JPS60149399A - アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイムの測定法 - Google Patents
アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイムの測定法Info
- Publication number
- JPS60149399A JPS60149399A JP59004495A JP449584A JPS60149399A JP S60149399 A JPS60149399 A JP S60149399A JP 59004495 A JP59004495 A JP 59004495A JP 449584 A JP449584 A JP 449584A JP S60149399 A JPS60149399 A JP S60149399A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ast
- protease
- isozyme
- activity
- aspartate aminotransferase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/52—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving transaminase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は血清、血漿など被検試料中のアスパラギン酸ア
ミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２，６，ＬＬ、系統名８
Ｌ−＾５ｐａｒｔａｔｅ ： ２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒ
ａｔｅ ａｍｉｎｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ、ａｓｅ ｓ別
名＝ Ｇｌｕｔａｍｉｃ −ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃｔ
ｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、以下ｒＡｓＴＪという）アイ
ソザイムの測定法に関する。さらに詳しくは、公知のＡ
Ｓ ’ｒ’の測定法において、細胞質性のＡＳＴアイ
ソザイムを特異的に阻害する活性を有するプロテアーゼ
を用いて該アイソザイムを不活性化せしめ、 −ミトコ
ンドリア性のＡＳＴアイソザイムのみを測定する方法に
関する。
ミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２，６，ＬＬ、系統名８
Ｌ−＾５ｐａｒｔａｔｅ ： ２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒ
ａｔｅ ａｍｉｎｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ、ａｓｅ ｓ別
名＝ Ｇｌｕｔａｍｉｃ −ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃｔ
ｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、以下ｒＡｓＴＪという）アイ
ソザイムの測定法に関する。さらに詳しくは、公知のＡ
Ｓ ’ｒ’の測定法において、細胞質性のＡＳＴアイ
ソザイムを特異的に阻害する活性を有するプロテアーゼ
を用いて該アイソザイムを不活性化せしめ、 −ミトコ
ンドリア性のＡＳＴアイソザイムのみを測定する方法に
関する。
ＡＳＴアイソザイムは肝臓、心筋、脳、骨格筋、腎臓な
どに存在し、次の反応を触媒する酵素として知られてい
る。
どに存在し、次の反応を触媒する酵素として知られてい
る。
Ｌ−アスパラギン酸→−２−オキソグルクル酸コオキザ
ロ酢酸＋Ｌ−グルタミン酸 ＡＳＴアイソザイムには、局在性を異にする細胞質性の
ＡＳＴアイソザイム（以下ｒｓ＝ＡｓＴＪという）とミ
トコンドリア性のＡＳＴアイソザイム（以下１ｍ−Ａ
Ｓ Ｔ Ｊという）の二種類のアイソザイムが存在し、
これらの分別定量は肝炎、心筋梗塞などの臨床診断法と
して′有用である。
ロ酢酸＋Ｌ−グルタミン酸 ＡＳＴアイソザイムには、局在性を異にする細胞質性の
ＡＳＴアイソザイム（以下ｒｓ＝ＡｓＴＪという）とミ
トコンドリア性のＡＳＴアイソザイム（以下１ｍ−Ａ
Ｓ Ｔ Ｊという）の二種類のアイソザイムが存在し、
これらの分別定量は肝炎、心筋梗塞などの臨床診断法と
して′有用である。
従来ＡＳＴアイソザイムの測定は、陰イオン交換体を用
いるクロマトグラフィー法（臨床化学、第５巻、１６３
頁、１９７７年）、免疫化学的方法および電気泳動法な
どが用いられているが、これらの方法は操作が煩雑であ
ること、測定に長い時間を要すること、および測定感度
並びに精度が十分でないなどの種々の欠点を有している
。
いるクロマトグラフィー法（臨床化学、第５巻、１６３
頁、１９７７年）、免疫化学的方法および電気泳動法な
どが用いられているが、これらの方法は操作が煩雑であ
ること、測定に長い時間を要すること、および測定感度
並びに精度が十分でないなどの種々の欠点を有している
。
本発明者らはＡＳＴアイソザイムの分別定量を目的とし
て、これらアイソザイムの阻害物質を検索したところ、
ストレプトミセス属に属する菌株が、ｓ −Ａ Ｓ Ｔ
は阻害するがｍ”ＡＳＴを全く阻害しない物質を生産す
ることを知った。そこで、この阻害物質を精製単離して
その理化学的性質を調べたところ、意外にもセリンプロ
テアーゼに分類される酵素であることがわかった。そこ
で、さらに公知のプロテアーゼについてＡＳＴアイソザ
イムに対する作用を調べたところ、セリンプロテアーゼ
に分類される酵素の中に本発明者らが見いだした上記阻
害物質と同様の阻害活性を示すものがあることを知った
。これらセリンプロテアーゼとは、プロナーゼ〔ストレ
プトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｇｒｉｓｅｕｓ）起源のアルカリ性プロテアーゼ）、ス
ブチリシン（５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ、バチルス属菌起源
のアルカリ性プロテアーゼ）などである。従来ＡＳＴア
イソザイムのプロテアーゼによる感受性の差異を明確に
した例はなく、本発明者らの報告が最初である。本発明
は上記知見に基づいて完成されたものであり、本発明法
によれば、二種類のＡＳＴアイソザイムを分離すること
なく、簡便かつ精度よく測定することが可能となった。
て、これらアイソザイムの阻害物質を検索したところ、
ストレプトミセス属に属する菌株が、ｓ −Ａ Ｓ Ｔ
は阻害するがｍ”ＡＳＴを全く阻害しない物質を生産す
ることを知った。そこで、この阻害物質を精製単離して
その理化学的性質を調べたところ、意外にもセリンプロ
テアーゼに分類される酵素であることがわかった。そこ
で、さらに公知のプロテアーゼについてＡＳＴアイソザ
イムに対する作用を調べたところ、セリンプロテアーゼ
に分類される酵素の中に本発明者らが見いだした上記阻
害物質と同様の阻害活性を示すものがあることを知った
。これらセリンプロテアーゼとは、プロナーゼ〔ストレ
プトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｇｒｉｓｅｕｓ）起源のアルカリ性プロテアーゼ）、ス
ブチリシン（５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ、バチルス属菌起源
のアルカリ性プロテアーゼ）などである。従来ＡＳＴア
イソザイムのプロテアーゼによる感受性の差異を明確に
した例はなく、本発明者らの報告が最初である。本発明
は上記知見に基づいて完成されたものであり、本発明法
によれば、二種類のＡＳＴアイソザイムを分離すること
なく、簡便かつ精度よく測定することが可能となった。
本発明に用いるプロテアーゼとは、５−ＡＳＴを特異的
に阻害する活性を有するプロテアーゼであれば何れでも
よいが、好ましくは本発明者らが゛土壌よりスクリーニ
ングして見いだしたストレプトミセス属に属す、るＮ［
１９７２２株が産生ずるプロテアーゼが用いられる。Ｎ
ａ ９７２２株は次の菌学的性質を有する。
に阻害する活性を有するプロテアーゼであれば何れでも
よいが、好ましくは本発明者らが゛土壌よりスクリーニ
ングして見いだしたストレプトミセス属に属す、るＮ［
１９７２２株が産生ずるプロテアーゼが用いられる。Ｎ
