DE3686597T2

DE3686597T2 - Uricase und verfahren zu deren herstellung.

Info

Publication number: DE3686597T2
Application number: DE8686107416T
Authority: DE
Inventors: Takahide Chikano; Minoru Kamimura; Masachika Takashio
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1985-06-05
Filing date: 1986-06-02
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2006-06-03
Also published as: JPH0671425B2; EP0204283A3; US4987076A; JPS61280272A; EP0204283A2; US4882280A; DE3686597D1; EP0204283B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Uricase, die in der Lage ist, Harnsäure oxidativ zu zersetzen und eine Aktivität dafür in einem pH-Bereich von 5 bis 10 hat, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus dem thermophilen Mikroorganismus Bacillus sp. TB-90 (FERM BP 795), biologisch reine Kulturen dieses Mikroorganismus und seine Verwendung zur Herstellung von Uricase.

Technischer Hintergrund

Uricase (EC 1.7.3.3) ist ein Enzym, das in der Leber und in den Nieren von Tieren sowie in bestimmten Mikroorganismen zu finden ist und welches die Oxidation von Harnsäure in Gegenwart von Sauerstoff katalysiert, so daß es in großem Umfange zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure in klinischen Untersuchungen verwendet wird.
Wie in JP-A-55-81586 und 56-124381 sowie in JP-B-56-43230 beschrieben, wird Uricase in großem Umfange auf mikrobiologischem Wege hergestellt. Eines der Probleme bei diesen mikrobiologischen Verfahren besteht darin, daß die Kultivierung des Mikroorganismus eine beträchtlich lange Zeit von 1 bis 3 Tagen oder sogar noch länger dauert, weil der Mikroorganismus, der in dem Verfahren verwendet wird, wie es in jeder der drei obengenannten Patentliteraturstellen beschrieben ist, mesophil ist.
Obgleich es vorteilhaft wäre, einen thermophilen Mikroorganismus zu verwenden, der eine hohe Stoffwechselgeschwindigkeit aufweist und schnell wachsen kann, im Hinblick auf die Möglichkeit, die Zeitspanne zu verkürzen, die für die mikrobiologische Produktion von Uricase erforderlich ist, ist bisher über kein Verfahren berichtet worden, bei dem ein thermophiler Mikroorganismus zur Herstellung von Uricase verwendet wird. Es wäre auch von Vorteil, einen thermophilen Mikroorganismus als Uricase-Quelle zu verwenden im Hinblick auf die ausgezeichnete Stabilität des so gebildeten Enzyms.
Vom Standpunkt der Aktivitätseigenschaften einer Uricase aus betrachtet ist es erwünscht, daß die Uricase eine hohe Aktivität in dem pH-Bereich von 6,5 oder in der Nähe desselben hat, um die Menge des Enzyms zu vermindern, die in der klinischen Analyse für Harnsäure erforderlich ist, weil die übliche Bestimmung der Harnsäure erfolgt durch die Kupplungsreaktion mit Peroxidase aus Meerrettich, die eine optimale Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 6,5 aufweist. Dennoch haben die üblicherweise in dem Stand der Technik verwendeten Uricasen einen optimalen pH-Wert in dem Bereich von 8,5 bis 9,0 und sie können im wesentlichen keine Aktivität bei einem pH-Wert von 6,5 aufweisen (vgl. JP-B-56-43230) oder die Aktivität bei einem pH-Wert von 6,5 beträgt weniger als 40% der Aktivität bei einem pH- Wert von 8,5 bis 9,0 (vgl. "Agric. Biol. Chem.", Band 44 (12), Seite 2811 (1980)).
Im Hinblick auf die vorstehend beschriebenen Probleme des Standes der Technik in Verbindung mit den bekannten Uricasen besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, einen thermophilen Mikroorganismus zu finden, der eine Uricase mit einer Harnsäure-zersetzenden Aktivität innerhalb eines breiten pH-Wertbereiches bilden kann.
Um dieses Ziel zu erreichen, wurden umfangreiche Forschungsarbeiten durchgeführt, um unter den thermophilen Mikroorganismen, die aus einer großen Anzahl von Bodenproben gewonnen wurden, einen thermophilen Mikroorganismus zu finden, der eine Uricase mit einer Harnsäure-zersetzenden Aktivität innerhalb eines breiten pH-Wertbereiches bilden kann, und schließlich wurde dieses Ergebnis erreicht, das zu der vorliegenden Erfindung führte.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine neue Uricase, die in der Lage ist, Harnsäure oxidativ zu zersetzen und eine Aktivität dafür innerhalb eines breiten pH-Bereiches von 5 bis 10 aufweist, die aus dem thermophilen Mikroorganismus Bacillus sp. TB-90 (FERM BP 795) erhältlich ist.
Die vorstehend definierte erfindungsgemäße neue Uricase ist ein mikrobiologisches Produkt, das von einem Mikroorganismus gebildet wird, der zum Genus der thermophilen Bazillen gehört und als Bacillus sp. TB-90 (FERM BP-795) bezeichnet wird, nachstehend abgekürzt als "TB-90" bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Verfahren zur Herstellung einer Uricase, die in der Lage ist, Harnsäure oxidativ zu zersetzen und eine Aktivität dafür in einem pH-Bereich von 5 bis 10 hat, das umfaßt das Kultivieren eines thermophilen Mikroorganismus Bacillus sp. TB-90 (FERM BP 795), der die Uricase in einem Nährstoff- Kulturmedium mikrobiologisch erzeugen kann unter Bildung der Uricase, und die Gewinnung (Abtrennung) der Uricase.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Bacillus sp. TB-90 (FERM BP 795) zur Herstellung von Uricase sowie biologisch reine Kulturen des Mikroorganismus Bacillus sp. TB-90 (FERM BP 795).

