JPS6050437B2 - クレアチニンアミドヒドロラ−ゼおよび/またはクレアチンアミジノヒドロラ−ゼの製造法 - Google Patents
クレアチニンアミドヒドロラ−ゼおよび/またはクレアチンアミジノヒドロラ−ゼの製造法Info
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- JPS6050437B2 JPS6050437B2 JP10503978A JP10503978A JPS6050437B2 JP S6050437 B2 JPS6050437 B2 JP S6050437B2 JP 10503978 A JP10503978 A JP 10503978A JP 10503978 A JP10503978 A JP 10503978A JP S6050437 B2 JPS6050437 B2 JP S6050437B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はクレアチニンアミドヒドロラーゼおよび/また
はクレアチンアミジノヒドロラーゼの製造法に関する。
はクレアチンアミジノヒドロラーゼの製造法に関する。
クレアチニンおよびクレアチンは人体の血液中または尿
中に存在する物質てあつて、その量を正確に把握するこ
とは日常の健康管理に大いに寄与する。一般に健康な人
間の血液中には0.5〜1.5m91dlのクレアチニ
ンが存在するが、筋ジストロフイー症や腎臓機能の疾患
のある人は血液中のクレアチニンの濃度が異常に高い値
を示し、また尿中にクレアチンの分泌が増加する。臨床
検査の分野ではクレアチニンの定量法としてピクリン酸
を用いるヤツフエ反応による方法が多く採用されている
が、近年クレアチニンアミドヒドロラーゼおよびクレア
チンアミジノヒドロラーゼを用いる酵素的定量法が開発
されてきた。
中に存在する物質てあつて、その量を正確に把握するこ
とは日常の健康管理に大いに寄与する。一般に健康な人
間の血液中には0.5〜1.5m91dlのクレアチニ
ンが存在するが、筋ジストロフイー症や腎臓機能の疾患
のある人は血液中のクレアチニンの濃度が異常に高い値
を示し、また尿中にクレアチンの分泌が増加する。臨床
検査の分野ではクレアチニンの定量法としてピクリン酸
を用いるヤツフエ反応による方法が多く採用されている
が、近年クレアチニンアミドヒドロラーゼおよびクレア
チンアミジノヒドロラーゼを用いる酵素的定量法が開発
されてきた。
酵素を用いる定量法の有利な点は試料中のクレアチニン
およびクレアチンの量を分別定量することができること
にある。そのためには通常クレアチニンアミドヒドロラ
ーゼおよびクレアチンアミジノヒドロラーゼが酵素活性
比で5:1〜1:5の割合で使用される。酵素を製造す
るにあたり、これらの酵素を同時に著量生産する微生物
に供給源を求めることが経済的に有利であり、現在、シ
ュードモナス属、フラボバクテリウム属、アクロモバク
ター属、ペニシリウム属、アルカリゲネス属の微生物が
これらの酵素を生産することが知られている。
およびクレアチンの量を分別定量することができること
にある。そのためには通常クレアチニンアミドヒドロラ
ーゼおよびクレアチンアミジノヒドロラーゼが酵素活性
比で5:1〜1:5の割合で使用される。酵素を製造す
るにあたり、これらの酵素を同時に著量生産する微生物
に供給源を求めることが経済的に有利であり、現在、シ
ュードモナス属、フラボバクテリウム属、アクロモバク
ター属、ペニシリウム属、アルカリゲネス属の微生物が
これらの酵素を生産することが知られている。
しかし、その生産量においてクレアチニンアミドヒドロ
ラーゼのみが顕著に多かつたりして、両酵素ともに生産
量が満足されるものは少ない。特にアルカリゲネス属の
微生物、例えば特開昭47−43281号公報および特
開昭47−43283号公報に記載されるアルカリゲネ
ス・スペックWS51400はクレアチニンアミドヒド
ロラーゼを多量に生産するが、クレアチンアミジノヒド