ａ ９７２２株は次の菌学的性質を有する。
（ａ）形態
基生菌糸から１μ内外の気菌糸を伸張しその先端に開放
型らせん状胞子の連鎖がみられる。
型らせん状胞子の連鎖がみられる。
気菌糸は単純分枝で車軸分枝はみられない。胞子の形態
は楕円形ないし円筒形で表面構造は平滑であり、その連
鎖数は１０胞子以上である。胞子の大きさは０．６〜１
．２μ×０．７〜１．８μである。鞭毛胞子、菌核、胞
子のうは認められない。
は楕円形ないし円筒形で表面構造は平滑であり、その連
鎖数は１０胞子以上である。胞子の大きさは０．６〜１
．２μ×０．７〜１．８μである。鞭毛胞子、菌核、胞
子のうは認められない。
ｌｂ）各培地における生育状態
１４〜２１日間培養したときの生育状態を第１表に示す
。
。
（以下余白）
＋ｃ＋生理的性質
■生育温度範囲
Ｂｅｎｎｅｔｉｓ ｂｒｏｔｈを用い−た温度勾配培養
装置での生育試験の結果、１０〜３６℃で生育した。
装置での生育試験の結果、１０〜３６℃で生育した。
■ゼラチンの液化：陽性
■スターチの加水分解：陽性
■脱脂牛乳の凝固：陰性
■脱脂牛乳のペプトン化：陽性
■メラニン様色素の生成：陽性
（ｄｌ炭素源の同化性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培
地上） Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、
Ｌ−ラムノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース
、Ｄ−マンニット、サリシン、シュークロースを利用す
る。イノジット、ラフィノースを利用しない。
地上） Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、
Ｌ−ラムノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース
、Ｄ−マンニット、サリシン、シュークロースを利用す
る。イノジット、ラフィノースを利用しない。
以上からＮｕ ９７２２株の性状を要約すると、気菌糸
はらせん糸を形成し、胞子表面構造は平滑である。
はらせん糸を形成し、胞子表面構造は平滑である。
気菌糸の色は茶灰色から灰味オリーブである。メラニン
様色素の産生は陽性で一部の培地で赤紫色の可溶性色素
を生産する。以上の菌学的性質を示す菌種について、パ
ージエイズ・マニュアル・オブ・デイターミネイティブ
・バタテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ：ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉ
−ｏｌｏｇｙ ）第７版（１９５７年）、同第８版（
１９７４年）、シャーリングとゴドリーブのＩＳＰ （
インターナシボナル・ストレプトミセス・プロジェクト
）報告（１９６８年、１９６９年および１９７２年）お
よびワックスマン著、ジ・アクチノミセテス（Ｔｈｅ
Ａｃｔｉｎｏ −ｍｙｃｅｔｅｓ ）第２巻（１９６１
年）を参考に検索すると、Ｎ１９７２２株に最も近縁す
るものとしてストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｃｈｒ
ｏｍｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。即ち、気菌糸の色調
が灰色でらせん糸を形成すること、赤紫色の可溶性色素
を生産すること、胞子表面が平滑であること、メラニン
様色素の生成が陽性であること（ペプトン・イースト・
鉄寒天培地で陽性、チロシン寒天培地で陰性）などの点
がよく一致している。糖の利用性については、イノジッ
トとラフィノースを利用しない点が異なっている。
様色素の産生は陽性で一部の培地で赤紫色の可溶性色素
を生産する。以上の菌学的性質を示す菌種について、パ
ージエイズ・マニュアル・オブ・デイターミネイティブ
・バタテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ：ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉ
−ｏｌｏｇｙ ）第７版（１９５７年）、同第８版（
１９７４年）、シャーリングとゴドリーブのＩＳＰ （
インターナシボナル・ストレプトミセス・プロジェクト
）報告（１９６８年、１９６９年および１９７２年）お
よびワックスマン著、ジ・アクチノミセテス（Ｔｈｅ
Ａｃｔｉｎｏ −ｍｙｃｅｔｅｓ ）第２巻（１９６１
年）を参考に検索すると、Ｎ１９７２２株に最も近縁す
るものとしてストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｃｈｒ
ｏｍｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。即ち、気菌糸の色調
が灰色でらせん糸を形成すること、赤紫色の可溶性色素
を生産すること、胞子表面が平滑であること、メラニン
様色素の生成が陽性であること（ペプトン・イースト・
鉄寒天培地で陽性、チロシン寒天培地で陰性）などの点
がよく一致している。糖の利用性については、イノジッ
トとラフィノースを利用しない点が異なっている。
以上のようＧご、歯、９７２２株はストレプトミセス・
ビオラセオクロモゲネスと糖の利用性について若干の相
違があるものの異なる菌種と考えられる程の相違ではな
く、ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネスと種を
同じくするものと判断し、ストレプトミセス・ビオラセ
オクロモゲネス１ｍ ９７２２と命名した。本菌株は、
通産省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
７３６２号（ＦＢ、ＲＭ Ｐ−７３６’２）として寄託
されている。
ビオラセオクロモゲネスと糖の利用性について若干の相
違があるものの異なる菌種と考えられる程の相違ではな
く、ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネスと種を
同じくするものと判断し、ストレプトミセス・ビオラセ
オクロモゲネス１ｍ ９７２２と命名した。本菌株は、
通産省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
７３６２号（ＦＢ、ＲＭ Ｐ−７３６’２）として寄託
されている。
上記菌株によって本発明に用いるプロテアーゼを製造す
るには、まず本菌株を栄養培地に培養して、培養物中に
プロテアーゼを蓄積せしめる。培養方法は、放線菌の一
般的な培養方法が用いられる。例えば、用いる栄養培地
としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源および無
機物などを含む合成培地または天然培地が用いられる。
るには、まず本菌株を栄養培地に培養して、培養物中に
プロテアーゼを蓄積せしめる。培養方法は、放線菌の一
般的な培養方法が用いられる。例えば、用いる栄養培地
としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源および無
機物などを含む合成培地または天然培地が用いられる。
炭素源としてはグルコース、フラクト−ス、マルトース
、シュクロース、糖蜜、澱粉、デキストリン、有機酸お
よびグリセリンなどが使用される。窒素源としては麦芽
エキス、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、肉エキス、
コーンスチープリカー、カゼイン、アミノ酸などの有機
窒素源、および硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素
源が使用される。
、シュクロース、糖蜜、澱粉、デキストリン、有機酸お
よびグリセリンなどが使用される。窒素源としては麦芽
エキス、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、肉エキス、
コーンスチープリカー、カゼイン、アミノ酸などの有機
窒素源、および硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素
源が使用される。
無機物としてはカリウム、ナトリウム、マグネシウム、
カルシウム、亜鉛、鉄などの無機塩が必要に応じて使用
される。培養中の発泡を抑えるために、界面活性剤、シ
リコン、植物油などの消泡剤を添加することもできる。
カルシウム、亜鉛、鉄などの無機塩が必要に応じて使用
される。培養中の発泡を抑えるために、界面活性剤、シ
リコン、植物油などの消泡剤を添加することもできる。
