JPS6291182A - クレアチン・アミジノ−ロラ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、アルカリ土類金属に属し、菌体外クレアチ
ン・アミジノヒドロラーゼ生産能を有する菌株を培養し
てクレアチン・アミジノヒドロラーゼを製造する方法に
関するものである。

〔従来の技術〕

血清りし・アチン濃度は原発性筋疾患、筋炎、筋萎縮、
甲状腺機能亢進症などで増加し４、タレアチン尿をきた
す。従って、クレアチンの定量を行なうことは、臨床医
学診断上極めて重要である。そこで、クレアチン・アミ
ジノヒドロラーゼが、クレアチンを特異的に分解する性
質を用いクレアチンの酵素定量法に利用している。

クレアチン・アミジノヒドロラーゼ（ＥＣ３・５・３・
３）は公知の酵素であり、この酵素はクレアチンに作用
して尿素とサルコシン（Ｓａｒｃｏｓｉｎｅ）に加水分
解する酵素であり、その反応式は次の通りである。

クレアチン　　・　　７ミシノヒトロラーセクレアチン
＋Ｈ２０−−ｍ−→　　尿素十サルコシン従来、クレア
チン・アミジノヒドロラーゼは特開昭４７−４３２８１
号公報及び特開昭５５−３４０２９号公報に示唆されて
いるようにアルカリ土類金属に属する細菌に存在するこ
とが知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、これらのアルカリ土類金属より得られるクレア
チン・アミジノヒドロラーゼはいずれも菌体内酵素であ
るため、この酵素を得るためには培養菌体を集菌して、
これを磨砕、超音波処理または溶菌処理して、酵素を分
離、抽出する操作を必要とするため、酵素精製操作が著
しく複雑化し、効率よく酵素を得ることができないとい
う問題点があった。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、この発明は培養菌体より抽出操作過程を経ずと
も、一段操作で効率よく、クレアチン・アミジノヒドロ
ラーゼを得ることを目的として以下のような手段を講じ
た。

すなわちこの発明は、アルカリ土類金属に属し、菌体外
クレアチン・アミジノヒドロラーゼ生産能を有する菌株
を培養し、培養液よりクレアチン・アミジノヒドロラー
ゼを分離、回収するものである。

この発明に使用される菌株としては、アルカリ土類金属
に属し、菌体外クレアチン・アミジノヒドロラーゼ生産
能を有する菌株であれば、いかなる菌株でもよい。

そして、アルカリ土類金属に属する具体例としては、ア
ルカリ土類金属菌株（微工研菌奇第５０７１号）等が挙
げられる。

以下、アルカリ土類金属菌株（微工研菌奇第５０７１号
）の菌学的性質について述べる。

ａ）形態　　幅０．５〜１．Ｏｐ、長さ１　、５〜３　
、５　ｐで単桿菌または２連閑のように観察さ れる。

運動性〜１本の鞭毛を有し、ｊ■動性あり。

グラム染色性：陰性。

抗酸性：陰性。

夾　膜：なし。

ｂ）各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養 ２８℃、４８時間の培養で直径３〜５龍の隆起した円形
コロニー、表面はなめらかでつやのある周縁円形状の集
落を形成する。

■肉汁寒天斜面培養 ２８℃、４８時間の培養で拡幅状に生育する。コロニー
の色は半透明の乳黄土色で、表面はつやがあり、拡散性
色素を生成しない。

■肉汁液体培養 静置培養では殆ど生育が認められない。

■肉汁寒天穿刺培養 ２８°Ｃ１４８時間の培養で表面及び穿刺穴に生育する
。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養 ２０°Ｃ１１〜１４日間の培養で表面ないし上層部に生
育するが、液化は認められない。