ロラーゼを少量しか生産しない。J 本発明者等はクレ
アチニンアミドヒドロラーゼおよびクレアチンアミジノ
ヒドロラーゼを顕著に生産する微生物を求めて種々鋭意
検討したところ、すでに工業技術院微生物工業研究所に
寄託されているアルカリゲネス属に属するAK−2株ワ
(微工研菌寄第4105号)が所期の目的を達成するこ
とを見出し本発明に到達した。
ラーゼのみが顕著に多かつたりして、両酵素ともに生産
量が満足されるものは少ない。特にアルカリゲネス属の
微生物、例えば特開昭47−43281号公報および特
開昭47−43283号公報に記載されるアルカリゲネ
ス・スペックWS51400はクレアチニンアミドヒド
ロラーゼを多量に生産するが、クレアチンアミジノヒド
ロラーゼを少量しか生産しない。J 本発明者等はクレ
アチニンアミドヒドロラーゼおよびクレアチンアミジノ
ヒドロラーゼを顕著に生産する微生物を求めて種々鋭意
検討したところ、すでに工業技術院微生物工業研究所に
寄託されているアルカリゲネス属に属するAK−2株ワ
(微工研菌寄第4105号)が所期の目的を達成するこ
とを見出し本発明に到達した。
すなわち本発明はアルカリゲネス属に属するAK−2株
(微工研菌寄第4105号)を培養し、培養物からクレ
アチニンアミドヒドロラーゼおよび/またはクレアチン
アミジノヒドロラーゼを採取することを特徴とするクレ
アチニンアミドヒドロラーゼおよび/またはクレアチン
アミジノヒドロラーゼの製造法である。本発明に従えば
クレアチニンアミドヒドロラーゼおよびクレアチンアミ
ジノヒドロラーゼを酵素活性比で6:1〜1:2の割合
にて製造することが可能である。
(微工研菌寄第4105号)を培養し、培養物からクレ
アチニンアミドヒドロラーゼおよび/またはクレアチン
アミジノヒドロラーゼを採取することを特徴とするクレ
アチニンアミドヒドロラーゼおよび/またはクレアチン
アミジノヒドロラーゼの製造法である。本発明に従えば
クレアチニンアミドヒドロラーゼおよびクレアチンアミ
ジノヒドロラーゼを酵素活性比で6:1〜1:2の割合
にて製造することが可能である。
本発明に用いるアルカリゲネス属に属するAK−2株(
微工研菌寄第4105号)は次のような菌学的性質を有
する。
微工研菌寄第4105号)は次のような菌学的性質を有
する。
A形態
(1)肉汁寒天培地に生育し、菌の形態は桿状であり、
0.5−0.8×1−3μの大きさで、通常単独である
が、まれに2−4連をなす。
0.5−0.8×1−3μの大きさで、通常単独である
が、まれに2−4連をなす。
時に伸長した細胞もみられるが細胞の多形性はない。(
2)運動性あり、周鞭毛も有する。
2)運動性あり、周鞭毛も有する。
(3) 胞子形成なし。
(4) グラム染色性は陰性
(5)抗酸性は陰性
B生育状態
(1)肉汁寒天平板培養
半透明灰白色又は灰黄色て、やや光沢を有する円形の
やや隆起したコロニーを生じ、周縁は円形で拡散性色素
は生産しない。
やや隆起したコロニーを生じ、周縁は円形で拡散性色素
は生産しない。
(2)肉汁寒天斜面培養
生育は良好で、灰白色または灰黄色て拡幅状をなす。
(3)肉汁液体培地培養 生育は良好で表面に膜を形成
することなく、培地はやや濁り、下層に白色の菌体を沈
.澱する。
することなく、培地はやや濁り、下層に白色の菌体を沈
.澱する。
(4)肉汁寒天穿刺培養 上面および穿刺孔中に生育す
る。
る。
(5)肉汁ゼラチン穿刺培養
表面に生育しわずかに液化する。
(6)リトマスミルク
培養と共にPHはゆつくりアルカリ性となる。
わずかにリトマスを還元するが液化、凝固はしない。]
生理的性質 (1)硝酸塩の還元:陰性 (2)脱窒素反応:陰性 (3)MRテストニ陰性 (4)VPテストニ陰性 (5)インドールの生成:陰性 (6)硫化水素の生成:陰性 (7)デンプンの加水分解:陽性(微弱)(8)クエン
酸の利用:陽性 (9)無機窒素源の利用:硝酸塩 陰性 アンモニウム塩 陽性(10色素
の生成:キングA培地およびB培地では色素の生産はな