培養は、通常振盪または通気攪拌下好気的条件のもとに
おこなうのがよい。培養温度は菌が生育しプロテアーゼ
が生産される範囲内であればいずれの温度でもよいが、
好ましくは２０〜３５°Ｃである。
おこなうのがよい。培養温度は菌が生育しプロテアーゼ
が生産される範囲内であればいずれの温度でもよいが、
好ましくは２０〜３５°Ｃである。
培地のｐＨは通常６〜９の範囲が好ましい。培養時間は
プ・テアー署の生産が最大に達する時間を選べばよく、
通常３０〜５０時間である。
プ・テアー署の生産が最大に達する時間を選べばよく、
通常３０〜５０時間である。
以上のようにして得られた培養物からプロテアーゼを採
取するには、その理化学的性質を利用して、公知の蛋白
質の精製法を適宜組み合わせて行うことができる。例え
ば、培養物をろ過もしくは遠心分離して菌体を除いたの
ち、硫安、硫酸ナトリウムなどを用いた塩析、エタノー
ル、メタノール、アセ１−ンなどを用いた有機溶媒沈澱
、活性炭、シリカケル、アルミナ、ヒドロキシアパタイ
ト、セルロースなどを用いた吸着クロマトグラフィー、
イオン交換樹脂、イオン交換セルロース、イオン交換セ
ファデックスなどを用いたイオン交換クロマトグラフィ
ー、セファデックス、バイオゲルなどを用いたケルろ過
および電気泳動、限外ろ過、透析なとの公知の方法を任
意の順序で適宜組め合せ、または繰り返すことにより精
製する。
取するには、その理化学的性質を利用して、公知の蛋白
質の精製法を適宜組み合わせて行うことができる。例え
ば、培養物をろ過もしくは遠心分離して菌体を除いたの
ち、硫安、硫酸ナトリウムなどを用いた塩析、エタノー
ル、メタノール、アセ１−ンなどを用いた有機溶媒沈澱
、活性炭、シリカケル、アルミナ、ヒドロキシアパタイ
ト、セルロースなどを用いた吸着クロマトグラフィー、
イオン交換樹脂、イオン交換セルロース、イオン交換セ
ファデックスなどを用いたイオン交換クロマトグラフィ
ー、セファデックス、バイオゲルなどを用いたケルろ過
および電気泳動、限外ろ過、透析なとの公知の方法を任
意の順序で適宜組め合せ、または繰り返すことにより精
製する。
以上の方法により得られたプロテアーゼの理化学的性質
を次に示す。
を次に示す。
■作用：５−ＡＳＴを阻害するがｍ −Ａ Ｓ Ｔは阻
害しない。カゼイン等の蛋白質の氷解反応を触媒する。
害しない。カゼイン等の蛋白質の氷解反応を触媒する。
■基質特異性コカゼイン、ヘモグロビン、アゾコール、
アルブミンに作用する。
アルブミンに作用する。
■至適ｐ＋ｌ：ｌ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）およ
びグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、（ｐＨｌＯ〜１
２）に熔解したカゼイン（１，３３％）を基質として測
定したところ、至適ｐＨは１１．６付近であった。
びグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、（ｐＨｌＯ〜１
２）に熔解したカゼイン（１，３３％）を基質として測
定したところ、至適ｐＨは１１．６付近であった。
■安定ｐ１１：３７“Ｃ１１４時間処理したところ、ｐ
１１５〜６の範囲で安定であった。
１１５〜６の範囲で安定であった。
■至適温度： ｐｉ ９．５で１０分間反応したところ
、至適温度は７５℃であった。
、至適温度は７５℃であった。
■温度安定性： ｐＨ８，５において、各温度で１０分
間処理したところ、５５°Ｃで１００％、６５°Ｃで８
５％の活性が残存していた。
間処理したところ、５５°Ｃで１００％、６５°Ｃで８
５％の活性が残存していた。
■分子量： １７，５００〜１８，０００ （Ｓ Ｄ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動法による。） ■等電点：９．８（焦点電気泳動法による。）■阻害剤
：フェニルメチルスルホニルフルオライドにより阻害さ
れる。ＥＤＴＡでは阻害されない。
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動法による。） ■等電点：９．８（焦点電気泳動法による。）■阻害剤
：フェニルメチルスルホニルフルオライドにより阻害さ
れる。ＥＤＴＡでは阻害されない。
［相］物質の色、形：白色、菱面体結晶本発明法におい
ては、上述のプロテアーゼの他に５−ＡＳＴを特異的に
阻害する性質を有するプロテアーゼであれば何れも使用
できる。これらプロテアーゼの例としては、プロナーゼ
（ストレプ（・ミセス・グリセウス（Ｓ、 ｇｒｉｓｅ
ｕｓ）起源のアルカリ性プロテアーゼ、利研化学社製〕
、スブチリシン（Ｓｕｂｔｉ ｌ１ｓｉｎ、バチルス属
菌起源のアルカリ性プロテアーゼ、メソツズ イン エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、）第１
９巻、 １７９−２４５頁 。
ては、上述のプロテアーゼの他に５−ＡＳＴを特異的に
阻害する性質を有するプロテアーゼであれば何れも使用
できる。これらプロテアーゼの例としては、プロナーゼ
（ストレプ（・ミセス・グリセウス（Ｓ、 ｇｒｉｓｅ
ｕｓ）起源のアルカリ性プロテアーゼ、利研化学社製〕
、スブチリシン（Ｓｕｂｔｉ ｌ１ｓｉｎ、バチルス属
菌起源のアルカリ性プロテアーゼ、メソツズ イン エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、）第１
９巻、 １７９−２４５頁 。
（１９７０） ）などが挙げられる。以下、本明細書に
おいてはこれらプロテアーゼを総じて単にプロテアーゼ
という。
おいてはこれらプロテアーゼを総じて単にプロテアーゼ
という。
次に、プロテアーゼを用いたＡＳＴアイソザイムの測定
法について説明する。本発明のＡＳＴアイソザイムの測
定法は、公知のＡＳＴの測定法において、反応液にプロ
テアーゼを添加することにより５−ＡＳＴが特異的に不
活性化される結果、Ｉｌｌ −Ａ Ｓ Ｔのみが測定さ
れる。プロテアーゼを加えないで操作した場合の測定値
、即ち総ＡＳＴとｍ −Ａ Ｓ Ｔの差より５−ＡＳＴ
が定量される。
法について説明する。本発明のＡＳＴアイソザイムの測
定法は、公知のＡＳＴの測定法において、反応液にプロ
テアーゼを添加することにより５−ＡＳＴが特異的に不
活性化される結果、Ｉｌｌ −Ａ Ｓ Ｔのみが測定さ
れる。プロテアーゼを加えないで操作した場合の測定値
、即ち総ＡＳＴとｍ −Ａ Ｓ Ｔの差より５−ＡＳＴ
が定量される。
ＡＳＴの測定法として従来知られているのは、被検試料
と基質（２−オキソグルタル酸およびＬ−アスパラギン
酸）を混合して反応せしめ、生成したオキザロ酢酸をリ
ンゴ酸脱水素酵素により還元して、同時に起こるＮＡＤ
Ｈの減少を測定する方法（Ｋ’ａｒｍｅｎ法、ジャーナ
ル・オブ・クリニカル・インベステイゲーション（Ｊ、
Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、）第３４巻、１２６頁、
１９５５年〕、同じくオキザロ酢酸にジニトロフェニ
ルヒドラジンを作用せしめて、生成色素を４９０−５３
０ｎｍにおける吸光度より測定する方法（Ｒｅｉ ｔｍ
ａｎ−Ｆｒａｎｋｅｌ法、臨床検査 第１２巻、３９８
頁、 １９６８年）、同じくオキザロ酢酸にジアゾニウ
ム塩を作用せしめて、生成色素を５００−５５０ｎｍに
おける吸光度より測定する方法〔クリニカ・キミカ・ア
クタ（Ｃ１ｔｎ、 Ｃｈｉｍ、 Ａｃｔａ）第７巻、１
９９頁、 １９６２年およびクリニカル・ケミストリー
（Ｃ１１ｎ。
と基質（２−オキソグルタル酸およびＬ−アスパラギン
酸）を混合して反応せしめ、生成したオキザロ酢酸をリ
ンゴ酸脱水素酵素により還元して、同時に起こるＮＡＤ
Ｈの減少を測定する方法（Ｋ’ａｒｍｅｎ法、ジャーナ
ル・オブ・クリニカル・インベステイゲーション（Ｊ、
Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、）第３４巻、１２６頁、
１９５５年〕、同じくオキザロ酢酸にジニトロフェニ
ルヒドラジンを作用せしめて、生成色素を４９０−５３
０ｎｍにおける吸光度より測定する方法（Ｒｅｉ ｔｍ
ａｎ−Ｆｒａｎｋｅｌ法、臨床検査 第１２巻、３９８
頁、 １９６８年）、同じくオキザロ酢酸にジアゾニウ
ム塩を作用せしめて、生成色素を５００−５５０ｎｍに
おける吸光度より測定する方法〔クリニカ・キミカ・ア
クタ（Ｃ１ｔｎ、 Ｃｈｉｍ、 Ａｃｔａ）第７巻、１
９９頁、 １９６２年およびクリニカル・ケミストリー
（Ｃ１１ｎ。
Ｃｈｅｍ、）第１９巻、７７６頁、 １９７３年〕など
の方法が知られている。
の方法が知られている。
本発明の好ましい実施方法についてさらに詳細に説明す
ると、血清などの被検試料をプロテアーゼ、血清アルブ
