして、Fucus vesiculosus由来フコイダンを処理し、その構造を分析した。
すなわち、参考例1の方法で製造したFucus vesiculosus由来硫酸化多糖混合物画分1gを100mlの水に溶解後、4.5gのシュウ酸を加え、6M水酸化ナトリウムでpHを1.0とし、100℃で5時間処理し、6M水酸化ナトリウムで、pHを8とし、遠心分離した。得られた上清にエタノールを85%となるように添加し、2時間放置後、遠心分離で沈殿を得た。沈殿を3000mlの10mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH8.0)に溶解後、30mM塩化ナトリウムを含む10mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH8.0)で平衡化した100mlのDEAE−セルロファインにかけ、同緩衝液で洗浄後、30mM〜500mMの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させた。溶出画分を10mlずつ分画し、それぞれの中性糖含量及びウロン酸含量をフェノール硫酸法及びカルバゾール硫酸法で測定した。溶出塩化ナトリウム濃度120〜250mMに中性糖とウロン酸を含む主成分が溶出されたので、この画分を集め、電気透析機で脱塩後凍結乾燥し、重水置換後NMR分析を行った。この結果、本物質はCarbohydrate Research,vol.125,283−290(1984)に記載のグルクロノマンナンと同じ構造であることが確認できた。
すなわち、本発明のオリゴ糖に含まれている不飽和グルクロン酸は、本発明の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの作用により硫酸化フコグルクロノマンナンのグルクロン酸から生成されることがわかった。
また、同時に、Fucus vesiculosus由来フコイダンにはフコフラノースを含む新規な硫酸化フコグルクロノマンナンが含まれることが分かった。
産業上の利用の可能性
本発明により硫酸化フコグルクロノマンナンの構造解析や硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖の再現性よい製造に用いることができる新規の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ及び該酵素の製造方法が提供される。また、該酵素を使用することにより製造できる、糖鎖工学用試薬として有用な硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖や分子種の少ないフコイダン画分及びそれらの製造方法が提供される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1:本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼのpHと相対活性(%)の関係を表すグラフである。
図2:本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの温度(℃)と相対活性(%)の関係を表すグラフである。
図3:本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖1−(1)の1H−NMRスペクトルを示す図である。
図4:本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖1−(1)の質量分析(マス)スペクトルを示す図である。
図5:本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖1−(2)の1H−NMRスペクトルを示す図である。
図6:本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖1−(2)の質量分析(マス)スペクトルを示す図である。
図7:本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(2)の1H−NMRスペクトルを示す図である。
図8:本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(2)の質量分析(マス)スペクトルを示す図である。
図9:本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(3)の1H−NMRスペクトルを示す図である。
図10:本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(3)の質量分析(マス)スペクトルを示す図である。
図11:本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(4)の1H−NMRスペクトルを示す図である。
図12:本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(4)の質量分析(マス)スペクトルを示す図である。
図13:本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(5)の1H−NMRスペクトルを示す図である。
図14:本発明により得られる硫酸化フコグルクロノマンナンオリゴ糖2−(5)の質量分析(マス)スペクトルを示す図である。
Claims (6)
- 下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ:
(I)作用:ヒバマタ目海藻由来硫酸化フコグルクロノマンナンに作用してα−D−マンノシル結合を脱離的に切断し、不飽和グルクロン酸基を持つオリゴ糖を生成させる;
(II)至適pH:本酵素の至適pHは約6.5〜8.0付近である;
(III)至適温度:本酵素の至適温度は約30℃〜40℃である;および
(IV)分子量:本酵素の分子量は、ゲルろ過法で測定した場合、約50〜60万である、
(V)フコフィラス フコイダノリティカス SI−1234株から得ることができる。 - 請求項2記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼ生産能を有するフコフィラス(Fucophilus)属細菌を培養する工程およびその培養物から該酵素を採取する工程を包含することを特徴とする請求項2記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼの製造方法。
- 褐藻類由来硫酸化多糖混合物画分に請求項2記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを作用させる工程およびフコイダン画分を採取する工程を包含することを特徴とするフコイダン画分の製造方法。
- 請求項2記載の硫酸化フコグルクロノマンナンリアーゼを含むことを特徴とする糖質工学用試薬。
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