ES2252358T3 - Metodo y dispositivo de ensayo para la cuantificacion del colesterol asociado a lipoproteinas de alta densidad. - Google Patents

Metodo y dispositivo de ensayo para la cuantificacion del colesterol asociado a lipoproteinas de alta densidad.

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ES2252358T3 ES02013433T ES02013433T ES2252358T3 ES 2252358 T3 ES2252358 T3 ES 2252358T3 ES 02013433 T ES02013433 T ES 02013433T ES 02013433 T ES02013433 T ES 02013433T ES 2252358 T3 ES2252358 T3 ES 2252358T3
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Abstract

Dispositivo de ensayo (14) para medir colesterol sérico asociado a lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que contiene además lipoproteínas de baja densidad (LDL) o lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), comprendiendo el dispositivo: a.una matriz de distribución de muestra (26) para distribuir la muestra de fluido sanguíneo; b.un elemento (74) que contiene un reactivo inmovilizado eficaz para unir selectivamente y/o eliminar lipoproteínas no-HDL de la muestra de fluido; y c.una almohadilla de ensayo de HDL (64) en la que se puede ensayar la concentración de HDL, en comunicación fluida con dicha almohadilla de reactivo (74); en la que dicha almohadilla de reactivo (74) se puede poner en comunicación fluida con dicha matriz de distribución de muestra (26).

Description

Método y dispositivo de ensayo para la cuantificación del colesterol asociado a lipoproteínas de alta densidad.
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para determinar la concentración de colesterol asociado a lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo y a un dispositivo de ensayo diagnóstico para realizar dicho método.
2. Antecedentes de la invención
Es sabido que la cantidad de colesterol presente en la sangre está relacionada con el riesgo de enfermedad coronaria. El colesterol circula en la sangre predominantemente en una forma asociada a proteínas. Las proteínas que transportan colesterol son las lipoproteínas, que se subdividen en tres clases en base a su densidad. Las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) son lipoproteínas ricas en triglicéridos que se sintetizan en el hígado y finalmente se convierten en lipoproteínas de baja densidad (LDL), que transportan la mayoría del colesterol plasmático en los seres humanos. Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) son lipoproteínas implicadas en el catabolismo de las proteínas ricas en triglicéridos y en la eliminación del colesterol de los tejidos periféricos y el transporte hasta el hígado. Se ha establecido la existencia de una relación inversa entre los niveles séricos de HDL y el riesgo de enfermedad coronaria. En particular, si la proporción de colesterol sérico asociado con HDL es baja, incrementa el riesgo de enfermedad coronaria.
En vista de la importancia de los niveles relativos de colesterol sérico en la evaluación del riesgo y la administración de la enfermedad aterogénica, se ha invertido un gran esfuerzo en el análisis de los niveles séricos de HDL, LDL, colesterol total y triglicéridos en grandes poblaciones, tanto de individuos normales como de individuos de riesgo. La efectividad de los tratamientos de individuos de alto riesgo se ha seguido mediante el ensayo regular de los niveles séricos de colesterol en los múltiples compartimentos de lipoproteínas.
Un método para el ensayo específico del colesterol HDL se basa en la precipitación selectiva de las lipoproteínas no-HDL del suero mediante un compuesto polianiónico, tal como el sulfato de dextrano, la heparina o el fosfotungstato, típicamente en presencia de cationes del grupo II, tales como el Mg^{2+}, Mn^{2+} o el Ca^{2+}. La especificidad y el grado de precipitación dependen de una pluralidad de factores, que dependen del tipo y concentración del reactivo precipitante. En general, el orden de precipitación de las partículas de colesterol en el suero, con concentraciones crecientes de polianión, es VLDL, LDL y HDL. El HDL generalmente permanece en disolución a concentraciones de heparina o sulfato de dextrano que precipitan completamente las partículas de menor densidad, aunque se pueden coprecipitar pequeñas cantidades de la especie apoE de HDL con las partículas de menor densidad. Mediante la precipitación selectiva de las partículas de menor densidad, se pueden determinar los niveles séricos de colesterol HDL.
En un procedimiento típico de ensayo de lípidos, se toma un pequeño volumen de sangre y se centrifuga para generar una muestra transparente de fluido de plasma o suero. El fluido de la muestra se divide en alícuotas en múltiples tubos de ensayo, para la determinación de (a) colesterol sérico total, (b) triglicéridos y (c) colesterol HDL. La muestra de HDL se precipita como anteriormente y se eliminan las partículas de menor densidad por filtración o centrifugación antes de la detección de colesterol. A continuación se hacen reaccionar las muestras con una mezcla de enzimas que contiene colesterol esterasa, colesterol oxidasa, peroxidasa y un colorante que se puede oxidar a un producto de color inconfundible en presencia de H_{2}O_{2}. Los tubos se pueden leer espectrofotométricamente para determinar los niveles totales deseados de colesterol HDL y LDL.
A pesar de la precisión y fidelidad que se puede alcanzar con el ensayo de colesterol en fase-líquida descrito, el ensayo tiene múltiples limitaciones para su utilización en un cribado amplio. En primer lugar, el método utiliza una muestra de sangre venosa, lo que necesita un técnico capacitado para extraer y fraccionar la muestra de sangre y hacer alícuotas de la sangre tratada en tubos de ensayo individuales. Por lo menos uno de los tubos de muestra (para la determinación de HDL) se debe tratar con un agente precipitante y se debe procesar además para eliminar el material precipitado. Aunque algunos de los procedimientos se pueden automatizar, los instrumentos analíticos diseñados para tal fin son caros y no se encuentran ampliamente disponibles fuera de los hospitales grandes.
Las patentes U.S. co-titulares nº 5.213.964; 5.213.965; 5.316.196 y 5.451.370 dan a conocer métodos y dispositivos de ensayo que superan sustancialmente muchos de los problemas mencionados anteriormente asociados con los métodos de ensayo en líquido para medir los niveles séricos de colesterol. En una forma de realización, el dispositivo está diseñado para medir la concentración de colesterol asociado a HDL en una muestra de sangre que contiene además partículas de LDL y VLDL. El dispositivo comprende una matriz filtrante capaz de separar lipoproteínas solubles y precipitadas, a la vez que una muestra fluida pasa a través de la matriz. Un depósito asociado a la matriz está diseñado para liberar un agente precipitante soluble, para precipitar selectivamente LDL y VLDL, cuando la muestra fluida se carga y hace pasar a través de la matriz filtrante. Ello permite la separación de HDL de las lipoproteínas precipitadas, con base en la más rápida migración del HDL a través de la matriz filtrante. La muestra fluida, desprovista así de las lipoproteínas no HDL, a continuación pasa a una superficie de ensayo en la que se determina el colesterol.
El dispositivo descrito anteriormente, aunque representa una mejora sobre los ensayos en fase líquida, presenta la posibilidad de contaminación de la senda del flujo de transporte con los reactivos precipitantes. Dichos reactivos podrían interferir con la cuantificación de HDL o con la química de otros ensayos que tienen lugar en otras regiones del dispositivo de múltiples ensayos. La presente invención aborda y resuelve dichos problemas.
Otros métodos y dispositivos para medir el colesterol HDL en las muestras de sangre se dan a conocer en los documentos EP 0408223 y EP 0415298 (Rittersdorf et al.), que describen un método de ensayo continuo realizado sobre una cinta de ensayo que comprende las etapas siguientes y los correspondientes elementos. La sangre se aplica a una capa separadora para separar los componentes celulares de la sangre. Conducido por fuerzas capilares o por la fuerza de la gravedad, la muestra fluye a través de otro transportador que contiene agentes precipitantes solubles que, una vez disueltos en la muestra de suero, precipitan las lipoproteínas no-HDL contenidas en la muestra. En otro transportador, los constituyentes precipitados, anteriores, se filtran de la muestras de suero para evitar que interfieran con la posterior cuantificación de HDL. En el mismo transportador, se transporta la muestra a una posición adyacente al transportador de cuantificación de HDL y se almacena hasta que se ha iniciado la etapa de cuantificación de HDL. Finalmente, la muestra se transfiere a una capa de cuantificación de HDL, en la que se cuantifica el colesterol HDL en la muestra de suero mediante una reacción enzimática.