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1, 2, 3, 4 und 5 erläutern jeweils den optimalen pH-Wert, den pH-Bereich der Stabilität, die optimale Temperatur für die Aktivität, den Temperaturbereich für die Stabilität bzw. die Beständigkeit gegenüber Natriumdodecylsulfat der erfindungsgemäßen neuen Uricase. Die Fig. 6 zeigt die Reaktionszeit, die erforderlich ist zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure nach der Peroxidase-Methode als Funktion der Menge des verwendeten Enzyms.

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung

Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren für die mikrobiologische Herstellung der neuen Uricase verwendete Mikroorganismus ist ein thermophiler Mikroorganismus, der zum Genus Bacillus gehört und in der Lage ist, die oben definierte neue Uricase zu bilden. Dieser Mikroorganismus umfaßt nicht nur den obengenannten Mikroorganismus TB-90, sondern auch alle natürlichen oder künstlichen Mutantenstämme desselben sowie verschiedene Mikroorganismenarten, in welche die Gene der obengenannten Bakterienstämme transferiert worden sind, vorausgesetzt, daß sie die Fähigkeit haben, die neue Uricase zu bilden.
Nachstehend sind die bakteriologischen Eigenschaften angegeben, durch welche der Mikroorganismus TB-90 charakterisiert ist. Die Prüfung dieser Eigenschaften erfolgte nach dem Verfahren und unter Verwendung der Formulierung des Kulturmediums, wie sie in den Büchern "Classification and Identification of Microorganisms", herausgegeben von T. Hasegawa, publiziert von der Tokyo University Press, und "Methods of Identification of Microorganisms", publiziert von Eisei G&ijlig;utsu Kai, Japan, beschrieben sind.

Morphologische Eigenschaften (nach 18-stündiger Kultivierung bei 55ºC)

1. Gestalt und Dimensionen der Zellen: Stäbchen, 0,5-0,8 · 1,3-2 um
2. Polymorphismus: keiner
3. Motilität: keine
4. Sporen: kreisförmige endogene Sporen, die im Zentrum einer Zelle gebildet werden
5. Gram-Reaktion: positiv
6. säurefeste Färbung: keine
7. Kapseln: keine
8. metachromatische Körnchen: keine

Kultureigenschaften (nach 18-stündigem Kultivieren bei 55ºC)

1. Nährstoff-Agarplatten-Kultur
Form: kreisförmig
Rand: glatt
Erhebungen: flach
Glanz: nicht stark
Oberfläche: etwas grob
Farbe: durchscheinend
2. Nährstoff-Agar-Schrägkultur
Wachstum: gut
Gestalt: fadenförmig
3. Nährstoff-Flüssigkeits-Kultur
Oberflächenwachstum: keines
Trübung: klar
Niederschläge: eine geringe Menge
Färbung und Entfärbung: keine
4. Nährstoff-Gelatine-Stabkultur (Prüfung des erstarrten Zustands des Mediums durch Abkühlen nach dem Kultivieren bei 55ºC für eine bestimmte Zeitspanne, 30% zugesetzte Gelatine)
Gutes Wachstum mit einem großen Volumen an Niederschlägen, jedoch keine Verflüssigung der Gelatine.
5. Nährstoff-Agar-Stabkultur
Gestalt: torusförmig (nur in der Nähe der Oberfläche) Oberflächenwachstum: gut
6. Reaktion auf Lakmus-Milch
keine Verfärbung von Lakmus, pH-Wert unverändert, keine Koagulation, keine Verflüssigung

Physiologische Eigenschaften (nach 1- bis 2-tägiger Kultivierung bei 55ºC)

1. Reduktion von Nitraten: keine
2. MR-Test: negativ
3. V-P-Test: negativ
4. Indol-Bildung: keine
5. Schwefelwasserstoff-Bildung: keine
6. Stärke-Hydrolyse: ja
7. Ausnutzung von Zitronensäure: keine
8. Ausnutzung von Ammoniumsalzen: ja
9. Bildung eines färbenden Materials: keine
10. Oxidase-Aktivität: ja
11. Katalase-Aktivität: ja
12. pH-Wert für das Wachstum: 4,5 bis 7,5 mit einem optimalen pH-Wert von 5,0 bis 6,5
13. Temperatur für das Wachstum: 38 bis 62ºC mit einer optimalen Wachstumstemperatur von 50 bis 60ºC
14. Wachstum in einem anaeroben Kulturmedium: keines
15. Wachstum in einem Sabouraud-Dexrose-Agar-Kulturmedium: gut
16. Wachstum bei 55ºC in einem Kulturmedium, das 0,02% Natriumazid enthält: keines
17. Wachstum in 0,001% Lysozym (getestet bei 45ºC): keines
18. Deaminierung von Phenylalanin: keine
19. Verträglichkeit gegenüber Natriumchlorid: Wachstum in 3% NaCl, jedoch kein Wachstum in 5% NaCl
20. Vitaminbedarf: ja
21. Zersetzung von Tyrosin: nein

