DE2246695C3 - Verfahren zur Herstellung von Cholesterinoxidase und Verwendung derselben zur Bestimmung von Cholesterin - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Cholesterinoxidase und Verwendung derselben zur Bestimmung von Cholesterin

Info

Publication number
DE2246695C3
DE2246695C3 DE2246695A DE2246695A DE2246695C3 DE 2246695 C3 DE2246695 C3 DE 2246695C3 DE 2246695 A DE2246695 A DE 2246695A DE 2246695 A DE2246695 A DE 2246695A DE 2246695 C3 DE2246695 C3 DE 2246695C3
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
cholesterol
cholesterol oxidase
activity
oxidase
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2246695A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2246695B2 (de
DE2246695A1 (de
Inventor
William Harrow Middlesex Richmond
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Research Development Corp UK
Original Assignee
National Research Development Corp UK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Research Development Corp UK filed Critical National Research Development Corp UK
Publication of DE2246695A1 publication Critical patent/DE2246695A1/de
Publication of DE2246695B2 publication Critical patent/DE2246695B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2246695C3 publication Critical patent/DE2246695C3/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S210/00—Liquid purification or separation
    • Y10S210/918—Miscellaneous specific techniques
    • Y10S210/922—Oil spill cleanup, e.g. bacterial
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/863—Mycobacterium
    • Y10S435/866—Mycobacterium smegmatis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/872—Nocardia
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/913—Aspergillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/921—Candida
    • Y10S435/923—Candida lipolytica
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/921—Candida
    • Y10S435/924—Candida tropicalis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/94—Saccharomyces
    • Y10S435/942—Saccharomyces cerevisiae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