Una desventaja de este diseño de ensayo es que el transportador que funciona como depósito permite la emigración dentro de la muestra de los constituyentes precipitados o los reactivos solubles, lo que puede interferir con la cuantificación de HDL. Además, durante el almacenamiento de la muestra de suero, el HDL puede quedar atrapado adhiriéndose a las fibras del transportador, los reactivos precipitantes pueden producir reacciones indeseables adicionales y la muestra de suero que se está secando puede atascar el transportador.
La patente U.S. nº 5.135.716 (Thakore) da a conocer dispositivos adicionales y métodos destinados a la cuantificación de HDL en una muestra de fluido sanguíneo. En dicho dispositivo, la muestra de fluido fluye continuamente a través de una senda ininterrumpida, desde un pocillo de entrada a un transportador para la cuantificación de HDL. En consecuencia, la capacidad para controlar el volumen de la muestra que entra en el transportador de ensayo de HDL y para controlar las condiciones ambientales para el ensayo de HDL, es limitada. Los dispositivos tampoco proporcionan la posibilidad de ensayar múltiples analitos simultáneamente.
Por consiguiente el objetivo de la presente invención es proporcionar un dispositivo para el ensayo de HDL y un método que superen las desventajas de técnica anterior mencionadas anteriormente.
3. Sumario de la invención
En un aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo destinado a la medición del colesterol sérico asociado a las lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que también contiene lipoproteínas de baja densidad (LDL) y/o lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Dicho dispositivo comprende:
(i)
una pluralidad de elementos porosos a través de los que puede fluir dicha muestra de fluido sanguíneo en secuencia por acción capilar y/o gravedad, en la que dicha pluralidad de elementos comprende una matriz para la distribución de la muestra, termina en una almohadilla de ensayo de HDL, en la que se puede ensayar la concentración de HDL y comprende además, corriente arriba de la almohadilla de ensayo de HDL, un elemento que contiene un reactivo inmovilizado eficaz para unirse selectivamente a las lipoproteínas no HDL y eliminarlas de la muestra de fluido.
El dispositivo comprende además: (ii) medios de montaje eficaces para ajustar el dispositivo entre (a) una posición para la distribución de la muestra, en la que la almohadilla de ensayo de HDL no está en comunicación fluida con la matriz de distribución de la muestra, y (b) una posición de ensayo, en la que la almohadilla de ensayo de HDL y la matriz de distribución se encuentran en comunicación fluida entre sí.
Preferentemente, el reactivo inmovilizado comprende un reactivo polianiónico, más preferentemente un polisacárido sulfonado. En una forma de realización, el reactivo inmovilizado está inmovilizado en una primera región de recolección de la muestra dentro de la matriz de distribución de la muestra, que se encuentra en comunicación fluida con la almohadilla de ensayo de HDL cuando el dispositivo está en la posición de ensayo. En otra forma de realización, el reactivo inmovilizado está inmovilizado en una almohadilla porosa de reactivo que se encuentra corriente abajo respecto a la matriz de distribución y corriente arriba con respecto a la almohadilla de ensayo de HDL, almohadilla de reactivo que se encuentra en comunicación fluida con la almohadilla de ensayo de HDL cuando el dispositivo se encuentra en la posición de ensayo. La almohadilla de reactivo puede estar unida a la almohadilla de ensayo de HDL.
Preferentemente, el dispositivo comprende además: una almohadilla filtrante, corriente arriba y en contacto con la matriz de distribución de la muestra, efectiva para eliminar los componentes celulares de la muestra de fluido sanguíneo y un cuerpo de casete que contiene la almohadilla filtrante y que comprende además un pocillo para contener la muestra de fluido sanguíneo, estando el pocillo en comunicación fluida con la almohadilla filtrante y con la matriz de distribución de la muestra.
Preferentemente, el dispositivo comprende además una barra de reacción a la que se encuentra unida la almohadilla de ensayo de HDL y los anteriormente mencionados medios de montaje son eficaces para unir la barra de reacción al cuerpo del casete y ajustar las posiciones relativas de la barra de reacción y el cuerpo del casete entre la posición de distribución de muestra y la posición de ensayo. Preferentemente, el medio de montaje es además eficaz para transferir el dispositivo entre la posición de ensayo y una posición en la que dicha almohadilla de ensayo de HDL no está en comunicación fluida con la matriz de distribución de la muestra.
En una forma de realización, la matriz de distribución de la muestra contiene regiones adicionales de recolección de muestra y la barra de reacción comprende almohadillas de ensayo adicionales, de tal manera que las almohadillas adicionales se ponen en comunicación fluida con las regiones de recolección de muestra adicionales cuando el dispositivo se transfiere a la posición de ensayo.
Típicamente, la almohadilla de ensayo de HDL contiene reactivos que, en presencia de colesterol HDL, producen un cambio detectable en la almohadilla de ensayo, que, en una forma de realización, es un cambio ópticamente detectable. La almohadilla de ensayo de HDL puede comprender un biosensor, que es preferentemente eficaz para medir electroquímicamente la producción de oxígeno o peróxido de hidrógeno que depende de la concentración de colesterol asociado a HDL en la almohadilla de ensayo.
En una forma de realización, la almohadilla de reactivo comprende una membrana polimérica porosa. En una forma de realización preferida, en la que el reactivo inmovilizado es un reactivo aniónico, tal como un polisacárido sulfonado, la membrana polimérica contiene grupos catiónicos superficiales. En otra forma de realización, tanto la almohadilla de ensayo de HDL como la almohadilla de reactivo son membranas poliméricas porosas y las membranas están laminadas conjuntamente.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo de ensayo destinado a medir el colesterol sérico asociado con lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que también contiene lipoproteínas de baja densidad (LDL) y/o lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), comprendiendo el dispositivo:
-
una matriz de distribución de la muestra para distribuir la muestra de fluido sanguíneo;
-
una almohadilla de reactivo que contiene un reactivo inmovilizado eficaz en eliminar selectivamente lipoproteínas no-HDL de la muestra de fluido; y
-
una almohadilla de ensayo de HDL en la que se puede ensayar la concentración de HDL, que está en comunicación fluida con la almohadilla de reactivo; en la que la almohadilla de reactivo se puede poner en contacto fluido con la matriz de muestra.
El reactivo inmovilizado comprende preferentemente un polisacárido sulfonado y la almohadilla de reactivo comprende preferentemente una membrana polimérica porosa con grupos catiónicos superficiales.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método de medida del colesterol sérico asociado con lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que también contiene lipoproteínas de baja densidad (LDL) y/o lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). El método comprende:
(a)
poner en contacto dicha muestra con una matriz absorbente de distribución de la muestra, en la que la matriz de distribución de la muestra es una de entre una pluralidad de elementos porosos contenidos dentro del dispositivo de ensayo, a través de la que la muestra puede fluir en secuencia por capilaridad o por gravitación,
en la que la pluralidad de elementos termina en una almohadilla de ensayo de HDL, en la que se puede ensayar la concentración de HDL, y comprende, corriente arriba de la almohadilla de ensayo de HDL, un elemento que contiene un reactivo inmovilizado eficaz en unirse selectivamente y eliminar las lipoproteínas no HDL de la muestra fluida,
(b)
poner en contacto la muestra con dicho elemento que contiene el reactivo inmovilizado;
(c)
colocar la matriz en comunicación fluida con la almohadilla de ensayo de HDL, por lo que la muestra se transfiere de dicho elemento a la almohadilla de ensayo de HDL; y
(d)
determinar el contenido de lipoproteínas HDL en la muestra de fluido sanguíneo.
De acuerdo con el método, antes de la etapa (c), la matriz no está en comunicación fluida con la almohadilla de ensayo de HDL.