ミンおよび補酵素ピリドキサールリン酸を含む緩衝液と
混合し、１０〜４０’Ｃで１〜３０分間プ分間プレイン
キュコーション−ＡＳＴを不活性化せしめる。次いで、
アスパラギン酸、２−オキソグルタル酸、リンゴ酸脱水
素酵素およびＮＡＤＨを含む緩衝液を加え２５〜３７°
Ｃで反応せしめ、ＮＡＤＨの減少を３４０ｎｍにおける
吸光度の減少より測定する。あらかじめ試料としてｍ
−Ａ Ｓ Ｔを用いて、上記と同様に操作して作成して
おいた検量線と上記測定値を比較することによりｍ−Ａ
ＳＴがめられる。−プロテアーゼを除いた以外は上記と
同様に操作して、得られた総ＡＳＴより上記ｍ−ＡＳＴ
を減することにより５−ＡＳＴがめられる。
ると、血清などの被検試料をプロテアーゼ、血清アルブ
ミンおよび補酵素ピリドキサールリン酸を含む緩衝液と
混合し、１０〜４０’Ｃで１〜３０分間プ分間プレイン
キュコーション−ＡＳＴを不活性化せしめる。次いで、
アスパラギン酸、２−オキソグルタル酸、リンゴ酸脱水
素酵素およびＮＡＤＨを含む緩衝液を加え２５〜３７°
Ｃで反応せしめ、ＮＡＤＨの減少を３４０ｎｍにおける
吸光度の減少より測定する。あらかじめ試料としてｍ
−Ａ Ｓ Ｔを用いて、上記と同様に操作して作成して
おいた検量線と上記測定値を比較することによりｍ−Ａ
ＳＴがめられる。−プロテアーゼを除いた以外は上記と
同様に操作して、得られた総ＡＳＴより上記ｍ−ＡＳＴ
を減することにより５−ＡＳＴがめられる。
本発明におけるプロテアーゼの使用量は、プレインキュ
ヘーションの温度および時間により変化させることがで
きるが、通常ｓ −Ａ Ｓ Ｔ Ｉ Ｋａｒｍｅｎ単位
当り、後述のＡＳＴ阻害活性単位として０．００５〜０
．０５単位である。
ヘーションの温度および時間により変化させることがで
きるが、通常ｓ −Ａ Ｓ Ｔ Ｉ Ｋａｒｍｅｎ単位
当り、後述のＡＳＴ阻害活性単位として０．００５〜０
．０５単位である。
本発明におけるＡＳＴアイソザイム阻害活性の測定法は
次のとおりである。０．１ｍｇ／ｍｌ！牛血清アルブミ
ンおよび４μＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）に５−ＡＳＴまたはｍ−
ＡＳ、Ｔ（いずれもブタ心臓起源、■。
次のとおりである。０．１ｍｇ／ｍｌ！牛血清アルブミ
ンおよび４μＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）に５−ＡＳＴまたはｍ−
ＡＳ、Ｔ（いずれもブタ心臓起源、■。
１ｉｏｒｉｎｏら、ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リー（Ｊ、 Ｂｉ、ｏｃｈｅｍ、 ）第８２巻、 ８４
７−８５２頁、 １９７７年、の方法により調製〕を溶
解した溶液０．５ｍで（ｓ−ＡＳＴまたはｍ、 −Ａ
Ｓ Ｔを５０ Ｋａｒｍｅｎ単位含む）とプロテアーゼ
の溶液０．５ｍＱを混合して、あらかじめ２５℃、１５
分間予熱したのち、２０ｍＭ アスパラギン酸、１０ｍ
Ｍ ２−オキソグルクル酸、０．２ｍＭＮＡＤＨおよび
リンゴ酸脱水素酵素（オリエンタル酵母社製）０．５μ
ｓを含む５０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
３．０−と混合して、２５°Ｃで反応せしめ、３４０ｎ
ｍにおける吸光度の１分間当りの減少を測定する。この
測定値と、プロテアーゼを除いて、上記と同じ方法で操
作したときの吸光度を比較したとき、後者の値を５０％
不活性化せしめるプロテアーゼの量を１単位とした。
リー（Ｊ、 Ｂｉ、ｏｃｈｅｍ、 ）第８２巻、 ８４
７−８５２頁、 １９７７年、の方法により調製〕を溶
解した溶液０．５ｍで（ｓ−ＡＳＴまたはｍ、 −Ａ
Ｓ Ｔを５０ Ｋａｒｍｅｎ単位含む）とプロテアーゼ
の溶液０．５ｍＱを混合して、あらかじめ２５℃、１５
分間予熱したのち、２０ｍＭ アスパラギン酸、１０ｍ
Ｍ ２−オキソグルクル酸、０．２ｍＭＮＡＤＨおよび
リンゴ酸脱水素酵素（オリエンタル酵母社製）０．５μ
ｓを含む５０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
３．０−と混合して、２５°Ｃで反応せしめ、３４０ｎ
ｍにおける吸光度の１分間当りの減少を測定する。この
測定値と、プロテアーゼを除いて、上記と同じ方法で操
作したときの吸光度を比較したとき、後者の値を５０％
不活性化せしめるプロテアーゼの量を１単位とした。
以下、試験例および実施例を以て本発明の詳細な説明す
る。
る。
試験例１ ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネス
Ｎ１９７２２株によるプロテアーゼの製造グルコース１
．０％、ポリペプトン１．０％、肉エキス １．０％、
塩化ナトリウム０．３％、アデカノール（消泡剤、旭電
化社商標） ０．０２％から成る組成の培地（ｐＨ７，
０）’ １００−を５００ｍ１！容の坂ロフラスコに入
れ、ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネスＮｏ、
９７２２ （ＦＥＲＭ ｌ” ７３６２）の斜面寒天
培養株を１白金耳摺種して、３０℃で４０時間往復振盪
培養し種培養液とした。上記と同じ組成の培地１８βを
３０β容のジャーファーメンタ−に入れ、種培養液を接
種して、通気量９ｊ２／分、攪拌回転数３００ｒｐｍ、
内圧０．５ｋｇ ／ ｏａ、温度２８°Ｃで４０時間培
養した。
Ｎ１９７２２株によるプロテアーゼの製造グルコース１
．０％、ポリペプトン１．０％、肉エキス １．０％、
塩化ナトリウム０．３％、アデカノール（消泡剤、旭電
化社商標） ０．０２％から成る組成の培地（ｐＨ７，
０）’ １００−を５００ｍ１！容の坂ロフラスコに入
れ、ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネスＮｏ、
９７２２ （ＦＥＲＭ ｌ” ７３６２）の斜面寒天
培養株を１白金耳摺種して、３０℃で４０時間往復振盪
培養し種培養液とした。上記と同じ組成の培地１８βを
３０β容のジャーファーメンタ−に入れ、種培養液を接
種して、通気量９ｊ２／分、攪拌回転数３００ｒｐｍ、
内圧０．５ｋｇ ／ ｏａ、温度２８°Ｃで４０時間培
養した。
培養液をろ過して菌体を除き、得られたろ液に硫安を８
０％飽和となるように加え、−晩装置した。
０％飽和となるように加え、−晩装置した。
遠心分離により沈澱を集め、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
４，０）に／８解した後、セロファンチューブを用いて
同緩衝液に透析した。次に同じ緩衝液で平衡化したＳＰ
−セファデックス（、−５０（ファルマシア社製）カラ
ム（４，８ｃｍφＸ ２’１３ｃｍ Ｌ ）に吸着させ
た後、０〜０．６Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配により溶
出した。０．２５〜０．３Ｍの塩化ナトリウムで溶出さ
れた活性画分を集め、硫安を８０％飽和となるように加
えて、生成した沈澱を遠心分離により集めた。
４，０）に／８解した後、セロファンチューブを用いて
同緩衝液に透析した。次に同じ緩衝液で平衡化したＳＰ
−セファデックス（、−５０（ファルマシア社製）カラ
ム（４，８ｃｍφＸ ２’１３ｃｍ Ｌ ）に吸着させ
た後、０〜０．６Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配により溶
出した。０．２５〜０．３Ｍの塩化ナトリウムで溶出さ
れた活性画分を集め、硫安を８０％飽和となるように加
えて、生成した沈澱を遠心分離により集めた。
沈澱を４０ｍＭホウ酸−水酸化カリウム＠ｉｈ液（ｐＨ
９，７）に溶解して、同緩衝液に透析した後、同じ緩衝
液で平衡化したＤＥＡＥ−−！＝ファデックス八へ２５
（ファルマシア社製）カラム（２，０ｃｍφｘｌＱｃｍ
Ｌ）に吸着させた。プロテアーゼはこの樹脂に弱い吸着
能を示すだけで、引続き同じ緩衝液を流すことにより溶
出された。溶出液に硫安を８０％飽和となるように加え
た後、生成した沈澱を遠心分離により集めた。沈澱を４
０ｍＭホウ酸−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ９，７）に
溶解して、同緩衝液に透析し、透析中に生じた沈澱は遠
心により除いた後、得られた酵素液を低温で放置するこ
とにより結晶プロテアーゼ標品を得た。
９，７）に溶解して、同緩衝液に透析した後、同じ緩衝
液で平衡化したＤＥＡＥ−−！＝ファデックス八へ２５
（ファルマシア社製）カラム（２，０ｃｍφｘｌＱｃｍ
Ｌ）に吸着させた。プロテアーゼはこの樹脂に弱い吸着
能を示すだけで、引続き同じ緩衝液を流すことにより溶