(1) das Enzympräparat mit einer spezifischen Cholesterinoxidaseaktivität von wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Proteinstickstoff und
(2) wenigstens ein Reagens, das zur Bestimmung der Menge verwendbar ist, in welcher ein Produkt bei der Cholesterinoxidasereaktion gebildet wird.
10. Verwendung des E ■ />mpräparates nach Anspruch 9 in gefriergetrockneter Form, die dann in ein wäßriges Präparat der gewünschten Wirkung mit einer Pufferlösung überführt wird.
11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Fertigpack die Komponenten in der erforderlichen Anzahl für die gleiche Anzahl von Untersuchungen enthält.
12. Verwendung nach Ansprüchen 9 bis 11, wobei das Reagens (2) ein Reagens enthält, das zur kolorimetrischen oder fluorimetrischen Bestimmung von Wasserstoffüeroxid dient.
13. Verwendung nach Ansprüchen 9 bis 12, wobei das Enzympräparat eine spezifische Cholesterinoxidaseaktivität von wenigstens 1 Einheit pro 50 μg Proteinstickstoff aufweist und bei Vorliegen in flüssiger Form eine Wirkung von wenigstens 0,5 Einheiten/ml besitzt
14. Verwendung nach Ansprüchen 9 bis 13, wobei zur Bestimmung des Gesamtcholesterins im Serum der Fertigpack als zusätzliche Komponente (3) wenigstens ein saures Reagens zur Neutralisation des verseiften Serums enthält
Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Die Bestimmung von Gesamtcholesterin in seiner Rolle als Indikator für Arteriosklerose und beginnende Herzkranzgefäßleiden stellt derzeit etwa 3% der Gesamtzahl von durchgeführten Untersuchungen in klinisch-chemischen Laboratorien dar. Für Großbritannien bedeutet dies derzeit etwa 1,5 Millionen Cholesterinuntersuchungen pro Jahr.
Cholesterin wird derzeit nach der Liebermann-Burchard-Reaktion bestimmt, welche die Verwendung von stark korrodierenden und viskosen Reagenlien bedingt und daher für die Automatisierung viele Hindernisse bietet.
Viele Arten von Nocardia können Cholesterin metabolisieren und insbesondere wurde von Stadtman et al, J. Biol. Chem., 206 (1954), S. 511-523, gefunden, daß eine Mycobacieriumerde befähigt ist, Cholesterin zu 44-Cholesicnon abzubauen. Das für diese Reaktion verantwortliche Enzym Cholesterindehydrogenase kann in zellfreier Form mit niedriger Aktivität erhalten werden. Die Herstellung dieser Cholesterindehydrogenase aus der gleichen Mycobacteriumerde als etwas reineres, lösliches Enzympräparat und die Bestimmung der Aktivität des Enzyms ist von Stadtman in Methods in Enzymology (1955) 1, Seiten 678 — 681, beschrieben worden, jedoch ist das lösliche Enzym noch von geringer Aktivität und es wurde keine wesentliche Reinigung erreicht.
Die 2 im Anspruch 1 angegebenen NCl B-Stämme besitzen eine Cholesterinoxidaseaktivität, die Cholesterin in ^-Cholestenon und Wasserstoffperoxid umwandelt. Die Verwendung von Cholesterinoxidase bietet die Grundlage für die enzymatische Bestimmung von Cholesterin in Flüssigkeiten und also auch von Gesamtcholesterin, die in einfacher Weise automatisiert werden kann und die Schwierigkeiten der Liebermann-Burchard-Reaktion vermeidet.
Die genannten 2 Mikroorganismen, die zur sogenannten Mycobacterium rhodocrous-Gruppe gehören, werden als »rauhe« und »glatte« Stämme bezeichnet und haben die Bezeichnung NCIB 10 554 und NCIB 10 555 der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Alberdeen, erhalten. Die zwei Mikroorganismen wurden auch beim Agricultural Research Service des United States Department of Agriculture, beim ARS Culture Collection Investigations Fermentation Laboratory, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt, wo sie die Bezeichnungen NRRL 5635 bzw. NRRL 5636 erhielten.
Die morphologischen Einzelheiten über diese Mikroorganismen sind wie folgt:
Rauhe Kolonie NCIB 10 554
Morphologie (Nähragar, 30° C) Grampositiv, Koryneorganismen. Kein gut entwikkeltes Mycel, jedoch rudimentäre Verästelung vorhanden. Beim Altern der Kultur erscheinen kokkenähnliche Formen. Nicht frei beweglich.
Morphologie der Kolonie (Nähragar, 5 Tage, 30° C) Kreisförmige, flache, vollständig trockene, opake, kremigorange Kolonien. 1,5—3 mm Durchmesser.
Hefe-Dextroseagar, 5 Tage, 30° C Kreisförmige, hochstehende, ganze, opake, schwachrosa Kolonien. Trockene verkrustete Oberfläche. 1 mm Durchmesser.
Gelatineagar
Unregelmäßige Koloniekante, hochgestellt, stumpfe, verkrustete Oberfläche, opake, schwachweiße Farbe.
Eigelb-Agarplatten
Unregelmäßige Koloniekante, hochgestellt, stumpfe, rauhe Oberfläche, opak, lederfarben.
Eigenschaften in flüssiger Kultur Weiße Oberflächenhaut, weißer, flockenförmiger Niederschlag, der sich beim Schütteln nicht vollständig dispergiert, keine Trübung.
Physiologie
Vollständig aerob
Gelatinehydrolyse +
Caseinhydrolyse —
Stärkehydrolyse -
Kovacsoxidase —
Katalase +
Urease
Indol
Vogue- Proskau er (V-P)-Test Methylrot
Entaminierung von Phenylalanin Hippurathydrolyse
Lackmusmilch
alkalisch
Anwendung von Verbindungen als einzige Kohlenstoffquellen
Citrat +
Lactat +
Malat +
Succinat +
Kohlehydrate (sauer)
In Peptonwasserzuckern war keine Säure nachweisbar
Zucker auf Ammoniumbasis
Fructose +
Glucose +
Saccharose +
Maltose +
Glycerin +
Sorbit +
Trehalose +
Raffinose +
Dulcit +
Lactose -
Mannit -
Stärke
Arabinose —
Glatte Kolonie NCIB 10 555
Morphologie (Nähragar, 30°C) Grampositiv, Koryneorganismen. Kein gut entwikkeltes Mycel, jedoch rudimentäre Verästelung vorhanden. Beim Altern der Kultur erscheinen kokkenähnliche Formen. Nicht frei beweglich.
Morphologie der Kolonie (Nähragar, 5 Tage, 30° C) Kreisförmige, ganze, konvexe, halbschleimige, opake-kremige, schwachweiße Kolonien, 0,5—2 mm Durchmesser.
Hefedextroseagar, 5 Tage, 30° C Konvexe, ganze, glatt scheinende, halbschleimige, blaßrose Kolonien.
Gelatineagar
Konvexe, ganze, glatt scheinende, blaßweise, opake Kolonien.
Eigelb-Agarplatten
Konvexe, ganze, opake, glatt scheinende Kolonien. Feuchte Oberfläche. 1 —3 mm Durchmesser.
Eigenschaften in flüssiger Kultur Weiße Gberflächenhaut, weißer flockenförmiger Niedei schlag, der sich beim Schütteln nicht vollständig dispergiert.
Physiologie
Vollständig aerob
Gelatinehydrolyse +
Caseinhydrolyse —
Stärkehydrolyse —
Kovacsoxidase —
Katalase + Indol
Voges-Proskauer(V-P)-Test -
Methylrot —
Entaminierung von Phenylalanin —
Hippurathydrolyse —
Lackmusmilch alkalisch
Anwendung von Verbindungen als einzige Kohlenstoffquellen
Citrat +
Lactat +
Malat +
Succinat +
Kohlehydrate (sauer)
In Peptonwasserzuckern war keine Säure nachweisbar
Zucker auf Ammoniumbasis
Fructose —
Glucose —
Saccharose —
Maltose +
Glycerin +
Sorbit +
Trehalose —
Raffinose +
Dulcit +
Xylose +
Arabinose +
Mannit — Stärke
Cholesterinoxidase wird erzeugt, indem ein Cholesterinoxidase bildender Mikroorganismus von Nocardia NCiD 10 554 oder NCIB 10555 gezüchtet, Zellen geerntet werden und Cholesterinoxidase von den Zellen
mit einem oberflächenaktiven Mittel ohne Zellzerstörung extrahiert und gewonnen wird.
Vorzugsweise wird Cholesterinoxidase in einer Form gewonnen, die eine spezifische Aktivität von wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Proteinstickstoff hit Es sind jedoch leicht höhere Aktivitäten erzielbar.
Eine Einheit an Cholesterinoxiduseaktivität ist hier als diejenige Aktivität definiert, die 1 μΜοΙ (10~6 Mol) Cholesterin zu 44-Cholestenon und Wasserstoffperoxid pro Minute bei 30° C und einem pH-Wert von 7 oxidiert
Der Mikroorganismus kann auf einem beliebigen, geeigneten Medium gezüchtet werden, bis die Zellen geerntet werden. Vorzugsweise wird der Organismus in einem Kulturmedium gezüchtet, welches Glycerin als eine Kohlenstoffquelle umfaßt Ein Beispiel eines Mediums ist:
(NH4)2SO4 0,2
CaCl2 · 2 H2O 0,001
FeSO4 ■ 7 H2O 0,001
K2HPO4 0,2
MgSO4 · 7 H2O 0,02
Glycerin 0,5
Hefeextrakt 2,0
