JPS61280272A - ウリカ−ゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規ウリカーゼおよびその製造法に関する。ウ
リカーゼは尿酸の定量に使用されるが、本発明ではこの
用途に極めて適した性質を有するウリカーゼを好熱性微
生物を用いて製造する。

〔従来の技術および発明が解決すべき問題点〕ウリカー
ゼ（ＥＣ１，７，３，３了ｉ物の肝臓、腎臓やある種の
微生物に存在し、酸素の存在下で尿酸を酸化する酵素で
あり、広く臨床検査の際に尿酸定量のために使用されて
いる。

ウリカーゼの微生物による生産は広く行われている（特
開昭５５−８１５８６．同５６−１２４３８１　、特公
昭５６−４３２３０など）が、使用される微生物はいず
れも中温菌であシ、培養期間は１日から３日以上と長期
間を要する。

ところで、好熱性微生物は代謝および増殖が早いため、
培養時間を短縮できる可能性があるが、これまでは好熱
性微生物によるウリカーゼの生産は報告されていない。

しかし、ウリカーゼの給源として好熱性微生物を利用で
きれば、生産される酵素が安定性にすぐれていることが
期待できる。

一方、ウリカーゼの活性特性に着目すると、後述するよ
うに、臨床検査の際、共役的に使用するパーオキシダー
ゼの活性がｐＨ６，５最大であることから、このｐＨ域
で活性の強いウリカーゼが酵素使用量の低減という立場
から望まし、いが、従来広く用いられてきたウリカーゼ
は至適ｐＨが８５〜９，０に存在し、ｐＨ６，５におけ
る活性が０％（特公昭５６−４３２３０）から４０％未
満（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、４４．（１２）
、２８１１（１９８０％）と著しく低いものであった。

〔問題点を解決するだめの手段〕

本発明者らは、上記の状況に鑑み、多くの土壌より好熱
性微生物を分離し、広い作用ｐＨ域を有するウリカーゼ
を生産する菌株の検索を行なった。

その結果、好熱性バチルス属に属する微生物、バチ／ｌ
／スーエスビ−（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）ＴＢ−９
０（以下、ＴＢ−９０菌と称する。）が目的とするウリ
カーゼを生産することを見出し、かかる知見に基いて本
発明を完成した。

すなわち本発明は尿酸を酸化的に分解する作用を有し、
かつｐＨ５〜１０の広い作用ｐＨ域を有するウリカーゼ
を提供するものであり、さらにバチルス属に属し、該ウ
リカーゼ生産能を有する好熱性微生物を栄養培地に培養
し、培養物中に該ウリカーゼを生成せしめ、これを採取
することを特徴とするウリカーゼの製造法を提供するも
のである。

本発明に用いるウリカーゼ生産菌としてはバチルス属に
属し、上記したウリカーゼを生産しうる好熱性微生物で
あればよい。したがって、ＴＢ−紗 ９０菌のほかに、その自然的または人為変異株ならびに
これら菌株の遺伝子を移された各種生物も本発明のウリ
カーゼ生産能を有する限シ、本発明に使用することがで
きる。

次に、ＴＢ−９０菌の菌学的性質を示す。なお、この菌
学的性質の検討には「微生物の分類と同定」（長谷用武
治編著、東京大学出版会）および「微生物同定法」（衛
生技術会）に記載されている方法、培地組成を用いた。

〔形態的所見〕（５５°Ｃ２１８時間培養）１、細胞の
形及び大きさ：短稈状、０，５〜０．８×１．３〜２μ ２、　多形性：なし ３、運動性；なし ４、胞子：円形の内生胞子２細胞中央に形成する。

胞子のうけふくれない。

５、　ダラム染色：陽性 ６、抗酸性：なし ７、　カプセル：なし ８、真東顆粒：なし 〔生育状態〕（５５°Ｃ２１８時間培養）１、肉汁寒天
平板培養 形状二円形 周縁：平滑 隆起：扁平 光沢：や＼あり 表面：や＼粗雑 色調二手透明 ２、肉汁寒天斜面培養 生育度：良好 形　状：糸状 ３、　肉汁液体培養 表面生育：なし 濁　　度：清澄 沈　　査：少量 着色、脱色：なし ４、　肉汁ゼラチン穿刺培養（ゼラチンは３０ｑ６添加
、５５°Ｃで適時培養後、冷却に固化状態を判定） 生育良好で沈渣大量であるが、ゼラチンは液化しない。