Preferentemente, el elemento que contiene el reactivo inmovilizado es una almohadilla de reactivo porosa, dispuesta corriente abajo respecto a la matriz de distribución y corriente arriba de la almohadilla de ensayo de HDL, almohadilla de reactivo que se encuentra en comunicación fluida con la almohadilla de ensayo de HDL en la etapa (c). En una forma de realización del método, la matriz no está en comunicación fluida con la almohadilla de reactivo antes de la etapa (b). Preferentemente, al poner en contacto la matriz con la almohadilla de reactivo en la etapa (b), la almohadilla de reactivo está en comunicación fluida simultánea con la almohadilla de ensayo de HDL. La almohadilla de reactivo se puede unir a la almohadilla de ensayo de HDL.
En otra forma de realización, el elemento que contiene el reactivo inmovilizado es la matriz, de modo que la puesta en contacto de las etapas (a) y (b) ocurre concurrentemente.
Todavía en otra forma de realización, el reactivo inmovilizado está contenido dentro de una matriz filtrante que se encuentra corriente arriba de y en contacto con la matriz de distribución de la muestra, de modo que las etapas de contacto (a) y (b) ocurren en orden inverso.
Preferentemente, el método comprende además la etapa de interrupción de la comunicación fluida entre la matriz y la almohadilla de ensayo, cuando la cantidad de muestra deseada ha sido transferida.
En una forma de realización preferida del método, el reactivo inmovilizado comprende un polisacárido sulfonado y la almohadilla del reactivo comprende una membrana polimérica porosa que comprende grupos catiónicos superficiales.
La indicación de colesterol HDL en la almohadilla de ensayo puede ser detectable ópticamente. La almohadilla de ensayo de HDL también puede comprender un biosensor. El biosensor es preferentemente eficaz para medir electroquímicamente la producción de oxígeno o peróxido de hidrógeno que depende de la concentración de colesterol asociado a HDL en la almohadilla de ensayo.
Los objetivos y características de la presente invención se pondrán más claramente de manifiesto haciendo referencia a los dibujos adjuntos descritos anteriormente.
4. Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1 a 3 son vistas laterales de dispositivos de análisis de múltiples analitos construidos de acuerdo con la pluralidad de formas de realización de la presente invención, con las Figuras 2 y 3 mostrando vistas parciales. La Figura 4 es una vista en perspectiva, en modo explosionado, de un dispositivo de análisis de múltiples analitos construido de acuerdo con una de las formas de realización de la presente invención.
5. Descripción detallada de la invención I. Definiciones
Los términos a continuación tienen los siguientes significados a menos que se indique de otro modo.
Un elemento está en "comunicación fluida" con otro elemento cuando un fluido puede viajar de un elemento al otro por capilaridad o gravitación. Los elementos no tienen que estar en contacto directo; es decir, pueden estar interpuestos otros elementos a través de los cuales dicho fluido puede pasar.
Una "almohadilla", tal como una almohadilla de reactivo o una almohadilla de ensayo, según se utiliza en la presente memoria, puede comprender cualquier material, tal como una membrana porosa o una cinta fibrosa, que puede contener reactivos impregnados o inmovilizados y a través de la cual se puede mover el fluido por capilaridad o gravedad.
II. Dispositivo de ensayo
Las Figuras 1 a 4 ilustran múltiples formas de realización de un dispositivo de ensayo de múltiples analitos 14 construido según la presente invención, con la Figura 4 mostrada en formato explosionado. El dispositivo está diseñado en particular con el fin de determinar el colesterol sérico asociado con HDL (también referido como colesterol asociado a HDL o simplemente colesterol HDL) que utiliza un pequeño volumen de muestra de sangre, comprendido típicamente entre 10 y 50 \mul de sangre. Otros ensayos, tales como el de colesterol total o el nivel de triglicéridos, se pueden realizar simultáneamente en la misma muestra. A la determinación del colesterol asociado a HDL también se la puede referir simplemente como determinación de HDL o ensayo de HDL.
El aparato comprende un cuerpo principal de soporte o soporte 15 que define un pocillo 16 de dimensiones calculadas para recibir una cantidad de muestra de sangre, comprendida típicamente entre 25 y 50 \mul. El pocillo está en contacto fluido con una almohadilla filtrante 22, que se puede transportar en una zona en forma de muesca 20 formada en el borde superior del soporte. El contacto fluido puede ser directo, o tal como se muestra en el dispositivo de la Figura 1, puede estar proporcionado por un conducto capilar 18 formado en la placa de la base del pocillo. El soporte es preferentemente una placa de material plástico, con el pocillo, la zona en muesca y/o el capilar conformados mediante métodos estándar de moldeo y maquinado.
La almohadilla filtrante 22 en la región 20 desempeña la función de eliminar parcialmente las partículas grandes de materia (incluidas la células sanguíneas) a la vez que la muestra se mueve a través de la matriz de la almohadilla en dirección de abajo a arriba, tal como se muestra en la figura. La almohadilla 22 está preferentemente formada una matriz de vidrio fibrosa de un material diseñado para atraer el fluido acuoso por el mojado de la superficie y para retardar el movimiento de las células sanguíneas cuando la muestra de sangre es atraída a través de la matriz. Una almohadilla ejemplar es un filtro de fibra de vidrio, tal como los filtros GF/D o PD008 de Whatman, con una densidad de empaquetamiento de aproximadamente 0,16 g/cm^{3} y un grosor de aproximadamente 1 mm. La almohadilla está calculada para absorber un volumen definido de fluido de muestra, preferentemente de entre aproximadamente 15 y 25 \mul. El tamiz filtrante 22 puede contener además reactivos para la captura de los hematíes, tales como lectinas, anticuerpos específicos a las proteínas de la membrana de las hematíes, trombina o reactivos de intercambio iónico. En una forma de realización, la almohadilla puede contener reactivos inmovilizados destinados a eliminar las lipoproteínas no HDL, tal como se describe más adelante.
La almohadilla filtrante 22, a su vez, está en contacto con una tira alargada de matriz de distribución de muestra 26 que se extiende a lo largo del borde superior de la placa 15. Dicha tira puede también estar soportada mediante el cojín de espuma 27 u otros soportes, tal como se muestra en la Figura 4. La matriz 26 sirve para distribuir el fluido de la muestra desde una región central de aplicación de la muestra 28, que está en contacto fluido con la almohadilla 22, hasta las regiones de recolección de la muestra tales como las 30, 32 dentro de la matriz.
La matriz está preferentemente formada de fibras de vidrio. La densidad de empaquetamiento y el grosor de la matriz son suficientes para absorber y distribuir volúmenes de fluido de muestra, p. ej. comprendidos entre 10 y 25 \mul, proporcionados a la región de aplicación de muestra de la cinta a las zonas de recolección de las muestras de la cinta. La matriz tiene una densidad de empaquetamiento preferida comprendida entre aproximadamente 0,16 y 4,0 g/cm^{3}. Un material de matriz ejemplar es el filtro de fibra de vidrio F-165-25A de Whatman, que tiene una densidad de empaquetamiento de aproximadamente 0,2 g/cm^{3} y un grosor de aproximadamente 0,12 mm.
El dispositivo 14 también comprende una barra de reacción 60 compuesta de un soporte alargado 62 y de múltiples almohadillas de reacción de ensayo humectables absorbentes 64, 66, 68 y 70, sobre la superficie inferior del soporte, tal como se indica. El soporte 62 es transparente o tiene ventanas, p. eje. la ventana 76 (Figura 4), que permiten la visión de las almohadillas a través del soporte. Dichas ventanas pueden ser de materiales transparentes o simplemente aperturas en el soporte. Las almohadillas de reacción de ensayo en la barra de reacción están unidas al soporte mediante un material adhesivo transparente o translúcido, o mediante soldadura sónica u otro método de unión adecuado. Cada almohadilla de ensayo utilizada para un ensayo en particular contiene reactivos dependientes del analito, eficaces con el fin de producir un cambio dependiente del analito en la almohadilla que se puede detectar de un modo conocido, tal como se describe más adelante. En un ensayo particular se pueden emplear todas o un subconjunto integral cualquiera de las almohadillas de ensayo.