Der Enzympegel steigt für wenigstens 2 Stunden nach dem Aufhören des Wachstums der Zellen noch weiter an. Obwohl das Enzym Cholesterinoxidase bei Abwesenheit eines Induktionsmittels erzeugt wird, kann die Enzymausbeute durch Induktion mit Cholesterin erhöht v. erden. Kleine Mengen Cholesterin können zu der Kultur als gesättigte Lösung in Aceton zugesetzt werden, bei größeren Mengen wird Cholesterin jedoch bevorzugt als Aufschlämmung in Wasser und einem
ίο Netzmittel, z. B. Poiyoxyäthylenderivaten von Sorbitanhydriden, die teilweise mit Fettsäure verestert sind (Tween 80), hergestellt, und die erhaltene Aufschlämmung wird zum Aufbrechen der Cholesterinteilchen zu einer feinen Suspension vor der Zugabe zu der Kultur
mit Schall behandelt
Als Beispiele für die Wirkung des Induktionsmittels sei angeführt, daß 0,2 g/l Cholesterin, welche bei einer Zellkonzentration von 5 g (Naßgewicht)/1 zugegeben wurden, eine Steigerung der Enzymproduktion bei dem
»rauhen« Stamm NCIB 10 554 in der Größenordnung von 4fachen und i,5 g/l Cholesterin, bei derselben Zellkonzentration zugegeben, eine Steigerung der Enzymproduktion in der Größenordnung vom 30fachen ergaben.
Die Zellen können durch Zentrifugieren geerntet d. h. gewonnen werden. Es kann gezeigt werden, daß die Zellen in dieser Stufe selbst eine Cholesterinoxidaseaktivität mit einer typischen, spezifischen Aktivität der Zellen des »rauhen« Stammes von etwa 0,5 μΜοΙ/mg/ Stunde besitzen.
Die Cholesterinoxidaseaktivität wird erfindungsgemäß ohne Zerstörung der Zellen gewonnen. Es gibt in der Tat Anzeichen, daß sich die Cholesterinoxidase auf der Oberfläche des Organismus befindet, und es wurde gefunden, daß sie mit guter Ausbeute der Aktivität unter Verwendung eines grenzflächenaktiven Mittels gewonnen werden kann. Nichtionische, grenzflächenaktive Mittel haben sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, und sehr gute Ergebnisse wurde mit Isooctylphen-
Um die Ausfällung von gering löslichen Salzen zu vermeiden, werden die oben angegebenen Bestandteile getrennt aufgelöst und dann zu einem geeignet großen Volumen von destilliertem Wasser in der gezeigten Reihenfolge hinzugegeben. Das Medium wird dann auf das gewünschte Volumen aufgefüllt. Die bevorzugte Inkubationstemperatur beträgt etwa 290C und der optimale pH-Wert liegt zwischen 6,0 und 7,6. Vorzugsweise wird der pH-Wert auf etwa pH = 6,7 eingeregelt.
Gesteigerte Ausbeuten an Zellen können durch Belüftung und Inbewegunghalten erhalten werden,
jedoch besitzt die Kultur die Neigung zum Schäumen 40 oxypolyäthoxyäthanol, welches etwa 10 Mol Äthylen- und hohe Raten einer Luftströmung und eines Rührens oxid enthält (Warenbezeichnung Triton X-100) erhalten, können im allgemeinen wegen eines übermäßigen Im folgenden wird dieses Isooctylphenoxypolyäthoxy-Schäumens nicht angewandt werden. Eine Luftströ- äthanol auch mit IOP bezeichnet,
mungsrate von 0,2 V/V/min und eine Rührergeschwin- Zur Entfernung der Cholesterinoxidase werden die
digkeit von 760 UpM ergaben ein rasches Wachstum 45 Zellen in einer Lösung des grenzflächenaktiven Mittels, ohne übermäßiges Schäumen. Ferner wird bevorzugt welche auf einen geeigneten pH-Wert gepuffert ist ein Antischaummittel wie Polypropylenglykol zur suspendiert, und die Suspension wird beispielsweise bei
Zimmertemperatur heftig gerührt. Die Cholesterinoxidase wird in der überstehenden Flüssigkeit durch Entfernen der Zellen, beispielsweise durch Zentrifugieren, gewonnen. Da die Zellen bei diesem Verfahren nicht zerbrochen werden, ist die Freisetzung von Protein niedrig, z. B. etwa 100 μ§/ΐη1.
Bei Versuchen zur Extraktion mit ΪΟΡ wurden 5,6 (Naßgewicht) Zellen des »rauhen« Stammes in 45 ml 0,5 M Tris*/HCl-Puffer bei einem pH von 8,0 suspendiert, der Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol in Konzentrationen von 1,3 und 5% enthielt. Die Suspension wurde heftig bei Zimmertemperatur gerührt und es wurden gleiche Anteile von 10 ml in Zeitabschnitten von 15 Minuten entnommen. Nach dem Entnehmen eines jeden Anteils wurde sofort mit 3500 UpM in einer Zentrifuge (Mistral 6L-Zentrifuge) zentrifugiert. Die Extrakte wurden dann auf die Cholesterinoxidaseaktivib5 tat untersucht, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden.
wie hOlypropylengiykoi zur Steuerung des Schäumens angewandt.
Falls die Anfangsimpfung des Mikroorganismus in das Kulturmedium gering ist, kann eine Verzögerungsphase von bis zu 16 Stunden auftreten. Die Verzögerungsphase ist eine Funktion der Größe der eingeimpften Menge und es wird keine Verzögerung erhalten, falls eine Impfungsmenge von mehr als 2%, bezogen auf das Zellengewicht am Schluß, verwendet wird.
Die erforderliche Gesamtinkubationszeit beträgt allgemein etwa 18 bis 24 Stunden. Unter optimalen Bedingungen beträgt die Verdoppelungszeit der Kultur etwa 2 Stunden und eine Zellenernte am Schluß von wenigstens 25 g (Naßgewicht) pro I der Zellen (5 g Trockengewicht) kann erhalten werden. Die Kultur kann in einem kleinen Umfang in 5-1- oder 10-1-Behältern durchgeführt werden, jedoch wurden auch ausgezeichnete Ergebnisse bei größeren Ansätzen in 100-1- und 1000-1-Behältern erhalten, wobei im letzteren Fall ein 500-1-Ansatz verwendet wurde.
Die Erzeugung von Cholesterinoxidase ist mit einer Verzögerung hinter dem Zellenwachstum verbunden.
*) Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Tabelle I
Extraktionszeit μ£ Cholesterin % gewonnenes
(min) oxidiert/50 μΙ/ Produkt in der
IS min überstehenden
Flüssigkeit
1% IOP
(Triton X-IOO)
15
30
45
60
1 1Wl IZU
ganze Zellen
3% IOP
(Triton X-100)
15
30
45
60
120
ganze Zellen
5% IOP
(Triton X-100)
15
30
45
60
120
ganze Zellen
30,0
35,0
35,0
37,5
36,5
53,5
36,0
35,5
38,5
38.5
41,0
52,5
34,0
37,5
38,5
38,0
41,0
54,5
56,0 65,5 65,5 70,0 68,3
68,5 67,5 73,5 73,5 78,0
62,5 69,0 71,0 70,0 75,0
Dies bedeutet, daß 70% der Aktivität der ganzen Zellen bei 1% IOP und bis zu 78% bei 3% IOP gewonnen werden können. Das grenzflächenaktive Mittel bleibt jedoch in der Cholesterinoxidaselösung zurück. Bei der Bestimmung von Cholesterin hat es sich herausgestellt, daß die Anwesenheit von Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol (Warenbezeichnung Triton X-100) vorteilhaft sein kann, daß die optimale Konzentration in dem Untersuchungsgemisch jedoch 0,25% beträgt, wobei höhere Konzentrationen hemmend wirken. Die Enzympräparation sollte daher keinen höheren Gehalt an grenzflächenaktiven Mittel besitzen als einem snnehnibiircn OchBlt in dem Untcrsuchun^s^cniisch entspricht Obwohl daher die beste Freisetzung bzw. Entfernung von Enzym bei 3% IOP (Triton X-100) erzielt werden kann, ist es besonders bevorzugt, bei einer niedrigeren Konzentration zu arbeiten, z. B. mit 1% IOP. Es kann jedoch erforderlich sein, das grenzflächenaktive Mittel zu entfernen, z. B. mittels Dialyse oder Gelfiltration oder alternativ durch Ausfällen des Proteins (Enzyms) aus der Lösung des grenzflächenaktiven Mittels.
Obwohl die durch Extraktion der Zellen mit einem grenzflächenaktiven Mittel hergestellte Cholesterinoxidasepräparation in einigen Fällen eine spezifische Aktivität und eine Wirkung haben kann, die zur Durchführung der Untersuchung ausreichend ist, ist es in den meisten Fällen erforderlich, den Extrakt zu reinigen und zu konzentrieren, bevor er praktisch bei einer Cholesterinuntersuchung angewandt werden kann. Im Falle einer fluorimetrischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid sollte die Enzympräparation eine Wirkung von wenigstens 10~2 Einheiten/ml besitzen, um ein Ergebnis in einer für die praktische Anwendung ausreichend kurzen Zeitspanne für einen Versuch zu liefern und insbesondere sollte die Präparation, wenn die Analyse automatisch durchgeführt wird, eine Wirkung bzw. Aktivität von wenigstens 10"' und vorzugsweise 0,5 Einheiten/ml besitzen.
