JP3110426B2 - 新規ヘパリチナーゼ及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘパラン硫酸及び
ヘパリンを分解する新規酵素ヘパリチナーゼ及びその製
法に関する。

【０００２】ヘパリチナーゼは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンとウロン酸との二糖単位の繰り返しを基本構
造とする、複合多糖であるヘパラン硫酸（以下ＨＳと略
す）やヘパリン（以下Ｈｅｐと略す）のグルコサミニド
結合を切断する酵素で、ＨＳやＨｅｐの生体内での機能
あるいは生体成分中のこれら物質の分析研究試薬として
有用である。また、近年、抗血栓剤として開発が進めら
れている低分子ヘパリン調製時の低分子化剤として、あ
るいは体外循環装置による治療の際問題となるＨｅｐの
副作用を軽減するための素材（Ｈｅｐ除去剤）としても
有用性が注目されており、診断、治療の目的に多様な用
途が期待される。

【０００３】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】これら
用途に用いうる酵素は、糖鎖に結合する硫酸基の有無、
結合位置など、糖鎖構造の違いを認識する種々の基質特
異性の異なるヘパリチナーゼを取り揃えることが必要で
あり、また、酵素源としては安定的に大量供給出来るも
のが望ましい。かかる観点から、本発明者らは上記用途
を満足する酵素を微生物起源に求め、該酵素生産菌を検
索し、既にフラボバクテリューム属細菌からヘパリチナ
ーゼを三種見いだした（特開平２−５７１８３号）。

【０００４】微生物起源のヘパリチナーゼに関して精製
や性質まで詳細に言及した報告としては、他にフラボバ
クテリューム属細菌やバチルス属細菌などから採取した
酵素が知られ、例えば第１０回国際グリココンジュゲー
トシンポジウム要旨集〔３３０頁、１９８９年〕や特開
平２−１４２４７０号公報に開示されている。これら公
知の酵素類は上記の目的のために有用であるが、更に基
質特異性の異なる新規ヘパリチナーゼが上記の目的達成
のために求められている。

【０００５】本発明者らはかかる理由から、更に新規ヘ
パリチナーゼ生産菌を広く自然界に検索した結果、埼玉
県下の土壌から分離したバチルス・サーキュランス（Ba
cillus circulans）ＨｐＴ２９８菌株が新規ヘパリチナ
ーゼを生産する能力を持つことを見いだした。これらヘ
パリチナーゼを分画・精製し、理化学的性質や特異性の
異なる４種の新しいヘパリチナーゼを単離した。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記のような
課題を解決するためになされたもので、ＨＳ及びＨｅｐ
を分解する新規酵素、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ、ヘパリチ
ナーゼＴ−II、ヘパリチナーゼＴ−III及びヘパリチナ
ーゼＴ−IVのうちヘパリチナーゼＴ−III（以下、本酵
素と呼ぶ）に関するものであり、また本酵素の生産能を
有するバチルス属の細菌から本酵素を効率よく製造する
方法に関するものである。以下に本発明を更に詳細に説
明する。

【０００７】本酵素の生産に用いる微生物は、本酵素の
生産能を有するバチルス属細菌であればいずれの菌株で
もよいが、本発明の実施例に用いたバチルス・サーキュ
ランスＨｐＴ２９８株は本発明者らがＨｅｐ資化性菌の
検索によって埼玉県下の土壌から分離した新菌株で、そ
の菌学的性質は次の通りである。

【０００８】 （Ａ） 形態学的性質 グラム染色 ： 陰性 細胞の形状 ： 桿菌（０．４〜０．５μm×２．０〜３．６μm） 胞子形状 ： 卵円形 胞子嚢の膨潤 ： 陽性 パラ胞子クリスタル： 陰性 運動性 ： 陽性

