JPH02195868A - プロテアーゼ生産菌およびそれを用いたプロテアーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、アルカリプロテアーゼを生産する新規微生物
、該微生物により生産されるプロテアーゼおよび該プロ
テアーゼの製造法に関する。

（従来の技術） プロテアーゼはタンパクをペプチドおよび／またはアミ
ノ酸に分解する反応を触媒する酵素であり２種々の動物
、植物および微生物から分離されている。パパイン、ペ
プシン、フィシン、トリプシンなどのプロテアーゼがよ
く知られており１食品、皮革および織物の加工、ならび
に医薬品、化粧品、洗剤などに広く利用されている。こ
れらのプロテアーゼのうらアルカリ側ｐｌ＋で至適活性
を示すものは、特に洗濯用予備剤または洗浄剤の成分と
して有用である。

このようなプロテアーゼを得るには、工業的生産の立場
からは５例えば、菌体内で生産されたプロテアーゼを菌
体外に分泌する微生物を利用するのが最も好ましい、こ
のような微生物としては。

非病原性細菌であるセラチア属菌（特公昭４１−１０１
９３号公報および特開昭６０−３７９８２号公報）、お
よびアルテロモナス属またはシュードモナス属に属する
ダラム陰性菌（特開昭６３−４２６８６号公報）が報告
されている。

これらの微生物のうち、セラチア属菌の生産するプロテ
アーゼはセラチオペプチダーゼと呼ばれ。

非常に効果的な抗炎症作用および去痰作用（喀痰液化作
用）を示す、このようなセラチア属菌として上記特公昭
４１−１０１９３号公報にはセラチアｓｐ、ｔ！１５が
、そして上記特開昭６０−３７９８２号公報にはセラチ
ア属菌の変異株であるセラチアｓｐ、ＭＴ−５−４０が
記載されている。しかし、これらの菌株の菌体あたりの
セラチオペプチダーゼ生産量および生産されたセラチオ
ペプチダーゼの比活性は十分とは言えない。そのため、
菌体あたりのペプチダーゼ生産量がより高いプロテアー
ゼ生産菌、より高い比活性を有するプロテアーゼおよび
該プロテアーゼの製造法の開発が望まれている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものであり。

その目的とするところは、菌体あたりのプロテアーゼ生
産量の高い微生物を提供することにある。

本発明の他の目的は、上記微生物により生産される比活
性の高いプロテアーゼを提供することにある０本発明の
さらに他の目的は、上記優れた性質を有するプロテアー
ゼの製造法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 発明者らは、カミキリムシの死体から種々の菌類の分離
を行なううち、得られた菌類のなかでセラチア属に属す
るセラチア　マルセスセンスが強力なプロテアーゼ産生
能を有するという知見を得。

本発明を完成するに至った。

本発明のプロテアーゼ生産菌は、セラチア　マルセスセ
ンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）で
ある。

本発明は、該セラチア　マルセスセンスが生産するプロ
テアーゼを包含する。

本発明のプロテアーゼの製造方法は、上記セラチア　マ
ルセスセンスを、該セラチア　マルセスセンスが利用し
うるタンパクを含有する培地で培養し、得られた培養物
または培養上清液からプロテアーゼを分離する工程を包
含する。

上記発明者らがカミキリムシの死体から分離した菌株は
、後述する菌学的性質をもとにｒ　Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓ
？１ａｎｎｕａｌ　ｏｆ　ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＤｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　ｌ１ａｃｔｅｒｉ。

１ｏｇｙ、　８ｔｈ　ｅｄ、　Ｊに従って分類すると、
セラチアマルセスセンスに属する新菌株であると同定さ
れた。この菌株は発明者らによりセラチア　マルセスセ
ンスＴＮ２２°株と命名され、微工研に寄託されている
［微工研菌寄第１０２９５号（ＦＥＲＮ　Ｐ−１０２９
５）。