Es deseable que las almohadillas de ensayo sean membranas poliméricas porosas, de un grosor comprendido preferentemente entre 100 y 150 \mum y con dimensiones laterales de aproximadamente 3 mm. El volumen de absorción de cada almohadilla está comprendido preferentemente entre aproximadamente 0,5 y 1,0 \mul. En una forma de realización, algunas o todas las almohadillas de reacción son membranas asimétricas; es decir, membranas que tienen un gradiente de porosidad a través del grosor de la membrana.
La barra de reacción está montada en el soporte 15 mediante medios de montaje eficaces para (a) mantener el dispositivo en una posición de distribución de la muestra, en la que la almohadilla de ensayo y, en una forma de realización, la almohadilla de reactivo (descrita más adelante), están separadas de la matriz de distribución de la muestra, y para (b) transferir el dispositivo a una posición de ensayo, en la que la almohadilla de ensayo, la almohadilla de reactivo, si se encuentra presente, y la matriz de distribución de la muestra están todas en comunicación fluida. Los medios de montaje también se puede utilizar con el fin de romper dicha comunicación fluida una vez que la cantidad deseada de muestra ha entrado en las almohadillas de ensayo, y/o después de un tiempo de contacto determinado, mediante la transferencia del dispositivo de la posición de ensayo a una posición en la que las almohadillas de ensayo no se encuentran en comunicación fluida con la matriz de distribución de muestra (que puede ser la misma que la posición de "distribución de muestra"). Dicha transferencia se puede controlar siguiendo la reflectancia en la superficie superior de la almohadilla de ensayo, que refleja la cantidad de mojado, tal como se describe en la patente US cotitular nº 5.114.350. Por el contrario, cuando la capacidad de absorción y la velocidad de adquisición de muestra del material de la almohadilla son conocidas, la cantidad de muestra se puede controlar con suficiente precisión utilizando simplemente un tiempo de contacto predeterminado.
Los medios de montaje pueden incluir, por ejemplo, un par de elementos elásticos, tales como los bloque de elastómero 71 y 72, que funcionan para dirigir la almohadilla de ensayo y, en una forma de realización, la almohadilla de reactivo hacia una posición de no transferencia o de distribución de muestra, en la que las almohadillas están separadas de la matriz de distribución de muestra. Mediante la compresión o liberación de los elementos elásticos, se puede establecer o deshacer de forma selectiva la comunicación fluida entre la matriz de distribución de muestra 26 y la almohadilla de ensayo de HDL 64 y/o la almohadilla de reactivo 74 (descrita más adelante). La comunicación fluida puede ser por contacto directo o a través de un elemento intermedio. Los bloques de soporte se pueden comprimir mediante muelles o mediante una acción de pistón. Por el contrario, mediante dispositivos mecánicos externos se pueden asociar el cuerpo principal 15 y/o el soporte 62 y mover el uno hacia el otro. Dichos dispositivos pueden incluir componentes convencionales tales como pinzas, pistones, motores paso a paso, tornillos sin fin o similares. Un sistema ejemplar es el Cholestech LDX® Analyser, un analizador automático, autocontenido, ventajoso para la utilización con dispositivos de ensayo tales como los descritos en la presente memoria.
Provisto en la senda de flujo de ensayo de HDL, corriente arriba de la almohadilla de ensayo de HDL, se encuentra un elemento que contiene inmovilizado un reactivo polianiónico eficaz en unir y eliminar de la muestra fluida, las lipoproteínas no HDL. Dicho elemento puede ser la almohadilla filtrante o la matriz de distribución de muestra. Preferentemente, entre la matriz de distribución de la muestra y la almohadilla de ensayo de HDL se proporciona una almohadilla de reactivo diferente 74 con dicho reactivo inmovilizado. Tal almohadilla de reactivo se puede fijar a la matriz de distribución de la muestra, tal como se muestra en la Figura 3 o más preferentemente, a la almohadilla de ensayo utilizada con el fin de ensayar HDL, tal como se muestra en las Figuras 1 y 4. Los reactivos de enlace inmovilizados pueden estar presentes en cualquiera o todos los elementos 22, 26 y 74; preferentemente, están limitados a la almohadilla de ensayo 74.
Tal almohadilla de reactivo 74 también puede estar soportada en una posición sustancialmente en el mismo plano entre la almohadilla de ensayo de HDL y una región de recolección de muestra de la matriz 26, tal como se muestra en la Figura 2. Por ejemplo, un elemento de soporte comprimible 73 podría soportar la almohadilla de reactivo 74 sobre la matriz, de modo que el movimiento de la barra de reacción hacia el cuerpo principal (o al revés) pondría dichas áreas en comunicación fluida, preferentemente primero poniendo la almohadilla de ensayo 64 en comunicación fluida con la superficie superior de la almohadilla de reactivo 74 y a continuación poniendo la superficie inferior de la almohadilla de reactivo en comunicación fluida con la matriz de distribución de muestra. Tal como se indicó anteriormente, la comunicación fluida puede ser por contacto directo, tal como se ilustra en las figuras, o a través de un elemento intermedio.
La almohadilla de reactivo tiene preferentemente un grosor comprendido entre aproximadamente 100 y 150 \mum, dimensiones laterales de aproximadamente 3 x 6 mm y un volumen de absorción comprendido entre aproximadamente 0,5 y 1,0 \mul. Contiene un reactivo inmovilizado eficaz en eliminar selectivamente partículas de LDL y VLDL de la muestra de fluido. El reactivo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o preferentemente un reactivo polianiónico que se une a LDL y VLDL. Dichos reactivos, conocidos en la materia, comprenden polisacáridos sulfonados, heparina y fosfotungstato, en presencia o ausencia de cationes del grupo II, tales como Mg^{2+}, Mn^{2+} o Ca^{2+}. Un reactivo preferido es un polisacárido sulfonado, tal como sulfato de dextrano, con un peso molecular típico comprendido entre 50.000 y 500.000 daltons, opcionalmente conjuntamente con acetato de magnesio o cloruro, tamponado con el fin de mantener el pH neutro.
La almohadilla de reactivo es efectiva en atrapar las lipoproteínas no HDL unidas dentro de la almohadilla de reactivo y evitar su entrada en la almohadilla de ensayo de HDL 64. Debido a que los reactivos de enlace están inmovilizados en el transportador y no están disueltos en la muestra fluida, se evita la migración de los componentes precipitados de la mezcla y el reactivo precipitante, dentro de la almohadilla de ensayo de HDL.
En una forma de realización preferida, la almohadilla de reactivo 74 está compuesta de una membrana polimérica porosa, con un tamaño de poro de 1 \mu o inferior. En una forma de realización, el reactivo polianiónico, p. ej., sulfato de dextrano, está inmovilizado por fuerzas electrostáticas y/o covalentemente a una membrana con grupos superficiales cargados positivamente. Un material ejemplar para tal fin es una membrana de nilón con grupos superficiales de amonio cuaternario, tal como la membrana AM080 proporcionada por Cuno Corp. (Meridian, CT). Otras membranas poliméricas comerciales con grupos superficiales catiónicos comprenden Immobilón-Ny+^{TM} (Millipore Corp., Bedford, MA), Zetabind® (también de Cuno Corp.), GeneScreen® (NEN/DuPont, Boston, MA), Hybond N+ (Amersham, Piscataway NJ) y Posidyne® (Pall Corp, Glen Cove, NY).