Ausnutzung von Kohlenstoffquellen

Der Mikroorganismus wächst unter Säurebildung durch Assimilierung von D-Xylose, D-Glucose, D-Galactose, Trehalose, Cellobiose und Glycerin.
Der Mikroorganismus nutzt nicht oder nur wenig aus Arabinose, Mannose, Fructose, Maltose, Saccharose, Lactose, D- Sorbit, D-Mannit, Stärke, 2-Keto-gluconat, Adonit, Xylit, Methyl-D-glucosid, N-Acetyl-D-glucosamin, Melezitose und Raffinose.
Als Ergebnis der Prüfung, die nach der Klassifizierungsmethode, wie sie in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Auflage (1974), beschrieben ist, unter Bezugnahme auf die obengenannten bakteriologischen Eigenschaften des Mikroorganismus vorgenommen wurde, wurde der erfindungsgemäße Mikroorganismus TB-90 identifiziert als zum Genus Bacillus gehörig. Obgleich es eine vorläufige Schlußfolgerung sein kann, die abgeleitet ist von dem Vergleich mit den bekannten Species, die zum Genus Bacillus gehören, daß der obengenannte Mikroorganismus TB-90 entweder ein Bacillus stearothermophilus, ein Bacillus coagulans oder ein Bacillus brevis sein kann im Hinblick auf den Temperaturbereich für das Wachstum, wird diese vorläufige Schlußfolgerung nicht gestützt wegen der fehlenden Motilität bei TB-90. Darüber hinaus kann TB-90 differenziert werden gegenüber Bacillus stearothermophilus in bezug auf die Fähigkeit, in einem Sabouraud-Dextrose-Agar- Kulturmedium zu wachsen, gegenüber Bacillus coagulans in bezug auf das Unvermögen, in einem anaeroben Agar-Kulturmedium und in Gegenwart von 0,02% Natriumazid zu wachsen, und gegenüber Bacillus brevis in bezug auf die Säurebildung aus Xylose, keine Alkalibildung in einem V-P-Kulturmedium und das Unvermögen, Casein und Thyrosin zu zersetzen. Außerdem konnte Uricase nicht gebildet werden, wenn das nachstehend beschriebene Kultivierungsverfahren bei dem Typ von Stämmen durchgeführt wurde, die umfassen Bacillus stearothermophilus IAM 11001, 11002, 11003, 11004 und 12043, Bacillus coagulans IAM 1194 und Bacillus brevis IAM 1031, wie sie im Institute of Applied Microbiology der Tokyo-Universität hinterlegt sind.
Wie aus der vorstehenden Beschreibung hervorgeht, ist eine angemessene Schlußfolgerung die, daß TB-90 eine neue Species ist, die zum Genus Bacillus gehört im Hinblick auf die Nichtidentität desselben mit irgendeiner der bekannten Species. Daher wurde ein Stamm von TB-90 hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology", Japan, als FERM BP-795.
Die erfindungsgemäße Uricase kann hergestellt werden durch Kultivieren des Mikroorganismus, der Uricase bilden kann, in einem Kulturmedium unter Bildung der Uricase und Abtrennung dieser Uricase.
Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nährstoff-Kulturmedium unterliegt keinen speziellen Beschränkungen einschließlich der natürlichen und synthetischen Komponenten, die enthalten eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Materialien und, je nach Bedarf, Wachstumsfaktoren, die von dem Mikroorganismus in einem gut ausgewogenen Mengenverhältnis benötigt werden.
Die für die Verwendung geeignete Kohlenstoffquelle umfaßt Glucose, Xylose, Galactose, Glycerin und andere Kohlenhydrate, Harnsäure und dgl. Die für die Verwendung geeignete Stickstoffquelle umfaßt Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Natriumnitrat, Harnstoff und andere organische Verbindungen, Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Stickstoff enthaltende natürliche Produkte, wie Peptide, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Harnsäure und andere. Die anorganischen Materialien, die verwendet werden, wenn es erwünscht ist, das Wachstum des Mikroorganismus und die Bildung des Enzyms zu fördern, umfassen verschiedene Arten von Phosphaten, verschiedene Arten von Sulfaten, wie Magnesiumsulfat und Eisen(II)sulfat, und verschiedene Arten von Chloriden, wie Natriumchlorid und Kaliumchlorid sowie Zeolith und Kaolin. Erforderlichenfalls kann das Kulturmedium mit Wachstumsfaktoren wie Biotin und Thiamin gemischt werden.
Obgleich die Kultivierung des Mikroorganismus entweder in einer festen Kultur oder in einer flüssigen Kultur erfolgen kann, ist die großtechnisch vorteilhafteste Methode die Flüssigkultivierung unter Belüften und Rühren. Die Kultivierung sollte bei einer Temperatur in dem Bereich von 38 bis 62ºC oder vorzugsweise von 50 bis 55ºC durchgeführt werden. Der pH-Wert des Kulturmediums sollte zweckmäßig neutral bis schwach sauer sein. Obgleich die Kultivierung stark von den Kultivierungsbedingungen abhängt, wird sie in der Regel 6 bis 20 Stunden lang fortgesetzt und sollte beendet werden, wenn eine beträchtliche Menge an Uricase in dem Medium nachgewiesen werden kann oder vorzugsweise dann, wenn die Menge der Uricase in dem Medium ein Maximum erreicht. Die von dem Mikroorganismus gebildete Uricase ist in der Regel in den Mikrobenzellen enthalten, die Uricase kann aber auch in dem Kulturmedium nachgewiesen werden, insbesondere dann, wenn die Kultivierung in der letzten Stufe vorliegt, die sich dem Ende nähert.
Die in der Kulturbrühe enthaltene Uricase kann nach irgendeiner der bekannten Methoden oder nach irgendeiner Kombination dieser bekannten Methoden gesammelt werden, ohne daß spezielle Beschränkungen bestehen. Nach Beendigung der Kultivierung wird die Kulturbrühe beispielsweise einer Zentrifugentrennung unterworfen, um die Mikrobenzellen zu sammeln, aus denen die Uricase auf geeignete Weise extrahiert wird. Die von unlöslichen Materialien und Zellbruchstücken durch Zentrifugieren und dgl. befreite Extraktlösung wird einer Reinigung der darin enthaltenen Uricase durch eine Kombination der Verfahren unterworfen, die umfassen die Ausfällung mit einer Säure, die Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel, das Aussalzen, die Dialyse und verschiedene chromatographische Methoden, wie z. B. der Ionenaustausch, die Gelfiltration, die hydrophobe Chromatographie und dgl., wobei die Uricase in sehr hoher Reinheit erhalten wird.
Nachstehend werden die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Uricase beschrieben. Die zur Bestimmung der Eigenschaften verwendete Probe war das in dem nachstehenden Beispiel erhaltene Enzym. Die Aktivitätsbestimmung der Uricase erfolgte in den meisten Fällen unter Anwendung des nachstehend beschriebenen UV-Verfahrens, bei dem die Abnahme der Ultraviolett-Absorption der Harnsäure bei einer Wellenlänge von 293 nm ausgenutzt wird. Die Aktivität der Uricase ist so definiert, daß ein Titer des Enzyms, das 1 uMol Harnsäure pro Minute unter den Meßbedingungen zersetzt, nachstehend als 1 U (Einheit) genommen wird. Die Aktivität in U/ml wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung errechnet:
Uricase-Aktivität, U/ml =
ΔOD x (Gesamtvolumen der Lösung) ml)x(x-fache Verdünnung)/ 12,2 x (Reaktionszeit, Minuten)x(Volumen der Enzymlösung in ml)
in der ΔOD die Abnahme der optischen Dichte bei 293nm während der Reaktion bedeutet und 12,2 der Molekularextinktionskoeffizient der Harnsäure in cm²/uMol angegeben ist.