■ヱ血性ｎ 本菌株の菌学的性質を表１に示す。

（以下余白） 表１ ａ、形態 ■細胞の形および大きさ ■運動性の有無 ■胞子の有無 ■グラム染色性 ■集落および表面の形状 ■菌の色 Ｃ０生理学的性質 ■ＭＲテスト ■ｖｐテスト ■フォーゲス・ プロスカラエル反応 ■インドールの生成 短桿菌 （０，８〜１．２）　Ｘ　（１，２〜３゜２）μ餉有り
；鞭毛の着生状態は周毛 無し 陰性 直径的３−一の円形コロニ を形成； 不透明な灰色がかった白 陰性 陽性 陽性 陰性 ■硫化水素の生成 ■クエン酸の利用 ■ガスの発生 （グルコース） ■ウレアーゼの生成 ■オキシダーゼ （Ｋｏｖａｃｓ） ■カタラーゼ ■β−ガラクトシダーゼ ＠生育の範囲 ＠０−Ｆグルコース ［相］アルギニンジヒドロ ラーゼ ■リジンデカルボキシ ラーゼ ■オルニチンデカルボ キシラーゼ 陰性 陽性 陰性 陰性 陰性 陽性 陽性 ４℃：生育しない ２０℃〜３７℃：生育する ４１°Ｃ：生育しない 発酵（通性嫌気性） 陰性 陽性 陽性 ■）’Ｊ７’）７ｙ７ｆ′７　　　　陰性ミナーゼ ［相］ゼラチナーゼ　　　　　　陽性 ［相］シトクロムオキシダーゼ　陰性 ＠ＤＮａｓｅ ■色素生成 ＠Ｍｏｅｌｌｅｒアルギニン ＠Ｍｏｅｌｌｅｒリジン ＠Ｍｏｅｌｌｅｒオルニチン ＠Ｔｗｅｅｎ８０ ＠糖からの酸の生成 グルコース マンニトール イノシトール ソルビトール ラムノース スクロース メルビオース アミダリン し−アラビノース アドニトール ラフィノース キシロース メレジトース 陽性 陰性 陰性 陽性 陽性 陽性 ＋ ＋ ＋ ＋ ｍ定 本菌株をセラチア属に属する菌株であると同定した根拠
を以下に示す。

本菌株は上述のように「グラム陰性であり２通性嫌気性
の桿菌である」という菌学的性質を有する。このような
細菌は、　　ｒ　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏ
ｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｄｅｔｅｒ＋ｗｉｎａｔｉｖ
ｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ＋　ａｔｈｅｄ、　」に
よれば第８部に分類される。第８部に分類されている科
および属は以下のとおりである。

１２、Ｃａｌ　ｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｔｕｍ属これら
１２の科および属に属する菌の菌学的性質と本菌株の菌
学的性質とを比較し、相違点を表２に示す０表２から明
らかなように１本菌株はＥｎ　ｔｅｒｏ−ｂａｃｔｅｒ
ｉａｃｅａｅ科を除＜１１の科または属のいずれとも菌
学的性質が異なる。

表２ 科または属 菌学的 性質 セラチア　マルセスセンスＴＮ２２ 株の菌学的性質 ３、ｂ１１狙組属 ６、ハ」」伽」■属 ７、Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ属 １０、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属１１、釘ｎ圧
劫あ＋ｃｉｌ山組属 表２に示すように１本国株はＥｎ　ｔｅｒｏｂａｃ　ｔ
ｅｒ　１ａｃｅａｅ科に属することがわかる。　Ｅｎｔ
ｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科は、さらに１２の属
に分類される。これら１２の属と本菌株の菌学的性質と
を比較した。菌学的性質のうち、明らかに異なる項目を
表３に示す。

（以下余白） 表３において、　Ｅｒｗｉｎｉａ属については、この属
に属する１３の種（ｓｐ、　）の菌学的性質が一部異な
るため１代表的性質を示１；（本印）例えば、　Ｅｒｗ
ｉｎｉａ属に属する種のうちＥ、　　肪■且岬ユ、　Ｅ
、　　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ。

ｐ、、　　ｓｔｅｗａｒｔｉｉおよびＥ、　　ｕｒｅｄ
ｏｖｏｒａの４種は硫化水素の生成が（−）であり、　
Ｅ、　　ｕｒｅｄｏｖｏｒａについてははＤＮａｓｅ　
（＋　）およびインドールの生成（＋）である。しかし
、これら４種は全てカゼインを分解せず、カゼインを培
地として生育する本菌株とは明らかに異なる。