５、　肉汁寒天穿刺培養 形状：念珠状（表面付近のみ） 表面生育：良好 ６、　リドマスミルク ＩＪ　）マス退色なり、ｐＨ不変化、ミルクの凝固。

液化なし 〔生理学的性質〕（５５°ｃ、ｉ〜２日培養）１、硝酸
塩の還元の有無：なし ２、　　ＭＲテスト：陰性 ３、　　ＶＰテスト：陰性 ４、　インドールの生成：なし ５、硫化水素の生成：なし ６．　デンプンの加水分解：あり ７　クエン酸の利用：な１− ８、°アンモニウム塩の利用：あり ９、色素の生成：なし １０−　オキシダーゼ活性：あり １１、　カタラーゼ活性：あり １２、生育ｐＨ：　４．５〜７．５．至適−範囲：５．
０〜６．５ １３、生育温度：３８〜６２°Ｃ２至適生育温度範囲＝
５０〜６０°Ｃ １４、嫌気性培地における発育性：なし１５、　　サブ
ロー・デキストロース寒天培地における発育性：良好 １６、アジ化ナトリウム０．０２　％含有培地、５５°
Ｃ培養下における発育性：なし １７、リゾチームｏ、ｏｏｉｓ存在下における発育性（
４５℃で試験）：なし １８、　　フェニルアラニンの脱アミノ反応：なし１９
、塩化ナトリウムの耐性：３チでは生育する力！、５％
では生育しない ２０、　　ビタミン要求性の有無：あり２１、　　チロ
シンの分解性：なし 〔炭素源の利用性〕 Ｄ−キシロ・−ス、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース
、トレハロース、セロビオース、　り’Ｊ　セＩＪ　７
を資化して増殖し、酸を生成する。

アラビノース、マンノース、フラクトース、マルトース
、シュークロース、ラクトース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ
−マンニトール、テンブン、２−ケトークルコネート、
アドニトール、キシリトール。

メチル−Ｄ−グルコシド、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミン、メレチトース、ラフィノースの利用性は微弱また
はなし。

以上の微生物の菌学的諸性質から、パージエイズ・マニ
ュアル・オプ・デタミナテイプ・バクテリオロジ−（第
８版、１９７４年）　（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓｍａｎｕａｌ
　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒ／ｍ１ｎａｔｉｖｅ　　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ　８＆ｅｄｉｔｒｏｎ　　（１９７４）
　：）の分類方法に従って検索し、前記ＴＢ−９０菌を
バチルス属と同定した。次に、公知のバチルス属の菌種
と比較するとき、前記ＴＢ−９０菌はその生育温度範囲
からバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）　、バ
チルス・コアギユランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　、ｃｏａ
ｇｕｌａｎｓ）及びバチルス・プレビス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　　ｂｒｅｖｉｓ　）のいずれかと考えられるが、
ＴＢ−９０菌は運動性がない点で上のいずれとも異って
いる。更に、バチルス・ステアロサーモフィラスとはサ
ブロー・テストロース培地で生育スル点で、バチルス・
コアギユランスとは嫌気寒天培地及び０，０２％アジ化
ナトリウム存在下で生育しない点で、まだバチルス・プ
レビスとはキシロースから酸を生成する点、■Ｐ培地で
アルカリを生産しない点、カゼイン及びチロシンを分解
しない点でそれぞれ異なっている。更に、標準菌株バチ
ルス・ステアロサーモフィラスＩＡＭＩ１００Ｉ。

１１００２．１１００３，１１００４，１２０４３、バ
チルス・コアギユランスＩＡＭ１１°９４．バチルス・
プレビスＩＡＭ　１０３１　（以上、東京大学応用微生
物研究所保管法）はいずれも後述の培養方法でウリカー
ゼを生産しなかった。

以上の事項から明らかな通り、ＴＢ−９０菌は、公知の
菌種と区別されるため、これを新菌種として設定するこ
とが適当であると結論された。

ＴＢ−９０菌は工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−７９５として寄託されている。

本発明のウリカーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に
培養し、培養物中に該ウリカーゼを生成せしめ、これを
採取することによって目的とするウリカーゼが得られる
。