1) Durch das Enzym katalysierte Reaktion

Das Enzym hat eine Aktivität, die folgende Reaktion zu katalysieren:
Harnsäure nicht-identifizierte Substanz

2) Optimaler pH-Wert (Einfluß des pH-Wertes auf die Aktivität)

Es wurde ein Vergleichstest durchgeführt unter Verwendung der erfindungsgemäßen Uricase, einer aus Hefe gewonnenen Uricase (ein Produkt der Firma Toyobo Co.) und einer weiteren Uricase, die aus Corynebacterium stammte (ein Produkt der Firma Seishin Seiyaku Co.). Jedes der Experimente für die Reaktion wurde durchgeführt durch Auflösung des Enzyms in einer Menge entsprechend 10 mU/ml bei 30ºC bei einem pH-wert von 8,0 in einer Pufferlösung mit einem variablen pH-Wert, wie in der Fig. 1 angegeben. Die Pufferlösung war eine 50 mM Boratpufferlösung, die 1 mM EDTA.2Na und 0,001% Triton X-100 enthielt, und die Endkonzentration der Harnsäure betrug 100 um. Die Reaktion wurde bei 30ºC durchgeführt unter Rühren der Lösung in einer Küvette mit einem magnetischen Stabrührer und Messen der Abnahme der UV-Absorption bei 293 nm.
Die Fig. 1 zeigt die relative Aktivität jedes der Enzyme als Funktion des pH-Wertes, wobei die Aktivität desselben beim optimierten pH-Wert als 100 angenommen wurde. Wie in dieser Figur dargestellt, wies das erfindungsgemäße Enzym eine viel höhere Aktivität auf als die beiden anderen Enzyme selbst in einem schwach sauren pH-Wertbereich und die Aktivität desselben überdeckte einen breiten pH-Bereich von 5 bis 10.