このように２本望株はセラチア属を除＜１０の属とは菌
学的性質が異なることがわかる。他方１本望株は１次の
表４に示すように、セラチア属と多くの点で性質が共通
する。

（以下余白） 表４ 本菌株とセラチア属との共通点 通性嫌気性 ダラム陰性 発酵的である 運動性有り９周毛 カタラーゼ オキシダーゼ インドールの生成 硫化水素の生成 ＭＲテスト ゼラチンの液化 β−ガラクトシダーゼ オルニチン反応 Ｎａ５ｅ ：陽性 ：陰性 ：陰性 ：陰性 ：陰性 ：陽性 ：陽性 ：陽性 ：陽性 以上の結果から９本望株はセラチア属に属する細菌であ
ると同定される。セラチア属に属する種はセラチア　マ
ルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　　ｍａｒｃｅｓｃｅ
ｎｓ）の１種類である。セラチア　マルセスセンスおよ
び本菌株の菌学的性質（表４の項目以外）を表５に示す
。

（以下余白） 表５ １　、　アルギニシジヒＥロラーゼ ２、　リシンデカルボキシラーゼ ３、クエン酸の利用 ４、ウレアーゼ ５、ＶＰテスト ロ、糖から酸の生成 ■グルコース ■マンニトール ■イノシトール ■ソルビトール ■シュークロース ■Ｌ（＋）−アラビノース ■アドニトール ■キシロース 陰性 陽性 陽性 陰性 陽性または陰性 十 ＋ ＋または ＋ ＋または− ＋または 陰性 陽性 陽性 陰性 陽性 ８、色素の生成　　　　　赤色または陰性　陰性９、ア
ルギニンの利用　　陰性　　　　　　陰性表５かられか
るように９本菌株とＢｅｒｇｅｙに記載されたセラチア
　マルセスセンスとはソルビトールおよびＬ（＋）−ア
ラビノースから酸を生成する点が異なるにすぎず、その
他の菌学的性質は全て一致する。それゆえ１本菌株をセ
ラチア　マルセスセンスに属する一菌株であると同定し
、これをセラチア　マルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ
’　ｓ＋ａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＴＭ０１株と命名した。

囲１条往 培地は格別である必要はなく、肉エキス、酵母エキス、
麦芽エキス、ペプトンなどの有機栄養源ニリン酸塩、マ
グネシウム、ナトリウム、カリウム。

マンガン、鉄などの無機栄養源などを適宜含有する通常
の培地が用いられる。

炭素源としては９例えば、グルコース、デキストリン、
可溶性殿粉、シェークロースなどを用いることができ、
窒素源としては９例えば、アンモニウム塩、硝酸塩など
の無機塩類を用いることができる。炭素源および窒素源
としてタンパクを多く含むコーンスチープリカー、ペプ
トン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、馬鈴薯抽出液など
が好適である。特に、タンパクとして礼装カゼイン（ミ
ルクカゼイン）を含有する培地は１９９本菌プロテアー
ゼの効果的な生産に有利である。

培養温度、　ｐＨ，時間などの条件は、プロテアーゼの
生産および該プロテアーゼの活性が最も高くなるように
適宜設定される。通常、培養温度は２０〜３７℃、好ま
しくは２５〜３０℃である。培養液の液性は弱酸性から
弱アルカリ性（ｐＨ５〜９）であり。

好ましくは中性付近（約ｐＨ７）である。このような培
養温度およびｐＨにて２４時間以上、好ましくは４８時
間程度好気的に撹拌または振盪しながら培養を行うこと
により本発明のプロテアーゼが生産される。該プロテア
ーゼは菌体外に分泌されて培養液中に蓄積する。

■皇■探皇失 上記培養液から本発明のプロテアーゼを採取・精製する
には既知の方法が単独もしくは併用して利用され得る０
例えば、培養終了後の培養液を濾過または遠心分離して
菌体を除去することにより。

培養上清液（無細胞培養液）が得られる。この培養上清
液を硫酸アンモニウム（硫安）などを用いた塩析；有機
溶媒による沈澱；等電点電気泳動；電気透析；ゲル濾過
、イオン交換、アフィニティー、吸着などの各種クロマ
トグラフィー；などの手段を用いて精製することにより
、高純度のプロテアーゼを得ることができる。