Im Fall der nichtfluorimetrischen Untersuchung sollte die Präparation eine Wirkung bzw. Aktivität von wenigstens 10 -' Einheiten/ml und für eine automatisierte Analyse von wenigstens 0,5 Einheiten/ml besitzen.
Die Präparation kann mit einer höheren Aktivität, z. B. 5 Einheiten/'mi oder mehr, hergestellt werden, jedoch wird bei höheren Werten der Aktivität bzw. Wirkung im allgemeinen mit einem Puffer vor der Verwendung in einem Test verdünnt.
In allen Fällen beträgt die spezifische Cholesterinoxidaseaktivität des Präparats wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Proteinstickstoff. Bei höheren Werten von Proteinstickstoff kann die vorhandene Proteinmenge die Untersuchungslösung zu viskos machen oder bei der Untersuchung stören. Eine spezifische Aktivität von wenigstens 1 Einheit pro 50 μg Proteinstickstoff ist besonders bevorzugt. Als besonders vorteilhafte Enzympräparation hat sich eine wäßrige Präparation mit einer spezifischen Aktivität von 1 Einheit Cholesterinoxidaseaktivität pro 28 μg Proteinstickstoff, einer Wirkung von 5 Einheiten/ml, welche 3% V/V IOP (Triton X-100) enthält, herausgestellt. Diese Präparation kann zur Verwendung in einer Untersuchung beispielsweise mit 0,01 M Phosphatpuffer verdünnt werden, so daß sie für eine automatisierte Analyse 0,5 Einheiten/ml oder für eine manuelle Analyse 0.1 Einheiten/ml enthält. Die Cholesterinoxidaseaktivität aufweisende Enzympräparation muß nicht in wäßriger Form vorliegen, und sie kann beispielsweise in Form eines gefriergetrockneten Pulvers vorliegen. Zusätzlich zu der Präparation eines löslichen, lyophilisierten Pulvers kann das Enzym in einer konzentrierten, gepufferten Lösung oder in Suspension mit Ammoniumsulfat mit oder ohne zugesetztem Puffer vorliegen.
Obwoh! mit der Cholestennoxidase sehr wenig Protein extrahiert wird, ist im allgemeinen in dem Extrakt mit dem grenzflächenaktiven Mittel eine gewisse Katalaseaktivität vorhanden. Der Betrag der Katalaseaktivität, der in der fertigen Enzympräparation toleriert werden kann, hängt von der zu verwendenden Untersuchungsmethode ab, wobei die Katalaseaktivität der Präparation wichtig ist wenn die I Jntersuchung eine Messung der erzeugten H2O2-Menge umfaßt. Bei einigen Untersuchungsmethoden, bei denen H2O2 bestimmt wird, umfassen die Verwendung von Peroxidase, und es ist in einigen Fällen möglich, begrenzte Katalasemengen mit Peroxidase auszuschalten. Zusätzlich ist es möglich, eine beliebige Konzentration an Katalase, weiche wahrscheinlich in dem Extrakt mit dem grenzflächenaktiven Mittel gefunden werden kann, mit einem Inhibitor zu hemmen, z. B. mit Natriumazid.
Die Wirkung der Katalase auf die Empfindlichkeit bei einer Untersuchung kann wie folgt gezeigt werden.
Es wurde eine Katalaselösung hergestellt, indem 20 μΐ einer kristallinen Suspension von Katalase in 50 ml 0,05 M Phosphatpuffer von pH=7,0 aufgelöst wurden.
Es wurde gefunden, daß 03 ml dieser Katalaselösung 7,04 μΜ H2O2 bei einem letztlichen Volumen von 2,5 ml
in 2,0 Minuten zersetzten. Hieraus läßt sich errechnen, daß die Katalaseaktivität der Lösung 7,04 Einheiten pro ml bei einem pH von 7,0 und 25° C betrug.
Unterschiedliche Mengen dieser Katalaselösung wurden in ein Cholesterinuntersuchungssystem eingegeben, welches 0,5 Einheiten Cholesterinoxidase in 2,0 ml enthielt, und die Verminderung der Empfindlichkeit der Untersuchung beobachtet. Die Ergebnisse waren die folgenden:
Zugesetzte Katalaseeinheiten
% Verminderung der Empfindlichkeit
95
66,4
343
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1
Herstellung von Cholesterinoxidase
500 1 eines sterilen Wachstumsmediums wurden mit 11 einer Impfkultur von Nocardia sp. NCIB 10 554 beimpft. Das Wachstumsmedium sowohl für die Impfkultur als auch die Kultur für die Herstellung bestand aus:
g/l
15
Die Zugabe von 0,1% Natriumazid zu dem Reaktionsgemisch hemmte jedoch vollständig selbst die höchsten Gehalte von Katalase, wodurch eine 100%ige Empfindlichkeit selbst bei Anwesenheit von Katalase erzielt wurde.
Im allgemeinen sollte die Katalase jedoch aus den Präparaten entfernt oder zumindest in starkem Maße reduziert werden, beispielsweise mittels Chromatographie auf DEAE-Cellulose.
Geeignete Arbeitsweisen zur Reinigung der mittels Extraktion mit grenzflächenaktivem Mittel erhaltenen Enzympräparation und zur eventuellen Katalaseentfernung umfassen die Ausfällung mit Ammoniumsulfat und/oder chromatographische Methoden und/oder Eindampfer, unter vermindertem Druck. Beispielsweise kann die Präparation durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat oder Polyäthylenglykol konzentriert, auf einer Säule eines dreidimensional vernetzten Polysaccharids (Warenbezeichnung Sephadex) entsalzt und dann einer Ionenaustauscherchromatographie unterworfen werden. In dieser Stufe kann es erforderlich sein, die Aktivität der Präparation um etwa das 15- bis 40fache anzuheben.
Die Konzentrierung und Reinigung kann beispiels weise durch Substrataffinität-Chromatographie durchgeführt werden. Durch Hydroxypropylierung von G-25 hergestelltes dreidimensional vernetztes Polysaccharid (Sephadex LH-20) besitzt sowohl hydrophile als auch lipophile Eigenschaften und kann in polaren, organischen Lösungsmitteln, Wasser, oder Gemischen hiervon gequellt werden. Das dreidimensional vernetzte Polysaccharid LH-20 kann in mit Cholesterin gesättigtem (z. B. etwa 4,0 g/%) Äthanol gequollen werden, und eine Säule kann mit auf diese Weise präparierten LH-20 gefüllt werden. Durch Waschen der Säule mit destilliertem Wasser kann das Cholesterin gleichförmig in dem Gel verteilt werden, und die Säule kann schließlich mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer bei pH=7,5 ins Gleichgewicht gesetzt werden. Eine wesentliche Reinigung der Enzympräparation kann unter Verwendung einer solchen Säule erzielt werden.
Vorzugsweise wird die Enzympräparation zuerst einer Ionenaustauscher-Chromatographie oder einer Substrataffinität-Chromatographie, vorzugsweise einer Chromatographie mit Hilfe von DEAE-Cellulose (schwach basische Anionenaustauscher mit Diäthylaminoäthyl als funktioneller Gruppe eines dreidimensional vernetzten Polysaccharids) unterworfen werden und dann weiter durch Ultrafiltration oder Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert werden.
(NH4J2SO4
CaCl2^IhO
FeSO4-TlI1O
K,HPO4
MgSO4-7 H,O
Glycerin
Hefeextrakt
pH
2,0
0,01
0,01
2,0
0,2
10
20
6,7
Die Kultur wurde 24 Stunden bei 300C sich vermehren gelassen. Die Kultur wurde durch einen Rührer in Bewegung gehalten, der mit drei Turbinenimpellern ausgerüstet war und bei 250 UpM lief, wobei sterile Luft durch ein Einleitungsrohr in einer Menge von 150 l/min zugeführt wurde. Das Schäumen wurde durch intermittierende Zugabe von Polypropylenglykolantischaummittel gesteuert. Nach etwa 14 Stunden, sobald die Kultur eine Konzentration von 1 bis 2 g Trockengewicht/l erreicht hatte, wurden 600 g in 2 1 eines Gemisches aus einem grenzflächenaktiven Mittel (Tween 80) und Wasser (0,03 : l/V/V) suspendiertes Cholesterin zu der Kultur hinzugegeben. Während der Wachstumsphase betrug die maximale Verdopplungszeit des Wachstums etwa 2 Stunden. Nach 24 Stunden, als die Zellkonzentration etwa 6 bis 7 g Trockengewicht/l betrug, wurden die Mikroorganismen durch Durchleiten durch eine Scheibenzentrifuge mit intermittierender Entleerung bei 400 l/h gesammelt. Alternativ kann natürlich auch ein vorbeschichtetes Vakuumdrehfilter verwendet werden. Die Fermentierungsdauer kann durch Impfen mit einer größeren Menge einer Impfkultur verkürzt werden.