La patente U.S. nº 5.543.054 (Charkoudian et al.) describe un método para unir covalentemente carbohidratos con carga negativa a una membrana con partes reactivas próximas a partes positivas en su superficie. La membrana es, por ejemplo, un polímero poroso, p. ej., tetrafluoroetileno, fluoruro de polivinilideno, poliéster, poliamida, policarbonato, polipropileno, polimetilmetacrilato, polimetacrilato, polisulfona o poliestireno, recubiertos con Hercules R-4308^{TM}, una resina de poliamido-poliamino epiclorhidrina.
En el caso de una membrana cargada positivamente, tal como se describió anteriormente, la membrana puede estar impregnada con una solución de polianión mediante un proceso de dispersión automatizado y secada. La membrana también se puede impregnar con catión divalente. Por el contrario, el reactivo se puede inmovilizar sobre pequeñas partículas que se aplican a continuación a la membrana adecuada.
Para la inmovilización de reactivos en fibras de vidrio, en las formas de realización en las que el reactivo enlazante se encuentra inmovilizado en la matriz filtrante y/o en la matriz de distribución, las fibras pueden recubrirse primero con un polímero catiónico tal como se describió anteriormente. Por el contrario, las fibras de vidrio se pueden funcionalizar con un reactivo que contiene un grupo de siloxano y un grupo catiónico (p.ej., cloruro de 3-(trietoxisilil)propiltrimetilamonio o un reactivo similar), tal como se conoce en la materia para funcionalizar superficies a base de sílice.
Un reactivo polianiónico de enlace también se puede inmovilizar a una membrana u otro sustrato, tal como un sustrato fibroso, mediante enlaces covalentes. En la técnica se conocen múltiples métodos químicos para enlazar polisacáridos covalentemente a diversos sustratos. [Véase, p. ej. la patente U.S. nº 4.744.899 (Tani et al.), nº 6.281.202 y nº 6.008.203 (Magnani et al.), nº 6.204.254 (Nelson et al.), nº 6.060.525 (Slingsby et al.), nº 5.919.525 (Sundberg et al.) y nº 5.811.532 (House)]. Por ejemplo, una superficie que contiene hidroxilo se puede modificar con epiclorhidrina con el fin de producir una superficie epoxidificada, que reacciona con los grupos hidroxilo en el polisacárido. Por el contrario, el polisacárido se puede modificar para que contenga grupos electrófilos, tales como epóxidos, ésteres o aldehídos, que pueden a continuación reaccionar con una superficie conteniendo aminas o tioles. Para el enlace a las superficies de vidrio o a las fibras de vidrio, así como también a otras superficies que contienen hidroxilo, son particularmente útiles los reactivos de silano funcionarizado, tales como los aminoalquil o hidroxialquil- trialcoxisilanos.
En una forma de realización, la almohadilla de reactivo 74 consiste en una única membrana. La presente invención también contempla la utilización de múltiples membranas apiladas, es decir, hasta aproximadamente seis, en la que por lo menos una y preferentemente cada una de las membranas contiene reactivos para enlazar lipoproteínas no HDL, para la almohadilla de reactivo 74.
En una forma de realización, la almohadilla de ensayo 64 también es una membrana polimérica, que contiene reactivos para el ensayo de los niveles de HDL. Si se desea, los reactivos para el ensayo de HDL, tales como la peroxidasa, se pueden inmovilizar a la membrana de la almohadilla de ensayo, según métodos bien conocidos para la inmovilización de enzimas. [Ver p. ej. las patentes U.S. nº 4.999.287; nº 5.419.902; Blum, L.J. et al., Anal. Lett . 20(2):317-326 (1987); Kiang, S.W. et al., Clin . Chem. 22(8):1378-1382 (1976); Guilbault, G.G., Ed., Modern Monographs in Analytical Chemistry, Vol 2: Analytical Uses of Immobilized Enzymes (1984); Tochilin, V.P., Progress in Clinical Biochemistry and Medicine, Vol 11: Immobilized Enzymes in Medicine (1991)]. En otra forma de realización se puede incluir en la almohadilla de reactivo un reactivo tal como la catalasa, que es efectiva para descomponer todo el peróxido de hidrógeno que se pueda difundir hacia abajo desde la almohadilla de ensayo 64.
En otra forma de realización un reactivo tal como la catalasa que es eficaz para descomponer cualquier peróxido de hidrógeno producido que podría difundirse hacia abajo desde la almohadilla de ensayo 64, se puede incluir en la almohadilla de reactivo 74.
En una forma de realización preferida, en la que se utilizan dos membranas poliméricas unidas en la almohadilla de ensayo 64 y en la almohadilla de reactivo 74, respectivamente, los reactivos apropiados están impregnados o inmovilizados, y las membranas se procesan como una capa de dos membranas para la incorporación en el dispositivo de ensayo durante la fabricación.
Todavía en otra forma de realización, la almohadilla de ensayo de HDL comprende un biosensor, tal como se describe, por ejemplo, en la publicación PCT nº WO 9958966 (Dobson et al.). Dicho documento da a conocer un dispositivo biosensor a microescala, que comprende una superficie conductora, una capa de material dieléctrico que recubre la superficie conductora y una pluralidad de poros que se extiende a través de la superficie dieléctrica y puede actuar como un microelectrodo, convirtiendo una respuesta química en una señal eléctrica. Durante su utilización, se aplica un fluido que debe ensayarse que contiene el analito a los poros de forma tal que se pone en contacto con el biopolímero. En el presente dispositivo de ensayo de HDL, esto se logra cuando la almohadilla de reactivo 74, que contiene fluido de muestra, se coloca o mantiene en comunicación fluida con la almohadilla de ensayo de HDL; es decir, la superficie del biosensor que contiene poros.
El biopolímero en los poros del microelectrodo es típicamente un enzima, tal como colesterol oxidasa, para la medición de colesterol asociado a HDL. El colesterol es oxidado por la colesterol oxidasa a la cetona correspondiente, liberando peróxido de hidrógeno, que a continuación se puede convertir en agua y oxígeno mediante el enzima peroxidasa. Tanto el oxígeno como el peróxido de hidrógeno se pueden medir electroquímicamente. Los métodos electroquímicos que se pueden utilizar comprenden los métodos amperométricos, tal como el electrodo de oxígeno de Clark, que mide la corriente producida por la reducción del oxígeno o la oxidación del peróxido de hidrógeno, o métodos voltamétricos. La utilización de voltametría cíclica en los microelectrodos ha sido descrita para la medición de múltiples analitos (ver p. ej. R.J. Forster, Chem . Soc. Rev. 289-297 (1994)], tal como dopamina (Pihel et al., Anal. Chem. 68(13)2084-2089 (1996) y fullerenos (Soucaze-Guillous et al., Anal. Chem. 65(6):669-672 (1993)] así como también peróxido de hidrógeno [(Horrocks et al., Anal. Chem. 65(24):3605-3614 (1993); Nowall et al., Electroanalysis 9(2):102-109 (1997); Dequaire et al., J. Am. Chem. Soc. 124(2):240-253 (2002)].
III. Método de ensayo
En funcionamiento, se coloca una muestra de sangre en el pocillo 16 y se embebe a través de la almohadilla filtrante 22, en la que se eliminan las partículas grandes, que comprenden los hematíes y a partir de ahí en la matriz de distribución de muestra 26. Estas etapas tienen lugar a la vez que el dispositivo está en un estado de "distribución de muestra" tal que la matriz de distribución de muestra no se encuentra en comunicación fluida con las almohadillas de ensayo, ni, en ciertas formas de realización (p. ej., Figuras 1 a 2), con la almohadilla de reactivo 74.
En algún momento antes del contacto con las almohadillas de ensayo, el suero de la muestra hace contacto con los reactivos de enlace inmovilizados, que pueden estar contenidos en la matriz filtrante, la matriz de distribución de muestra o, más preferentemente, en una almohadilla de reactivo separada, de modo que las lipoproteínas no HDL se unen al portador correspondiente. El dispositivo es por consiguiente eficaz en eliminar del suero las lipoproteínas no HDL, a la vez que permite el paso del suero que contiene el HDL en fase líquida a la almohadilla de ensayo de HDL 64. En una forma de realización esta eliminación tiene lugar a la vez que el dispositivo se encuentra en la posición de distribución de muestra; es decir, cuando el reactivo está inmovilizado en la almohadilla de tamizado, a la almohadilla de distribución de muestra o, preferentemente en una almohadilla de reactivo diferente que se encuentra en comunicación fluida con dichos elementos (p. ej. Figura 3).