例えば、培養液に硫安を加えて５０％飽和とし上清液を
採取し、さらに硫安を加えて７０％飽和とし。

析出した沈澱物を採取することにより、　５．８５倍に
精製された酵素が得られる（実施例６参照）、以下、後
述の酵素の性質は、この５０〜７０％硫安画分を用いて
調べられた。

蛮止激定ニ プロテアーゼ活性は、アンソン−萩原変法、カニツツ（
Ｋｕｎｉｔｚ）の変法■またはカニッツの変法■に従っ
て測定できる。特に記さない限り、プロテアーゼ活性は
アンソン−萩原変法を用いて測定し、以前に報告されて
いるプロテアーゼの活性と比較する場合にのみ、カニッ
ツ（Ｋｕｎｉｔｚ）の変法Ｉまたは■を用いて測定する
こととする。以下に。

各測定法を詳しく説明する。

〔アンソン−萩原変法〕

この測定法の原理は２．ミルクカゼインにプロテアーゼ
を作用させた後にミルクカゼインの等電点付近でトリク
ロロ酢酸を加えて抽出し、このトリクロロ酢酸可溶性画
分中の非タンパク部分に含まれるアリルアミノ酸（ミル
クカゼインのプロテアーゼによる分解産物）をフォリン
試薬（フェノール試薬）により発色させて比色すること
による。

（ａ　）　１．５％ミルクカゼイン溶液１＋ａｌを試験
管（１５Ｘ　１５０ｗ＋ｓ　）に採り、測定すべき酵素
液を情製氷または緩衝液で適当な濃度に希釈して調製し
た希釈酵素液１１Ｉｌを加えてよく振りまぜ、直ちに３
７℃の恒温水槽中に入れて６０分間反応させる。

（ｂ　）反応後、０．４？ｌトリクロロ酢酸１ｍｌを加
え。

３７℃にて１０分間保った後、遠心分離（３，ＯＯＯｒ
ｐｍ　Ｘ１５分間）シ、上滑を採取する。

（Ｃ）上清１ａ＋１を試験管（１８Ｘ２００ｍｍ）に採
り。

０．４Ｍ炭酸ナトリウム液５ｍｌを加えた後、フェノー
ル試薬（和光純薬工業株式会社製　の試薬を２倍希釈し
たもの）１ｍｌを加えてよく振り混ぜ、３７°Ｃにて２
０分間保って発色させる。この液を光路長１０ＩＩＩＩ
Ｉ＋のキュベツトに採り、　６６０ｎｍにおける吸光度
を測定する。この値をＥとする。

（ｄ　）上記反応液とは別に、１．５％ミルクカゼイン
溶液に希釈酵素液を加える前に０．４Ｍ　）リクロロ酢
酸を加えたブランクを用意し、同様に操作して６６０ｒ
＋ｍにおける吸光度を測定する。この吸光度をブランク
値Ｅ゛とする。

（ｅ　）チロシン標準液（１０００ｔ！ｇ　／ｍｌ）の
０゜１．２．３および４Ｉｎ１．をそれぞれ別のメスフ
ラスコに採り、　０．２Ｎ塩酸を加えて１００ｍ１　と
する。この希釈液各１ｍｌを採り、上記（Ｃ）項と同様
に発色させて吸光度を測定する。この吸光度をそれぞれ
Ｅｏ、Ｅ＋、　Ｅｘ、　Ｅ３およびＥ４として検量線を
作成し。

検量線から吸光度差１．０００に対応するチロシンのＩ
Ｆ　　（８ｇ）を求める。このＦの値は、酵素活性測定
を行う度に測定・算出する。

（ｆ　）上記のようにして測定したとき、１分間に、１
Ｍｇのチロシンに相当する非タンパク性のフェノール試
薬呈色物質を生成する酵素活性を。

プロテアーゼの１単位（ＡＵ）とする。プロテアーゼ活
性（ＡＵ）は２次式（１）により求められる。

プロテアーゼ活性（ＡＵ） ＝（Ｅ−Ｅ’）　　ＸＦ　　Ｘ３　　ｘ（１／６０）ｘ
ａ本　　　　　　（１）＊ｄ　＝酵素液の希釈率（倍） さらに、プロテアーゼ活性（ＡＵ）を酵素タンパク（ロ
ーリ−（Ｌｏｗｒｙ）法により求められる）　１ｍｇあ
たりに換算することにより、プロテアーゼ比活性（ＡＵ
／ｍｇタンパク）が求められる。