Die geernteten Zellen wurden in 0,01 M Kaliumphosphatpuffer, pH = 7,0, der 0,5% (V/V) 1OP (Triton X-100) enthielt, bei 100C, so daß ein Endvolumen von 601 erhalten wurde, suspendiert Nach sanftem Rühren während 2 Stunden — wobei kürzere Zeiten bei nur geringer Verminderung der Menge von extrahiertem Enzym angewandt werden können, wurden die extrahierten Zellen durch Durchleiten durch eine Röhrenzentrifuge (Modell 6P, Sharpies) entfernt Die erhaltene, klare, überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Säule von 51 Fassungsvermögen bei 5° C durchgeschickt, welche DE-52-CelIulose enthielt, welche zuvor mit 0,01 M Kaliumphosphatpuffer mit einem pH von 7,0, der 0,5% IOP (Triton X-100) enthielt, ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Die vorhandene Cholesterinoxidase und irgendwelche vorhandene Katalase wurden von der DE-52-Cellulose zurückgehalten. Die Cholesterinoxidase wurde durch stufenweise Elution mit Kaliumphosphatpuffer von pH = 7,0 mit zunehmenden Molgehalten, der 0,5% IOP (Triton X-100) enthielt, bei 5° C freigesetzt Irgendwelche, vorhandene Katalase blieb auf der Säule zurück.
Die an Cholesterinoxidase reichen, eluierten Fraktionen wurden durch Ultrafiltration bei 5° C unter
Verwendung einer PM-30-Membran weiter konzentriert Die erhaltene, zurückbleibende Lösung von 3 1 besaß eine Cholesterinoxidaseaktivität von 5,5 μΜοΙ Cholesterin oxidiert/ml/min bei 37°C. Die gesamte Ausbeute betrug etwa 20%. Diese kann durch Waschen der verworfenen Feststoffe in der Extraktions- und durch Auffangen einer größeren Fraktion in der lonenaustauscherstufe erhöht werden. Die Enzymlösung wurde in flüssiger Form bei 5° C aufbewahrt, wobei Azid als Konservationsmittel hinzugesetzt wurde. Die Lösung behielt ihre Gesamtaktivität praktisch für wenigstens zwei Monate.
Die Enzympräparation besaß eine spezifische Cholesterinoxidaseaktivität von etwa 1 Einheit pro 28 μg Proteinstickstoff und eine Wirkung von etwa 5 Einheiten/ml. Die Präparation enthielt etwa 3% V/V JOP (Triton X-100).
Beispiel 2
Ausrüstung für die Untersuchung
von freiem Cholesterin in Serum
Prinzip
Cholesterinoxidase oxidiert Cholesterin zu <d4-Cholestenon unter gleichzeitiger Bildung von Wasserstoffperoxid. Das erzeugte Wasserstoffperoxid wird mit Xylenol-orange und vierwertigem Titan in ein Chelat überführt Die Absorption dieses rotgefärbten Komplexes wird bei 550 nm gemessen.
Reagentien
1. 0,01 M Phosphatpuffer, pH = 7,0, welcher 0,10 g/% Natriumazid enthält.
2. Cholesterinoxidaselösung, 5 Einheiten (1 ml oxidiert 5 pM Cholesterin pro Minute bei pH = 7,0 und 30°C), welche 3,0% V/V 1OP (Triton X-100) enthält.
3. Arbeits-Enzymlösung — 5 ml Cholesterinoxidaselösung werden zu 41 ml des 0,01-M-Phosphatpuffers (1) hinzugegeben.
4. Schwefelsäure, 2N — 56 ml konzentrierte Schwefelsäure werden zu destilliertem Wasser hinzugegeben und auf 1 1 verdünnt.
5. Ausgangstitanlösung, 0,001 M — 0,08 g Titandioxid werden in einen 25-ml-Erlenmeyerkolben gegeben und es werden 0,5 g Ammoniumsulfat und 2,5 ml konzentrierte Schwefelsäure hinzugegeben. Dieses Gemisch wird auf einer Heizplatte erwärmt, bis alle Bestandteile aufgelöst sind und das Gemisch farblos ist Die Lösung wird dann abgekühlt und mit destilliertem Wasser auf 11 aufgefüllt
6. Ausgangsxylenolorangelösung, 0,001 M — 0,76 g Xylenolorange werden in destilliertem Wasser aufgelöst und auf 1 1 verdünnt
7. Kombiniertes Farbreagens — Ein Volumteil der Ausgangstitanlösung werden zu 0,5 Volumteilen 2 N-Schwefelsäure hinzugegeben und vermischt Ein Volumenteil der Ausgangsxylenolorangelösung und 0,5 g Polyoxyäthylenlauryläther (Warenbezeichnung Brij-35) pro 1 Reagens werden dann hinzugegeben.
8. Ein Cholesterin-Standard, der bis zu 3,0 mM pro 1 enthält, wird durch Auflösen von trockenem, reinem Cholesterin (BDH Biochemical Standard) in Isopropylalkohol hergestellt
Die Ausrüstung für 20 Untersuchungen umfaßt die beiden Reagentien A und B und eine Standard-Cholesterinlösung, die oben beschriebene Reagenslösung 8.
Reagens A — 80 ml Cholesterinoxidaselösung, hergestellt als das oben aufgeführte Reagens 3).
Reagens B — 40 ml des kombinierten Farbreagens, hergestellt als das oben beschriebene Reagens 7).
Methode
100 μΐ Serum oder Cholesterin-Standard werden zu 2,0 ml Reagens A hinzugegeben und 10 Minuten bei 37° C inkubiert.
Dann werden 1,0 ml Reagens B zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, und die Inkubation bei 37°C für weitere 5 Minuten fortgeführt.
Blindwerte werden erhalten, indem Serum oder Cholesterin-Standard direkt zu einem Gemisch von 2 ml Reagens A und 1,0 ml Reagens B hinzugegeben werden und 5 Minuten bei 370C inkubiert wird
Die optische Dichten der Testlösungen werden gegen die entsprechenden Blindproben bei 550 nm abgelesen.
Berechnung der Ergebnisse
mM Cholesterin für Litertest =
OD550 —Standard
Äthanolisches KOH und Cyclohexan werden von dem Benutzer bereitgestellt, da ersteres instabil ist und beide in relativ großen Volumen erforderlich sind.
Methode
0,2 ml Serum oder Standard werden zu 1,0 ml äthanolischem KOH hinzugegeben, und das Gemisch wird 5 Minuten bei 75°C in verschlossenen Reagenzgläsern inkubiert.
0,1 ml des verseiften Extraktes werden dann zu 1,0 ml 0,083 N-HCI, welche 0,3% 1OP (Triton X-100) enthält d. h. Reagens A, hinzugegeben. Die Lösung wird vor der Zugabe von 1,0 ml der Arbeits-Enzymlösung, d.h. dem Reagens B, vermischt. Nach Zugabe der Cholesterinoxidase wird das Reaktionsgemisch 10 Minuten bei 37° C inkubiert
5,0 ml äthanolisches KOH werden dann hinzugefügt und das während der Reaktion gebildete 44-Cholestenon wird in 4,0 ml Cyclohexan extrahiert
Blindproben werden in ähnlicher Weise hergestellt mit der Ausnahme, daß die Arbeits-Enzymlösung erst nach Zugabe des äthanolischen KOH hinzugegeben wird.
Die optischen Dichten der Extrakte werden gegen die Blindproben bei 236 nm abgelesen.
Ferner kann bei der Ausrüstung die Enzympräparation (1) in flüssiger Form mit einer Wirkung von wenigstens 10 -2 Einheit/ml vorliegen.
Bei einer weiteren Ausführungsforni der Ausrüstung umfaßt die Komponente (2) wenigstens ein Reagens, das an einer Reaktion teilnimmt, mittels der Wasserstoffperoxid colorimetrisch oder fluorimetrisch bestimmt werden kann.
Bei einer weiteren Ausfuhrungsform weist die Enzympräparation (1) eine spezifische Cholesterinoxidaseaktivität von wenigstens 1 Einheit pro 50 μg Proteinstickstoff auf und besitzt falls sie in flüssiger Form vorliegt eine Wirkung von wenigstens 0,5 Einheiten/mL
Bei einer weiteren Ausführungsform enthält sie eine Einzelmenge einer jeden Komponente, wobei die für eine Einzeluntersuchung erforderliche Menge aus dieser Einzelmenge entnommen wird.
Bei einer weiteren Ausführungsforrn der Ausrüstung
enthält diese Einheitsdosen der Enzymkomponente (1), wovon jede wenigstens 0,05 und insbesondere 0,5 Einheiten Cholesterinoxidaseaktivität enthält.
Bei einer weiteren Ausführungsform liegen die Einheitsdosen der Enzymkomponente (1) in gefriergetrockneter oder konzentrierter Form in Einzelbehältern vor, welche mit Puffer vor jedem Test in gebrauchsfähige Form überführt werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Ausrüstung für die Untersuchung auf Gesamtcholesterin in Serum enthält die Ausrüstung zusätzlich zu den Komponenten (1), (2) eine weitere Komponente (3) in Form wenigstens eines sauren Reagens zur Neutralisation des verseiften Serums.
Die Ausrüstung kann zusätzlich wenigstens eine standardisierte Cholesterinlösung enthalten.
Die Enzympräparation (1) kann Peroxidase oder ein beliebiges anderes Reagens, welches bei der Durchführung der Untersuchung erforderlich und mit Cholesterinoxidase verträglich ist, enthalten.
Die Komponente (2) der Ausrüstung ist für gewöhnlich, wenn Wasserstoffperoxid colorimetrisch bestimmt werden soll, ein Sauerstoffakzeptor wie 4-Aminophenazon und Phenol oder Xylenolorange und vierwertiges Titan.
Die Komponente (3) kann verdünnte HCl oder H2SO4 sein, und falls 44-Cholestenon direkt durch die Carbonyiabsorption bestimmt wird und kein Farbreagens vorliegt, kann dieses saure Reagens die einzige andere Komponente der Ausrüstung neben der Enzympräparation (1) sein.