■リドマスミルク 培養とともにゆっくりアルカリ性となり、リドマスをわ
ずかに還元するが、液化、凝固はしない。

■ハレイショ寒天培地 ２８℃、２４時間の培養で拡幅状によく生育する。コロ
ニーの色は半透明の乳白色あるいは灰白色で表面はなめ
らかでつやがある。

Ｃ）生理学的性質 ■硝酸塩の還元：なし。

■脱窒反応（駒形らの方法）：陰性。

■ＭＲテスト：陰性。

■ｖｐテスト：陰性。

■インドールの生成：生成せず。

■硫化水素の生成：生成せず。

■デンプンの加水分解：分解せず。

■クエン酸の利用：利用する。

（にｏｓｅｒ　Ｃ１ｔｒａｔｅ培地及びＣｈｒｉｓｔｅ
ｎｓｅｎ培地）■無機窒素源の利用（飯塚・駒形の方法
）硝酸塩：利用する。

アンモニウム塩：利用する。

［相］色素の生成：ビオシアニン系色素を生成せず。

■ウレアーゼ：生成する。

０オキシダーゼ：生成する。

０カタラーゼ：生成する。

■生育の範囲：　ｐ１１６．５〜９．５、主通ｐｉｓ、
ｏ附近、温度２０〜３０°Ｃ１至適温度２８°Ｃ１（培
地は肉汁寒天培地使用）。

［相］酸素に対する態度：好気性。

＠ｔｏ−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ試験）：
酸化的にも能酵的にも糖を分解しない。

Ｏ糖からの酸及びガスの発生：Ｌ−７ラビノ−ス、Ｄ−
キシロース、Ｄ−グル コース、Ｄ−マンノース、Ｄ− フラクトース、Ｄ−ガラクト− ス、麦芽糖、ショ糖、乳糖、ト レハロース、Ｄ−ソルビ・７ト、 Ｄ−マンニット、イノシフト、 グリセリン、デンプンのいずれ の糖からも酸及びガスの発生は 認められない。

ｄ）その他の性質 ■ガゼインのペプトン化：生成せず。

■タマゴの消化：消化せず。

■アルギニンの加水分解二分解せず。

■フェニルピルビン酸テスト：陰性。

■インドフェニル酸テスト：陰性。

■アセトイン産生：産生せず。

■グルクロン酸の酸化：酸化せず。

■リジンの脱炭酸の反応：陰性（シモンズ・クエン酸培
地及びＬＩＭ培地）。

■β−ガラクトシダーゼ：生成する。

［相］炭素化合物の利用：Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシ
ロース、Ｄ−グルコース、 Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクト ース、Ｄ−ガラクトース、乳糖、 麦芽糖、ショ糖、トレハロース、 ラフィノース、Ｄ−ソルビット、 イノジット、グリセリン、サリ シン、α−メチルグルコジッド、 イヌリン、デキストリン、デン プン、セルロース、Ｌ−ソルボ ース、セロビオース、グリコゲ ン、エリスリオール、ピルビン 酸、乳酸、マロン酸、シュウ酸、 ｄ−酒石酸、醋酸及びプロピオ ン酸を利用しない。

ラムノース、コハク酸、クエン 酸、酢酸及びフェニルアラニン をそれぞれ資性化できる。

この発明に用いられた菌株の諸性質をＢｅｒ１１ｅｙ’
　ｓＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第１巻（１９８３年）の分類と対
比すると本菌株は、ダラム陰性、好気性の桿菌で１本の
鞭毛を有し、運動性があること、カタラーゼ陽性、オキ
シダーゼ陽性、糖から酸及びガスの生成が認められない
ことより、アルカリ土類金属に属すると判定される。

上述の菌株を用いて、以下クレアチン・アミジノヒドロ
ラーゼの製造方法について述べる。

この発明に用いられるアルカリ土類金属菌株は、固型培
地を用いて培養することができるが、液体培地を用い、
振盪培養または通気撹拌深部培養を行なうのが望ましい
。

培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものが広く使用される。窒素源としては、利用可能な窒
素源であればよく、大豆粉、コーンステイープリカー、
種々の肉エキス、ペプトン、酵母エキスなどが使用され
る。炭素源としては、利用可能な炭素化合物であればよ
り、Ｉｌｉ類、可溶性でんぷん、グリセリンなどが使用
される。その他無機塩として、硝酸ナトリウム、塩化ナ
トリウム、リン酸−カリウム、リン酸二カリウム、塩化
カリウム、硫酸第一鉄、硫酸銅、塩化マンガン、硫酸亜
鉛などが必要に応じて使用される。また培地中にクレア
チンを添加すれば、培養液中へのクレアチン・アミジノ
ヒドロラーゼの蓄積が増加する。その添加濃度は０．５
〜１．０％程度が好ましい。

培養温度は菌が発育し、菌体外にクレアチン・アミジノ
ヒドロラーゼを生産する温度範囲内ならばいかなる温度
でもよく、好ましくは約２８℃である。培養時間は条件
によって多少異なるが、通常２〜５日間である。そして
、培養液中のクレアチン・アミジノヒドロラーゼ生産量
が、最高に達する時期を見計らって適当な時期に培養を
終了すればよい。