し、肉汁寒天、肉汁ゼラチン、ポテトデキストロース培
地では水溶性色素の生成は認められない。
生理的性質 (1)硝酸塩の還元:陰性 (2)脱窒素反応:陰性 (3)MRテストニ陰性 (4)VPテストニ陰性 (5)インドールの生成:陰性 (6)硫化水素の生成:陰性 (7)デンプンの加水分解:陽性(微弱)(8)クエン
酸の利用:陽性 (9)無機窒素源の利用:硝酸塩 陰性 アンモニウム塩 陽性(10色素
の生成:キングA培地およびB培地では色素の生産はな
し、肉汁寒天、肉汁ゼラチン、ポテトデキストロース培
地では水溶性色素の生成は認められない。
(11)ウレアーゼニ陰性
(12)オキシダーゼニ陽性
(13)カタラーゼニ陽性
(14)生育PH:5〜9、特にPH6.5〜7.5て
よく生育する。
よく生育する。
(15)生育温度:15〜40℃、特に25〜50゜C
で最もよく生育する。
で最もよく生育する。
(16)好気性および嫌気性:好気性
(17)O−Fテストニ陰性
(18)糖の利用:ヒユーライフソン培地を用いて糖の
利用を調べた。
利用を調べた。
下記いずれの糖からもガスの発生および酸の生成は認め
られない。L−アラビノース、D−キシロース、D−グ
ルコース、D−マンノース、D−フラクトース、D−ガ
ラクトース、麦芽糖、シヨ糖、乳糖、トレハロース、D
−マンニトール、D−ソルビトール、イノシトール、グ
リセロール、可溶性澱粉。
られない。L−アラビノース、D−キシロース、D−グ
ルコース、D−マンノース、D−フラクトース、D−ガ
ラクトース、麦芽糖、シヨ糖、乳糖、トレハロース、D
−マンニトール、D−ソルビトール、イノシトール、グ
リセロール、可溶性澱粉。
)その他の性質
(1)3−ケトラクトースの生成:陰性
上記の菌学的性質を「バージエイのマニュアル●オブ●
デイターミネイテイブ●バクテリオロジー(第8版、1
97拝)」を参照して検討すると3−ケトラクトースを
生成せず、アミノ酸、アンモニア態窒素を利用するので
アグロバクテリウム属に属さない。
デイターミネイテイブ●バクテリオロジー(第8版、1
97拝)」を参照して検討すると3−ケトラクトースを
生成せず、アミノ酸、アンモニア態窒素を利用するので
アグロバクテリウム属に属さない。
クエン酸を利用するのでリゾピウム属ではない。更に本
菌は好気的に生育し、嫌気的には生育せず、水溶性およ
び非水溶性の顕著な色素を生成しないので、フラボバク
テリウム、クロモバクテリウム属にも属さず、アルカリ
ゲネス属に属するものと判定される。
菌は好気的に生育し、嫌気的には生育せず、水溶性およ
び非水溶性の顕著な色素を生成しないので、フラボバク
テリウム、クロモバクテリウム属にも属さず、アルカリ
ゲネス属に属するものと判定される。
次にアルカリゲネス属蔀−2株を用いてクレアチニンア
ミドヒドロラーゼおよび/またはクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼを製造する方法について説明する。
ミドヒドロラーゼおよび/またはクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼを製造する方法について説明する。
アルカリゲネス属ΔK−2株をクレアチニンおよび/ま
たはクレアチンを含む培地で液体培養すると菌体内に上
記酵素が蓄積される。
たはクレアチンを含む培地で液体培養すると菌体内に上
記酵素が蓄積される。
次いでこの菌体から通常の方法により上記酵素を抽出し
、分離精製することにより、酵素粉末を同時に、または
別々に得ることができる。さらに具体的に説明すると、
アルカリゲネス属蔀−2株をクレアチニンおよび/また
はクレアチンを主たる窒素源および炭素源とし、さらに
適当な無機塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化鉄およ
び有機微量栄養物質として酵母工キズ、麦芽工キズを添
加した培地で、中性付近のPHにて一般的な培養条件、
すなわち25〜35℃で1〜2日間通気攪拌培養すれは