本発明に使用する栄養培地としては、炭素源。

窒素源、無得物及び必要に応じ使用菌株の必要とする微
量栄養素を程よく含有するものであれば天然及び合成培
地のいずれでもよい。

炭素源としてはグルコース、キシロース、ガラクトース
、グリセリン等の炭水化物や尿酸などが用いられる。

窒素源としては硫安、塩安、硝酸ソーダ、尿素等の有機
化成品、グルタミン酸などのアミノ酸やペプチド、肉エ
キス、大豆粉等の含窒素天然物や尿酸などが使用出来る
。

リウム、塩化カリウム等の各種酸塩やゼオライト。

力オ９ン、その他が用いられ、菌の増殖と酵素生成を促
進する。

その他にビオチン、チアミン等の微量栄養素を必要に応
じて使用する。

培養法としては、固体培養、液体培養のいずれも可能で
あるが、工業的には通気攪拌培養法が最も適している。

培養は３８〜６２℃の範囲の温度で行うことが出来るが
、５０〜５５°Ｃが好適である。−は中性乃至弱酸性が
望ましい。

培養時間は条件によって変って来るが、通常は６時間か
ら２０時間であり、ウリカーゼの生成が確認された時、
好ましくは生成が最大に達した時に培養を停止する。

本酵素は主として菌体中に生成されるが、培養後期には
培地中にも蓄積される。

培養物中からのウリカーゼの採取は適宜既知の方法を組
み合せて実施すればよい。たとえば培養終了後、培養物
中から菌体を遠心分離などにより取得し、ついでこの菌
体から適当な手段でウリカーゼを抽出する。遠心分離等
によってこの抽出液を処理して不溶性成分を除去した後
、酸沈殿、有機溶媒沈殿、塩析、透析、更には各種クロ
マトグラフィー（イオン交換法、ゲルｐ過法、疎水りロ
マト法等）によって精製する。かくて、純度の極めて高
いウリローゼを取得することが出来る。

次に、本発明のウリカーゼの性質を示す。なお、標品と
しては後記実施例１で得られた酵素を使用した。

ウリカーゼ活性の測定は、主として後述のＵＶ法（尿酸
の吸収（２９３μｍ）の減少を測定する）によった。ま
た、ウリカーゼ活性は後記測定条件下で１分間に１μｍ
ｏｌｅの尿酸を分解する酵素力価をＩＵ（ユニット）と
した。

計算式は次の通りである。

（ウリカーゼ活性）Ｕ／　　−到′ｌ）ｘ　（ゝ０液鑓
″′）７ゴー　１２２Ｘ（反応時間・分）× △・ＯＤ＝反応中の２９３μｍの吸収の減少１２．２：
尿酸のミリモル分子吸光係数（ｃｒＬ／ｍ１ｃｒαｍｏ
ｌｅ） （１１作用 本酵素は次の反応を触媒する。

（２）至適一 本発明の酵素標品及び対照として酵母由来のウリカーゼ
（東洋紡製）とコリネバクテリウム由来のウリカーゼ（
盛進製薬製）をそれぞれｐＨ８，０。

３０℃で１０　ｍＵ／ｒｔｔｌになる酵素量を用い、第
１図に示した種々のｐＨのバッファーに溶解して反応さ
せた。

尿酸濃度は１．００μ間とし、バッファーは５０ｍＭホ
ウ酸緩衝液（ＩｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び０．００１
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を使用した。反応は３０’
Ｃで実施し、キュベツト中に攪拌子を入れて攪拌混合し
つつ吸光度（２９３μｍ）の減少を測定した（ＵＶ法）
。

各酵素の最大活性を示すｐＨで活性を各々１００とし、
各−における相対活性を第１図に示す。図から明らかな
ように、本発明の酵素標品は至適ｐＨが８であるが、対
照の２酵素と比較して弱酸性においてもはるかに強い活
性を示し、しかもｐＨ５〜１０という広いｐＨ域で活性
を示した。

（３）安定ｐＨ範囲 酵素標品を第２図に示す種々のｐＨの５０　ｍＭ　’）
ン酸バッフ７−　（１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．０
０１％Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎＸ−１００含有）に２００　ｍ
Ｕ／ｍ／（３０００。

ｐＨ８，０で測定）になるよう溶解した。

ついで、各酵素溶液を３ｏ°ｄで１５日間保った後、５
０ｍＭのホウ酸バッファー（ｐＨ８，０、１ｍＭＥＤＴ
Ａ・２　Ｎａ　、　０．００１　％Ｔ　ｒｉｔｏｎＸ−
１００含有）を用いて２０倍に希釈し、ｐＨ８，０付近
とし、これらの酵素溶液に１００μＭの尿酸を加え、３
０°Ｃで反応させた。酵素活性はＵＶ法で測定し、試験
開始時（即ち、無処理）の活性を１．００とした場合の
各、Ｈにおける相対残存活性を第２図に示す。