【０００９】 （Ｂ） 生育特性 好気的生育 ： 陽性 嫌気的生育 ： 陰性 生育温度 １５℃： 陽性 ２０℃： 陽性 ３０℃： 陽性 ４０℃： 陽性 ５０℃： 陽性 ５１℃： 陽性 ５２℃： 陰性 リゾチーム（０．００１％）存在下での生育： 陽性 ＮａＣｌ存在下での生育 ２％： 陽性 ５％： 陰性 ７％： 陰性 pH６．８（栄養培地）での生育： 陽性 pH５．７（サブローデキストロース培地）での生育： 陽性 生育pH ： ５．０〜９．０、特に６．５〜７．５が最適 ＮａＣｌ及びＫＣｌの要求性： 陰性

【００１０】 （Ｃ） 生理学的性質及びその他の性質 カタラーゼ ： 陽性 Ｖ−Ｐ試験 ： 陰性 Ｖ−Ｐ培地でのpH： ６．０以下 酸生成 Ｄ−グルコースから ： 陽性 Ｄ−キシロースから ： 陽性 Ｄ−マンノースから ： 陽性 Ｌ−アラビノースから： 陽性 Ｄ−マンニトールから： 陽性 ソルビトールから ： 陰性 Ｄ−グルコースからのガス生成： 陰性 インドール生成 ： 陰性 カゼインの加水分解： 陰性 デンプンの加水分解： 陽性 チロシンの分解 ： 陰性 フェニルアラニンの脱アミノ反応： 陰性 硝酸塩の還元 ： 陽性 クエン酸の資化性 ： 陽性 プロピオン酸の資化性： 陰性 ヘパリンの資化性 ： 陽性 ヘパラン硫酸の資化性： 陽性 コンドロイチン硫酸の資化性： 陽性 ケラト硫酸の資化性： 陰性 グアニン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量： ５３．０モル％ 主たるイソプレノイドキノン： メナキノン−７（ＭＫ−７） 細胞壁ペプチドグリカン中のジアミノピメリン酸（ＤＡＰ） ： ｍｅｓｏ−ＤＡＰ

【００１１】上記の菌学的性質を有するＨｐＴ２９８株
の分類学上の位置を、バージェイズ・マニュアル・オブ
・システマテック・バクテリオロジー、第１版、第２巻
（１９８６年）を参照して検討すると、本菌は運動性を
有する好気性グラム陰性桿菌で芽胞を形成し、主たるイ
ソプレノイドキノンがメナキノン−７であり、細胞壁の
ペプチドグリカンにｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を含
むことから、バチルス属に属する菌株と判定された。更
にその他の性質をバチルス属の公知種と比較すると、本
菌株はバチルス・サーキュランス（Bacillus circulan
s）の種に属すると同定された。しかしながら、公知の
バチルス・サーキュランス菌株、例えばＩＦＯ１３６３
２、ＩＦＯ１３６３５及びＩＦＯ１３６３６は本発明の
酵素を生産せず、この点で公知の菌株と区別される新菌
株である。

【００１２】バチルス属のＨＳ及びＨｅｐの分解酵素生
産菌は、バチルス・ＳＰ（Bacillus・sp）ＢＨ１００株
が知られているが（特開平２−１４２４７０号）、嫌気
条件での生育、最高生育温度、Ｖ−Ｐ培地でのpH、デン
プンの加水分解能、ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量の項目で試験
結果が異なることから明らかなように、前記ＨｐＴ２９
８株はＢＨ１００株とは相違する。なお、前記ＨｐＴ２
９８株は工業技術院微生物工業技術研究所に微生物国際
受託番号ＢＰ−３７６５として寄託されている。

【００１３】本発明の新規なヘパリチナーゼＴ−III
は、バチルス・サーキュランスＨｐＴ２９８株あるいは
バチルス属に属する本酵素生産菌を、通常微生物の培養
に用いられる栄養培地、好ましくは酵素生産能を高める
ためにＨｅｐやＨＳあるいはこれらを含む物質を添加し
た培地で培養することにより、培地液あるいは菌体中に
生産蓄積されるので、公知の方法で精製酵素を得ること
ができる。