、菌体の増殖とともに酵素か菌体内に生成蓄積される。
また本菌株を一般に菌体増殖のために用いる通常の窒素
源および炭素源、例えば窒素源としてポリペプトン、コ
ーンステープリカー、肉工,キズ、尿素を用い、また炭
素源としてブドウ糖、庶糖、グリセロールを用い、さら
に無機塩類および微量栄養物質を添加した液体培地で、
中性付近のPHにおいて、25〜35゜Cで1〜2日間
通気攪拌して培養した後、菌体の増殖終了時にクレアチ
ニン.および/またはクレアチンを培養液中に添加して
、さらに培養するか、または一旦集菌して洗浄した後、
クレアチニンおよび/またはクレアチンを含む溶液中て
、本菌株を通気攪拌して適応培養することにより菌体内
に酵素を生成蓄積せしめることができる。菌体内から酵
素を抽出し、分離精製するには通常の方法を用いること
ができる。
、分離精製することにより、酵素粉末を同時に、または
別々に得ることができる。さらに具体的に説明すると、
アルカリゲネス属蔀−2株をクレアチニンおよび/また
はクレアチンを主たる窒素源および炭素源とし、さらに
適当な無機塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化鉄およ
び有機微量栄養物質として酵母工キズ、麦芽工キズを添
加した培地で、中性付近のPHにて一般的な培養条件、
すなわち25〜35℃で1〜2日間通気攪拌培養すれは
、菌体の増殖とともに酵素か菌体内に生成蓄積される。
また本菌株を一般に菌体増殖のために用いる通常の窒素
源および炭素源、例えば窒素源としてポリペプトン、コ
ーンステープリカー、肉工,キズ、尿素を用い、また炭
素源としてブドウ糖、庶糖、グリセロールを用い、さら
に無機塩類および微量栄養物質を添加した液体培地で、
中性付近のPHにおいて、25〜35゜Cで1〜2日間
通気攪拌して培養した後、菌体の増殖終了時にクレアチ
ニン.および/またはクレアチンを培養液中に添加して
、さらに培養するか、または一旦集菌して洗浄した後、
クレアチニンおよび/またはクレアチンを含む溶液中て
、本菌株を通気攪拌して適応培養することにより菌体内
に酵素を生成蓄積せしめることができる。菌体内から酵
素を抽出し、分離精製するには通常の方法を用いること
ができる。
例えば菌体磨砕、超音波処理、自己消化法により無細胞
酵素液とした後、硫酸アンモニウム塩析、アセトン、ア
ルコール等による溶媒沈澱法により部分精製してクレア
チニンアミドヒドロラーゼおよびクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼを含む複合酵素標品とするか、あるいは硫安
分画法により低飽和濃度で沈☆化するクレアチニンアミ
ドヒドロラーゼをまず昶取し、さらに硫安濃度を高飽和
度としてクレア「ンアミジノヒドロラーゼを沈澱させ回
収する方(などがある。さらに高度に精製した酵素標品
をJるにはイオン交換クロマトグラフィーおよび分j一
篩により精製することができる。本発明で得られた酵素
は次の性質を有してい3。
酵素液とした後、硫酸アンモニウム塩析、アセトン、ア
ルコール等による溶媒沈澱法により部分精製してクレア
チニンアミドヒドロラーゼおよびクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼを含む複合酵素標品とするか、あるいは硫安
分画法により低飽和濃度で沈☆化するクレアチニンアミ
ドヒドロラーゼをまず昶取し、さらに硫安濃度を高飽和
度としてクレア「ンアミジノヒドロラーゼを沈澱させ回
収する方(などがある。さらに高度に精製した酵素標品
をJるにはイオン交換クロマトグラフィーおよび分j一
篩により精製することができる。本発明で得られた酵素
は次の性質を有してい3。
クレアチニンアミドヒドロラーゼ
1作用
クレアチニンニクレアチン
2至適PHはPH7〜8てあり、安定PH範囲はPH5
〜7.5と酸性側でも比較的安定てある。
〜7.5と酸性側でも比較的安定てある。