〔カニッツの変法■〕

特公昭４１−１０１９３号公報（前出）に開示された方
法である。この方法においては、上記アンソン−萩原変
法の（ｂ）項の操作で得られるトリクロロ酢酸添加後の
上清液を光路長１０１のキュベツトに採り、　２７５ｎ
ｍにおける吸光度を測定し９反応時間を２０分間に換算
したときの吸光度の増加を算出する。

吸光度を１．００だけ増加させる酵素活性を１単位（に
Ｕ）とする。

〔カニッツの変法■〕

特公昭６０−３７９８２号公報（前出）に開示された「
酵素研究法」　（第２巻２３９頁、乾量書店（１９５６
）　）に記載の方法である。この方法では、１分間に１
Ｍｇのチロシン相当量のトリクロロ酢酸可溶性物質を与
える酵素を１単位（Ｋ″Ｕ）とする。吸光度＝１を示す
チロシン濃度を１３５　μｇ／ｍｌとして。

上記カニッッの変法■で得られる測定値から算出するこ
ともできる。

Ｍ皇立性ｉ 本発明のプロテアーゼの理化学的性質を以下に示す。

■作用および基質特異性 タンパクを分解してアミノ酸もしくはポリペプチドを生
成する。

■至適ｐＨ範囲および安定ｐＨ範囲 上記５０〜７０％硫安画分を用い１反応ｐＨを第３図の
ように変化させ、活性測定値に準じて酵素反応を行なっ
た。そのときのプロテアーゼ活性を第３図に示す。第３
図においてプロテアーゼ活性は。

３７°Ｃ，ｐＨ７における活性を１００％としたときの
相対活性（％）として示す。第３図かられかるように９
本酵素の至適反応ｐＨはｐＨ８〜１０であり、このアル
カリｐＨ領域ではプロテアーゼ活性がｐＨ７における活
性の２倍近くにまで高くなった。

次に、上記５０〜７０％硫安画分を、第４図に示すｐＨ
６〜１１の各ｐＨのリン酸−ＮａＯＨ緩衝液中（約１０
０μｇ／ｄ）で５°Ｃにて２４時間保存した。その後、
これをｐＨ９のリン酸緩衝液で１００倍に希釈し、残存
するプロテアーゼ活性を測定した。その結果を第４図に
示す。第４図から、上記条件下で本酵素はｐ１１６〜１
０であり、はぼ１００％の活性が残存することがわかる
。この酵素をｐＨ７のリン酸緩衝液中で５°Ｃにて保存
した場合には、１ケ月後も安定であった。

■作用適温の範囲 上記５０〜７０％硫安画分を用い、第５図に示す温度条
件下で、活性測定法に準じて酵素反応を行なった。その
ときのプロテアーゼ活性を第５図に示す。第５図かられ
かるように２本酵素の至適反応温度は約５０℃である。

■ｐＨ，温度などによる失活の条件 本プロテアーゼは、第４図から、５℃、　ｐＨ１１以上
において２４時間で失活することが明らかである。

次に、上記５０〜７０％硫安画分（ｐＨ７）を第６図に
示す５〜５０℃の各温度に２４時間保存した後、残存す
るプロテアーゼ活性を測定した。その結果を第６図に示
す、第６図から、上記条件下で本酵素は５〜３７°Ｃで
ほぼ安定、そして４２°Ｃでは比較的安定であるが、５
０℃では失活することがわかる。この酵素を５℃で保存
した場合には、１ケ月後も安定であった。

（実施例） 本発明を以下の実施例につき説明する。

！隻炭よ 〔セラチア　マルセスセンスＴＮ２２株のカゼイン培地
での培養■〕 ミルクカゼイン０．５％、　ＫＨｚＰＯｎ　０．１％、
　Ｋ！Ｈ１’０４０．２％、　ＭｇＳＯ４・７Ｈｚ００
．１％、　ＦｅＳＯ４・’ｒｔｔ！ｏ　Ｏ，００１％、
　Ｍｎ５Ｏｎ　６４〜６Ｈｔ００．０００１％、　Ｎａ
Ｃ１０，００１％および酵母エキス０．０２％の組成の
液体培地（ｐＨ６）１００ｍｌを５００ｍ１容量の坂ロ
フラスコに入れ、セラチア　マルセスセンスＴＮ２２株
を１白金耳接種し。