【００１４】更に具体的に説明すると、バチルス属に属
する本酵素生産菌を適当な栄養培地、例えば適当な炭素
源、窒素源、無機塩類とＨｅｐやＨＳあるいはこれらを
含む物質などを含む培地で菌を培養し、本酵素を培地中
か菌体中に生産蓄積させる。炭素源としては、資化でき
るものはいずれの物質も利用でき、例えば、Ｄ−グルコ
ース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アラビノ
ース、Ｄ−マンニトール、澱粉及びその加水分解物、糖
蜜、クエン酸塩、各種ペプトン類などが挙げられる。窒
素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、各種ペプトン
類、各種肉エキス類、大豆粉、脱脂大豆粉、コーンステ
ープリカー、アミノ酸溶液、アンモニウム塩など有機無
機の窒素化合物又はこれら含有物が利用できる。無機塩
としては、各種リン酸塩、マグネシウム、カリウム、ナ
トリウム、カルシウムなどの塩類が使用される。そして
更に必要に応じて菌の生育あるいは酵素生産に必要な各
種の無機物や有機物、例えばシリコーン油、ゴマ油、各
種界面活性剤などの消泡剤やビタミン類を培地に添加す
ることができる。

【００１５】本発明においては、本酵素の誘導物質とし
てＨｅｐやＨＳ又はそれらを含有する物質を添加すれば
大量に本酵素を生成させることができる。これら誘導物
質の添加は培養当初からでも培養途中に行ってもよい。
添加量としてはＨｅｐやＨＳとして通常０．２％〜２％
添加すれば良い結果が得られる。

【００１６】培養の形態は液体培養でも固体培養でもよ
いが、通常は液体培養が好適であり、工業的には深部通
気撹拌培養を行うのが有利である。本発明における培養
条件は、本酵素の生産に最も有利な条件を適当に選択、
調節して行う。培養温度は１５〜５１℃の範囲内で適宜
変更することができるが、特に好ましいのは４０〜４５
℃である。培養時間は培養条件によって異なるが１〜２
日程度であって、本酵素が最高蓄積量になる時期に培養
を終了すればよい。培地のpHは培地調製時に中性付近に
あればよく、通常の場合特に調節の必要はない。

【００１７】このようにして得た培養液の上清液及び菌
体抽出液の双方から前記４種の酵素を得ることができ
る。培養上清液については、硫酸アンモニウムを加え、
０．６飽和として析出した沈澱物を透析した後、ハイド
ロキシアパタイト、イオン交換樹脂、ゲルろ過剤、吸着
剤を用いて酵素を分画精製する。また、菌体内酵素につ
いては、菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波又は機械
的破砕法によって菌体を破壊して酵素を抽出した後、そ
の遠心上清液を培養上清液に用いたのと同様の手法によ
り精製できる。しかし、これら精製の手法により本発明
は何ら制約を受けるものではない。

【００１８】本酵素の力価は、本酵素がヘキソサミニド
結合に作用するリアーゼであり、切断部の断端のウロン
酸の４位と５位の炭素間に形成される二重結合が紫外吸
収を持つことを利用し、その増大を測定することにより
求められる。

【００１９】酵素の基質には、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ、
ヘパリチナーゼＴ−II及びヘパリチナーゼＴ−IIIにつ
いては、ウシ腎臓由来のＨＳを、ヘパリチナーゼＴ−IV
については、ブタ腸粘膜由来のＨｅｐを用いる。

【００２０】即ち、上記基質１０mg/ml水溶液２５μlに
対し、酵素液１０μl、１００mMトリス・酢酸緩衝液（p
H７．０）２５μl、２０mM塩化カルシウム２５μl及び
水１５μlを加え、４５℃で１０分間反応させる。この
液に対し、０．０６N塩酸溶液５００μlを加え反応を停
止させ、２３２nmにおける紫外吸収Ａを測定する。対照
液として同溶液のゼロ時間における紫外吸収Ａ₀を測定
する。

【００２１】酵素力価の表示は、上記反応条件で１分間
に１μmolの分解量を生じさせる力価を１単位として、
次の式から算出する。 Ａ−Ａ₀／５．５（分子吸光係数を用いたモル補正）×
６００／１０（酵素希釈補正）×１／１０（１分当りの
補正）＝Ｕ／ml（使用酵素１ml当りの単位)