この酵素の各PHのクレアチンに対する活性度を第1図
に、また各PH条件下で25゜C..田時間放置したと
きの残存活性を第2図に示す。3至適温度は50〜60
℃で温度耐性のよい性質を有している。
に、また各PH条件下で25゜C..田時間放置したと
きの残存活性を第2図に示す。3至適温度は50〜60
℃で温度耐性のよい性質を有している。
4力価の測定法
M/50燐酸緩衝液でPH8.Oに調整した100ミリ
モルのクレアチン溶液Lmlへ適当に稀釈した酵素液0
.1m1を添加し、37℃で1紛間反応させる。
モルのクレアチン溶液Lmlへ適当に稀釈した酵素液0
.1m1を添加し、37℃で1紛間反応させる。
反応混液からその0.1m1をサンプリングし、1%ピ
クリン酸1m1、1Nカセイソーダ1m1および蒸留水
1m1の中に注加し、25℃、2紛間放置する。分光光
度計で酵素反応0分の時の試料を対照として520r1
Tn.の吸光度を測定し、次の通り計算する。UImL
=Δ0DX6.45×酵素稀釈倍率ここでクレアチニン
アミドヒドロラーゼ1単位は上記反応条件で1分間に1
マイクロモルのクレアチニンを生成する酵素量と定める
。
クリン酸1m1、1Nカセイソーダ1m1および蒸留水
1m1の中に注加し、25℃、2紛間放置する。分光光
度計で酵素反応0分の時の試料を対照として520r1
Tn.の吸光度を測定し、次の通り計算する。UImL
=Δ0DX6.45×酵素稀釈倍率ここでクレアチニン
アミドヒドロラーゼ1単位は上記反応条件で1分間に1
マイクロモルのクレアチニンを生成する酵素量と定める
。
クレアチンアミジノヒドロラーゼ
1作用
クレアチン→尿素+ザルコシン
2至適PHはPH7〜8であり、安定PH範囲はPH6
〜8である。
〜8である。
この酵素の各PHのクレアチンに対する活性度を第1図
に、または各PH条件下で25℃、川時間放置したとき
の残存活性を第2図に示す。3至適温度は45℃付近で
あるが、50℃以上では不安定である。
に、または各PH条件下で25℃、川時間放置したとき
の残存活性を第2図に示す。3至適温度は45℃付近で
あるが、50℃以上では不安定である。
4力価の測定法
M/50燐酸緩衝液でPH8.Oに調整した100ミリ
モルのクレアチン溶液1mtに適当に稀釈した酵素液0
.1m1を添加し、37℃で1紛間反応させる。
モルのクレアチン溶液1mtに適当に稀釈した酵素液0
.1m1を添加し、37℃で1紛間反応させる。
反応混液1m1に対してボ塩酸濃度に調製したジメチル
スルフオキシド溶液で2%濃度にしたP−ジメチルアミ
ノベンズアルデヒド溶液の2m1を添加し、25℃で2
紛間放置する。酵素反応0分の時の試料を対照として分
光光度計により435nTr1.の吸光度を測定し、次
の通り計算する。UIml=Δ0D×6.45×酵素稀
釈倍率ここでクレアチンアミジノヒドロラーゼ1単位は
上記反応条件で1分間に1マイクロモルの尿素を生成す
る酵素量と定める。
スルフオキシド溶液で2%濃度にしたP−ジメチルアミ
ノベンズアルデヒド溶液の2m1を添加し、25℃で2
紛間放置する。酵素反応0分の時の試料を対照として分
光光度計により435nTr1.の吸光度を測定し、次
の通り計算する。UIml=Δ0D×6.45×酵素稀
釈倍率ここでクレアチンアミジノヒドロラーゼ1単位は
上記反応条件で1分間に1マイクロモルの尿素を生成す
る酵素量と定める。
次に実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例1クレアチン1%、酵母工キズ0.1%、麦芽工
キズ0.03%、リン酸2カリウム0.7%、リン酸1
カリウム0.15%及び10−3M硫酸マンガン、10
−4M塩化第二鉄を水道水に添加溶解し、PH7.4に
調整した培地を100mLずつ、500mL容量の肩付
フラスコに分注して加圧殺菌した。この培地にアルカリ
ゲネス属ΔK−2株(微工研菌寄第4105号)を一白
菌耳、植菌して30゜Cで2@間振盪培養したところ培
地中のクレアチンはほぼ消失した。遠心分離により1.