出された。溶出液に硫安を８０％飽和となるように加え
た後、生成した沈澱を遠心分離により集めた。沈澱を４
０ｍＭホウ酸−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ９，７）に
溶解して、同緩衝液に透析し、透析中に生じた沈澱は遠
心により除いた後、得られた酵素液を低温で放置するこ
とにより結晶プロテアーゼ標品を得た。
試験例２ 各種プロテアーゼのＡＳＴアイソザイム阻害
活性の比較 第２表に示す各種プロテアーゼ、即ち、ストレプトミセ
ス ビオラセオクロモゲネスＮｏ、９７２２の産生ずる
プロテアーゼ、プロナーゼ〔科研化学社製のプロナーゼ
（粗精製品）から金属プロテアーゼ阻害剤を用いたアフ
ィニティークロマトグラフィー法により金属プロテアー
ゼ活性を除いたもの〕、スブチリシンＢＰＮ’ （長潮
産業社製、商標：ナガーセ）、スブチリシン・カールス
ハーグ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ
、 Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、、第１９巻、 １７
９−２ｉ５頁、’ １９７０年〕、セファロスポリウム
（Ｃｅｐｂａｒｏｓｐｏｒｉｕｍ）属菌起源のアルカリ
性プロテアーゼ（Ｊ、 Ｙａｇｔら、ジャーナル・オブ
・ファーメンテ−ジョン・テクノロジー（Ｊ、 ｐ６ｒ
ｍｅｎｔ。
活性の比較 第２表に示す各種プロテアーゼ、即ち、ストレプトミセ
ス ビオラセオクロモゲネスＮｏ、９７２２の産生ずる
プロテアーゼ、プロナーゼ〔科研化学社製のプロナーゼ
（粗精製品）から金属プロテアーゼ阻害剤を用いたアフ
ィニティークロマトグラフィー法により金属プロテアー
ゼ活性を除いたもの〕、スブチリシンＢＰＮ’ （長潮
産業社製、商標：ナガーセ）、スブチリシン・カールス
ハーグ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ
、 Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、、第１９巻、 １７
９−２ｉ５頁、’ １９７０年〕、セファロスポリウム
（Ｃｅｐｂａｒｏｓｐｏｒｉｕｍ）属菌起源のアルカリ
性プロテアーゼ（Ｊ、 Ｙａｇｔら、ジャーナル・オブ
・ファーメンテ−ジョン・テクノロジー（Ｊ、 ｐ６ｒ
ｍｅｎｔ。
Ｔｅｃｈｎｏｌ、）第５０巻、 ５９２−５９９頁、
１９７２年〕、アスペルギルス 起源のプロテアーゼ〔伊藤ら，薬学雑誌，第８８巻、
１５７６−１５８２頁， １９６８年〕、アスペルギル
ス・オリーゼ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ ）起源のアルカリ
性プロテアーゼ〔林，化学と生物，第１１巻，８１８９
頁， １９７３年〕、ペニシリウム・リラシナム（Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍｌｉｌａｃｉｎｕｍ ）起源のアル
カリ性プロテアーゼＣＭ。
１９７２年〕、アスペルギルス 起源のプロテアーゼ〔伊藤ら，薬学雑誌，第８８巻、
１５７６−１５８２頁， １９６８年〕、アスペルギル
ス・オリーゼ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ ）起源のアルカリ
性プロテアーゼ〔林，化学と生物，第１１巻，８１８９
頁， １９７３年〕、ペニシリウム・リラシナム（Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍｌｉｌａｃｉｎｕｍ ）起源のアル
カリ性プロテアーゼＣＭ。
Ａｒａｉら．アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケ
ミストリー（ Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
）第４１巻、 ２２９３− ２２９４頁， １９７７
年〕、カンジダ・リボリテイカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ）起源のアルカリ性プロテアーゼ（
Ｓ． Ｔｏｂｅら，八ｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．＋第４０巻．． １０８７− １０９２頁， １９
７６年〕、サーモリシン（ Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ＋
バチルス・サーモプロテオリティカス（Ｂ． ｔｈｅｒ
ｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）起源の中性プロテア
ーゼ＋ Ｈ． Ｍａｔｓｕｂａｒａら，ジ・エンザイム
ズ（Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ ） ＋ Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ ｆＩＪＩ第３版、７２１頁， １９７
０年〕、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ ）、α−キモト
リプシン（ α− Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ） 、パ
パイン（Ｐａｐａｆｎ） 、フィシン（Ｆｉｃｉｎ ）
およびプロメライン（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ ）を用いて
、前述のＡＳＴアイソザイム阻害活性の測定法に従って
操作し、Ｓ−ＡＳＴまたはｍ − Ａ Ｓ Ｔの残存活
性を調べた。
ミストリー（ Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
）第４１巻、 ２２９３− ２２９４頁， １９７７
年〕、カンジダ・リボリテイカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ）起源のアルカリ性プロテアーゼ（
Ｓ． Ｔｏｂｅら，八ｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．＋第４０巻．． １０８７− １０９２頁， １９
７６年〕、サーモリシン（ Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ＋
バチルス・サーモプロテオリティカス（Ｂ． ｔｈｅｒ
ｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）起源の中性プロテア
ーゼ＋ Ｈ． Ｍａｔｓｕｂａｒａら，ジ・エンザイム
ズ（Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ ） ＋ Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ ｆＩＪＩ第３版、７２１頁， １９７
０年〕、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ ）、α−キモト
リプシン（ α− Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ） 、パ
パイン（Ｐａｐａｆｎ） 、フィシン（Ｆｉｃｉｎ ）
およびプロメライン（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ ）を用いて
、前述のＡＳＴアイソザイム阻害活性の測定法に従って
操作し、Ｓ−ＡＳＴまたはｍ − Ａ Ｓ Ｔの残存活
性を調べた。
結果を第２表に示す。なお、各プロテアーゼの添加量は
、カゼイン氷解活性、即ち基質カゼインとプロテアーゼ
を３７“Ｃ、１０分間反応せしめた後、トリクロロ酢酸
可溶性両分にフォーリン試薬を加えて、生じた青色の６
６０ｎｍにおける吸光度を測定し、そのＯＤ値を以て表
示したものである。
、カゼイン氷解活性、即ち基質カゼインとプロテアーゼ
を３７“Ｃ、１０分間反応せしめた後、トリクロロ酢酸
可溶性両分にフォーリン試薬を加えて、生じた青色の６
６０ｎｍにおける吸光度を測定し、そのＯＤ値を以て表
示したものである。
第２表
第２表の結果から、ｓ−ＡＳＴはストレプトミセス・ビ
オラセオクロモゲネスｋ ９７２２の産生ずるプロテア
ーゼ、プロナーゼ、スブチリシンのような微生物の産生
ずるセリンプロテアーゼに分類される酵素によって不活
性化されるが、金属プロテアーゼ（サーモリシン）およ
びチオールプロテアーゼ（パパイン、フィシンおよびブ
ロメライン）によっては影響を受けないことがわかる。