【００２２】本発明の新規なヘパリチナーゼＴ−III及
び他のヘパリチナーゼ類の理化学的性質を示す。 （１）作 用 いずれの酵素もヘパリン又はヘパラン硫酸のグリコサミ
ニド結合に作用するリアーゼであり、切断部のグルクロ
ン酸又はイズロン酸の４位と５位の炭素の間に二重結合
を形成する。

【００２３】（２）基質特異性（図１−図２） ヘパリチナーゼＴ−１及びヘパリチナーゼＴ−IIはＨｅ
ｐには殆ど作用せず、主としてＨＳに作用し、分解物と
して生ずる不飽和二糖は非硫酸化物（以下「△ＤｉＨＳ
−ＯＳ」という）及び少量のウロン酸−グルコサミン−
Ｎ−硫酸（以下「△ＤｉＨＳ−ＮＳ」という）である。
ヘパリチナーゼＴ−IIIはＨｅｐには殆ど作用せず、主
としてＨＳに作用し、分解物として生ずる不飽和二糖は
△ＤｉＨＳ−ＯＳ及び△ＤｉＨＳ−ＮＳである。ヘパリ
チナーゼＴ−IVはＨｅｐ及びＨＳに作用し、分解物とし
て生ずる不飽和二糖は△ＤｉＨＳ−ＮＳ、ウロン酸−グ
ルコサミン−Ｎ，６−ジ硫酸（以下「△ＤｉＨＳ−ｄｉ
Ｎ，６Ｓ」という）、ウロン酸−２−硫酸−グルコサミ
ン−Ｎ−硫酸（以下「△ＤｉＨＳ−ｄｉＵ，ＮＳ」とい
う）及びウロン酸−２−硫酸−グルコサミン−Ｎ，６−
ジ硫酸（以下「△ＤｉＨＳ−ｔｒｉＳ」という）であ
る。

【００２４】（３）至適pH（図３） 本酵素等の至適pHを５０mMの酢酸緩衝液、トリス・酢酸
緩衝液及びトリス・塩酸緩衝液を用い、４５℃、１０分
間の反応で調べたところ、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ及びヘ
パリチナーゼＴ−IIはいずれもpH５．５〜６．５であ
り、ヘパリチナーゼＴ−IIIはpH７．０〜８．０、ヘパ
リチナーゼＴ−IVはpH７．５〜８．０である。

【００２５】（４）安定pH範囲（図４） 本酵素等の安定pH領域を１００mMの酢酸緩衝液、トリス
・酢酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液及びグリシン・水酸
化ナトリウム緩衝液を用い、３７℃、３０分間処理して
調べたところ、ヘパリチナーゼＴ−ＩはpH４．５〜９．
５、ヘパリチナーゼＴ−IIはpH５．０〜９．５、ヘパリ
チナーゼＴ−IIIはpH５．０〜９．５、ヘパリチナーゼ
Ｔ−IVはpH５．０〜１０．０の範囲でそれぞれ安定であ
る。

【００２６】（５）作用至適温度（図５） 本酵素等の至適温度を５０mMのトリス・酢酸緩衝液pH
７．０を用い、１０分間の反応で調べたところ、ヘパリ
チナーゼＴ−Ｉ及びヘパリチナーゼＴ−IIはいずれも５
５℃、ヘパリチナーゼＴ−IIIは５０℃、ヘパリチナー
ゼＴ−IVは４０℃である。

【００２７】（６）安定温度範囲（図６） 本酵素等の安定温度範囲を５０mMのトリス・酢酸緩衝液
pH７．０を用い、６０分間各温度で処理して調べたとこ
ろ、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ及びヘパリチナーゼＴ−IIは
いずれも５０℃以下、ヘパリチナーゼＴ−IIIは４５℃
以下、ヘパリチナーゼＴ−IVは４０℃以下でそれぞれ安
定である。