5yの湿菌体を回収し、さらにM/20リン酸緩衝液(
PH7.4)100m1で懸濁して10mtとした後、
超音波破砕装置で2紛間処理してから遠心分離により無
細胞抽出液を得た。残菌体を同一緩衝液て洗浄して合計
30mLの淡黄色透明な無細胞抽出液を回収した。本液
中のクレアチニンアミドヒドロラーゼ全活性は15弾位
であり、クレアチンアミジノヒドロラーゼ全活性は14
弾位であつた。無細胞抽出液30m1へ硫酸アンモニウ
ム14yを添加溶解したところ白濁した。これから遠心
分離により沈澱を回収した後、M/50リン酸緩衝液(
PH6.O)10m1に懸濁溶解し、不溶物を遠心分離
により除去することにより淡黄色の粗酵素液10m1を
得た。M/50リン酸緩衝液(PH7.O)に透析する
ことにより部分精製された複合酵素液15m1を得た。
なお、本液中のクレアチニンアミドヒドロラーゼ活性は
12弾位であり、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性
は90#FL位であつた。実施例2 ペプトン2%、酵母工キズ0.4%、麦芽工キズ0.1
%、リン酸2カリウム1.4%、リン酸1カリウム0.
3%および10−3M硫酸マンガン、10−4M塩化第
二鉄を含むPH7.4に調整した培地50m1と4%ブ
ドウ糖溶液50mtとを別個に加圧殺菌してから混合し
た培地にアルカリゲネス属蔀−2株を一白金耳植菌し、
30℃で2?間振盪培養したものを種菌とした。
キズ0.03%、リン酸2カリウム0.7%、リン酸1
カリウム0.15%及び10−3M硫酸マンガン、10
−4M塩化第二鉄を水道水に添加溶解し、PH7.4に
調整した培地を100mLずつ、500mL容量の肩付
フラスコに分注して加圧殺菌した。この培地にアルカリ
ゲネス属ΔK−2株(微工研菌寄第4105号)を一白
菌耳、植菌して30゜Cで2@間振盪培養したところ培
地中のクレアチンはほぼ消失した。遠心分離により1.
5yの湿菌体を回収し、さらにM/20リン酸緩衝液(
PH7.4)100m1で懸濁して10mtとした後、
超音波破砕装置で2紛間処理してから遠心分離により無
細胞抽出液を得た。残菌体を同一緩衝液て洗浄して合計
30mLの淡黄色透明な無細胞抽出液を回収した。本液
中のクレアチニンアミドヒドロラーゼ全活性は15弾位
であり、クレアチンアミジノヒドロラーゼ全活性は14
弾位であつた。無細胞抽出液30m1へ硫酸アンモニウ
ム14yを添加溶解したところ白濁した。これから遠心
分離により沈澱を回収した後、M/50リン酸緩衝液(
PH6.O)10m1に懸濁溶解し、不溶物を遠心分離
により除去することにより淡黄色の粗酵素液10m1を
得た。M/50リン酸緩衝液(PH7.O)に透析する
ことにより部分精製された複合酵素液15m1を得た。
なお、本液中のクレアチニンアミドヒドロラーゼ活性は
12弾位であり、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性
は90#FL位であつた。実施例2 ペプトン2%、酵母工キズ0.4%、麦芽工キズ0.1
%、リン酸2カリウム1.4%、リン酸1カリウム0.