オラセオクロモゲネスｋ ９７２２の産生ずるプロテア
ーゼ、プロナーゼ、スブチリシンのような微生物の産生
ずるセリンプロテアーゼに分類される酵素によって不活
性化されるが、金属プロテアーゼ（サーモリシン）およ
びチオールプロテアーゼ（パパイン、フィシンおよびブ
ロメライン）によっては影響を受けないことがわかる。
ただし、セリンプロテアーゼであってもペニシリウム・
リラシナムおよびカンジダ・リボリテイカ起源のプロテ
アーゼにはＡＳＴアイソザイム阻害活性は認められず、
動物起源のトリプシンおよびα−キモトリプシンはｓ
−ＡＳＴに対する阻害作用が弱い。
リラシナムおよびカンジダ・リボリテイカ起源のプロテ
アーゼにはＡＳＴアイソザイム阻害活性は認められず、
動物起源のトリプシンおよびα−キモトリプシンはｓ
−ＡＳＴに対する阻害作用が弱い。
また、これら使用した全てのプロテアーゼはｍ−ＡＳＴ
を阻害しないか、または阻害作用が極めて弱い。本発明
らが見いだしたストレプトミセス・ビオラセオクロモゲ
ネスＮａ ９７２２の産生するプロテアーゼは、公知の
セリンプロテアーゼに比較してｓ−ＡＳＴに対する特異
性が高いこと、およびカゼイン氷解活性当りの阻害活性
が高いという有利な特徴を有する。即ち、上述の公知の
セリンプロテアーゼにおいては、５−ＡＳＴを完全に阻
害するためには本試験例で使用した量よりも多くの添加
量を必要とした。
を阻害しないか、または阻害作用が極めて弱い。本発明
らが見いだしたストレプトミセス・ビオラセオクロモゲ
ネスＮａ ９７２２の産生するプロテアーゼは、公知の
セリンプロテアーゼに比較してｓ−ＡＳＴに対する特異
性が高いこと、およびカゼイン氷解活性当りの阻害活性
が高いという有利な特徴を有する。即ち、上述の公知の
セリンプロテアーゼにおいては、５−ＡＳＴを完全に阻
害するためには本試験例で使用した量よりも多くの添加
量を必要とした。
試験例３ プロテアーゼの使用量とＡＳＴアイソザイム
阻害活性の関係 ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネス陶９７２２
の産生ずるプロテアーゼとスブチリシンＢＰＮ′のＡＳ
Ｔアイソザイム阻害活性の比較を行った。即ち、前述阻
害活性の測定法において、用いるプロテアーゼの重量お
よびプロテアーゼのカゼイン氷解活性を種々変化させ、
ＡＳＴアイソザイムの残存活性を測定したところ、第１
図および第２図に示すようにストレプトミナス・ビオラ
セオクロモゲネスＮＯ，９７２２の産生ずるプロテアー
ゼは、重量当りではスブチリシンＢＰＮ”の５分の１以
下、カゼイン氷解活性当りでは約２０分の１以下の量で
５−ＡＳＴを完全に阻害した。この場合ｒｎ −ＡＳＴ
の阻害は全く認められなかった。
阻害活性の関係 ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネス陶９７２２
の産生ずるプロテアーゼとスブチリシンＢＰＮ′のＡＳ
Ｔアイソザイム阻害活性の比較を行った。即ち、前述阻
害活性の測定法において、用いるプロテアーゼの重量お
よびプロテアーゼのカゼイン氷解活性を種々変化させ、
ＡＳＴアイソザイムの残存活性を測定したところ、第１
図および第２図に示すようにストレプトミナス・ビオラ
セオクロモゲネスＮＯ，９７２２の産生ずるプロテアー
ゼは、重量当りではスブチリシンＢＰＮ”の５分の１以
下、カゼイン氷解活性当りでは約２０分の１以下の量で
５−ＡＳＴを完全に阻害した。この場合ｒｎ −ＡＳＴ
の阻害は全く認められなかった。
実施例１
血清試料２０種類を用いて、各”々の２００ｐｆ！と０
．３■／ｍｆ！プロテアーゼ（ストレプトミセス・ビオ
ラセオクロモゲネスＮａ ９７２２起源）、０．１■／
ｍｐ牛血清アルブミンおよび４μＭピリドキサールリン
酸を含む５０１ｎＭトリス塩酸緩衝液（ｐｌ＋ ８．５
１１１．Ｏｍｌを混合して、３７℃、１５分間予熱した
のち、２０ｍＭ アスパラギン酸、１０ｍＭ ２−オキ
ソグルタル酸、０．２ｍＭ Ｎ ＡＤＨおよびリンゴ酸
脱水素酵素（オリエンタル酵母社製＞０．５ｐｌ’を含
む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） ３．０
−と混合して、３７℃で反応−きしめ、３４０ｎｍにお
ける吸光度の１分間当りの減少を測定した。あらかじめ
試料としてｍ−ＡＳＴを用いて、上記と同様に操作して
作成しておいた検量線と上記測定値を比較することによ
りｍ ” Ａ ＳＴ活性をめた。
．３■／ｍｆ！プロテアーゼ（ストレプトミセス・ビオ
ラセオクロモゲネスＮａ ９７２２起源）、０．１■／
ｍｐ牛血清アルブミンおよび４μＭピリドキサールリン
酸を含む５０１ｎＭトリス塩酸緩衝液（ｐｌ＋ ８．５
１１１．Ｏｍｌを混合して、３７℃、１５分間予熱した
のち、２０ｍＭ アスパラギン酸、１０ｍＭ ２−オキ
ソグルタル酸、０．２ｍＭ Ｎ ＡＤＨおよびリンゴ酸
脱水素酵素（オリエンタル酵母社製＞０．５ｐｌ’を含
む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） ３．０
−と混合して、３７℃で反応−きしめ、３４０ｎｍにお
ける吸光度の１分間当りの減少を測定した。あらかじめ
試料としてｍ−ＡＳＴを用いて、上記と同様に操作して
作成しておいた検量線と上記測定値を比較することによ
りｍ ” Ａ ＳＴ活性をめた。
比較例として、上記と同じ試料を用い、公知の免疫化学
的方法によるｍ −Ａ Ｓ Ｔ活性の測定試薬であるｍ
−ＡＳＴ試薬「栄研」 （栄研化学社Ｍ）を使用して測
定を行った。
的方法によるｍ −Ａ Ｓ Ｔ活性の測定試薬であるｍ
−ＡＳＴ試薬「栄研」 （栄研化学社Ｍ）を使用して測
定を行った。
測定結果を第３表に示す。本発明法による測定値と公知
の方法による測定値の間には極めて良い相関関係（相関
係数０．９７６）が認められた。
の方法による測定値の間には極めて良い相関関係（相関
係数０．９７６）が認められた。
（以下余白）
第３表
実施例２
実施例１におけるプロテアーゼに代えて、スブチリシン
ＢＰＮ’ を使用して同様に操作したところ、公知方法
との相関係数は０．９６８であった。
ＢＰＮ’ を使用して同様に操作したところ、公知方法
との相関係数は０．９６８であった。
実施例３
実施例１におけるプロテアーゼに代えて、プロナーゼを
使用して同様に操作したところ、公知方法との相関係数
は０．９６３であった。
使用して同様に操作したところ、公知方法との相関係数
は０．９６３であった。
実施例４
試料として血清を用い、実施例１と同様に操作してｍ
−Ａ Ｓ Ｔ活性をめた。次いで、反応液よりプロテア
ーゼを除いた以外は同様に操作することにより総ＡＳＴ
活性をめた。測定結果は、ｍ−ＡＳＴｉ性が１７Ｋａｒ
ｍｅｎ単位であり、総ＡＳＴ活性ば１２３ Ｋａｒｍｅ
ｎ単位であった。これらの値の差より、ｓ −ＡＳＴ活
性は１０６ Ｋａｒｍｅｎ単位と計算された。
−Ａ Ｓ Ｔ活性をめた。次いで、反応液よりプロテア
ーゼを除いた以外は同様に操作することにより総ＡＳＴ
活性をめた。測定結果は、ｍ−ＡＳＴｉ性が１７Ｋａｒ
ｍｅｎ単位であり、総ＡＳＴ活性ば１２３ Ｋａｒｍｅ
ｎ単位であった。これらの値の差より、ｓ −ＡＳＴ活
性は１０６ Ｋａｒｍｅｎ単位と計算された。
第１図はストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネスＮ
ｏ、９７２２の産生ずるプロテアーゼおよびスブチリシ
ンＢＰＮ”の使用量（重量）とＡＳＴアイソザイム阻害
活性の関係を表す図であり、第２図は同じくカゼイン氷
解活性とＡＳＴアイソザイム阻害活性の関係を表す図で
ある。第１図および第２図において、各記号は次の意味
を表す。 −０−ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネスＮＯ
，９７２２の産生ずるプロテアーゼの５−ＡＳＴに対す
る阻害 −・−同じ（ｍ −Ａ Ｓ Ｔに対する阻害−〇−スブ
チリシンＢＰＮ”のｓ −ＡＳ＋Ｔに対する阻害 一諺一同じ（ｍ７ＡＳＴに対する阻害 特許出願人 村尾澤夫■） 第 １ 図 ０．２ １ １０ １００ 瓜 量 （μｇ） 第２図 ０．００１ ０．０１ ０．１ １．０、カゼイン氷解
活性（ＯＤ） 手続補正書（自発） １．事件の表示 昭和５９年特許願第４４９５号 ２、発明の名称 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソザイム
の測定法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪府堺市堀上縁町２丁８−１２５、補正により
増加する発明の数 なし６、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄および発明の詳細な説明の