Claims (9)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von Cholesterinoxidase durch Züchtung eines der Cholesterinoxidase erzeugenden Stämme Nocardia NCIB 10 554 und NCIB 10 555, durch Ernten der Zellen, durch Extraktion der Cholesterinoxidase durch Extraktion der Zellen mit einem oberflächenaktiven Mittel ohne Zellzerstörung und durch die Gewinnung des Enzyms.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als oberflächenaktives Mittel ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, insbesondere Isooctylphenoxypolyäihoxyäthanol, das etwa 10 Mol Äthylenoxid enthält, verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus in einem Medium, das Glycerin als eine Kohlenstoffquelle enthält, insbesondere bei einem pH von 6 — 8 gezüchtet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus in Gegenwart von Cholesterin gezüchtet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche ! —4, dadurch gekennzeichnet, daß eine zellfreie Flüssigkeit mit Cholesterinoxidaseaktivität weiter durch Ionenaustauschchromatografie, insbesondere an DEAE-Cellulose gereinigt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die durch Chromatografie gereinigte Flüssigkeit weiter durch Ultrafiltration oder Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Choleslerinoxidaseaktivität in eine feste, insbesondere gefriergetrocknete Form, überführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Cholesterinoxidasepräparat mit einer spezifischen Aktivität von wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Proteinstickstoff gewonnen wird.
9. Verwendung des nach einem der Ansprüche 1 -8 gewonnenen Enzympräparats zur Bestimmung von Cholesterin in einer Flüssigkeit in Form eines Fertigpacks, enthaltend
DE2246695A 1971-09-22 1972-09-22 Verfahren zur Herstellung von Cholesterinoxidase und Verwendung derselben zur Bestimmung von Cholesterin Expired DE2246695C3 (de)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB4409571 1971-09-22
GB2865072*[A GB1385319A (en) 1971-09-22 1972-06-19 Enzyme preparations
US289581A US3907642A (en) 1971-09-22 1972-09-15 Cholesterol oxidase and method of extracting from nocardia
US435892A US3907645A (en) 1971-09-22 1974-01-23 Cholesterol assay