3%および10−3M硫酸マンガン、10−4M塩化第
二鉄を含むPH7.4に調整した培地50m1と4%ブ
ドウ糖溶液50mtとを別個に加圧殺菌してから混合し
た培地にアルカリゲネス属蔀−2株を一白金耳植菌し、
30℃で2?間振盪培養したものを種菌とした。
同一培地10eを含む20e容量のジヤーフアーメンタ
ーへ種菌を添加して30℃で通気攪拌した。■時間後連
続遠心機にて湿菌体を回収し、こ″れをクレアチニン1
009、酵母工キズ10y1麦芽工キズ3V1リン酸二
カリウム50q1リン酸一カリウム10Vを水道水10
eて溶解した培地へ添加して均一に懸濁したのち28℃
で1満間20e容量のジヤーフアーメンター内で通気攪
拌培養した。連続遠心機で集菌して320yの湿菌体を
採取し、これをM/50リン酸緩衝液(PH7.4)2
fで懸濁してから菌体磨砕機、ダイノミルKD上にてガ
ラスビーズ磨砕により菌体内の酵素を抽出し、連続遠心
分離により不溶物を除去することによつて粗酵゛素液1
.8eを得た。この粗酵素液へ硫酸アンモニウム430
fを添加して塩析物1を回収した。次に濾液へ再び硫酸
アンモニウム360yを添加溶解して生ずる塩析物■を
回収した。塩析物1をM/50リン酸緩衝液(PH6.
O)200m1で溶解し、不溶物を除去したのちセフア
デツクスG−25カラムに通液して300m1の酵素画
分を回収した。
ーへ種菌を添加して30℃で通気攪拌した。■時間後連
続遠心機にて湿菌体を回収し、こ″れをクレアチニン1
009、酵母工キズ10y1麦芽工キズ3V1リン酸二
カリウム50q1リン酸一カリウム10Vを水道水10
eて溶解した培地へ添加して均一に懸濁したのち28℃
で1満間20e容量のジヤーフアーメンター内で通気攪
拌培養した。連続遠心機で集菌して320yの湿菌体を
採取し、これをM/50リン酸緩衝液(PH7.4)2
fで懸濁してから菌体磨砕機、ダイノミルKD上にてガ
ラスビーズ磨砕により菌体内の酵素を抽出し、連続遠心
分離により不溶物を除去することによつて粗酵゛素液1
.8eを得た。この粗酵素液へ硫酸アンモニウム430
fを添加して塩析物1を回収した。次に濾液へ再び硫酸
アンモニウム360yを添加溶解して生ずる塩析物■を
回収した。塩析物1をM/50リン酸緩衝液(PH6.
O)200m1で溶解し、不溶物を除去したのちセフア
デツクスG−25カラムに通液して300m1の酵素画
分を回収した。
本液中にはクレアチニンアミドヒドロラーゼが4200
弾位含まれていた。この溶液を凍結乾燥することにより
、1mg当り1弾位のクレアチニ”ンアミドヒドロラー
ゼの粉末2.8yを得た。一方、塩析物■を2ミリモル
のメルカプトエタノールを含むM/20リン酸緩衝液(
PH8.O)300m1に溶解し、セフアデツクスG−
25カラムで通液脱塩したのち凍結乾燥することにより
クレアチンアミジノヒドロラーゼを1m9当り0.6単
位含む粉末24.6yを得た。実施例3 実施例2と同様にして得た塩析物1をM/50リン酸緩
衝液(PH6.O)で溶解し、不溶物を除去したのち、
セフアデツクスG−25カラムに通液した。
弾位含まれていた。この溶液を凍結乾燥することにより
、1mg当り1弾位のクレアチニ”ンアミドヒドロラー
ゼの粉末2.8yを得た。一方、塩析物■を2ミリモル
のメルカプトエタノールを含むM/20リン酸緩衝液(
PH8.O)300m1に溶解し、セフアデツクスG−
25カラムで通液脱塩したのち凍結乾燥することにより
クレアチンアミジノヒドロラーゼを1m9当り0.6単
位含む粉末24.6yを得た。実施例3 実施例2と同様にして得た塩析物1をM/50リン酸緩
衝液(PH6.O)で溶解し、不溶物を除去したのち、
セフアデツクスG−25カラムに通液した。
得られた100mLの酵素溶液を60℃で3紛処理した
後、不溶物を遠心分離により除去し、次いで常法により
塩析、脱塩した。得られた溶液を凍結乾燥してクレアチ
ニンアミドヒドロラーゼを1m9当り4弾位含む粉末1
63mgを得た。この粉末にはクレアチンアミジノヒド
ロラーゼは含まれていなかつた。また実施例2と同様に
して得た塩析物■を2ミリモルのメルカプトエタノール
を含むM/20リン酸緩衝液(PH8.O)に溶解し、
セフアデツクスG−25カラムで通液、脱塩した。
後、不溶物を遠心分離により除去し、次いで常法により
塩析、脱塩した。得られた溶液を凍結乾燥してクレアチ
ニンアミドヒドロラーゼを1m9当り4弾位含む粉末1
63mgを得た。この粉末にはクレアチンアミジノヒド
ロラーゼは含まれていなかつた。また実施例2と同様に
して得た塩析物■を2ミリモルのメルカプトエタノール
