JPS6342686A - プロテア−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、プロテアーゼの製造法に関し、さらに詳細に
は、細菌を使用したプロテアーゼの製造法に係わる。

プロテアーゼは、医薬品だけではなく、食品加工に、ま
た、化粧品および洗剤としても使用されている非常に重
要な酵素である。

〔従来技術、発明が解決しようとする問題点〕従来、セ
リンプロテアーゼ、システィンプロテアーゼ、金属プロ
テアーゼおよびアスパルティ。

クプロテアーゼならびに酸性プロテアーゼ、中性プロテ
アーゼおよびアルカリ性プロテアーゼなどの多くのプロ
テアーゼが知られている。これらのプロテアーゼは動物
、植物または微生物に由来するものが一般であるが、工
業的生産の立場からはプロテアーゼを生産し、このプロ
テアーゼを菌体外に排出する微生物を利用することが最
も好ましい。このようにプロテアーゼを生産する微生物
はそのほとんどがダラム陽性菌であり、ダラム陰性菌は
未だ知られていない。

本発明者らは、プロテアーゼを生産し、このプロテアー
ゼを菌体外に排出するダラム陰性菌の取得を目的とした
。

〔問題を解決するための手段、作用〕

本発明者らは、プロテアーゼを生産し、このプロテアー
ゼを菌体外に排出するダラム陰性細菌を見出すべく鋭意
研究を重ねた結果、ダラム陰性細菌であるアルテロモナ
ス属およびシュードモナス属のそれぞれに属する細菌が
プロテアーゼを生産し、このプロテアーゼを菌体外に排
出することを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、アルテロモナス属またはシュード
モナス属に属し、プロテアーゼを生産し、該プロテアー
ゼを菌体外へ排出する細菌を培養し、得られた培養液も
しくは培養上澄液からプロテアーゼを分離採取すること
を特徴とするプロテアーゼの製造法である。

本発明において使用される菌株としては、アルテロモナ
ス属およびシュードモナス属のいずれかに属し、プロテ
アーゼを生産し、このプロテアーゼを菌体外に排出する
菌株であればよく特に制限はなく、たとえば、アルテロ
モナス　マクレオデイ−（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｍ
ａｃｌｅｏｄｉｉ）、アルテロモナスランデイリー（Ａ
ｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｕｎｄｉｎａ）、アルテロモナ
ス　ルブラ（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｒｕｂｒａＬア
ルテロモスプトリファシエンス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａ
ｓ　ｐｕｔｒｉｆａｃｉｅｎｓ）。

アルトモナスコ千ナス　ニガリファシェンス（八１　ｔ
ｅｒｏｍｏｎａｓｎｉｇａｒｉｆａｃｉｅｎｓ）および
シュードモナス　アトランチイカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　　ａｔｌａｎｔｉｃａ）などに属する菌株が好ま
しい。　代表例としてアルテロモナスマクレオデイ−Ａ
ＴＣＣ２７１２６，アルテロモナスウンティナＡＴＣＣ
２９６６０（＝ＩＡＭ　１２９２２Ｌ　Ｔ）Ｉｉテロモ
ナス　ルブラＡＴＣＣ２９５７０，アルテロモナス　プ
）　ＩＪ　７　ｙ　シｘ　ン４　ＡＴＣＣ８０７１（＝
ＮＣＴＢ　１０４７１）、　フルテロモナス　ニガリフ
ァシェンスＡＴＣＣ１９３７５（＝ＩＡＭ　１３０１０
）およびシュードモナス　アトランチイカＡＴＣＣ１９
２６２などが存在する。これらの菌種は、いずれも公知
の菌種であり、また、これらの菌株はいずれもそれぞれ
の菌種の基準株である。これらの細菌の菌学的性質は、
たとえば、アルテロモナス　ニガリファジエンシスにつ
いては「インターナショナル　ジャーナル　オブ　シス
テマティノク　バクテリオロジー（“Ｉｎｔ、　Ｊ、　
５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔ、′）、第３４巻、第１４５〜１
４９頁（１９８４）　ｊに、また、これ以外の細菌につ
いては［バーシーズ　マニュアル　オブ　システマテイ
ンク　バクテリオロジー（”Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　　Ｍａ
ｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔ−ｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ”）第１巻（１９８４）第３４３〜３５
２頁、ウィリアムス　アンド　ゥィルキンス社、ハルチ
イモア）」に、それぞれ記載されている。