欄 ７、補正の内容 ＋ｌ）明細書の特許請求の範囲の欄を別紙のとおり補正
する。 （２ン明細書第９頁９行目に「寄託されている。」とあ
る後に以下の記載を挿入する。 「なお本寄託菌株はブダペスト条約に基づく寄託に移管
され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４６として同寄託機
関に寄託されている。」 （３）明細書箱１７頁５行目に「ＦＥＲＭ Ｐ −７３
６２Ｊとあるを’ ＦＥＲＭ ＢＰ −６４６，Ｊと補
正する。 ２、特許請求の範囲 １ 被検試料中のアスパラギン酸アミノトランスフェラ
ーゼ活性の測定に際して、細胞質性のアスパラギン酸ア
ミノトランスフェラーゼアイソザイムを特異的に阻害す
る活性を有するプロテアーゼを用いることを特徴とする
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソザイム
の測定−法。 ２ プロテアーゼが微生物起源のセリンプロテアーゼで
ある特許請求の範囲第１項記載のアスパラギン酸アミノ
トランスフェラーゼアイソザイムの測定法。 ３ セリンプロテアーゼがストレプトミセス・ビオラセ
オクロモゲネスＮ１１９７２２ （ＦＥＲ）１１ Ｂｌ
’−６４６’）の産生ずるセリンプロテアーゼである特
許請求の範囲第２項記載のアスパラギン酸アミノトラン
スフェラーゼアイソザイムの測定法。 受託番号変更届 昭和５９年１１月１′１１日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第４４９５号 ２、発明の名称 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソザイム
の測定法 ３、手続きをする者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪府堺市堀上縁町２丁８−１２４、旧寄託機関
の名称 通産省工業技術院微生物工業技術研究所５、旧受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−７３，６２ ｊ、 ’ｉ ’Ｉ、：：ｊＯ’ ６、新寄託機関の名称 通産省工業技術院微生物工業技術研究所７、新受託番寸 ＦＥＲＭ １３Ｐ−６４６ ８、添イ］書類の目録 新受託番号を証明する書面 １通
ｏ、９７２２の産生ずるプロテアーゼおよびスブチリシ
ンＢＰＮ”の使用量（重量）とＡＳＴアイソザイム阻害
活性の関係を表す図であり、第２図は同じくカゼイン氷
解活性とＡＳＴアイソザイム阻害活性の関係を表す図で
ある。第１図および第２図において、各記号は次の意味
を表す。 −０−ストレプトミセス・ビオラセオクロモゲネスＮＯ
，９７２２の産生ずるプロテアーゼの５−ＡＳＴに対す
る阻害 −・−同じ（ｍ −Ａ Ｓ Ｔに対する阻害−〇−スブ
チリシンＢＰＮ”のｓ −ＡＳ＋Ｔに対する阻害 一諺一同じ（ｍ７ＡＳＴに対する阻害 特許出願人 村尾澤夫■） 第 １ 図 ０．２ １ １０ １００ 瓜 量 （μｇ） 第２図 ０．００１ ０．０１ ０．１ １．０、カゼイン氷解
活性（ＯＤ） 手続補正書（自発） １．事件の表示 昭和５９年特許願第４４９５号 ２、発明の名称 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソザイム
の測定法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪府堺市堀上縁町２丁８−１２５、補正により
増加する発明の数 なし６、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄および発明の詳細な説明の
欄 ７、補正の内容 ＋ｌ）明細書の特許請求の範囲の欄を別紙のとおり補正
する。 （２ン明細書第９頁９行目に「寄託されている。」とあ
る後に以下の記載を挿入する。 「なお本寄託菌株はブダペスト条約に基づく寄託に移管
され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４６として同寄託機
関に寄託されている。」 （３）明細書箱１７頁５行目に「ＦＥＲＭ Ｐ −７３
６２Ｊとあるを’ ＦＥＲＭ ＢＰ −６４６，Ｊと補
正する。 ２、特許請求の範囲 １ 被検試料中のアスパラギン酸アミノトランスフェラ
ーゼ活性の測定に際して、細胞質性のアスパラギン酸ア
ミノトランスフェラーゼアイソザイムを特異的に阻害す
る活性を有するプロテアーゼを用いることを特徴とする
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソザイム
の測定−法。 ２ プロテアーゼが微生物起源のセリンプロテアーゼで
ある特許請求の範囲第１項記載のアスパラギン酸アミノ
トランスフェラーゼアイソザイムの測定法。 ３ セリンプロテアーゼがストレプトミセス・ビオラセ
オクロモゲネスＮ１１９７２２ （ＦＥＲ）１１ Ｂｌ
’−６４６’）の産生ずるセリンプロテアーゼである特
許請求の範囲第２項記載のアスパラギン酸アミノトラン
スフェラーゼアイソザイムの測定法。 受託番号変更届 昭和５９年１１月１′１１日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第４４９５号 ２、発明の名称 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソザイム
の測定法 ３、手続きをする者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪府堺市堀上縁町２丁８−１２４、旧寄託機関
の名称 通産省工業技術院微生物工業技術研究所５、旧受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−７３，６２ ｊ、 ’ｉ ’Ｉ、：：ｊＯ’ ６、新寄託機関の名称 通産省工業技術院微生物工業技術研究所７、新受託番寸 ＦＥＲＭ １３Ｐ−６４６ ８、添イ］書類の目録 新受託番号を証明する書面 １通
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 被検試料中のアスパラギン酸アミノトランスフェラ
ーゼ活性の測定に際して、細胞質性のアスパラギン酸ア
ミノ１−ランスフェラーゼアイソザイムを特異的に阻害
する活性を有するプロテアーゼを用いることを特徴とす
るアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソザイ
ムの測定法。 ２ プロテアーゼが微生物起源のセリンプロテアーゼで
ある特許請求の範囲第１項記載のアスパラギン酸アミノ
トランスフェラーゼアイソザイムの測定法。 ３ セリンプロテアーゼがストレプトミセス・ビオラセ
オクロモゲネスに９７２２（微工研菌寄第７３６２号）
の産生ずるセリンプロテアーゼである特許請求の範囲第
２項記載のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼア
イソザイムの測定法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59004495A JPS60149399A (ja) | 1984-01-12 | 1984-01-12 | アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイムの測定法 |
| US06/688,423 US4769323A (en) | 1984-01-12 | 1985-01-02 | Method for fractional determination of aspartate aminotransferase isozymes, and composition therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59004495A JPS60149399A (ja) | 1984-01-12 | 1984-01-12 | アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイムの測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60149399A true JPS60149399A (ja) | 1985-08-06 |
Family
ID=11585651
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59004495A Pending JPS60149399A (ja) | 1984-01-12 | 1984-01-12 | アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイムの測定法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4769323A (ja) |
