SE448324B - Sett vid immunkemisk bestemning av lipoproteiner och apolipoproteiner - Google Patents

Description

p44s 324 Lipoproteiner i olika fraktioner av blod har separerats från varandra genom bl á ultracentrifugering,'kromatografi, utfallning med polyanjoner och elektrofores. De separerade lipoproteinerna har sedan kvantifierats och karaktäriserats med hjälp av bl a de apolípoproteiner som ingår-i dem. Detta har skett med bl_a olika immunkemiska metoder., Apolipoproteinbeståmningar har utförts med bl a: radiell immundiffusion, elektroimmunologisk, radioimmunologisk och enzymimmunologisk metodik, isoelektrisk fokusering, nephelo- metri, polyakrylamidelektrofores och densitometri. Det är helt klart, att man även kan utnyttja andra detektionssätt, såsom fluorescens och kemiluminiscens.

~Lipoproteiner och apolipoproteiner, deras struktur och kvantifiering samt den kliniska betydelsen av deras serum- och plasmanivåer har avhandlats i åtskilliga läroböcker och översiktsartiklar (se t ex Newman HAI et al; Immunologícal Z Åssay of Lipoproteins as an Indicator of Genetic and Acquired Disease och Gibson JC et al; Laboratory Management (1983) mars, s l9f27 och april, s 27É37. ' "Immunkemíska bestämningsmetoder av lipo~ såväl som apolipo- proteiner har varit svåra att standardisera. Sålunda har det varit-mycket vanligt att resultat erhållna från olika laboratorier och vid olika testtillfällen varierat. Man har visat, att behandlingen av testprovet har varit av betydelse.

Variationerna i resultaten har bl a härletts till, att icke-reproducerbara.förändringar lätt uppkommer vid lagring av ett prov. För att undvika problemen har man på olika sätt försökt avlipidisera prover med hjälp av lipidlösande lösningsmedel, detergenter och lipas. Tanken har varit att man på detta sätt bättre skulle exponera lipoproteinernas antigena determinanter. Ingen av avlipidiseringsmetoderna har dock visat sig vara_riktigt bra. 448 524 Ett första syfte med uppfinningen är att erbjuda en metod för att stabilisera prover avsedda för immunkemisk bestäm- ning av apola). Ett andra syfte är att förbättra reproducer- barheten vid bestämning av detta apoprotein. Ett tredje esyfte är att förbättra säkerheten vid diagnos av sjukdomar, som är korrelerade till onormala nivåer av apo(a) eller Lpla). Ett fjärde syfte är ett sätt att exponera antigena .determinanter hos apo(a).

Uppfinningen erbjnder förbättrade metoder för att studera och immunkemiskt bestämma eventuellt förekommande isoformer och-polymorfi hos apo(a)._ Enligt uppfinningen uppnås dessa syften genom att man, innan det att provet reageras med avsedd anti(apo(a)) eller anti(Lp(a)) antikropp, i ett förbehandlingssteg håller pH på provet vid ett icke-denaturerande värde, som ligger över pH oa 9,0 eller under pH ca 3,0; Provet hålles vid detta pH-värde under en tillräckligt lång tid och temperatur, för gatt lipoproteinets antigena determinanter skall bli optimalt exponerade för immunreaktion.Som sista steg i förbehandlingen enligt uppfinningen inställes pH till det värde som erfordras för immunreaktionen, så att den immunkemiska bestämningen kan genomföras på i och för sig känt sätt.

Med icke-denaturerande värde avses, att pH-värdet skall vara ^sådant, att för testet väsentliga antigena determinanter i apolipo- eller lipo-proteinet ej förstöras, t ex genom hydrolys eller genom andra irreversibla förändringar.

Provet kan vara ett helblodsprov eller olika fraktioner därav, såsom en plasmaf eller serumfraktion. Det kan även 7 vara en av de i blod naturligt förekommande lipoprotein- fraktionerna, t ex kylomikroner, VLDL, LDL, Lpla) eller HDL, vilken på i och för sig känt sätt frånseparerats. p44sf524 Under förbehandlingssteget är pH-värdet företrädesvis justerat till ett pH-värde valt i intervallet 0-3, såsom 0-2,5 eller 9,0-14,0, företrädesvis det senare intervallet och då lämpligen över pH_ca 10, såsom över ll men under 13. pH-justeringen kan ske med icke-buffrande syror, såsom N " saltsyra eller med dito alkaliska lösningar, såsom natriumf hydroxid. Givetvis använder man helst utspädda lösningar för att bättre kunna kontrollera tillsatsen. pH»värdet kan även justeras med hjälp av buffertsystem, som har hög buffert- 7 kapaoitet inom ovan nämnda intervall. Lämpliga buffertsystem är syra-baspar_med pKa-värden inom de angivna intervallen, t ex H3Po¿/H2Po; pch c13cooH/c13coof för »pH o-s och npoâ' /P02' för pH 9-14. för pH större än 9,0 är koncentrationen av hydroxidjon och/eller tillsatta buffrande komponenter större än 1o'5 M, såsom större än 1o',3 M, och lämpligen under 2 M, t ex under 0,5 MÅ För pH mindre än 3-är koncen- trationen av H30+'och/eller tillsatta buffrande komponenter _72: 5 större än 10-3 M, såsom större än 10 M, och lämpligen under 2>M.