本酵素はｐＨ５〜９の間で活性を完全に維持した。

（４）　　至適温度 酵素標品を１０　ｍＵ／ｍｅになるよう５０　ｍＭホウ
酸バッファー（ｐＨ８，０、１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ
。

０．００１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有）に溶解し
、尿酸１００μＭを基質として反応させた。反応温度は
第３図に示した。反応時間は６分間とし、ＵＶ法で測定
した。

最も活性の高い値を１００とした場合の各温度における
相対活性を第３図に示す。

本酵素の至適温度は４５〜５０°Ｃであることが判明し
た。

（５）安定温度範囲 酵素標品８ｍＵを１００μｌのホウ酸バッファーに’ｐ
Ｈ９，１、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　・２Ｎａ及びＯ，ＯＯ１
％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有）に溶解し、第４図に
示す各温度に１０分間保持した後、３０°ＣとしてＵＶ
法で残存活性を測定した（ｐＨ８，０，尿酸１００μＭ
）。

無処理の酵素活性を１００として、各温度における相対
活性を第４図に示す。

本酵素は５０’Ｃ以下では１０分間の処理によっても失
活は認められず活性を１００％維持していた。

（６）界面活性剤への抵抗性 各濃度のドデシル硫酸ナトリウムを含有するＵＶ法の反
応液２　ｍｌに２０　ｍＵの酵素標品あるいは対照とし
て市販の酵母由来ウリカーゼ（東洋紡製）またはコリネ
バクテリウム由来ウリカーゼ（盛進製薬製）を加えて反
応させた。酵素活性はドデシル硫酸ナトリウム無添加の
場合を１００として第５図に示す。

本酵素の活性はドデシル硫酸ナトリウム０．０８チ迄阻
害されないが、対照の２酵素は活性を減じ、本酵素のタ
ンパク変性剤に対する抵抗性が明らかとなった。

（７）基質特異性 本酵素標品の尿酸関連物質との反応性（具体的には）（
２０２生成性）を調べた。Ｈ２Ｏ２の検出にはペルオキ
シダーゼ法を用いた。

酵素標品１３ｍＵを後述のペルオキシダーゼ法反応液（
各基質は２００μＭ相当含有）２ｍＡ’に溶解し、生成
するＨ２Ｏ２を測定した。尿酸を基質とする場合の活性
を１００としたときの各基質の相対活性を第１表に示す
。本酵素はアデニン、グアニン。

キサンチ／、ヒポキサンチン、テオプロミン、テオフィ
リンには全く活性を示さなかった。

第　　　１　　　表 次Ｋ　、Ｈ２０２検出に用いたペルオキシダーゼ法の詳
細を示す。

０．０５％のＴｒｉｔｏｎｘ−１００、４９０μＭの４
−アミノアンチピリン、　５．３　ｍＭの石炭酸及び６
　Ｕ／ｍ／　のペルオキシダーゼを含む５０ｍＭ’Ｊン
酸バッファ（ｐＨ６，５）に供試した各基質２００μＭ
相当を溶解し、この反応液２．０　ｍ／！に酵素標品１
３ｍＵを添加し、３７℃で反応させ、生成した過酸化水
素の量に比例して生ずる色素（λｍａｘ５００　ｎｍ）
の増加を測定した。なお、反応時間は１５時間とした。

（８）分子量 ゲルｐ過法による本酵素の分子量は約１００，０００で
ある。

前述したように、ウリカーゼは尿酸の定量に使用される
が、ウリカーゼを使用する尿酸の定量法としては下記の
方法がある。

（１１尿酸とウリカーゼを反応させて生じる過酸化水素
を測定する方法、例えば ■　過酸化水素を４−アミノアンチピリンと７ｘ７−ル
あるいはその誘導体とパーオキシダ−ゼの存在下反応さ
せて過酸化水素量に比例して生成する色素を吸光度から
定量する（酵素比色性中ウリカー・ゼ・バーオシダーゼ
法）、（ロ）過酸化水素とアルコールをカタラーゼの存
在下反応させ、生じたアルデヒドをアセチルアセトン及
びアンモニアを縮合させて生成する色素を吸光度から定
量する（酵素比色法中ウリカーゼ・カタラーゼ法）、 （ハ）　上記のカタラーゼによる反応生成物のアルデヒ
ドと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤＨ）をアルコールデヒドロゲナーゼの存在下反応さ
せてＮＡＤを生成せしめる。その際、減少するＮＡＤＨ
を定量する（紫外部吸収法）。

