JP2726274B2 - 新規ケラタン硫酸分解酵素並びにそれを生産する微生物及び方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、新規なケラタン硫酸分解酵素並びにそれを
生産する微生物及び方法に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題） 従来微生物由来のケラタン硫酸（以下「KS」という）
を分解する酵素（以下「KSase」という）としてはエジ
ェリヒア・フロインディ、フラボバクテリウム・ケラト
リティカス、及びバクテロイド・フラキリス等の産生す
るエンド−β−ガラクトシダーゼ類とシュードモナス属
の産生するケラタナーゼがあり、これらの酵素は、いず
れもKS糖鎖骨格中のβ１−４ガラクトシド結合に作用す
ることが知られている。

KSには動物の角膜中に存在するKSIと軟骨などの組織
に含まれているKSII及びケラタンポリ硫酸があり、いず
れもガラクトースとＮ−アセチルグルコサミンを構成単
位２糖とするコポリマーであるが、KSIがＮ−アセチル
グルコサミンの６位の炭素の水酸基が硫酸化されている
場合が多いのに対し、KSII及びケラタンポリ硫酸はＮ−
アセチルグルコサミンの６位及びガラクトースの６位の
両方の水酸基が硫酸化された２糖ジ硫酸の成分の占める
割合が高い。

KSはムコ多糖代謝異常症で生体内に蓄積したり、ある
いは加齢変化により軟骨中の含量が増加することが知ら
れているが、その糖鎖構造についてはまだ十分解明され
ておらず構造解析に役立つ酵素の開発が望まれている。

従来のKSase類はいずれもガラクトシド結合に作用す
るタイプであるが、ガラクトースが硫酸化されている場
合には分解されないため実際にはほとんどのKSIIタイプ
の骨格（２糖ジ硫酸の成分の占める割合が高い骨格）を
有する糖鎖を分解できなかった。

本発明者らはKSIIタイプの骨格にも作用するKSaseを
得るため広く土壌菌を検索し、KSII資化性菌を捜した結
果、埼玉県下の土壌よりKSII分解能を有する酵素を産生
するバチルスsp.Ks36株（以下単に「Ks36株」ともい
う）を単離することに成功した。

この菌の産生するKSaseは分子量約20万で、従来のエ
ンド−β−ガラクトシダーゼ類がいずれも３万前後であ
るのに比べ、はるかに大きく、また、KSを分解した後に
生じる２糖の還元末端糖がＮ−アセチルグルコサミンで
あることから、Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を分解
すること、更にこれらの２糖中にはモノ硫酸、ジ硫酸が
存在することから、従来の酵素とは全く異なる性質を有
する極めて特徴的な酵素であることが確認され、本発明
を完成するに至った。

［発明の構成］ （課題を解決するための手段及び作用） 本発明は、ケラタン硫酸Ｉ、ケラタン硫酸II及びケラ
タンポリ硫酸の分解能を有する新規なケラタン硫酸分解
酵素並びにそれを生産する微生物及びケラタン硫酸分解
酵素の製造方法に関するものである。

本発明の新規なKSase生産菌のKs36株は、次のような
菌学的性質を有する。

A.形態 （１）肉汁寒天培地に生育し、菌の形態は桿状であり、
0.5〜0.9×1.6×2.5μの大きさで単独ないしは２連であ
るが、まれに数連をなす。

（２）細胞の多形性はない （３）運動性あり （４）グラム染色性は陰性 （５）胞子の形状は卵円形 （６）胞子嚢の膨潤は陽性 （７）パラ胞子クリスタルは陰性 B.生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 周辺は淡いゾーゲ色で中心部が明るい灰黄色（JIS Z
8102“色名”準拠、工業用色名帳による判定）の半透
明、円形、レンズ状のコロニーを生ずる。

周縁は不規則な波形状で、拡散性色素は生産しない。

（２）肉汁寒天斜面培養 生育はあまり良くなく、接種線にそって均一に生育す
る。生育部分は淡いゾーゲ色を呈し、半透明である。

（３）肉汁液体培養 振盪培養でわずかに生育するが、静置培養ではほとん
ど生育が認められない。

（４）肉汁ゼラチン平板培養 生育はあまり良くなく、接種線にそって均一に生育す
る。生育部分は淡いゾーゲ色を呈する。ゼラチンを液化
しない。

（５）リトマス・ミルク リトマスが桃色に変化する。（酸の生成） C.生理学的性質及びその他の性質 （１）インドールの生成：陰性 （２）硫化水素の生成：陰性 （３）デンプンの加水分解：陽性 （４）クエン酸の利用：陰性 （５）色素の生成 キングＡ培地、キングＢ培地での生育は悪く、色素を
生成しない。