Eventuellt kan man även tillsätta olika lipidupplösande enzymer, som är verksamma vid det pH-värde vid vilket förbehandlingssteget utföres. Buffertkapaciteten under förbehandlingssteget skall vara sådan, att man lätt kan *justera pH till det värde som fordras av den efterföljande immunkemiska_bestämningsmetoden. Under förbehandlingen frisättes sura substanser vilket tyder på att en partiell hydrolys sker av provet} Bnffertkapaciteten bör vara så hög så att frisatta substanser kan neutraliseras.

Effektiviteten av förbehandlingssteget kan studeras i relation till den immunkemiska bestämníngsmetod som man avser använda. Man kan sålunda bestämma optimala tempera~ turer, optimala tider och optimala pH-betingelser, genom att i separata försök bestämma, hur dessa variabler påverkar den avsedda testmetodiken. I utförandeexemplen har detta gjorts med ett s k sandwich~förfarande. Alltför höga temperaturer 448 324 och koncentrationer och alltför långa tider kan leda till denatureringseffekter av apolipoproteiner. Detta innebär att man i sandwichförfarandet får ett sänkt upptag.

Förbehandlingssteget enligt uppfinningen utföres lämpligen vid en temperatur vald i intervallet 0 - 500 C, företrädes- vis 10 - 4Qq C. Förbehandlingssteget kan ingå som ett av många olika förbehandlingssteg, Temperaturen och koncentrationen av syra och bas skall vara valda till.för aktuellt pH icke-denaturerande värden.

Praktiska överväganden bestämmer färbehandlingstiden. Man väljer temperatur och pH så att förbehandlingssteget kan ske under? S-min - 20 tim, företrädesvis» 5 min - 5 tim.

Att den immunkemiska bestämningen sker på i och för sig känt sätt innebär, att varje immunkemisk metod med tillräcklig ' känslighet och specificitet kan utnyttjas. För lipoproteiner och apolipoproteiner är ett stort antal kända. Se t ex teknikens ståndpunkt ovan. Uppfinningens förbehandlingssteg är potentiellt användbart vid alla dessa metoder. Speciellt kan nämnas sådana som innebär att man utnyttjar minst en immunkemisk reaktant vilken uppvisar en analytisk indikerbar "grupp såsom en enzymatiskt aktiv (enzym, koenzym, kofaktor, 'substrat etc), radioaktiv, kemiluminogen, fluorogen, parti- kulär (virus, latex, guld) grupp.

I vissa fall kan man i de aktuella bestämningsmetoderna, ekvivalent med en affinitet mellan ett antigen (hapten) och motsvarande antikropp, aven utnyttja andra biospecifika affiniteter. Exempel på föreningar som uppvisar sådana andra taffiniteter är Protein A4IgG,gko1hydrat-lektin, C1q-immun- komplex, RF-faktor - immunkomplex, biotin-avidin o s v. 44svs24 Ü Speciellt stora fördelar uppnås vid immunkemiska metoder, som innebär att en märkt immunkemisk reaktant utnyttjas för att kvantifieraÄapo(a) utan att detta separerats från övriga apolipoproteiner, t'eX,kvantifiering i serum, plasma och helbloa; ' i i i Uppfinningen skall nu åskådliggöras med hjälp av ett antal icke-begränsande exempel. Det visar på ett bra sätt att uppfinningen är överlägsen tidigare metodik för avlipidisering av prover avsedda för immnnkemisk bestämning av lipoproteiner , och apolipoproteinerr Reagens:_ Éosfatbuffert.I (pH 2,0,0,0S M) innenâllande Tween® 20 (o,1 %), bovint serum albumin <1 sy, EDTA (o,o1 M) och bakteriøstat (o,1s %). ' ' AntiaEo(a) antiserum framställdes på känt sätt genom immuni- sering av get och kallas fortsättningsvis för get antiapo(a).