En otra forma de realización preferida, el reactivo está inmovilizado en una almohadilla de reactivo 74 que no se encuentra en comunicación fluida con la matriz de filtrado o con la matriz de distribución de muestra durante la etapa de distribución de muestra, p. ej., tal como se muestra en las Figuras 1, 2 y 4. Una ventaja de las formas de realización en las Figuras 1 a 4, que utilizan una almohadilla de reactivo separada, es que la matriz de distribución de muestra y los elementos corriente arriba no contienen reactivos que se unan a no HDL; dichos reactivos solamente están presentes en la almohadilla de reactivo 74. Por consiguiente, se elimina la posibilidad de interferencia por dichos reactivos, en los ensayos de analitos diferentes de HDL.
Cuando la muestra de suero alcanza los lugares de recolección de las muestras, tales como los lugares 30 y 32 adyacentes a los extremos de la matriz 26, el dispositivo se ajusta a una posición de ensayo, preferentemente mediante el desplazamiento de la barra de reacción 60, para situar las almohadillas de ensayo 64, 66, 68 y/o 70 y, en las formas de realización de las Figuras 1 a 2 y 4, la almohadilla de reactivo 74, en comunicación fluida con la matriz. En tal posición, el fluido de muestra en la matriz es atraído en la almohadilla(s) de ensayo por flujo capilar. La barra de reacción se mantiene en tal posición hasta que se logra el grado de mojado deseado de la almohadilla(s) de ensayo. La barra se mueve entonces, si se desea, para romper la comunicación fluida entre la matriz de distribución de muestra y la almohadilla(s) de ensayo, cuando ha entrado la cantidad deseada de fluido de muestra en la almohadilla(s) de ensayo, y/o después de un tiempo de contacto adecuado.
En formas de realización del dispositivo en las que la almohadilla de reactivo 74 esta colocada entre la almohadilla de ensayo 64 y la matriz de distribución de muestra 26 pero sin fijarse en ninguna de ellas (p. ej. Figura 2), el movimiento de la barra de reacción con respecto al cuerpo principal, típicamente moviendo la barra de reacción hacia abajo, coloca estas tres áreas en comunicación fluida, preferentemente colocando la almohadilla de ensayo 64 en comunicación fluida con la almohadilla de reactivo 74, para aproximar la disposición de los elementos mostrados en las Figuras 1 a 4 y, a continuación, con todavía más desplazamiento, colocando la almohadilla de reactivo en comunicación fluida con la matriz de distribución de muestra. Se mantiene el contacto hasta que se logra el grado de mojado deseado, tal como se describió anteriormente.
Durante la operación, en formas de realización tales como las ilustradas en las Figuras 1 a 2 y 4 (que además se caracterizan por que los reactivos enlazantes están limitados al elemento 74), cuando la muestra fluida pasa a través de la senda de ensayo de HDL, que comprende las almohadillas 74 y 64, su frente pasa en dirección hacia arriba a través de la almohadilla 74, en la que reaccionan las lipoproteínas no HDL y quedan atrapadas, y directamente a la almohadilla de ensayo adyacente 64, en la que el HDL reacciona con los reactivos de ensayo que contiene, para la medición del colesterol asociado a HDL. Otras porciones de la muestra siguen en contacto con la almohadilla 74 durante este tiempo y proceden desde la almohadilla 74 a la almohadilla 64 de modo similar, hasta que se alcanza la capacidad de absorción de la almohadilla 64. En consecuencia, la cuantificación del colesterol asociado con HDL en la almohadilla de ensayo 64 tiene lugar concurrentemente con la reacción de enlace que tiene lugar en la almohadilla de reactivo 74. Preferentemente, el volumen de muestra fluida transferido hasta la senda de ensayo de HDL (que comprende las almohadillas 74 y 64) desde la matriz de distribución de muestra es igual o mayor que la capacidad de absorción de la almohadilla de ensayo 64 e inferior o igual a la capacidad de absorción combinada de la almohadilla de ensayo 64 y la almohadilla de reactivo 74.
En estas formas de realización, cuando la muestra fluida hace contacto con la almohadilla de reactivo 74 que contiene el reactivo de enlace inmovilizado, este último se pone en contacto directo con la almohadilla de ensayo de HDL 64, limitando de este modo el contacto temporal de la muestra de sangre con el reactivo de enlace antes de la reacción de ensayo de HDL. En consecuencia, la preparación de la muestra y la evaluación de HDL se realizan en etapas diferentes, en las que la preparación de la muestra comprende, por ejemplo, filtrar los componentes celulares de la muestra y, opcionalmente, el almacenamiento temporal de la muestra de sangre y la adaptación de la muestra de sangre a las necesidades del ensayo o condiciones tales como temperatura, presión y atmósfera ambiental. Debido a que el contacto temporal de la muestra de sangre con los diferentes reactivos es reducido, cualquier interferencia química con la evaluación de HDL se evita. Debido a que los reactivos están inmovilizados, es poco probable que migren de la almohadilla de reactivo a los elementos adyacentes. Si se desea, el ensayo se puede interrumpir durante el tiempo deseado una vez aplicada la muestra y la eliminación de los componentes celulares, pero antes del contacto con los reactivos de enlace, p. ej. para ajustar la atmósfera alrededor o adaptarse la temperatura ambiental para apoyar el ensayo. Ello se logra manteniendo el dispositivo en la posición de distribución de la muestra. Para ello, la matriz de distribución de la muestra está diseñada para servir además como depósito si se necesita.
La almohadilla de ensayo de HDL contiene reactivos para la cuantificación del colesterol asociado a HDL. Preferentemente, éstos comprenden colesterol esterasa, para liberar colesterol libre de la HDL, colesterol oxidasa, para producir H_{2}O_{2} por reacción con el colesterol libre, peroxidasa y un sistema de colorantes acoplado que se convierte, en presencia de peroxidasa y H_{2}O_{2}, en un producto señal de la reacción claramente coloreado. La almohadilla de ensayo también puede comprender un biosensor eficaz para cuantificar H_{2}O_{2} electroquímicamente y/o O_{2}, tal como se describe más adelante.
El resto de las almohadillas de ensayo también contienen reactivos de ensayo que producen un cambio en la almohadilla que se puede detectar ópticamente, tanto visualmente como mediante un detector, de modo conocido. En las formas de realización preferidas del dispositivo actual y método, los reactivos de unión de no-HDL están situados en la almohadilla de reactivo 74 y no en la matriz de distribución de muestra o la matriz de tamizado. Por consiguiente, la posibilidad de interferencia por dichos reactivos, en los ensayos de analitos diferentes al HDL, queda limitada.
Preferentemente, cada una de dichas almohadillas de ensayo contiene componentes reactivos para la producción de H_{2}O_{2} mediante la reacción del analito con un enzima; a continuación el H_{2}O_{2} convierte a un reactivo sustrato en un producto de color señal de reacción, o se mide electroquímicamente, tal como se describió anteriormente. Las reacciones enzimáticas de color que utilizan una pluralidad de oxidasas con sustratos específicos, para la generación enzimática de H_{2}O_{2} y la subsiguiente oxidación de un colorante para generar un producto de reacción coloreado, son bien conocidas en la materia.