培養液よりクレアチン・アミジノヒドロラーゼを分離す
るには、まずヲｒ過、遠心分離等により、菌体その他の
固形分を除去し、得られた粗製クレアチン・アミジノヒ
ドロラーゼ含有液をさらに公知の蛋白質、酵素などの単
離、精製手段を用いることにより、精製されたクレアチ
ン・アミジノヒドロラーゼを得ることができる。たとえ
ば、粗製のクレアチン・アミジノヒドロラーゼに、必要
に応じて硫酸ストレプトマイシン水溶液、硫酸プロタミ
ン水溶液を加えて核酸などを除去し、これに硫酸アンモ
ニウムなどを加えて塩析させるか、アセトン・エタノー
ルなどの有機溶媒を加えて、分別沈殿させ、沈殿物を集
める。さらにこの沈殿物を精製するには、たとえば沈殿
物をトリス−塩酸緩衝液などの溶媒に溶解し、ジエチル
アミノエチル−セルロースイオン交換体、ジエチルアミ
ノエチル−デキストランイオン交換体、ジエチルアミノ
エチル−アガロースイオン交換体などの陰イオン交換体
を用いる吸着溶出法、デキストランゲル、ポリアクリル
アミドゲルなどのゲル″／′濾過剤によるクロマトグラ
フ法、ハイドロキシアパタイトによる吸着溶出法及びポ
リアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法を行なえば
よい。

これらの手段は、適宜選択、組合わせて行ない、次いで
真空凍結乾燥などの手段により、乾燥して精製されたク
レアチン・アミジノヒドロラーゼ粉末を得る。

次に、この発明で得られたクレアチン・アミジノヒドロ
ラーゼの理化学的性質について述べる。

０作用 この酵素はクレアチンを加水分解して、尿素とサルコシ
ンにする作用を有し、クレアチンに、対するＫｍ　（ミ
カエリス（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ）定数〕値は、４．８３
Ｘ１０−’Ｍ　（３７°ＣＰＨ７，８）である。

■力価測定法 クレアチン０．１Ｍを含有した５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，８）　１．０　ｍｌ！、適当に希釈した醇素液
０．１ｍｊ２加え、３７℃、で１ｏ分間反応させたのち
、これにＰ−ジメチルアミノヘンズアルデビド溶液（２
，０ｇのＰ−ジメチルアミノベンズアルデビドを１００
ｍＡジメチルスルボキシドに溶解させたのち、濃塩酸１
５ｍｆ加えたもの）２．０ｍｊ２添加し、２５℃で２０
分間放置する。

酵素反応０分の時の試料を対照として分光光度計により
４３５ｎｍにて吸光度（△ＯＤ）を測定し、次の通り計
算する。

酵素液１　ｍｅ中の酵素活性単位（Ｕ／ｍｊｌり＝ΔＯ
Ｄ　ｘ９．６６ｘ酵素希釈倍率 ここで、クレアチン・アミジノヒドロラーゼ酵素活性は
上記の反応条件下で１分間に１μｍａｉｌ尿素を生成す
る酵素量を１単位（ＩＵ）とする。

■至適ｐｎ 至適ｐｉ（は７．０〜８．０付近である。

使用した緩衝液はｐｏ６．ｏ〜８．０＝リン酸緩衝液、
ｐｌ（’７．０〜９．０：　＋−リス−塩酸緩衝液、ｐ
Ｈ８，５〜９．５＝炭酸緩衝液である。

■ｐＨ安定性 各ｐＨの緩衝液に酵素を加え、５℃にて４８時間放置し
たのち、その残存活性を測定した。

使用した緩衝液は前記のものと同様である。

その結果、クレアチン・アミジノヒドロラーゼはｐＨ７
、Ｏ〜８．５付近で安定であると認められる。

■熱安定性 クレアチン・アミジノヒドロラーゼの５０ｍＭリン酸緩
衝液溶液（ｐＨ７，５）　　１．０ｍｊ！を各温度にて
３０分間処理したのち、酵素の残存活性を測定した。そ
の結果、クレアチン・アミジノヒドロラーゼは４０℃付
近以下で安定であると認められる。