3) Einfluß des pH-Wertes auf die Stabilität

Das erfindungsgemäße Enzym wurde gelöst in einer 50 mM Phosphatpufferlösung bei variierendem pH-Wert wie in der Fig. 2 angegeben, die 1 mM EDTA.2Na und 0,001% Triton X-100 enthielt, in einer Konzentration von 200 mU/ml, bestimmt bei 30ºC mit einem pH-Wert von 8,0.
Nach 15-tägigem Stehenlassen derselben bei 30ºC wurde jede der Enzymlösungen mit einer 50 mM Boratpufferlösung bei einem pH-Wert von 8,0, die 1 mM EDTA.2Na und 0,001% Triton X-100 enthielt, auf das 20-fache verdünnt und dann wurden 100 uM Harnsäure zu der auf diese Weise verdünnten Lösung mit einem pH-Wert von etwa 8,0 zugegeben, um die enzymatische Reaktion bei 30ºC zu bewirken. Die Aktivität des Enzyms wurde bestimmt nach der UV-Methode und die Ergebnisse der restlichen Aktivität sind in der Fig. 2 angegeben, wobei für jeden pH-Wert die Aktivität am Beginn des Tests, d. h. ohne die Behandlung, auf 100 festgesetzt wurde. Die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms war in dem pH-Bereich zwischen 5 und 9 ganz stabil.

4) Optimale Temperatur (Einfluß der Temperatur auf die Aktivität)

Das erfindungsgemäße Enzym wurde in einer 50 mM Boratpufferlösung bei einem pH-Wert von 8,0, die 1 mM EDTA.2Na und 0,001% Triton X-100 enthielt, in einer Konzentration von 10 mU/ml gelöst und die enzymatische Reaktion wurde mit 100 um Harnsäure als Substrat bei variierenden Temperaturen, wie in der Fig. 3 angegeben, 6 Minuten lang durchgeführt. Die Abnahme der Harnsäurekonzentration wurde nach der UV-Methode bestimmt. Wie aus der Fig. 3 hervorgeht, welche die relative Aktivität des Enzyms bei variierenden Temperaturen zeigt, wobei der größte Wert auf 100 festgesetzt wurde, hatte das erfindungsgemäße Enzym eine optimale Temperatur bei 45 bis 50ºC.

5) Einfluß der Temperatur auf die Stabilität

Eine Lösung von 8 mU des erfindungsgemäßen Enzyms, gelöst in 100 ul einer 50 mM Boratpufferlösung bei einem pH-Wert von 9,1, die 1 mM EDTA.2Na und 0,001% Triton X-100 enthielt, wurde 10 Minuten lang bei variierenden Temperaturen, wie in der Fig. 4 angegeben, stehen gelassen und dann wurde die restliche Aktivität des Enzyms nach der UV- Methode bei 30ºC mit einem pH-Wert von 8,0 unter Verwendung von 100 uM Harnsäure bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Fig. 4 angegeben, in der die relative Aktivität als Funktion der Temperatur dargestellt ist, wobei die Aktivität des frischen Enzyms auf 100 festgesetzt wurde. Wie aus dieser Figur hervorgeht, wurde keine Inaktivierung des Enzyms nach 10 Minuten beobachtet, wenn die Temperatur bei 50ºC oder darunter lag, wobei die anfängliche Aktivität vollständig beibehalten wurde.

6) Verträglichkeit gegenüber ionischen oberflächenaktiven Agentien

Es wurden Vergleichstests durchgeführt unter Verwendung der gleichen drei Arten von Uricasen, wie sie in dem vorstehend beschriebenen Test zur Bestimmung des optimalen pH-Wertes verwendet wurden, durch Auflösen von 20 mU des Enzyms in 2 ml der Lösung für die UV-photometrische Aktivitätsbestimmung, die Natriumdodecylsulfat in variierender Konzentration enthielt, zur Durchführung der enzymatischen Reaktion mit Harnsäure. Die Ergebnisse sind in der Fig. 5 dargestellt, in der die Aktivität des Enzyms als Funktion der Konzentration des oberflächenaktiven Agens angegeben ist, wobei der in Abwesenheit des oberflächenaktiven Agens erhaltene Wert als 100 angenommen wurde. Aus dieser Figur geht hervor, daß das erfindungsgemäße Enzym hochbeständig war gegenüber diesem Protein-denaturierenden Agens und daß seine Aktivität frei von der Inhibierungswirkung von Natriumdodecylsulfat war bis zu einer Konzentration von 0,08 % während die beiden anderen im Handel erhältlichen Uricasen einer Inhibierung oder Denaturierung unterlagen.

7) Substratspezifität

Die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms gegenüber mehreren, mit Harnsäure verwandten Verbindungen wurde geprüft mittels der Bildung von Wasserstoffperoxid, das nach der Peroxidase-Methode nachgewiesen wurde. Es wurden somit 13 mU des erfindungsgemäßen Enzyms in 2 ml der Testlösung für die nachstehend beschriebene Peroxidase-Methode gelöst, die 200 uM des Substrats enthielt, zur Bestimmung der durch die enzymatische Reaktion gebildeten Menge an Wasserstoffperoxid. Das erfindungsgemäße Enzym, das für Harnsäure streng spezifisch war, war absolut inaktiv gegenüber Adenin, Guanin, Xanthin, Hypoxanthin, Theobromin und Theophyllin.
Nachstehend wird die Peroxidase-Methode, die zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid angewendet wurde, näher beschrieben.
Jede der Substrat-Verbindungen wurde in einer Menge entsprechend einer Konzentration von 200 uM in einer 50 mM Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 6,5, die 0,05% Triton X-100, 490 uM 4-Aminoantipyrin, 5,3 mM Phenol und 6 U/ml Peroxidase enthielt, gelöst und es wurden 2,0 ml der Lösung mit 13 uU des erfindungsgemäßen Enzyms gemischt zur Durchführung einer Reaktion auf dem getesteten Substrat bei 37ºC für 15 Stunden unter Bildung von Wasserstoffperoxid. Die Menge des Wasserstoffperoxids wurde bestimmt durch die Erhöhung der Absorption bei einer Wellenlänge von 500 nm als die λmax, zurückzuführen auf das färbende Material, das in einer Menge proportional zu dem Wasserstoffperoxid gebildet wird.