（ＩＩ）　　尿酸をウリカーゼと反応させる際に消費さ
れる酸素あるいは生成する炭酸ガスを測定する方法（電
極法）。

（］１リ　　反応の前後における尿酸由来の紫外部吸収
の差を測定する方法（紫外部吸収法）。

（５）　ウリカーゼ処理及び未処理の試料に化学的尿酸
定量法（例えばリンタングステン酸法）を適用する方法
等がある。

この中でウリカーゼ　パーオキシダーゼ法は、広く用い
られている。この反応系のｐＨはウリカーゼの一一活性
特性に従って選択されるが、共役して用いるパーオキシ
ダーゼのｐＨ−活性は弱酸性（ｐＨ６，０〜・７．０）
が最大であることや呈色試薬の安定性、定量感度のｐＨ
依存性を考慮することが必要である。

給源により差異があるが、一般にウリカーゼはアルカリ
性（ｐ）Ｉ　ｓ、　ｏ〜９．０）に最大活性を示し、中
性あるいは弱酸性での活性が皆無（特公昭５６−４３２
３０）であるかまだは極めて弱い（特開昭５６−１２４
３８１　）。そのほか弱酸性で最大活性を示すが、弱酸
性での安定性が著しく劣る例（特開昭５６−８１５８６
　）　Ｌか知られていない。

一方、臨床検査では反応温度が３７℃に設定されている
のが伝統であるので、温度−安定性、温度−活性も重要
な要素であシ、ウリカーゼの反応速度、即ち尿酸定量反
応に要する時間及び必要とするウリカーゼの量が可及的
に少ないことがウリカーゼに要求される。

次に、尿酸定量に用いた際の本酵素標品と既知市販酵素
（酊母由来、東洋紡製）の比較を述べる。

尿酸定量に要する反応時間は酵素使用量に反比例するが
、この関係を前述のパーオキシダーゼ法を用いて算出し
た。組成物中の各成分の種類とその使用量ならびに組成
物を用いての実験操作は尿酸の量を３７．２μＭに設定
したこと以外は前述の通りである。

必要反応時間は反応を開始してから過酸化水素の量に比
例して生ずる色素の量、すなわち５００ｎｍの吸光度が
一定になる（反応の終了）迄の時間で表わしだ。

第６図に示しだように、本酵素の使用量は対照酵素の２
０％の力価０で済むことが理解される。

なお、酵素活性は本酵素標品の場合はｐＨ８；　０　、
対照酵素の場合はｐＨ８，５（いずれも至適ｐＨ）で３
０℃にてＵＶ法により算出しだ。

〔発明の効果〕

本発明の酵素ウリカーゼは、好熱性微生物に由来するた
め、安定性にすぐれており、しかも広い作用ｐＨ域を有
する、界面活性剤に対する抵抗性が犬である等の性質を
有している。そのため、既知ウリカーゼよりも少量の使
用で尿酸の定量を行うことができる。本酵素による尿酸
の定量は様々な方法で実施しうるが、とシわけウリカー
ゼ・パーオキシダーゼ法が好適である。

また、本酵素の製造は、好熱性微生物を用いているため
、短時間で効率よく行うことができる。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例によシ詳しく説明する。

実施例１ 種菌として、ＴＢ−９０菌を使用した。

グルコース１グ／ｄ、ｔ、酵母エキス１９７ｄｉ　、ペ
プトン１　ｔ／ｄｉからＫＨ２ＰＯ４１？／　ｄｔ　、
　Ｋ２　ＨＰＯ４１ｆ／ｄｔ　、　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
００，５？／ｄｔ及び水道水からなる種培養培地１０ｍ
６！を大型試験管に入れ、１２１０Ｃで１５分間滅菌後
、該培地に前記菌株を１白全耳接種し、５５°Ｃで６時
間振盪培養した。

前記前培養３０１ｒＬｌを５６容のジャー・ファーメｄ
ｔ、員￥−−Ｍ　ｇ　ＳＯ４・７Ｈ２００，５グ／ｄｔ
、大豆油０、５　？／ｄｔ及び水道水からなる）に加え
、５５°Ｃ９３００ｒｐｍ、通気量１　ｔ／を培地の条
件で本培養を行い、１３時間で培養を終了した。