Se puede utilizar un dispositivo con cuatro o más almohadillas de reacción para medir simultáneamente colesterol HDL (HDL), glucosa, colesterol total (TCh) y lípidos triglicéridos (TG). Cada almohadilla contiene los componentes de la senda común anteriormente descritos (peroxidasa y sistema de colorante acoplado) de modo que el H_{2}O_{2} generado produce un producto señal de reacción de color inconfundible. La almohadilla de ensayo de colesterol total, que está expuesta al suero sin estar expuesta a los reactivos de precipitación o enlace, y las almohadillas de ensayo de HDL comprenden cada una de ellas, además de los componentes de la senda común, colesterol esterasa, para liberar el colesterol esterificado en forma de colesterol libre a partir de las lipoproteínas séricas, que comprenden partículas de HDL, LDL y VLDL y colesterol oxidasa, para generar H_{2}O_{2} por reacción con el colesterol libre en el fluido de muestra, tal como se describió anteriormente. La almohadilla de ensayo de glucosa comprende glucosa oxidasa, además de los componentes de la senda común. La almohadilla de triglicéridos comprende, además de los componentes de la senda común, lipasa, L-glicerol quinasa y L-glicerol-3-fosfato oxidasa, para generar H_{2}O_{2} a partir de los triglicéridos, por la ruta del intermedio L-glicerol-3-fosfato.
La muestra de suero introducida en la almohadilla TG no se expone a reactivos precipitantes o enlazantes, y por consiguiente contiene todas las lipoproteínas del suero, de modo que la señal de TG representa los triglicéridos totales del suero.
También se pueden utilizar almohadillas estándar de referencia; ver por ejemplo, el sistema descrito en la patente U.S. cotitular nº 5.114.350.
Tal como se indicó anteriormente, una ventaja del dispositivo actual y método es que la matriz de distribución de muestra no contiene reactivos de enlace o precipitación de no-HDL; dichos reactivos se encuentran solamente en la almohadilla de reactivo 74. Por consiguiente, la posibilidad de interferencia con dichos reactivos, en los ensayos de analitos tales como colesterol sérico total y triglicéridos totales, se elimina.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran a título no limitativo la invención.
Ejemplo 1 Preparación de la membrana de reactivo con reactivo de enlace inmovilizado
Una disolución acuosa que contiene entre 5 y 20 mg/ml de sulfato de dextrano (MW 500.000) y (opcionalmente) 12,5 mM de Mg(OAc)_{2} se dispensa sobre una membrana catiónica tal como se describió anteriormente, p.ej. una membrana de nilón con grupos de amonio cuaternario superficiales, de un grosor de aproximadamente 125 \mum. La disolución de reactivos se dispensa a una velocidad de aproximadamente 16 \mul/pulgada y a continuación se seca la membrana durante 20 minutos a 50ºC en un proceso de rodillo continuo. Longitudes de, p. ej., 100 pies se pueden preparar de tal modo y cortar para que se adapten al dispositivo de ensayo.
Ejemplo 2 Preparación de la membrana de ensayo de HDL
Para preparar una membrana de ensayo de HDL, se impregna una membrana de polisulfona con la siguiente formulación acuosa: colesterol oxidasa 36,5 Unidades/ml, colesterol esterasa 215 Unidades/ml, peroxidasa 200 Unidades/ml, 4-aminoantipirina 1,88 mg/ml y TOOS ácido (3-[etil(3-metilfenil)amino]-2-hidroxi propansulfónico 12,05 mg/ml. El reactivo se dispensa a una velocidad de 16,6 \mul/pulgada y se seca la membrana durante 20 minutos a 50ºC en un proceso continuo de rodillo. De este modo se pueden preparar longitudes de, p. ej. 100 pies y cortarlas con el fin de adaptarlas al dispositivo de ensayo.
Para preparar una almohadilla laminada de reactivo/ensayo tal como la mostrada en la Figura 1, las dos membranas, impregnadas con reactivo como anteriormente, se unen por separado (en secuencia) a la barra de reacción mediante soldadura ultrasónica, o se pueden unir simultáneamente con una única etapa de soldado ultrasónico. Las membranas también se pueden laminar conjuntamente antes de la aplicación de los reactivos y a continuación se aplican los reactivos respectivos, primero a un lado del laminado y a continuación al otro lado.
Ejemplo 3 Procedimiento de ensayo representativo
Un ensayo típico se realiza en un analizador LDX®, utilizando almohadillas de reactivo y almohadillas de ensayo de HDL preparadas esencialmente como se describe en los Ejemplos 1 a 2. Para cualquier configuración del dispositivo de ensayo tal como se muestra en la Figura 1, la muestra (35 \mul de suero o sangre entera) se aplican al pocillo de la muestra y se permite que se distribuya a través de la matriz de distribución de muestra durante 2 minutos. A continuación se pone en contacto la barra de reacción con la matriz durante 3 segundos, un tiempo suficiente para transferir suero suficiente para llenar la almohadilla de reactivo y la almohadilla de ensayo (capacidad combinada de aproximadamente 1,5 \mul), a continuación de lo cual se devuelve la barra a su posición original. Durante 150 segundos a cada 3 segundos se toman mediciones de reflectancia de la superficie superior de la almohadilla de ensayo de HDL, para seguir el progreso la reacción de ensayo de HDL. El valor mínimo de reflectancia obtenido se convierte en mg/dl de colesterol HDL según una curva de calibración establecida anteriormente.

Claims (39)

1. Dispositivo de ensayo (14) para medir colesterol sérico asociado a lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que contiene además lipoproteínas de baja densidad (LDL) o lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), comprendiendo el dispositivo:
a.
una matriz de distribución de muestra (26) para distribuir la muestra de fluido sanguíneo;
b.
un elemento (74) que contiene un reactivo inmovilizado eficaz para unir selectivamente y/o eliminar lipoproteínas no-HDL de la muestra de fluido; y
c.
una almohadilla de ensayo de HDL (64) en la que se puede ensayar la concentración de HDL, en comunicación fluida con dicha almohadilla de reactivo (74); en la que dicha almohadilla de reactivo (74) se puede poner en comunicación fluida con dicha matriz de distribución de muestra (26).
2. Dispositivo (14) según la reivindicación 1, que comprende además:
(i)
una pluralidad de elementos porosos (22, 64, 66, 68, 70) a través de los cuales dicha muestra de fluido sanguíneo puede fluir en secuencia por acción capilar y/o por gravedad, y
(ii)
medios de montaje (71, 72) eficaces para ajustar el dispositivo (14) entre (a) una posición de distribución de muestra, en la que la almohadilla de ensayo de HDL (64) no está en comunicación fluida con la matriz de distribución de muestra (26) y (b) una posición de ensayo, en la que dicha almohadilla de ensayo de HDL (64) y dicha matriz de distribución de muestra (26) están en comunicación fluida entre sí.
3. Dispositivo (14) según la reivindicación 1, en el que el reactivo inmovilizado está inmovilizado a una primera región colectora de muestra (30) dentro de la matriz de distribución de muestra (26), que está dispuesta en comunicación fluida con la almohadilla de ensayo de HDL (64) cuando el dispositivo (26) se encuentra en la posición de ensayo.
4. Dispositivo (14) según la reivindicación 1, en el que dicho elemento (74) es una almohadilla de reactivo porosa (74) dispuesta corriente abajo de la matriz de distribución (26) y corriente arriba de la almohadilla de ensayo de HDL (64), que está dispuesto en comunicación fluida con la almohadilla de ensayo de HDL (64) cuando el dispositivo (14) se encuentra en la posición de ensayo.
5. Dispositivo (14) según la reivindicación 3, en el que la almohadilla de reactivo (74) está unida a la almohadilla de ensayo de HDL (64).
6. Dispositivo (14) según la reivindicación 1, que comprende además una almohadilla filtrante (22) eficaz para extraer componentes celulares de la muestra de fluido sanguíneo, corriente arriba de, y en contacto con dicha matriz de distribución de muestra (26).
7. Dispositivo (14) según la reivindicación 5, que comprende además un cuerpo de casete (15) que contiene dicha almohadilla filtrante (22) y comprende además un pocillo (16) para contener dicha muestra de fluido sanguíneo, en comunicación fluida con dicha almohadilla filtrante (22) y la matriz de distribución de muestra (26).