これらのプロテアーゼ生産細菌を培養するにあたって用
いられる栄養培地としては、これらの細菌が生育、増殖
しうる培地であればよ（、特に制限はないが、プロテア
ーゼの生産性の点から、カゼインを含有することが好ま
しい。炭素源および窒素源としては、これらの細菌が資
化しうるちのであればよく、特に制限はないが、通常は
、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、コーンステイー
プリカー、＃ａ蜜、および肉エキスなどの天然培地が好
適に使用される。その他、必要に応じて、たとえば、ア
ンモニウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩およびカル
シウム塩のような無機塩類などを使用することができる
。

前記の菌株は、いずれも海洋性細菌であるので、培地用
水として海水もしくは塩化ナトリウム濃度２〜６ｗｔχ
の塩化ナトリウム水溶液を使用することが好ましい。

培養条件は、使用される菌株によって異なり、各菌株に
とって生育、増殖およびプロテアーゼの生産に適した培
養条件を選択すればよい。たとえば、通常は、培養温度
は２０〜４０℃の範囲から、また、培養ｐＨは６〜８の
範囲からそれぞれ選択される。

培養方式は、回分培養もしくは連続培養のいずれでもよ
いが、プロテアーゼ生産の点がらは回分培養が好ましい
。

窒素源として、アンモニウム塩を使用した場合には、菌
体の増殖に伴って培養液中のｐＨが低下するので、培養
期間において培養液のｐＨを所定の値に保ために、アン
モニア、苛性カリもしくは苛性ソーダなどを添加して培
養液のｐＨを調節する必要がある。就中、アンモニアが
好ましい。

このようにして細菌を培養して得られた培養液から、た
とえば、遠心分離もしくは濾過などの常法により細菌菌
体を除去して培養上澄液かえられる。

培養上澄液からのプロテアーゼの分離、精製は、常法に
よることができる。すなわち、たとえば、培養上澄液に
硫安を７０ｗｔχになるように添加しｐＨ７〜９に調整
してから放置するか、または、たとえば、エタノールも
しくはアセトンなどのようなプロテアーゼの貧溶媒を５
０〜８０ｖｏｌχになるように添加して放置することに
よりプロテアーゼを沈澱させる。この沈澱物は、たとえ
ば、濾過、遠心分離もしくは膜分離などの常法により培
養上澄液から分離、回収することができる。プロテアー
ゼを沈澱させるために硫安を使用した場合には、沈澱物
に硫安が混入されていることが一般であるが、この硫安
は、たとえば、透析などにより除去することができる。

また、この沈澱物には菌体が混入されていることがある
が、この菌体を除去するには、この沈澱物とプロテアー
ゼの冨溶媒である、たとえば水とを混合して、不溶物で
ある菌体を分離、除去すればよい。培養上澄液を直接、
膜濃縮にかけてプロテアーゼ濃縮液を得ることができる
。

なお、培養液も培養上澄液と同様に処理することができ
る。このようにしてプロテアーゼ粗酵素液を得ることが
できる。

プロテアーゼの純度をさらに向上させるために、さらに
ＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）もしく
はゲル濾過などによって精製することができる。

このようにして得られたプロテアーゼ粗酵素液およびプ
ロテアーゼ精製酵素液は、必要に応じて、たとえば、凍
結乾燥などの常法により乾燥することもできる。

本発明では、プロテアーゼの活性測定法として、アンソ
ン−萩原変法をもちいた。

アンソン−萩原変法： 原理−ミルクカゼインにプロテアーゼを作用させたのち
、カゼインの等電点付近でトリクロル酢酸を加え、トリ
クロル酢酸可溶区分にフォリン試薬を加えてトリクロル
酢酸可溶区分の非蛋白部分にふくまれるアリルアミノ酸
を発色させ、その色を比色することによりプロテアーゼ
の活性度をもとめる。

活性度の定義−後記の条件で３７℃で１分間に１γのチ
ロシンに相当する呈色を示す酵素活性度を［１本位（ｕ
ｎｉｔ）　Ｊとする。

基質溶液−無水物として１．２ｇに相当するミルクカゼ
イン（Ｈａｗ＋ｍｅｒｓｔｅｎ、Ｅ、Ｍｅｒｃｋ）に０
．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　−１１ＣＩ緩衝溶液（ｐＴ＋　７
．８）５０ｍＺを加え分散させてから、沸騰水中で１０
分間加熱して溶解させ、冷却後、蒸溜水を加えて全量を
１００ｍ／とする。