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE2246695A1 DE2246695A1 (de) 1973-03-29
DE2246695B2 DE2246695B2 (de) 1980-11-06
DE2246695C3 true DE2246695C3 (de) 1981-08-20

Family

ID=27448749

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2246695A Expired DE2246695C3 (de) 1971-09-22 1972-09-22 Verfahren zur Herstellung von Cholesterinoxidase und Verwendung derselben zur Bestimmung von Cholesterin
DE2265122A Expired DE2265122C2 (de) 1971-09-22 1972-09-22 Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin
DE2265121A Expired DE2265121C3 (de) 1971-09-22 1972-09-22 Enzympräparat zur Bestimmung von Cholesterin und Verfahren zu seiner Herstellung

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2265122A Expired DE2265122C2 (de) 1971-09-22 1972-09-22 Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin
DE2265121A Expired DE2265121C3 (de) 1971-09-22 1972-09-22 Enzympräparat zur Bestimmung von Cholesterin und Verfahren zu seiner Herstellung

Country Status (6)

Country Link
US (3) US3907642A (de)
CH (2) CH588077A5 (de)
DE (3) DE2246695C3 (de)
FR (1) FR2187125A5 (de)
GB (1) GB1385319A (de)
NL (1) NL168268C (de)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1385319A (en) * 1971-09-22 1975-02-26 Nat Res Dev Enzyme preparations
DE2224133B2 (de) * 1972-05-17 1974-06-20 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verwendung von bestimmten Mikroorganismen-Stämmen zur Gewinnung von Cholesterinoxydase, welche Cholesterin mit O tief 2 zu Cholestenon + H tief 2 O tief 2 oxydiert
DE2224132C2 (de) * 1972-05-17 1980-04-03 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin
US4045296A (en) * 1972-08-09 1977-08-30 Beckman Instruments, Inc. Rate sensing batch analysis method and enzyme used therein
US4164448A (en) * 1973-12-07 1979-08-14 Boehringer Mannheim Gmbh Activation of cholesterol oxidase for cholesterol assay
CA1056282A (en) * 1974-03-25 1979-06-12 Charles T. Goodhue Multilayer analytical elements for use in the assay of cholesterol
US3884764A (en) * 1974-03-25 1975-05-20 Eastman Kodak Co Method and composition for blood serum cholesterol analysis
US3979283A (en) * 1974-09-25 1976-09-07 Bioteknika International, Inc. Microbial degradation of DDT
DE2456586C3 (de) * 1974-11-29 1979-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verwendung von bestimmten Mikroorganismenstämmen zur Gewinnung von Cholesterinoxidase, welche Cholesterin mit O2 zu Cholestenon + H2 O2 oxidiert
JPS552277B2 (de) * 1974-12-27 1980-01-19
JPS527484A (en) * 1975-07-04 1977-01-20 Kikkoman Corp Process for preparing cholesterol oxidase
US4035237A (en) * 1975-11-07 1977-07-12 Eastman Kodak Company Method for the preparation of cholesterol oxidase
US4052263A (en) * 1975-12-11 1977-10-04 Eastman Kodak Company Production of cholesterol esterase using Nocardia cholesterolicum
CA1067844A (en) * 1975-12-11 1979-12-11 Eastman Kodak Company Method and medium for producing cholesterol oxidase
US4040908A (en) * 1976-03-12 1977-08-09 Children's Hospital Medical Center Polarographic analysis of cholesterol and other macromolecular substances
US4184921A (en) * 1976-03-25 1980-01-22 Boehringer Mannheim Gmbh Process and reagent for determining cholesterol
US4043870A (en) * 1976-05-11 1977-08-23 The Upjohn Company Process of purifying cholesterol oxidase
US4066083A (en) * 1976-06-03 1978-01-03 Pentapharm A.G. Sterile surgical collagen product
US4161425A (en) * 1976-07-01 1979-07-17 Beckman Instruments, Inc. Enzymatic reagent system for total cholesterol assay using oxygen-rate method
DE2649749A1 (de) * 1976-10-29 1978-05-11 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und reagens zur bestimmung von gesamtcholesterin oder gebundenem cholesterin
US4166763A (en) * 1976-12-10 1979-09-04 Eastman Kodak Company Analysis of lactic acid or lactate using lactate oxidase
USRE32016E (en) * 1976-12-10 1985-10-29 Eastman Kodak Company Analysis of lactic acid or lactate using lactate oxidase
US4275151A (en) * 1977-02-03 1981-06-23 Eastman Kodak Company Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters
US4250255A (en) * 1977-07-11 1981-02-10 Eastman Kodak Company Assay method for isoenzyme activity
US4414326A (en) * 1978-04-24 1983-11-08 Goldberg Jack M Diagnostic agents
DK151634C (da) * 1978-09-29 1988-06-20 Mitsubishi Chem Ind Fremgangsmaade til rensning af langkaedet acyl-coenzym-a-syntetase
US4215993A (en) * 1978-12-04 1980-08-05 Data Medical Associates, Inc. Precipitating reagent and method for isolation and determination of high density lipoproteins in human serum
US4247631A (en) * 1979-01-31 1981-01-27 Millipore Corporation Reagent and method for the analytic determination of hydrogen peroxide
US4378429A (en) * 1979-08-23 1983-03-29 Modrovich Ivan Endre Enzymatic method and stabilized solutions for determining total cholesterol in human serum
ATE8912T1 (de) * 1980-07-10 1984-08-15 Ivan Endre Modrovich Stabilisierte enzymatische loesungen und verfahren zum bestimmen von gesamtcholesterin im menschlichen serum.
US4374930A (en) * 1981-10-19 1983-02-22 Eastman Kodak Company Method for the purification of cholesterol oxidase
US5047327A (en) * 1982-04-02 1991-09-10 Ivan E. Modrovich Time-stable liquid cholesterol assay compositions
US5062958A (en) * 1988-05-12 1991-11-05 Biotrol, Inc. Method for water purification
US5171688A (en) * 1988-08-30 1992-12-15 Cholestech Corporation Self-corrected assay device
US5156954A (en) * 1989-03-08 1992-10-20 Cholestech Corporation Assay device and method using a signal-modulating compound
US5487978A (en) * 1988-11-03 1996-01-30 Gds Technology, Inc. Method, composition and device for the determination of cholesterol using cholesterol oxidase obtained from bacterial strain NRRL B-18713
CA2002890C (en) * 1988-11-14 1999-12-14 Susan Long Expression of dna sequences derived from nocardioform microorganisms
CA1340449C (en) * 1988-11-14 1999-03-16 Susan Long Expression of dna sequences derived from nocardioform microorganisms
US5114350A (en) * 1989-03-08 1992-05-19 Cholestech Corporation Controlled-volume assay apparatus
US5340539A (en) * 1989-03-16 1994-08-23 Chemtrak, Inc. Non-instrumented cholesterol assay
US5238816A (en) * 1989-07-24 1993-08-24 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Omega carboxyalcohol oxidase enzyme
US4948297A (en) * 1989-07-24 1990-08-14 Fleming Joseph W Correction method for contaminated sites
JP2786679B2 (ja) * 1989-07-24 1998-08-13 旭化成工業株式会社 新規なω位カルボキシアルコール酸化酵素
US5206148A (en) * 1989-07-24 1993-04-27 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Method for assaying aliphatic alcohol, aliphatic aldehyde or ω-carboxylic acid derivatives thereof
US5110724A (en) * 1990-04-02 1992-05-05 Cholestech Corporation Multi-analyte assay device
AU3597393A (en) * 1992-01-31 1993-09-01 Actimed Laboratories, Inc. Inhibition of catalase activity in biological fluids
US5614410A (en) * 1992-07-14 1997-03-25 Sbp Technologies, Inc. Bioremediation of soil or groundwater contaminated with compounds in creosote by two-stage biodegradation
US5876671A (en) * 1993-03-24 1999-03-02 The Regents Of The University Of California Office Of Technology Transfer Sonication standard laboratory module
DE69407769T2 (de) * 1993-03-26 1998-05-28 Sbp Technologies Inc Verfahren zur biologischen sanierung von kontaminiertem boden oder grundwasser
FR2730584B1 (fr) * 1995-02-10 1997-04-25 Joanes Pierre Deguitre Procede et dispositif pour traiter des huiles et solvants contamines par des substances radioactives
US6057147A (en) * 1997-01-21 2000-05-02 Overland; Bert A. Apparatus and method for bioremediation of hydrocarbon-contaminated objects
JP2001525670A (ja) * 1997-05-16 2001-12-11 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 有機化合物の選択的酸化方法
BR0007101E2 (pt) * 2000-10-16 2018-10-30 Gct Global Ciencia E Tecnologia Bio S/A "composição, uso de uma composição, processos de tratamento de efluentes, de recuperação de um reator anaeróbio, de recuperação de um reator aeróbio, de remoção de gorduras de um equipamento de separação, de limpeza de fossas sépticas e de produção de uma composição"
ES2252358T3 (es) 2002-04-09 2006-05-16 Cholestech Corporation Metodo y dispositivo de ensayo para la cuantificacion del colesterol asociado a lipoproteinas de alta densidad.
US9079786B2 (en) * 2006-06-20 2015-07-14 Johannes van Leeuwen Purification of thin stillage from dry-grind corn milling with fungi
US7824879B2 (en) 2007-01-09 2010-11-02 Cholestech Corporation Device and method for measuring LDL-associated cholesterol
CA2682864C (en) * 2007-04-12 2019-12-31 Novozymes Biologicals, Inc. The treatment of wastewater with fungi
US20100296087A1 (en) * 2007-05-31 2010-11-25 Juergen Gailer Method for assessing trace element related disorders in blood plasma
US8481295B2 (en) * 2007-06-20 2013-07-09 Johannes van Leeuwen Fungi cultivation on alcohol fermentation stillage for useful products and energy savings
US20150260631A1 (en) * 2014-03-17 2015-09-17 Health Diagnostic Laboratory, Inc. System and method for assessing quanitites or sizes of lipoprotein particles from lipoprotein particle compositions
CN103184154B (zh) * 2013-04-02 2014-06-25 南开大学 一种生产380号船舶燃料油的生物技术及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2265121C3 (de) * 1971-09-22 1979-07-26 National Research Development Corp., London Enzympräparat zur Bestimmung von Cholesterin und Verfahren zu seiner Herstellung