■至適温度 クレアチン・アミジノヒドロラーゼの反応の至適温度は
４０°Ｃ付近であると認められる。

■分子量 約５０，０００　（ゲルン濾過法により測定）〔作用〕 この発明で用いる菌は、菌体外酵素生産能を有するので
、酵素は培養液中に蓄積する。

したがって、菌体内酵素生産菌の場合のように、培養液
より菌体を分離し、これを磨砕、超音波処理または自己
消化等により酵素を分離、抽出する必要がない。

〔実施例〕

以下、この発明を実施例に基づきさらに具体的に説明す
る。

実施例■ 可溶性でんぷん１．０％（Ｗ／Ｖ）　、グルコース１．
０％（Ｗ／Ｖ）　、肉エキス０．７５％（ｗ／ｖ）、ポ
リペプトン０．７５％（ｗ／ｖ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
ＯＯ，１％（ｗ／ｖ）、微量金属溶液（ＣＬＩＳＯ４・
５ＨｚＯ１０，０ｇ　、　ＭｎＣ１ｚ　　・４ＨｚＯ１
０，０ｇ　、　Ｚｎ５Ｏ＝　　Ｈ７Ｈ２０１００，ｏｇ
を９０Ｏｎ＋１の蒸留水に溶かし、液が透明になるまで
塩酸を加え、蒸留水で１１とする）０．１％（ｗ／ｖ）
よりなる培地１１０　ｍ　ｌ　（ｐ）１７．４）を、５
００　ｍｌ容の坂ロフラスコに加え、１２０℃で２０分
高圧滅菌後、アルカリ土類金属菌株（微工研菌奇第５０
７１号）を接種し、２８℃で２日間振盪培養して種菌を
得た。次いでこの種菌をグルコース２゜０％（ｗ／ｖ）
、大豆粉２．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン０．２％（
Ｗ／Ｖ）　、クレアチン０．５％（ｗ　／　ｖ　）　、
ＮａＮＯ３０−２％（ｗ／　ｖ）　、ＫＨｚＰＯ，、０
゜１％（ｗ　／　ｖ　）　、ＭｇＳＯ４・７　Ｈｚｏ　
０．０５％（ｗ／　ｖ）　、ＫＣＩ　Ｏ，０５％（ｗ／
ｖ）　、Ｆｅ５Ｏａ　　・７１１ｚＯＯ，０００１％（
ｗ　／　ｖ　）よりなる培地（ｐＨ８，０）　５　ｐの
入った滅菌後の１０！容のジャーファメンターに移植し
、２８℃で２日間、回転数４０Ｏｒｐｍ、ｉｉ１気ｆｆ
１Ｏ，８Ｅｌｍｉｎの条件下通気攪拌培養した。

次に得られた培養液を回転数３，５０叶ρｍで２０分間
冷却遠心し、菌株その他の固形分を除き、粗製のクレア
チン・アミジノヒドロラーゼ含有液４０５０ｍｆを得た
。（クレアチン・アミジノヒドロラーゼ酵素活性３８８
８　Ｕ　） この粗製酵素液に硫酸アンモニウム２０９０ｇを添加し
て沈殿物を回収した。この沈殿物を２０ｍＭ　トリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）　　５００ｍＪに溶解して、
同一緩衝液に対して一晩透析後、この？８液２０ｍ！を
２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ１７，８）で平衡
化したＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン社製）を充填
したカラム（径３ｃｍＸ２１ｃｍ）にチャージし、０．
１５Ｍ　ＮａＣ１含有の同一緩衝液にて洗浄後、ＮａＣ
ｌ　０．１５Ｍ〜０．７Ｍの濃度勾配で溶出し、活性画
分を回収し、次にこの活性画分を限外９濾過器（東洋科
学産業社製）を用いて濃縮した後、２０ｍＭ　）リス−
塩酸緩衝液（ｐ１１７．８）に対してｌ＠透析した後、
この溶液を凍結乾燥してクレアチン・アミジノヒドロラ
ーゼの粉末（全活性１２３０　Ｕ　、蛋白質量３５０ｍ
ｇ　、比活性３．５Ｕ／　ｍｇ回収率３２．２％）を得
た。

〔発明の効果〕

以上に述べた如く、この発明によれば培養菌体より抽出
操作過程を経ずとも、一段操作で効率よ（、クレアチン
・アミジノヒドロラーゼを得ることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、アルカリゲネス属に属し、菌体外クレアチン・アミ
   ジノヒドロラーゼ生産能を有する菌株を培養し、培養液
   よりクレアチン・アミジノヒドロラーゼを分離、回収す
   ることを特徴とするクレアチン・アミジノヒドロラーゼ
   の製造法。