8) Molekulargewicht

Das erfindungsgemäße Enzym hat ein Molekulargeicht von etwa 120 000, bestimmt nach der Gelfitrationsmethode.
Wie oben angegeben, ist eine Uricase ein Enzym, das verwendbar ist für die quantitative Bestimmung von Harnsäure, wobei die quantitative Bestimmung von Harnsäure unter Verwendung einer Uricase auf den nachstehend beschriebenen verschiedenen Wegen durchgeführt werden kann.
I. Harnsäure wird quantitativ bestimmt durch die Bestimmung des durch die enzymatische Zersetzung der Harnsäure mittels Uricase gebildeten Wasserstoffperoxids, wobei das Wasserstoffperoxid nach mehreren verschiedenen Methoden bestimmt werden kann, die umfassen:
a) die Uricase-Peroxidase-Methode als eine enzymatische Photometrie, bei der das Wasserstoffperoxid mit 4-Aminoantipyrin und Phenol oder einem Derivat desselben in Gegenwart von Peroxidase umgesetzt wird unter Bildung eines färbenden Materials in einer Menge proportional zum Wasserstoffperoxid, woran sich die Bestimmung der Absorption anschließt;
b) die Uricase-Katalase-Methode als eine enzymatische Photometrie, bei der Wasserstoffperoxid umgesetzt wird mit einem Alkohol in Gegenwart von Katalase unter Bildung eines Aldehyds und das färbende Material, das als Kondensationsprodukt davon mit Acetylaceton und Ammoniak gebildet wird, bestimmt wird durch die Zunahme der Absorption; und
c) die Ultraviolett-Absorptions-Methode, bei der der obengenannte Aldehyd als Reaktionsprodukt mittels Katalase umgesetzt wird mit Nicotinamidadenindinucleotid in der reduzierten Form (NADH) in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase unter Bildung von NAD und wobei die Abnahme der NADH bestimmt wird durch Ultraviolett-Photometrie.
II. Die Harnsäure wird quantitativ bestimmt durch die Elektroden-Methode, bei der der Sauerstoffverbrauch oder die Bildung von Kohlendioxid bestimmt wird im Verlaufe der Zersetzung der Harnsäure durch Uricase.
III. Die Harnsäure wird quantitativ bestimmt unter Anwendung der Absorptions-Methode unter Ausnutzung der Differenz in bezug auf die Ultraviolett-Absorption, die auf die Harnsäure selbst zurückzuführen ist ,zwischen den Werten vor und nach der Reaktion.
IV. Der Harnsäure-Gehalt in den Materialien vor und nach der Uricase-Behandlung wird bestimmt nach einer chemischen Methode zur quantitativen Bestimmung der Harnsäure, beispielsweise der Phosphowolframsäure-Methode.
Unter den vorstehend beschriebenen Methoden zur quantitativen Bestimmung der Harnsäure ist die am häufigsten angewendete Methode die Uricase-Peroxidase-Methode. Der pH- Wert der Reaktionsmischung in diesem Falle sollte bestimmt werden in Abhängigkeit von den pH-Aktivitäts-Charakteristiken der Uricase und es ist wesentlich, daß mehrere Faktoren in Betracht gezogen werden einschließlich der Stabilität des färbenden Reagens, der pH-Abhängigkeit der Empfindlichkeit für die quantitative Bestimmung und der pH- Aktivitäts-Charakteristiken der gleichzeitig verwendeten Peroxidase, welche die höchste Aktivität bei geringer Acidität bei einem pH-Wert von 6,0 bis 7,0 hat.
Obgleich dies vom Ursprung des Enzyms abhängig ist, weisen Uricasen im allgemeinen die höchste Aktivität unter alkalischen Bedingungen bei einem pH-Wert von 8,0 bis 9,0 auf und sind absolut inaktiv (vgl. JP-B-56-43 230) oder nur sehr schwach aktiv (vgl. JP-A-56-124 381) im neutralen oder schwach sauren pH-Bereich. Im übrigen ist in JP-A-56-81 586 ein Beispiel beschrieben, bei dem eine Uricase eines spezifischen Typs die höchste Aktivität in einem schwach sauren pH-Bereich aufweist, deren Stabilität unter diesen Bedingungen jedoch extrem schlecht ist.