を含むM/20リン酸緩衝液(PH8.O)に溶解し、
セフアデツクスG−25カラムで通液、脱塩した。
得られた1507TLtの酵素溶液を予めM/20リン
酸緩衝液(PH7.5)で平衡化したDEAE−セルロ
ースカラム(2.8cm径×40cm高)へ負荷し、同
一緩衝液で洗浄したのち、同一緩衝液とM/2塩化カリ
ウムを含む同一緩衝液との濃度勾配を作つて溶出した。
M/10〜M/5の塩化カリウムを含む画分にクレアチ
ンアミジノヒドロラーゼが含まれる。この画分200m
1を常法により塩析、脱塩し、次いで凍結乾燥し、1m
9当り3.弾位の粉末630m9を得た。なお、この粉
末にはクレアチニンアミドヒドロラーゼは含まれていな
かつた。
酸緩衝液(PH7.5)で平衡化したDEAE−セルロ
ースカラム(2.8cm径×40cm高)へ負荷し、同
一緩衝液で洗浄したのち、同一緩衝液とM/2塩化カリ
ウムを含む同一緩衝液との濃度勾配を作つて溶出した。
M/10〜M/5の塩化カリウムを含む画分にクレアチ
ンアミジノヒドロラーゼが含まれる。この画分200m
1を常法により塩析、脱塩し、次いで凍結乾燥し、1m
9当り3.弾位の粉末630m9を得た。なお、この粉
末にはクレアチニンアミドヒドロラーゼは含まれていな
かつた。
第1図はクレアチニンアミドヒドロラーゼ(CNと略記
する)およびクレアチンアミジノヒドロラーゼ(CIと
略記する)の各PHの基質に対する活性度を比較したも
のである。
する)およびクレアチンアミジノヒドロラーゼ(CIと
略記する)の各PHの基質に対する活性度を比較したも
のである。
Claims (1)
- 1 アルカリゲネス属に属するAK−2株(微工研菌寄
第4105号)を培養し、培養物からクレアチニンアミ
ドヒドロラーゼおよび/またはクレアチンアミジノヒド
ロラーゼを採取することを特徴とするクレアチニンアミ
ドヒドロラーゼおよび/またはクレアチンアミジノヒド
ロラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10503978A JPS6050437B2 (ja) | 1978-08-28 | 1978-08-28 | クレアチニンアミドヒドロラ−ゼおよび/またはクレアチンアミジノヒドロラ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10503978A JPS6050437B2 (ja) | 1978-08-28 | 1978-08-28 | クレアチニンアミドヒドロラ−ゼおよび/またはクレアチンアミジノヒドロラ−ゼの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5534029A JPS5534029A (en) | 1980-03-10 |
JPS6050437B2 true JPS6050437B2 (ja) | 1985-11-08 |
Family
ID=14396854
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10503978A Expired JPS6050437B2 (ja) | 1978-08-28 | 1978-08-28 | クレアチニンアミドヒドロラ−ゼおよび/またはクレアチンアミジノヒドロラ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6050437B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5639781A (en) * | 1979-09-11 | 1981-04-15 | Kobayashi Seiyaku Kk | Preparation of creatinineamidohydrolase |
JP2904386B2 (ja) * | 1992-03-05 | 1999-06-14 | コスモ石油株式会社 | シンカー埋設方法およびシンカー |
JP5470906B2 (ja) * | 2009-02-26 | 2014-04-16 | 東洋紡株式会社 | カタラーゼ |
-
1978
- 1978-08-28 JP JP10503978A patent/JPS6050437B2/ja not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5534029A (en) | 1980-03-10 |
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