| JP (1) | JPS60149399A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0352547A2 (en) * | 1988-07-15 | 1990-01-31 | International Reagents Corporation | LDH1 assay |
| US5081014A (en) * | 1985-12-23 | 1992-01-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method of measuring a co-enzyme |
| US5200322A (en) * | 1986-09-19 | 1993-04-06 | Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for assaying protein C and measuring kit for the same |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5726042A (en) * | 1988-04-07 | 1998-03-10 | Abbott Laboratories | Expression of heterologous proteins in Bacillus megaterium utilizing sporulation promoters of Bacillus subtilis |
| JP2848840B2 (ja) * | 1989-03-03 | 1999-01-20 | 国際試薬株式会社 | Ｇｏｔアイソザイムの分別定量法 |
| DE3937126A1 (de) * | 1989-11-08 | 1991-05-16 | Deutsche Hefewerke | Verfahren zur ansaeuerung von melasseloesungen |
| US5444042A (en) * | 1990-12-28 | 1995-08-22 | Cortex Pharmaceuticals | Method of treatment of neurodegeneration with calpain inhibitors |
| CN104459158B (zh) * | 2014-12-22 | 2016-06-22 | 宁波美康生物科技股份有限公司 | 天冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒 |
| CN110018305B (zh) * | 2019-05-12 | 2020-12-08 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒及应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1171257B (it) * | 1981-05-28 | 1987-06-10 | Biodata Spa | Metodo per la determinazione della attivita' degli isoenzimi citoplasmatico e mitocondriale della glutammico ossalacetico transaminasi nel siero o plasma umano |
-
1984
- 1984-01-12 JP JP59004495A patent/JPS60149399A/ja active Pending
-
1985
- 1985-01-02 US US06/688,423 patent/US4769323A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5081014A (en) * | 1985-12-23 | 1992-01-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method of measuring a co-enzyme |
| US5200322A (en) * | 1986-09-19 | 1993-04-06 | Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for assaying protein C and measuring kit for the same |
| EP0352547A2 (en) * | 1988-07-15 | 1990-01-31 | International Reagents Corporation | LDH1 assay |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4769323A (en) | 1988-09-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2849773B2 (ja) | ストレプトミセス属由来のトランスグルタミナーゼの製造法 | |
| JPS61280272A (ja) | ウリカ−ゼおよびその製造法 | |
| US4039384A (en) | Creatinine amidohydrolase and creatine amidinohydrolase and process for producing them | |
| Gerze et al. | Partial purification and characterization of protease enzyme from Bacillus subtilis megatherium | |
| JPS60149399A (ja) | アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイムの測定法 | |
| JPH03236766A (ja) | 新規アスコルビン酸オキシダーゼ及びその製造方法 | |
| JPH0665300B2 (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ | |
| JPS61146183A (ja) | フェニルアラニン―デヒドロゲナーゼを含有するロドコッカス・スペック及びその取得法 | |
| JP3360291B2 (ja) | γ−サイクロデキストリンの増収方法 | |
| JP2882652B2 (ja) | アルカリプロテアーゼ及びその生産性微生物 | |
| CA1324586C (en) | Choline oxidase and method for producing the same | |
| JP3782621B2 (ja) | ヒスタミンデヒドロゲナーゼ及びその製造法 | |
| JPH01320991A (ja) | Ｄ−ホモフエニルアラニン類の製造方法 | |
| JPH03127985A (ja) | Ｌ―カルニチンデヒドロゲナーゼおよびその製造法 | |
| JP3093039B2 (ja) | 新規エステル分解酵素ａおよびその製造方法 | |
| JPH05328972A (ja) | 新規なアミノアシラーゼおよびその製造方法 | |
| JPS60149382A (ja) | アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイム阻害活性を有するプロテア−ゼの製造法 | |
| JPH04126075A (ja) | ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 | |
| CA1309678C (en) | Urease and method of producing the same | |
| JPS6058068A (ja) | 新規なアミンデヒドロゲナーゼｍ | |
| JP3272416B2 (ja) | 新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法 | |
| JPH01137973A (ja) | アシルアミノ酸ラセマーゼ、その製造法および用途 | |
| JPS6318471B2 (ja) | ||
| JPS60244286A (ja) | 蓚酸オキシダ−ゼの製造法 | |
| JPH02195868A (ja) | プロテアーゼ生産菌およびそれを用いたプロテアーゼの製造法 |