Im Hinblick auf das traditionelle Verfahren der klinischen Analyse, bei welcher die Reaktionstemperatur in den meisten Fällen für enzymatische Reaktionen 37ºC beträgt, ist andererseits die Temperaturabhängigkeit der Stabilität und Aktivität des Enzyms ebenfalls ein wichtiger Faktor, der in Betracht gezogen werden muß. Die für die quantitative Bestimmung der Harnsäure verwendete Uricase muß auch eine hohe Aktivität aufweisen, so daß die Zeit, die für die Reaktion benötigt wird, so kurz wie möglich ist und die Menge des bei der Reaktion verwendeten Enzyms so gering wie möglich ist.
Nachstehend wird ein Vergleich zwischen der erfindungsgemäßen Uricase und einer handelsüblichen Uricase, die aus Hefe stammt (ein Produkt der Firma Toyobo Co.) vom Standpunkt der Verwendung des Enzyms für die quantitative Bestimmung von Harnsäure angegeben. In der vergleichenden Untersuchung wurde die obengenannte Peroxidase-Methode angewendet zur Bestimmung der Beziehung zwischen der Menge des verwendeten Enzyms und der Reaktionszeit, die für die quantitative Bestimmung der Harnsäure erforderlich war, wobei dazwischen im allgemeinen eine umgekehrt proportionale Beziehung angenommen wird. Die Reaktionsbedingungen waren im wesentlichen die gleichen wie vorstehend beschrieben einschließlich der Arten und Mengen der in der Reaktionsmischung enthaltenen Komponenten und des Verfahrens zur Durchführung der Reaktion mit Ausnahme der Konzentration der Harnsäure, die 37,2 um betrug.
Die Reaktionszeit, die erforderlich war zur Vervollständigung der Reaktion, war gegeben durch die Zeit vom Start der Reaktion bis zu dem Augenblick, in dem die Absorption bei 500 nm, die der Menge des proportional zur Menge des Wasserstoffperoxids gebildeten färbenden Materials entsprach, konstant wurde.
Wie aus den Ergebnissen in der Fig. 6 hervorgeht, war die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms so hoch, daß etwa die gleichen Ergebnisse erhalten werden konnten bei Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms in einer Menge von nur 20% der Einheiten des handelsüblichen Enzyms, das zu Vergleichszwecken verwendet wurde. Die enzymatische Aktivität in diesem Falle wurde errechnet für die pH-Werte 8,0 und 8,5, d. h. die optimalen pH-Werte für die erfindungsgemäßen bzw. Vergleichsenzyme bei 30ºC nach der UV-Methode.
Die mit der erfindungsgemäßen Uricase erhaltenen Vorteile sind zusammenfassend folgende: das Enzym weist eine ausgezeichnete Stabilität auf dank des thermophilen Mikroorganismus, aus dem es stammt, und es hat auch die vorteilhaften Eigenschaften, daß das Enzym über einen breiten pH-Bereich aktiv ist und hochbeständig ist gegenüber oberflächenaktiven Agentien. Daher kann die erforderliche Menge an Enzym bei der quantitativen Bestimmung der Harnsäure stark herabgesetzt werden im Vergleich zu einer konventionellen Uricase, die aus Hefe stammt. Die quantitative Bestimmung der Harnsäure durch Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms kann nach mehreren verschiedenen Methoden durchgeführt werden, unter denen die Uricase-Peroxidase- Methode bevorzugt ist. Das erfindungsgemäße Enzym kann innerhalb einer verhältnismäßig kurzen Zeit mit einem hohen Wirkungsgrad (Ausbeute) hergestellt werden, weil es ein Produkt eines thermophilen Mikroorganismus ist.
Nachstehend werden die erfindungsgemäße neue Uricase und das Verfahren zu ihrer Herstellung anhand eines Beispiels näher beschrieben.