Monoklonala antikroppar mot apo(a) (= mus antiapo(a)) framställdes genom hybridisering av mus-myélomceller med mjältceller från möss immnniserade med rent Lp(a). Hybri- diseringen och efterföljande odling och kloning av hybrid- erna utfördes enligt: Éesearch Monographs in Immunology Vol. 3 General editor I;L. Turk, Elsevier/North Holland, Bio- medical Press, New York 1981. I 44 u; 112 448 324 1251-märkt monoklonal antiapo(a) antikropp (= mus antiapo(a) 1251, SIÉ framställdes genom att märka mus antiapo(a) med I enligt chloramin T-metoden (Hunter & Greenwood, Nature 194 *(1962) s 495).

Decantin¶_suspension (Pharmacia AB, Uppsala, Sverige) innehåller häst antifår~lgG antikroppar, kovalent bundna till adaros partiklar; Reagenset år anvandbart därför att häst antifâr-IgG antikroppar kraftigt korsreagerar med ~fâr~IgG. 7 SDS =.Natriumdodecylsu1fat Renex®730f= Detergent från Atlas Chemical Industries, England" I ' Triton® X-100 à Icke-jonisk detergent (se Merck Index 10th edition. 1983 s 971, Merck & Co, Rahway, USA Lipas var från Sigma Chemical Company, USA.

I försöfien I och 4 har apo(a) bestämts i enheter (U) per liter relativt ett referensserum. Detta har ingen betydelse för de slutsatser som kan dras ur resultaten, Exempel 1. Förbehandling av serum vid surt och alkaliskt pH l.l Förbehandling: a), _Alkaliskt pH. Lika delar serum och 0,13 M NaOH blandades och inkuberades vid rumstemperatur (=RT) i 2 timmar, varefter fosfatbuffert I tillsattes till- 18 ggr spädning avl-provet. pH uppmättes till - 12,0 vid starten-och sjönk under inkuberingen till ca 11,1; 448 324 b) Surt pH;1Lika delar serum och 0,2 M HCl blandades och inkuherades vid (Rf) i 20 timmar,_varefter fosfatbuffert I tillsattes till 18 ggr spädning av ' provet. pH var vid starten ca 1 och 'steg något Kunder inkuberingen. ' cl, Alkaliskt buffertsystem. hika delar serum och I 0,2 M trinatriumfosfat blandades och inkuberades vid RT ill timme, varefter fosfatbnffert I till- sattes till 18 ggr spädning av provet. pH upp- fiättes till ca 11,7 under hela inkuberingen.

“Testmetod fdr att bestämma hur förbehandlingssteget påverkar tillgänglighet av antigena determinanter; 150 /ul från reaktionsblandningen i steg 1 späddes_ ieniigtfspäaningsschemat 1/13 - 1/54 - 1/162 -- 1/489 -i i 1/1458 - 1/4374. varje Späaning-bianaaaes med so /ul 1251 och inkuberades under l timme vid' mus antiapo(a) RT,-varefter 50 /ul get antiapola) tillsattes. Reak- tionsblandningen fick stå i 0,5 tim vid RT, varefter det bildade komplexet fälldes med fastfasbundna anti :antikroppar (2 ml Decanting Suspension, 0,5 tim och RT). Suspensionen~centrifugerades och supernatanten dekanterades av och kastades. Radioaktiviteten be- stämdes hos återstoden. Resultaten framgår av tabell 1 nedan;' "r 448 524 ä mm HHBWNQHÉHHJEN »HHÉ HB wøäñme ubHHflfiw www ämñåfim ww på äwfiëflmmäHHmu ä B f Awmïšfi .wmwšu åmflšu mšššm s N 4 . s H s .ON s ON n oN vä. 4 HwH. 4. 4 HnH. HnH HHH 4 HnH .Humwwwfiëwmmf mowz 2 mHö wømmmz z Nä 42mm z Nä mšmnoüHo z N.¿ Hun z NS .wfiammH ._ 4 àmnfiwânwnuwm 4 wnïßflbü* fiwwåflßpx 4 .HB ä”. 4 H34 NNN. HB Hmm H>H..H4:NN 4 4 4 HB. NfiN HB 0.3 momz s 25 . Hgommwz z Nä 42mm z NS mäwnofiHu 2 Nå. . Hum s Nå Rvwåauww . 4 . . mm ëfimmm . mm »Ham 4 »mHwäHHwno4 4 øopmämnfiøâfiflumm. 4 4 H Hämä. g. 7 44sds24a 10 1 Resultaten anger avläst koncentration i*U apQ(a)/l. Det 'visar på ett klart och entydigt sätt, att förbehand- lingen har en mycket stor betydelse för att inmunreak- tionen skall kunna ske på bästa sätt.