３０℃にて振盪培養した。この培養液を毎日３ｍｌずつ
採取し、プロテアーゼ活性を経日的に測定した。

結果を第１図に示す。第１図から、プロテアーゼ活性は
培養を開始してから２日（約４８時間）後に最高となる
ことがわかる。

培養開始から３日後の培養液から得られるの乾燥菌体量
は０．６ｇ／ｌであり、培養液中のタンパク濃度は１．
０４　（ｍｇ／ｍｌ）　、プロテアーゼ活性は２０９．
８（ＡＵ／ｓｌ）　、プロテアーゼ比活性は２０１．７
　（ＡＵ／ｍｇタンパク）であった。

ル較燃土 〔セラチア　マルセスセンスＩＰ０１２６４８株の培養
〕セラチア　マルセスセンスＩＰ０１２６４８株を用い
。

実施例１に準じて培養を行った。培養開始から３日後の
培養液から得られるの乾燥菌体量は１．１ｇ／ｌであり
、培養液中のタンパク濃度は０．６５　（ａ＋ｇ／ａ＋
１）　。

プロテアーゼ活性は６１．６　（Ａｌｌ／ｍｌ）　、プ
ロテアーゼ比活性は９４．８（ＡＵ　／ｒ＠ｇタンパク
）であった。

実施例１および比較例１で得られた値と比較すると、　
ＴＮ２２株はＩＰｏ　１２６４８株の２倍以上の比活性
を有するプロテアーゼを３倍以上の量で生産したことが
わかる。しかも、　ＴＮ２２株の乾燥菌体量は１２０１
２６４８株の約半分である。このように９本発明におい
ては、菌体あたりのプロテアーゼ生産量および生産タン
パクあたりのプロテアーゼ活性量が大きいことがわかる
。

１施１ 〔ペプトン培地での培養■〕 ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、マルトエキス
０．３％およびグルコース１％の組成の液体培地（ｐＨ
６）を用いたことを除いては、実施例１に準じてセラチ
ア　マルセスセンスＴＮ２２株の培養を行った。結果を
第２図に示す。第２図かられかるように、プロテアーゼ
活性は実施例１の結果と同様に培養を開始してから２日
目に最高となる。

裏ｋｆＭｉ 〔ペプトン培地での培養■〕 ミルクカゼインをペプトン２％に変えたことを除いては
、実施例１に準じてセラチア　マルセスセンスＴＮ２２
株の培養を行った。培養開始から４９時間後のプロテア
ーゼ活性は２７４．３　　（Ａυ／ｍｌ）であり、比活
性は９１．７　（ＡＵ／ａ＋ｇタンハク）テアッた。

実施舅土 〔ゼラチン培地での培養〕 ミルクカゼインをゼラチン２％に変えたことを除いては
、実施例１に準じてセラチア　マルセスセンスＴＮ２２
株の培養を行った。培養開始から４９時間後のプロテア
ーゼ活性は５８．９　（ＡＨ／ｎ＋１）であり。

比活性は１３．１　（ＡＵ／ｍｇタンパク）であった。

裏施皿ｌ 〔硫安分画によるプロテアーゼの分離・精製〕実施例１
に準じてセラチア　マルセスセンスＴＮ２２株を培養し
、培養液を遠心分離することにより無細胞の培養上滑液
１７９＋ｓｌを得た。この培養上清液に硫酸アンモニウ
ム（硫安）を５０％飽和となるように添加し１次いで遠
心分離することにより上清液を得た。この上清液に、さ
らに硫安を７０％飽和となるように添加し、析出した沈
澱物を遠心分離により集め、　０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＦＩ７．０　）に溶解して２．９６ｍ１とした。こ
の硫安分画による酵素の精製を表６に示す。これにより
、プロテアーゼは７８％の回収率で５．８５倍に精製さ
れた。