培養終了後、遠心分離により菌体を得、この菌体をｌｔ
の０．１　％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液中に分散
し、１晩７〜８℃で放置してウリカーゼを抽出した。こ
の抽出液を遠心分離して上清液を得た。上清液中のウリ
カーゼ活性は１０　Ｕ／ｄｔであった（上清液１．　Ｏ
Ｌ　、全活性１００Ｕ、）。

この上清液に３規定の酢酸を加えてｐＨ４，１とし、７
〜８°Ｃで３〜４時間静置することによりウリカーゼを
酸沈殿物として回収した。具体的には傾斜法で上清液を
除いた後、更に遠心分離を行い酸沈殿物を回収した。

この沈殿物を５０ｍＭのホウ酸ノ（ツファー（ｐＨ８、
０）　１００　ｒｒｔｌを用いて溶解し、透析膜（セロ
ファンチューブ）に入れ、７〜８°Ｃで１晩２ｔの５０
ｍＭ　リン酸バッフチー（ｐＨ６，０）に対して透析し
た。透析内液を５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６，０
）で予め平衡化したＤＥＡＥ−バイオゲルＡ（弱塩基性
イオン交換体、　ＣＪ、型、バイオラド社）のカラム（
直径２．５　ｃＩｒＬ、実効長さ１５　ｃｍ　）に通塔
し、ウリカーゼを相体に吸着させた。

次いで、５０ｍＭリン酸バッファー（ＰＩ−１６，１５
００ｍＡ！で洗浄後、上記バッファー５００ｍＪ及びこ
れに０．２Ｍの食塩を加えたバッファー５００ｍｊを用
いて直線濃度勾配溶出を行った。溶出液を１（１’づつ
分画し、ウリカーゼ溶出区分を集め、硫安６０チ飽和と
して沈殿物を遠心分離により集めた。

この沈殿物を少量の５０ｍＭ！Ｊン酸バッファー（ｐ［
−１８，０）に溶解し、同バッファーで平衡化したナフ
ァデツクスＧ−２００（ファルマシア社製、直径２．５
　ｃｍ　、実効長さ８０　ｃｒｒｔ　）のカラムにチャ
ージし、同バッファーで溶出した。溶出液を５１づつ分
画し、ウリカーゼ溶出区分を硫安６０％飽和とし、生成
する沈殿物を遠心分離により集めた。次に、これを５０
ｍＭのホウ酸バッファー（ｐＨｓ、ｏ）に溶解し、同バ
ッファー１ｔに対してセロファンチューブを透析膜と七
で７〜８°Ｃで一夜透析した。

透析チューブ内液を凍結乾燥し、ウリカーゼの粉末を得
た（比活性３Ｕ／■タンパク）。菌体抽出液からの活性
回収率は４１％であった。なお、この酵素標品の性質は
前記したとおりである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のウリカーゼの至適ｐＨを、第２図は該
ウリカーゼの安定ｐＨ範囲を、第３図は該ウリカーゼの
作用至適温度を、第４図は該ウリカーゼの安定温度範囲
を、第５図は該ウリカーゼのドデシル硫酸ナトリウムへ
の耐性を、第６図はパーオキシダーゼ法による尿酸定量
の際の酵素使用量と必要反応時間の関係をそれぞれ示す
ものである。 肩 芙ｌｉｔ ヨ 第１図 ｉ−１ 第２図 Ｈ 第３図 双成°芭康（°Ｃ） 第４図 女人・シＭ（”Ｃ） 第５図 トチ−シル基えＶ帆アトリヴムｆｉ／！（％）＃　奔　
ｔ　（ユニット／２．４ＭＬ）手続補正書く自発） 昭和６０年７　月１０日

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）尿酸を酸化的に分解する作用を有し、かつｐＨ５
   〜１０の広い作用ｐＨ域を有するウリカーゼ。
2. （２）バチルス属に属し、尿酸を酸化的に分解する作用
   を有し、かつｐＨ５〜１０の広い作用ｐＨ域を有するウ
   リカーゼを生産する能力のある好熱性微生物を栄養培地
   に培養し、培養物中に該ウリカーゼを生成せしめ、これ
   を採取することを特徴とするウリカーゼの製造法。
3. （３）バチルス属に属するウリカーゼ生産能を有する好
   熱性微生物がバチルス・エスピーＴＢ−９０（ＦＥＲＭ
   　ＢＰ−７９５）である特許請求の範囲第２項記載の方
   法。