【００２８】（７）pH、温度などによる失活の条件（図
４、図６） 本酵素等を１００mMの酢酸緩衝液、トリス・酢酸緩衝
液、トリス・塩酸緩衝液及びグリシン・水酸化ナトリウ
ム緩衝液を用い、３７℃、３０分間処理することによ
り、調べたところ、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ、ヘパリチナ
ーゼＴ−II及びヘパリチナーゼＴ−IIIはpH４．５以
下、pH１０．０以上で、ヘパリチナーゼＴ−IVはpH４．
５以下、pH１０．５以上でそれぞれ急激に失活する。ま
た、本酵素等を５０mMのトリス・酢酸緩衝液pH７．０を
用い、６０分間各温度で処理して調べたところ、ヘパリ
チナーゼＴ−Ｉ及びヘパリチナーゼＴ−IIはそれぞれ５
５℃以上、ヘパリチナーゼＴ−IIIは５０℃以上、ヘパ
リチナーゼＴ−IVは４５℃以上でそれぞれ急激に失活す
る。

【００２９】（８）無機イオンの影響（表１） 本酵素等の活性は各種イオンにより賦活又は阻害され
る。ヘパリチナーゼＴ−ＩはＣａ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｍｇ²⁺、
Ｍｎ²⁺で賦活され、Ｚｎ²⁺で阻害される。ヘパリチナー
ゼＴ−IIはＢａ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｍｎ²⁺で
賦活され、Ｚｎ²⁺で阻害される。ヘパリチナーゼＴ−II
IはＺｎ²⁺で阻害される。ヘパリチナーゼＴ−IVはＢａ
²⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺で賦活され、Ｃｏ²⁺、Ｚｎ²⁺で阻害
される。

【００３０】

【表１】

【００３１】これら４種のヘパリチナーゼの酵素化学的
性質を公知酵素と比較検討すると、ヘパリチナーゼＴ−
Ｉ、ヘパリチナーゼＴ−II及びヘパリチナーゼＴ−III
はヘパリンには殆ど作用せずヘパラン硫酸に作用し、分
解物がフラボバクテリューム属細菌の公知酵素のものと
異なる理由から、また、ヘパリチナーゼＴ−IVは、ヘパ
リン及びヘパラン硫酸に作用するがフラボバクテリュー
ム属細菌の公知酵素とは分解物が異なること及びバチル
ス属細菌の酵素とは至適温度や温度安定性が異なる等の
理由から、上記４種のヘパリチナーゼは公知酵素とは異
なる性質を有する新規酵素と確認された。