（６）ウレアーゼ：陽性 （７）オキシダーゼ：陽性 （８）カタラーゼ：陽性 （９）酸素に対する態度：好気性 （10）生育pH:5〜9.5、特に７〜８が最適 （11）生育温度:15〜42℃、特に37〜40℃が最適 （12）炭素源の利用： 酵母エキスを添加したヒューレイフソンの培地を用い
て炭素源の利用を調べた。酸の生成は以下の通り（＋；
陽性、−：陰性） Ｌ−アラビノース − セロビオース ＋ Ｄ−キシロース − ラフィノース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−ソルビトール − Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−マンニトール − Ｄ−フラクトース ＋ イノシトール − Ｄ−ガラクトース ＋ グリセリン ＋ 麦芽糖（マルトース） ＋ サリシン ＋ ショ糖（シュクロース） ＋ エタノール − 乳糖（ラクトース） ＋ 可溶性デンプン ＋ トレハロース ＋ （13）エスクリンの分解：陽性 （14）β−ガラクトシダーゼ産生：陽性 （15）マロン酸の利用：陰性 （16）アルギニンの分解：陰性 （17）リジンの脱炭酸反応：陰性 （18）オルニチンの脱炭酸反応：陰性 （19）デオキシリボヌクレアーゼ産生：陰性 （20）アセトアミドの分解：陰性 （21）ツイーン80の分解：陽性 （22）グルコン酸の酸化：陰性 上記の菌学的性質を有するKs36株の分類学上の位置
を、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマテック
・バクテリオロジー、第１版、第２巻（1986年）を参照
して検討すると、本菌は運動性を有する好気性グラム陰
性桿菌で芽胞を形成することから、バチルス属に属する
菌株と判定された。

なお、本菌株Ks36株は工業技術院微生物工業技術研究
所に微生物受託番号第10204号（以下「微工研菌寄第102
04号」という）として寄託されている。

本発明の新規なケラタン硫酸分解酵素は、Ks36株のよ
うなバチルス属に属するケラタン硫酸分解酵素生産菌を
通常、微生物の培養に用いられる栄養培地、好ましくは
酵素産生能を高めるためにケラタン硫酸又はそれを含む
物質を添加した培地で培養することにより培地中あるい
は菌体中に生産蓄積されるので、公知の方法で抽出、精
製することによって精製酵素を得ることができる。

更に具体的に説明すると、Ks36株のようなバチルス属
に属するケラタン硫酸分解酵素生産菌を適当な栄養培
地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類と酵素生産
能を高めるためにケラタン硫酸又はそれを含む物質など
の誘導物質を含む培地で菌を培養し、該酵素を培地中あ
るいは菌体中に生産蓄積せしめるのであるが、炭素源と
してはグルコース、ガラクトース、マンノース、フラク
トース、マルトース、シュクロース、ラクトース、セロ
ビオース、ラフィノース、デンプン及びその加水分解
物、糖蜜、グリセリンなどが利用できる。窒素源として
は、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、大
豆粉、脱脂大豆粉、コーンスティープリカー、尿素、ア
ンモニウム塩など有機、無機の窒素化合物又はこれを含
有するものが用いられる。無機塩としては、各種リン酸
塩、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム
などの塩類が使用される。そして、更に必要に応じて菌
の生育あるいは酵素生産に必要な各種の無機物や有機
物、例えばシリコーン油、ゴマ油、各種界面活性剤など
の消泡剤やビタミン類を培地に添加することができる。

本発明においては、特に酵素の誘導物質としてケラタ
ン硫酸又はそれを含有する物質を添加すれば大量の該酵
素を生成せしめることができる。これらの添加物の添加
は培養当初からでも培養途中に行なってもよい。添加量
としてはケラタン硫酸として通常0.2％〜２％添加すれ
ば良い結果が得られる。

培養の形態は液体培養でも固体培養でもよいが、通常
は液体培養が好適であり、工業的には深部通気攪拌培養
を行なうのが有利である。

本発明における培養条件は使用する菌株、培地組成等
により多少異なるが、該酵素の生産に最も有利な条件を
適当に選択、調節して行なう。培養温度は15〜42℃の範
囲内で適宜変更することができるが、特に好ましいのは
37〜40℃である。培養時間は条件によって異なるが、１
〜２日程度であって該酵素が最高蓄積量に達する時期に
培養を終了すればよい。培地のpHは培地調製時に中性付
近にあればよく、通常の場合、特に調節の必要はない。

得られた菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波又は機
械的磨砕法によって菌体を破壊して酵素を抽出した後、
その遠心上清液を集め、硫安塩析により粗分画を得る。
粗酵素液は脱塩後、陰イオン交換クロマトグラフィー、
ハイドロフォビッククロマトグラフィー及びゲルクロマ
トグラフィーなどの方法を用いることにより精製するこ
とができる。