（以下余白） １旌糎旦 〔アンソン−萩原変法での測定値とカニッツ変法！およ
び■での測定値との比較〕 ミルクカゼインの濃度を３％にしたことを除いては、実
施例１に準じてセラチア　マルセスセンスＴＭ２２の培
養を行った。培養開始から４９時間後のプロテアーゼ活
性をアンソン−萩原変法により測定すると６２６．８　
　（ＡＨ／ｍｌ　）　テあり、比活性は８７．３（ＡＵ
／■タンパク）であった。このプロテアーゼ活性をカニ
ッツの変法■により測定すると６０．３　（ＫＩＪ／ｍ
ｌ）　”ｔ？あり、比活性は８．６　　（ＫＵ／ｍｇ９
７バク）であった、さらに、この測定値をカニッッの変
法Ｈの単位に換算すると、プロテアーゼ活性は１３９６
（Ｋ’ｔｌ／閣ｌ）であり、比活性は１９９．４　　（
Ｋ’ｔｌ／■タンパク）であった。

セラチア　マルセスセンスＴＮ２２株が生産するプロテ
アーゼは、特公昭４１−１０１９３号公報（前出）に記
載のセラチアｓｐ、Ｅ１５のプロテアーゼ生産量４０〜
５０　（ＫＵ／ｗ＋１）を上回り、かつ特公昭６０−３
７９８２号公報（前出）に記載のセラチアｓｐ、ＭＴ　
−５−４０（＾ＴＣＣ２１０７４）のプロテアーゼ生産
量ＴＯＯ（Ｋ’Ｕ／ｍｌ）および比活性１００　　（Ｋ
’Ｕ／ｍｇタンパク）を大きく上回った。

（発明の効果） 本発明によればこのように、プロテアーゼ生産能を有す
る新規微生物が得られる。このセラチアマルセス　セン
スＴＮ２２株からは、比活性が高く。

保存安定性に優れたプロテアーゼが得られる。セラチア
　マルセスセンスＴＮ２２株は国体あたりのプロテアー
ゼ生産量が高いので、この菌株を用いることによりプロ
テアーゼを大量に得ることができる。このプロテアーゼ
はアルカリプロテアーゼであるため洗濯用予備浸漬物ま
たは洗浄剤の成分として有用である。また９本酵素は抗
炎症作用や去痰作用を有するセラチオペブチターゼであ
るため。

医薬品としても有用である。

４　　　　　の　　　なＵ 第１図は１本発明のセラチア　マルセスセンスをカゼイ
ン培地にて培養したときの、培養時間とプロテアーゼ活
性との関係を示すグラフ；第２図は１本発明のセラチア
　マルセスセンスをペプトン培地にて培養したときの、
培養時間とプロテアーゼ活性との関係を示すグラフ；第
３図は２本発明酵素の至適反応ｐｉを示すグラフ：第４
図は９本発明酵素の安定ｐＨ範囲を示すグラフ；第５図
は。

本発明酵素の至適反応温度を示すグラフ；そして第６図
は１本発明酵素の安定温度範囲を示すグラフである。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プロテアーゼ生産能を有するセラチアマルセスセン
   ス（￥Ｓｅｒｒａｔｉａ￥￥ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ￥）
   。 ２、セラチアマルセスセンスＴＮ２２株（微工研菌寄第
   １０２９５号；ＦＥＲＭ　Ｐ−１０２９５）である、特
   許請求の範囲第１項に記載のセラチアマルセスセンス。 ３、特許請求の範囲第１項に記載のセラチアマルセスセ
   ンスにより生産されるプロテアーゼ。 ４、前記セラチアマルセスセンスがセラチアマルセスセ
   ンスＴＮ２２株である、特許請求の範囲第３項に記載の
   プロテアーゼ。 ５、特許請求の範囲第１項に記載のセラチアマルセスセ
   ンスを、該セラチアマルセスセンスが利用しうるタンパ
   クを含有する培地で培養し、得られた培養物または培養
   上清液からプロテアーゼを分離する工程を包含するプロ
   テアーゼの製造法。 ６、前記セラチアマルセスセンスがセラチアマルセスセ
   ンスＴＮ２２株である、特許請求の範囲第５項に記載の
   プロテアーゼの製造法。