【００３２】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限する
ものではない。 実施例 ペプトンＡ（極東製薬製）０．７５％、酵母エキス（極
東製薬製）０．５％、ヘパリンナトリウム（シンテック
ス製）０．５％、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．１％、ＭｇＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ ０．０２％、ＮａＣｌ０．１％、消泡剤アデカ
ノールＬＧ１０９（旭電化製）０．００５％（pH７．
０）の組成からなる生産培地２００００mlを３００００
ml容のジャーファーメンターに仕込み、１２０℃で２０
分間蒸気滅菌後、予めハートインヒュージョン寒天培地
（栄研化学製）で４５℃一日培養後、生産培地と同組成
（但し、ヘパリンナトリウムは０．２％、消泡剤は無添
加）の種培地に接種して、４５℃、２０時間振盪培養し
ておいたバチルス・サーキュランスＨｐＴ２９８株の培
養液６００ml（３％）を無菌的に接種し、４５℃で１８
時間通気（１v.v.m)撹拌（３００rpm)培養を行った。培
養終了後、培養液を連続遠心分離にて処理して菌体を集
め、この菌体（湿潤量１１０ｇ）のうち半量を３００ml
の０．１Mリン酸緩衝液（pH６．８）中に懸濁し、超音
波破砕器を用いて破砕した。破砕後、遠心分離により不
溶物を除去し、得られた上清液に硫酸アンモニウムを加
え０．６飽和とした。沈澱物を集め、２０mMトリス・酢
酸緩衝液pH７．０で一夜透析し、透析液をＤＥＡＥ−セ
ファセルカラム（４．２×２５cm）に負荷し、同緩衝液
で溶出させた。その溶出液をハイドロキシアパタイトカ
ラム（３．２×２４cm）に負荷し、同緩衝液中で食塩濃
度を０〜０．５Mまで直線的に上昇させることにより溶
出させた。Ｈｅｐ及びＨＳを基質として活性を測定した
ところ、通過液でヘパリチナーゼＴ−Ｉが、０．２M前
後でヘパリチナーゼＴ−IIが、０．４M前後でヘパリチ
ナーゼＴ−III及びヘパリチナーゼＴ−IVが溶出され
た。それぞれの画分を限外ろ過膜を用いて脱塩し、次い
で５０mMトリス・酢酸緩衝液に置換した。そのうちヘパ
リチナーゼＴ−ＩとヘパリチナーゼＴ−IIの両画分につ
いては、それぞれをセファクリルＳ−３００カラム
（３．８×１００cm）に負荷し、０．２M食塩を含む５
０mMトリス・酢酸緩衝液でゲルろ過を行い、それぞれの
活性画分を集め、限外ろ過膜を用いて濃縮脱塩し、酵素
液を得た。又、ヘパリチナーゼＴ−III及びヘパリチナ
ーゼＴ−IVが同時に溶出された画分については、硫酸化
セルロファインカラム（３．２×２０cm）に負荷し、５
０mMトリス・酢酸緩衝液中で食塩濃度０〜０．３Mまで
直線的に上昇させることにより溶出させた。０．１M前
後でヘパリチナーゼＴ−IIIが、０．１５M前後でヘパリ
チナーゼＴ−IVが溶出され、それぞれの画分を限外ろ過
膜を用いて濃縮脱塩し、酵素液を得た。

【００３３】各酵素の収量 ヘパリチナーゼＴ−Ｉ ： １２Ｕ ヘパリチナーゼＴ−II ： ６Ｕ ヘパリチナーゼＴ−III ： ５０Ｕ ヘパリチナーゼＴ−IV ： ６Ｕ

【００３４】

【発明の効果】本発明によれば、ヘパリン及びヘパラン
硫酸を分解する新規のヘパリチナーゼＴ−IIIを提供す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヘパリン（ブタ腸粘膜由来）及びヘパラン硫酸
（ウシ腎臓由来）に対する各酵素の分解能を示す。

【図２】酵素分解物の二糖成分をそれぞれ調べた結果を
示す。

【図３】至適pHを示す。

【図４】安定pH範囲を示す。

【図５】作用至適温度を示す。

【図６】安定温度範囲を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:09） (72)発明者 吉田 圭一 東京都東大和市立野３丁目1253番地 生 化学工業株式会社 東京研究所内

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するヘパリチナ
   ーゼＴ−III。 （Ａ） 作 用 ヘパリン及びヘパラン硫酸のグリコサミニド結合に作用
   するリアーゼであり、切断部のグルクロン酸又はイズロ
   ン酸の４位と５位の炭素の間に二重結合を形成する。 （Ｂ） 基質特異性 ヘパリンには殆ど作用せず、主としてヘパラン硫酸に作
   用し、分解物として生ずる不飽和二糖は非硫酸化物及び
   ウロン酸−グルコサミン−Ｎ−硫酸である。 （Ｃ） 至適pH ７．０−８．０ （Ｄ） 安定pH範囲 ５．０−９．５ （Ｅ） 至適温度 ５０℃ （Ｆ） 安定温度範囲 ４５℃以下（Ｇ） 阻害 酵素活性がＺｎ ²⁺ で阻害される。
2. 【請求項２】 バチルス属に属するヘパリチナーゼＴ−
   III生産能を有する細菌を培養し、その培養液又は菌体
   抽出液からヘパリチナーゼＴ−IIIを採取することを特
   徴とする、請求項１記載のヘパリチナーゼＴ−IIIの製
   造法。