菌体外液（培養液等）の酵素についても硫安塩析後、
同様の方法により精製することができる。

本酵素の活性は、粗酵素段階においては、ゲルクロマ
ト用のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーを用
い、基質KSの低分子化の程度を示差屈折検出器を用いて
確認できる。精製の進んだ段階においては、KS分解によ
って生じる還元端の増加をパークージョンソン法［J.Bi
ol.Chem.,181,149（1949）］により測定することができ
る。

即ち、ケラタンポリ硫酸（サメ軟骨）基質（10mg/m
l）10μｌに対し、酵素液10μ１、10mM酢酸緩衝液pH6.2
180μｌを加え、37℃で15分間反応させる。これにパ
ークージョンソン法の試薬カルボネート−シアナイド液
200μｌを加え、反応を停止し以後フェリシアナイド液2
00μｌ、鉄明バン液1mlを加えて混合し、パークージョ
ンソン法に従って690nmの吸光度を測定する。この吸光
度をＡとし、同反応液のゼロ時間における吸光度をAo、
更に標準試薬として反応液の代わりにガラクトース10μ
g/ml溶液を200μｌ用いて同様に処理した場の吸光度をA
stとする。上記条件下で１分間に１μモルのガラクトー
ス換算の還元力を生成せしめる酵素量を１単位とすると 本発明の新規のケラタナーゼ（KSaseII）の理化学的
性質を示す。

（１）作用 本酵素はケラタン硫酸に作用し、そのＮ−アセチルグ
ルコサミニド結合を加水分解する。

（２）基質特異性 本酵素は、KSI、KSII及びケラタンポリ硫酸に作用
し、分解産物として２糖モノ硫酸及び２糖ジ硫酸を生ず
る（図１）。本酵素は脱硫酸化したケラタンには作用せ
ず、作用部位の糖鎖には硫酸基が必須である。

（３）至適pH及び安定pH範囲 本酵素の至適pHは、10mM酢酸緩衝液及び10mMトリス−
酢酸緩衝液中、37℃で測定した結果、pH5.5〜6.0である
（図２）。

本酵素を10mMトリス−酢酸緩衝液中で37℃、１時間放
置した場、pH7〜８付近で安定である（図３）。

（４）作用至適温度 本酵素を24〜60℃の温度範囲、10mM酢酸緩衝液pH6.2
で10分間反応後の活性を測定した結果、至適温度は約30
〜40℃であった（図４）。

（５）安定温度範囲 本酵素を24〜60℃の温度範囲、10mM酢酸緩衝液pH6.2
で30分間放置した後、その活性を測定した結果、35℃以
上では活性は1/2以下になった（図５）。

（６）分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（５％濃度）
で本酵素を還元下及び非還元下で泳動した場合、いずれ
も同じ移動度の単一バンドを示し、標準物質A.ミオシン
（分子量200,000）、B.フォスフォリラーゼＢ（分子量9
7,400）、C.牛血清アルブミン（分子量68,000）、D.卵
白アルブミン（分子量43,000）の検量曲線から分子量は
200,000±10,000と算出された（図６）。

（７）種々薬剤の影響 本酵素を各種薬剤1mM存在下で活性を測定した結果、Z
n²⁺、Mn²⁺、EDTA、PCMBで阻害され、Mg²⁺でやや賦活さ
れた（表）。

（発明の実施例） 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、
これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。

実施例１ ペプトン（極東製）0.5％、酵母エキス（極東製）0.2
％、サメ軟骨より調製したケラタンポリ硫酸0.2％、K₂H
PO₄0.1％、MgSO₄・7H₂O0.2％、NaCl 0.1％（pH7.0）の
組成からなる培地500mlを2l容肩付フラスコに仕込み、1
20℃で20分間蒸気滅菌後、Ks36株（微工研菌寄第10204
号）を数白金耳無菌的に植菌し、30℃で24時間振盪培養
した（125往復／分、振幅7cm）。ケラタン硫酸分解の酵
素力価は培養液1ml当り0.8ミリ単位であった。

実施例２ ペプトン（極東製）0.5％、酵母エキス（極東製）0.2
％、サメ軟骨より調製したケラタンポリ硫酸0.5％、K₂H
PO₄0.1％、MgSO₄・7H₂O0.02％、NaCl 0.1％、消泡剤ア
デカノールLG109（旭電化製）0.005％（pH7.0）の組成
からなる培地20lを30l客のジャーファーメンターに仕込
み、120℃で20分間蒸気滅菌後、予め実施例１に示した
培地で30℃で20時間振盪培養しておいたKs36株（微工研
菌寄第10204号）１（５％）を無菌的に植菌し、30℃
で24時間通気（1V.V.m）攪拌（200rpm）培養した。培養
液20lを連続遠心分離機にて処理して菌体を集め、湿重
量で120gの菌体を得た。この菌体中に含まれるケラタン
硫酸分解酵素の力価は湿重量1g当り0.8単位であった。