Beispiel

In ein großes Reagensglas wurden 10 ml eines Impfkulturmediums, hergestellt durch Auflösen von 1 g/dl Glucose, 1 g/dl Hefeextrakt, 1 g/dl Pepton, 1 g/dl Kaliumdihydrogenphosphat (KH&sub2;PO&sub4;), 1 g/dl Dikaliumhydrogenphosphat (K&sub2;HPO&sub4;) und 0,5 g/dl Magnesiumsulfat (MgSO&sub4;.7H&sub2; O) in Leitungswasser, eingeführt und nach 15-minütigem Sterilisieren bei 121ºC wurde das Kulturmedium mit TB-90 als Impfstoff inokuliert. Das Kultivieren des Mikroorganismus wurde durchgeführt durch 6-stündiges Schütteln des Mediums bei 55ºC.
Danach wurden 30 ml der so erhaltenen Kultur zu 1,5 1 eines Produktions-Kulturmediums in einem Kolben-Fermenter mit einer Kapazität von 5 l zugegeben, das hergestellt worden war durch Auflösen von 3 g/dl Glucose, 1 g/dl Hefeextrakt, 0,5 g/dl Pepton, 4 g/dl Harnsäure, 1 g/dl Kaliumdihydrogenphsopaht (KH&sub2;PO&sub4;), 0,5 g/dl Magnesiumsulfat (MgSO&sub4;.7H&sub2;O) und 0,5 g/dl Sojabohnenöl in Leitungswasser, und die Kultivierung wurde 13 Stunden lang unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 300 UpM und unter Belüften in einer Rate von 1 l Luft/l Kulturmedium bei 55ºC durchgeführt.
Nach Beendigung der Kultivierung wurden die durch Zentrifugentrennung gesammelten Bakterienzellen in 1 l einer 0,1 %igen wäßrigen Lösung von Triton X-100 dispergiert und die wäßrige Dispersion wurde über Nacht bei einer Temperatur von 7 bis 8ºC stehen gelassen, um eine Extraktion der Uricase in die wäßrige Phase zu bewirken, woran sich die Zentrifugentrennung der Dispersion anschloß unter Bildung einer klaren wäßrigen Lösung als überstehende Flüssigkeit. Die Uricase-Aktivität in dieser wäßrigen Lösung betrug 10 U/dl entsprechend einer Gesamtaktivität von 100 U in 1,0 l der wäßrigen Lösung als überstehende Flüssigkeit.
Die Uricase-enthaltende wäßrige Lösung wurde angesäuert, so daß sie einen pH-Wert von 4,1 hatte, durch Zugabe von 3 N Essigsäure und 3 bis 4 Stunden lang bei einer Temperatur von 7 bis 8ºC stehen gelassen, so daß die Uricase ausgefällt wurde. Die Uricase wurde aus der überstehenden Flüssigkeit durch Dekantieren und dann durch Zentrifugentrennung als Niederschlag gewonnen (abgetrennt).
Die so gesammelten Niederschläge wurden in 100 ml einer 50 mM Boratpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 gelöst und die Lösung wurde in einem Cellophan-Rohr über Nacht bei einer Temperatur von 7 bis 8ºC einer Dialyse unterworfen gegen 2 l einer 50 mM Phosphatpufferlösung mit einem pH- Wert von 6,0. Die auf diese Weise dialysierte Lösung wurde über eine Säule mit einem Innendurchmeser von 2,5 cm und einer effektiven Länge von 15 cm laufen gelassen, die mit einem schwach basischen Ionenaustauscher (DEAE-Biogel A, ein Produkt der Firma Biorad Co.) in der Cl-Form gefüllt war und die vorher mit einer 50 mM Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0 äquilibriert worden war, so daß die Uricase an dem Träger adsorbiert wurde.
Danach wurde der Träger in der Säule mit 50 ml einer 50 mM Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0 gewaschen und einer Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten unterworfen unter Verwendung von 500 ml der gleichen Pufferlösung, die 0,4 M Natriumchlorid enthielt. Das Eluat wurde in Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 10 ml gesammelt. Die die Uricase enthaltenden Fraktionen wurden miteinander vereinigt und es wurde Ammoniumsulfat zu der so kombinierten wäßrigen Lösung in einer Konzentration von 60% Sättigung zugegeben, woran sich das Sammeln der Niederschläge in der Lösung durch Zentrifugentrennung anschloß.
Die Niederschläge wurde in einem geringen Volumen einer 50 mM Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 gelöst und die Lösung wurde auf eine Säule mit einem Innendurchmesser von 2,5 cm und einer effektiven Länge von 80 cm aufgegeben, die mit Sephadex G-200 (einem Produkt der Firma Pharmacia Co.) gefüllt war, das mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, woran sich die Elution mit der gleichen Pufferlösung anschloß. Das Eluat wurde in Fraktionen mit einem Gewicht von jeweils 5 g gesammelt und es wurde Ammoniumsulfat zu den Fraktionen, welche die Uricase enthielten, zugegeben und diese wurden in einer Konzentration von 60% Sättigung kombiniert zur Ausfällung der Uricase. Die Uricase-Niederschläge, die durch Zentrifugentrennung gesammelt wurden, wurden in einer 50 mM Boratpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 gelöst und die Lösung wurde über Nacht einer Dialyse bei einer Temperatur von 7 bis 8ºC in einem Cellophan-Rohr als Dialysemembran gegen 1 l der gleichen Pufferlösung unterworfen. Die Lösung wurde nach Beendigung der Dialyse gefriergetrocknet, wobei die Uricase in pulverförmiger Form erhalten wurde, die eine spezifische Aktivität von 3 U/mg Protein aufwies. Die Ausbeute an diesem Uricase-Produkt betrug 41%, bezogen auf den Gehalt derselben in dem Extrakt aus den Bakterienzellen. Die Eigenschaften dieses Enzymprodukts waren wie vorstehend beschrieben.

Claims

1. Uricase, die Harnsäure oxidativ zersetzen kann und eine Aktivität dafür in einem pH-Bereich von 5 bis 10 aufweist, erhältlich aus dem thermophilen Mikroorganismus Bacillus sp. TB-90 (FERM BP 795).

2. Verfahren zur Herstellung einer Uricase, die Harnsäure oxidativ zersetzen kann und eine Aktivität dafür in einem pH-Bereich von 5 bis 10 aufweist, das umfaßt das Kultivieren eines thermophilen Mikroorganismus Bacillus sp. TB-90 (FERM BP 795), der die Uricase mikrobiologisch bilden kann, in einem Nährstoff-Kulturmedium unter Bildung der Uricase und das Gewinnen (Abtrennen) der Uricase.

3. Verwendung von Bacillus sp. TB-90 (FERM BP 795) zur Herstellung von Uricase.

4. Biologisch reine Kulturen des Mikroorganismus Bacillus sp. TB-90 (FERM BP 795).