8. Dispositivo (14) según a reivindicación 6, que comprende además una barra de reacción (60) a la que se encuentra unida dicha almohadilla de ensayo de HDL (64).
9. Dispositivo (14) según la reivindicación 7, en el que dichos medios de montaje (71, 72) son eficaces para unir dicha barra de reacción (60) a dicho cuerpo de casete (15) y para ajustar las posiciones relativas de la barra de reacción (60) y del cuerpo de casete (15) entre dicha posición de distribución de muestra y dicha posición de ensayo.
10. Dispositivo (14) según la reivindicación 8, en el que la matriz de distribución de muestra (26) contiene regiones colectoras de muestra adicionales (30, 32) y dicha barra de reacción (60) comprende además almohadillas de ensayo adicionales (66, 68, 70), de tal manera que dichas almohadillas de ensayo adicionales (66, 68, 70) se ponen en comunicación fluida con dichas regiones colectoras de muestra adicionales (30, 32) cuando el dispositivo (14) se transfiere a la posición de ensayo.
11. Dispositivo (14) según la reivindicación 1, en el que dicho medio de montaje (70, 72) es además eficaz para (c) transferir el dispositivo (14) de dicha posición de ensayo a una posición en la que dicha almohadilla de ensayo de HDL (64) no está en comunicación fluida con dicha matriz de distribución de muestra (26).
12. Dispositivo (14) según la reivindicación 1, en el que dicho reactivo inmovilizado comprende un reactivo polianiónico.
13. Dispositivo (14) según la reivindicación 11, en el que dicho reactivo polianiónico inmovilizado comprende un polisacárido sulfonado.
14. Dispositivo (14) según la reivindicación 1, en el que dicha almohadilla de ensayo de HDL (64) contiene reactivos que, en presencia de colesterol HDL, producen un cambio detectable en la almohadilla de ensayo de HDL (64).
15. Dispositivo (14) según la reivindicación 13, en el que dicho cambio se puede detectar ópticamente.
16. Dispositivo (14) según la reivindicación 1, en el que dicha almohadilla de ensayo de HDL (64) comprende un biosensor.
17. Dispositivo (14) según la reivindicación 15, en el que dicho biosensor es eficaz para medir electroquímicamente la producción de oxígeno o peróxido de hidrógeno que depende de la concentración de colesterol asociado a HDL en dicha almohadilla de ensayo (64).
18. Dispositivo (14) según la reivindicación 1, en el que dicha almohadilla de reactivo (74) comprende una membrana polimérica porosa.
19. Dispositivo (14) según la reivindicación 17, en el que dicha membrana polimérica contiene grupos superficiales catiónicos.
20. Dispositivo 14 según la reivindicación 1, en el que dicha almohadilla de reactivo (74) comprende múltiples membranas apiladas, por lo menos una de las cuales contiene un reactivo inmovilizado eficaz para unirse a las lipoproteínas no HDL.
21. Dispositivo (14) según la reivindicación 1, en el que cada una de dicha almohadilla de ensayo de HDL (64) y dicha almohadilla de reactivo (74) es una membrana polimérica porosa.
22. Dispositivo (14) según la reivindicación 21, en el que dicha almohadilla de ensayo de HDL (64) comprende grupos superficiales catiónicos.
23. Dispositivo (14) según la reivindicación 5, en el que la almohadilla de ensayo de HDL (64) y la almohadilla de reactivo (74) están laminadas conjuntamente.
24. Método para medir el colesterol sérico asociado a lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que contiene además lipoproteínas de baja densidad (LDL) o lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), que comprende las etapas siguientes:
a.
poner en contacto dicha muestra con un elemento (74) que contiene un reactivo inmovilizado eficaz para unirse selectivamente y/o eliminar lipoproteínas no HDL de dicha muestra.
b.
transferir dicha muestra de dicho elemento (74) a la almohadilla de ensayo de HDL (64) en la que se puede ensayar la concentración de HDL; y
c.
determinar el contenido de lipoproteínas HDL en dicha muestra en dicha almohadilla de ensayo de HDL (64).
25. Método según la reivindicación 24, que comprende además las etapas siguientes:
d.
poner en contacto la muestra con una matriz absorbente de distribución de muestra (26), en la que dicha matriz de distribución de muestra (26) es uno de entre una pluralidad de elementos porosos (22, 26, 64, 66, 68, 70) contenidos dentro de un dispositivo de ensayo (14), a través del cual dicha muestra puede fluir en secuencia por acción capilar y/o gravedad, terminando dicha pluralidad de elementos (22, 26, 64, 66, 68, 70) en dicha almohadilla de ensayo de HDL (64) y comprendiendo, corriente arriba de dicha almohadilla de ensayo de HDL (64), dicho elemento (74),
e.
colocar dicha matriz de distribución de muestra (26) en comunicación fluida con dicha almohadilla de ensayo de HDL (64), por lo que dicha muestra se transfiere desde dicho elemento (74) hasta dicha almohadilla de ensayo de HDL (64); en la que antes de dicha etapa de colocación, dicha matriz de distribución de muestra (26) no está en comunicación fluida con dicha almohadilla de ensayo de HDL (64).
26. Método según la reivindicación 24, en el que dicho elemento (74) es una almohadilla de reactivo porosa, dispuesta corriente abajo de la matriz de distribución de muestra (26) y corriente arriba de la almohadilla de ensayo de HDL (64), que se encuentra en comunicación fluida con la almohadilla de ensayo de HDL (64) en la etapa (b).
27. Método según la reivindicación 25, en el que, antes de la etapa (a), dicha matriz de distribución de muestra (26) no está en comunicación fluida con dicha almohadilla de reactivo (74).
28. Método según la reivindicación 26, en el que al poner en contacto dicha matriz de distribución de muestra (26) con dicha almohadilla de reactivo (74), dicha almohadilla de reactivo (74) está en comunicación fluida simultáneamente con la almohadilla de ensayo de HDL (64).
29. Método según la reivindicación 28, en el que dicha almohadilla de reactivo (74) está unida a dicha almohadilla de ensayo de HDL (64).
30. Método según la reivindicación 29, en el que la almohadilla de ensayo de HDL (64) y la almohadilla de reactivo (74) están laminadas conjuntamente.
31. Método según la reivindicación 25, en el que dicha matriz de distribución de muestra (26) contiene dicho reactivo inmovilizado, de tal manera que las etapas (a) y (b) ocurren simultáneamente.
32. Método según la reivindicación 25, en el que dicho reactivo inmovilizado está contenido dentro de una matriz filtrante (22) corriente arriba de y en contacto con dicha matriz de distribución de muestra (26), de tal manera que la etapa (a) tiene lugar antes de la etapa (d).
33. Método según la reivindicación 25, que comprende además la etapa de interrumpir dicha comunicación fluida entre la matriz de distribución de muestra (26) y la almohadilla de ensayo de HDL (64), cuando la cantidad deseada de muestra ha sido transferida.
34. Método según la reivindicación 25, en el que dicho reactivo inmovilizado comprende un polisacárido sulfonado.
35. Método según la reivindicación 26, en el que dicha almohadilla de reactivo (74) comprende una membrana polimérica porosa con grupos superficiales catiónicos.
36. Método según la reivindicación 26, en el que dicha almohadilla de reactivo (74) comprende múltiples membranas apiladas, por lo menos una de las cuales contiene un reactivo inmovilizado eficaz para unirse a lipoproteínas no HDL.
37. Método según la reivindicación 25, en el que dicha indicación detectable de colesterol HDL se puede detectar ópticamente.
38. Método según la reivindicación 24, en el que dicha almohadilla de ensayo de HDL (64) comprende un biosensor.
39. Método según la reivindicación 38, en el que dicho biosensor es eficaz para medir electroquímicamente la producción de oxígeno o peróxido de hidrógeno que depende de la concentración de colesterol asociado a HDL en dicha almohadilla de ensayo de HDL (64).
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