実施例３ 培養液10lに硫酸アンモニウムを0.6飽和になるように
加え、生じた沈殿を遠心分離し、50mMトリス塩酸緩衝液
pH7.4に透析した。

この液を予め同緩衝液で平衡化したDEAE−セルロファ
イン（生化学工業製）カラム（2.4×27cm）に通して酵
素を吸着させ、食塩濃度を直線的に０から0.75Mに上昇
させ、酵素を溶出させた。活性画分を5mlまで濃縮しセ
ファクリルーＳ−300（ファルマシア製、スエーデン）
のカラム（3.5×110cm）に通し、0.5M食塩、0.01Mトリ
ス塩酸緩衝液P7.4の溶媒を用いてゲルろ過を行なった。
この活性画分を集め、限外ろ過膜（イマージブル、ミリ
ポア）を用いて脱塩濃縮し、濃縮酵素液2mlを得た。こ
のものの比活性は0.36単位/mg（ウシ血清アルブミン換
算重量）であり、培養液からの回収率は46％、比活性は
1060倍上昇した。

実施例４ 実施例２で得られた菌体30gを50mMトリス塩酸緩衝液p
H7.4、120mlに懸濁し、冷却しながら磨砕機にかけ菌体
を破壊した。磨砕後、不溶物を遠心（１万回転、30分）
除去し、上清に硫酸アンモニウムを加え、55％飽和とし
た。生じた沈殿を遠心分離して集め、50mMトリス塩酸緩
衝液pH7.4に対し、透析脱塩し、この内液を実施例３に
示した方法と同様の方法でDEAE−セルロファイン、セフ
ァクリルＳ−300を用いてカラムクロマトグラフィーを
行なった後、得られた活性画分20mlに対し食塩を加え４
モル濃度とした。この液を予め4M食塩、5mMリン酸緩衝
液pH7.0で平衡化したフェニル−セファロースCL−4B
（1.6×15cm）に負荷し食塩濃度を4Mから0Mまで下げて
酵素を溶出した。得られた酵素は5.2単位、比活性は牛
血清アルブミン重量換算で3.1単位/mg、硫安塩析後から
の回収率は14.8％であった。

［発明の効果］ 本発明によれば、新規ケラタン硫酸分解酵素を提供す
ることができる、

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明の酵素の基質特異性を示す図であり、図
２は、本発明の酵素の至適pHを示す図であり、図３は、
本発明の酵素の安定pH範囲を示す図であり、図４は、本
発明の酵素の至適温度を示す図であり、図５は、本発明
の酵素の安定温度範囲を示す図であり、図６は、本発明
の酵素の分子量を示す図である。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の理化学的性質を有することを特徴と
   する新規ケラタン硫酸分解酵素。 作用 ケラタン硫酸に作用し、そのＮ−アセチルグル
   コサミニド結合を加水分解する。 基質特異性 ケラタン硫酸Ｉ、ケラタン硫酸II及びケ
   ラタンポリ硫酸に作用し、分解産物として２糖モノ硫酸
   及び２糖ジ硫酸を生じる。脱硫酸化したケラタンには作
   用せず、作用部位の糖鎖には硫酸基が必須である。 至適pH（10mM酢酸緩衝液及び10mMトリス−酢酸緩衝
   液、37℃） 5.5〜6.0 安定pH範囲（10mMトリス−酢酸緩衝液、37℃、１時間
   放置） ７〜８ 至適温度（10mM酢酸緩衝液、pH6.2、10分反応） 30〜40℃ 安定温度範囲（10mM酢酸緩衝液、pH6.2、30分放置） 30℃以下 分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法） 200,000±10,000
2. 【請求項２】ケラタン硫酸Ｉ、ケラタン硫酸II及びケラ
   タンポリ硫酸の分解能を有するケラタン硫酸分解酵素生
   産菌であるバチルスsp.Ks36株（微工研菌寄第10204
   号）。
3. 【請求項３】バチルス属に属する、ケラタン硫酸Ｉ、ケ
   ラタン硫酸II及びケラタンポリ硫酸の分解能を有するケ
   ラタン硫酸分解酵素生産菌を培養し、その培養液又は菌
   体内抽出液から請求項１記載のケラタン硫酸分解酵素を
   分離、採取することを特徴とするケラタン硫酸分解酵素
   の製造法。