フェノール試薬−和光純薬製のフェノール試薬を用いる
。使用にあたって、この原液に等量の蒸溜水を加える。

測定条件−酵素液０　、２　ｒｎｌづつを試験管２本に
とり、３７℃の恒温水槽に約３分間浸漬する。そのうち
の１本に、予め３７℃に保温しておいた基質溶液の２ｍ
ｌを加えると同時に計時をはじめる。正確に１ｏ分経過
したのち、これに３％トリクロル酢酸溶液を３　、０　
ｍｌ加えて酵素反応を停止させ、３０分間放置して沈澱
を凝集させてから、反応混液を東洋濾紙Ｎｏ。

１３１（直径９ｃｍ）で濾過し、清澄濾液を得る。もう
１本の試験管は、ブランクテストのために、３％トリク
ロル酢酸溶液を加え、つづいて基質溶液２ＩＩ１１を加
えて３０分間放置して沈澱を凝集させてから、東洋濾紙
ＮＯ，１３１（直径９ｃｍ）で濾過し、清澄濾液を得る
。各清澄濾液１　、　Ｑ　ｍｌを試験管にとり、０．４
Ｍ炭酸ナトリウム水溶液５ｍｌ、２倍稀釈フェノール試
薬１．０−を加え、３７℃の恒温水槽に２０分間浸漬し
て発色させる。この呈色液を分光光度計（日立２２ＯＡ
　ｍｏｄｅ＋）を用いて蒸溜水を対照として、波長６６
０ｎｍで、比色し、吸光度を求める。酵素作用を行った
方の吸光度からブランクテストの吸光度を差し引いたも
のが、酵素作用によって生じた反応生成量を表す。この
吸光度の値を別に作成しておいた作用標準曲線にあては
めて相当する活性を読みとりユニット（ｕｎｉｔ　　以
下同様）を算出する。

〔実施例〕

実施によって本発明をさらに具体的に説明する。

なお、本発明は実施例によって限定されるものではない
。

実施例 純水１ａあたり、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス２ｇ
　、ＭｇＳＯ４’７Ｈｚ０２ｇ　ＩＭＣＩ　３ｇ　、Ｃ
ａＣ１ｚ−２８ｚＯＯ，５ｇ　、ＭｇＣｌｚ・６Ｈ２０
２ｇおよびＮａＣｌ　５０ｇを？容解し、ｐＨ７．８に
調整された培地２０−を１００ｍ／容三角フラスコに入
れ、殺菌した培地６個を用意し、それぞれのフラスコに
アルテロモナス　マクレオデイ−ＡＴＣＣ２７１２６、
アルテロモナス　ウンディナＡＴＣＣ２９６６０゜アル
テロモナス　ルブラＡＴＣＣ２９５７０，アルテロモナ
ス　ブトリフプシェンスへＴＣＣ８０７１，アルテロモ
ナス　ニガリファシエンスＡＴＣＣ１９３７５およびシ
ュードモナス　アトランチイカＡＴＣＣ１９２６２をそ
れぞれ植菌し、２日間培養（前培養）した。

純水２００＋ｄ当たり、カゼイン５ｇおよびＮａＣＯ３
０，４ｇを溶解してＡ溶液とする。また、純水１００ｍ
７当たり、くえん酸鉄０．１ｇを加熱溶解してＢ溶液と
する。純水７００ｍ７当たり、バクトソイトン（Ｄｉｒ
ｃｏ）５ｇ、カザミノ酸１ｇ、ポリペプトン１０ｇ、酵
母エキス２ｇ　１ＫＣＩ　３ｇ　、Ｃａｃ１２・２Ｈ２
００，５ｇ　、ＭｇＣｈ・６Ｈ□０２ｇおよびＮａＣ１
５０ｇを溶解してＣ溶液とする。これらのＡ、Ｂおよび
Ｃ溶液を混合し、ｐ）１７．８に調整された培地２００
−を１１容三角フラスコに入れて殺菌した培地６個を用
意した。それぞれのフラスコに、前記の６個の前培養液
をそれぞれ２ｖｏｌｘづつ植菌し、本培養を行った。

３０℃で回転振とう培養を４０時間および６４時間それ
ぞれ行ったのち、培養液を遠心分離し、培養上澄液を得
た。

この培養上澄液中のプロテアーゼ活性を測定し、次表の
ような結果を得た。

（発明の効果〕 本発明によれば、医薬品３食品化粧品および洗剤分野で
広く使用されているプロテアーゼを容易に、かつ、安定
的に、しかも効率よく得ることが可能となる。

特許出願人　三菱瓦斯化学株式会社 代表者長野　和書

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. アルテロモナス属またはシュードモナス属に属し、プロ
   テアーゼを生産し、該プロテアーゼを菌体外へ排出する
   細菌を培養し、得られた培養液もしくは培養上澄液から
   プロテアーゼを分離採取することを特徴とするプロテア
   ーゼの製造法