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE173761C1 (de) * 1956-11-07 1960-12-20
US3152983A (en) * 1961-12-12 1964-10-13 Socony Mobil Oil Co Inc Microbial disposal of oily wastes
US3183173A (en) * 1963-06-10 1965-05-11 Miles Lab Test composition for detecting hydrogen peroxide
US3371019A (en) * 1965-01-08 1968-02-27 Searle & Co Diagnostic indicator
US3607093A (en) * 1968-02-15 1971-09-21 Schering Corp Devices for testing biological liquids
US3580840A (en) * 1969-03-18 1971-05-25 Litton Systems Inc Process for treating sewage and other contaminated waters
FR2047147A5 (de) * 1969-05-06 1971-03-12 Kyowa Hakko Kogyo Kk
US3547813A (en) * 1969-07-02 1970-12-15 Union Carbide Corp Biochemical oxidation with low sludge recycle
US3725258A (en) * 1972-02-14 1973-04-03 Air Prod & Chem Activated sludge sewage treatment process and system

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2265121C3 (de) * 1971-09-22 1979-07-26 National Research Development Corp., London Enzympräparat zur Bestimmung von Cholesterin und Verfahren zu seiner Herstellung

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
In Betracht gezogene ältere Patente: DE-PS 22 65 121

Also Published As

Publication number Publication date
DE2265121C3 (de) 1979-07-26
NL7212811A (de) 1973-03-26
CH596553A5 (de) 1978-03-15
DE2265122C2 (de) 1982-08-19
NL168268C (nl) 1985-01-16
US3907642A (en) 1975-09-23
NL168268B (nl) 1981-10-16
FR2187125A5 (de) 1974-01-11
DE2265121B2 (de) 1978-11-02
DE2246695B2 (de) 1980-11-06
US3907645A (en) 1975-09-23
CH588077A5 (de) 1977-05-31
DE2265121A1 (de) 1976-05-06
DE2246695A1 (de) 1973-03-29
US3899376A (en) 1975-08-12
DE2265122A1 (de) 1976-05-06
GB1385319A (en) 1975-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2246695C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Cholesterinoxidase und Verwendung derselben zur Bestimmung von Cholesterin
DE1800508C3 (de) Verfahren zur Herstellung von proteolytischen Enzymaufbereitungen und ihre Verwendung
DE1932981C3 (de) Verfahren zur biotechnischen Herstel lung eines Enzyms Lipase
EP0170880B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Aminooxydase enthaltendem Material, bzw. Aminooxydase, aus Mikroorganismen, solche Produkte und deren Verwendung zum Abbau von Histamin in Nahrungsmitteln, Getränken und Futtermitteln
DE2400323A1 (de) Neue glucose-isomerase, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE2153232C3 (de) Verfahren zur Herstellung einer Amylose
DE2512606A1 (de) Verfahren zur herstellung eines cholesterin-oxidase-enzyms
DE1230751B (de) Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Zuechten von Mikroorganismen
DE2925427C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Protease
DE2920764C2 (de)
DE2417642B2 (de) Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose
DE3539702C2 (de)
DE2804356C2 (de) Verfahren zur Hydrolyse von proteingebundenen Cholesterinestern
DE2650753A1 (de) Verfahren zur herstellung von cholesterin-oxidase
DE2164018C3 (de) Verfahren zur biotechnischen Her stellung von Uncase
DE3041744C2 (de)
EP0173919B1 (de) Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Aldose-1-epimerase
DE2819384C3 (de) Mikrobiologisch hergestellte Lipase und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE2917891A1 (de) Verfahren zur herstellung von acyl-coa- synthetase lcf-18
DE2107461A1 (de) Verfahren zum Herstellen von alkali schem Dextranase Enzym
EP0024345A1 (de) Verfahren zur Gewinnung von Cholesterinesterase
DE3137049C2 (de) Verfahren zur Gewinnung von Uricase mit Mikroorganismen
DE2419232C3 (de) Verfahren zur Reinigung von mikrobiologischem Rennin
DE2448343C3 (de) Desoxyribonuklease sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Desoxyribonukleotiden mit endständigem Desoxyguanosin
DE2063988A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Protease

Legal Events

Date Code Title Description
C3 Grant after two publication steps (3rd publication)