Det visar även, att en natríumhydroxidlösning är .betydligt effektivare:än en saltsyralösning. De stu- derade serumproverna_har spätts enligt tabellen..De olika spädningarna har hehandlats enligt 1.1 och apo(a) har kyantifierats enligt 1.2. ' -Genom att öka behandlingstiden med_0;13 M NaÖH kunde visas att för en given spädning sjönk upptaget. Detta ' tyder på att antigena determinanter irreversibelt 'förstörts, Exempel 2 Jämförelse mellan uppfinningens förbehandling och förbehandling enligt tidigare teknik * 2.1 Förbehandlingbl Lika delar serum och behandlingslösning blandades och 'íick inkubera under 2-16 timmar; varefter provet spaddes 20 ggr med fosfatbuffert I; Testmetoden enligt .l.2 applicerades sedan på reaktionslösningarna. I tabell 2 framgår behandlingslösningar, tider och temperaturer. Resultaten ges i tabell 3. fr; 'Il viga \ IRC* Tabeli 2 Béhandlingsiösnih¶1_ 'o,5 %4sDs 4 44 2;5*%'sDs 4M'Ûfçá 6MAu- zm cuaniain ; Hcl II- T 2'% RT;iton®_x - lod 10 2 fi~ 4 14% Rehex® BÖI 5 %R"- _ 500 U/ml Lipasfv 100 u_ 0;l3M NaOH ll ßen.tiaR leh 16n 4 ízh 4 42h44 Tzh Rzhí leh ishf 1@nT 1eh l6h ~ 16h zh 448 324 Beh@temE RT RT 'RT RT» RT RT RT RT RT RT 37° c O 37 C RT 1à +44s 324 6.: En» ä. AW. .uxwwww Hmøxmw mfiunfinm M Hmwowmëmmcfiwwmwwflmflflww mflnw>nm mummfluflu uum Hmmfi> mn .^mmummsv umomuu wummflflflu ©msmE.Hwv0u >m w fl mG«=wcfln_Hmmnm Gmumufiømmm °.w ~.m H_m N.m w_m ~_m_ NÅM m.m H.m H.m_N_m m.w .Q.m¶@ w.m w_m u.m w.m m.m >- m«m_ H.« @_m w_m @.m Ao_» w_m °wH\H amw ^«.mq m >.ow _ ø_ofi ¶w.°fi m.oH «.flHM ~_flH¶~.HH >.°fiHo_°H m_m o.Qfi >wÅmH.fi~°~¶ o~\H H\=°ofi H\noom ¶ æm .wH.. wofií >@N. zw zw zw¶¶ sq ¶@m_~ wm_o nummm >oum | _ wæmuq om xmzmm. oofix Hum_ . amma mmm ¶ .. _ ¶ ¶ zoaHme åHQHZmaw. ¶ wmflwumßuno ¶ >oHm umwmnmmmnumh ¿r, 448 524' 13 »Exempel 3, Jämförande-studier mellan enligt uppfinningen förbehandlat serumprov och teferensprov innehållande 'affinitetsrenat apoia) 3.1 Affinitetsrening av apo(a) från serum behandlat enligt Ül.1;a.

Get antiapo(a) antisetum bands kovalent till CNBr- aktiverad Sepharose® 4B (Pharmacia AB, Sverige) enligt tillverkarens rekommenderade metod (se även US-Ä-3645852). 20 ml av den ethâllna immunosorbentsuspensionen blandades7 _ med 5 ml NaOH-behandlat prov enligt 1.1.a och späddes med fosfatbuffert (pH 7,4, 0,05 Mï till en totalvclym på ca765 ml. Den erhållna suspensionen packades i kolonn och eluerades enligt tabell 4. 7 _ 1 _ pH eluer- :Steg Elueringsmedel 7 » ingsmedel I TQEE nr Volym 17 ' Tvätfi.f0sfatbuffert ' pa 7,4, zxgel '27 “ 0,1 M Acetatbuffert + 1 1 0,5 M Nacl' ' 1 7' 'pH 4,5, 1 "i 3 - 7Fosfatbuffert pH 7,4 2 " 4 *o,1 M Glycinbuffert + ' ' 0,5 M Nacl ~ 1* pH 2,8 73 'P 5 I som 3 '*' *u 7 - 4 - " 1 7 * 7 _ W _ 1 7 6 ' 7som 4 " 77 - " -1 5- É 7 _ som 3 f _ I 7 3 6 " 7 7 7 * 7 1 7. 7 . . 8 _ som 4 _- ' - 7 " lä som 3 l I 'I - 8 ' " 7 ** ,77. . 7 101 Guanidin - Hcl 6 M,i, _ fosfatbuffert _ ps 6,0 g " ll _sem 3 f“1 ' _77 ' *Å 7 " 448 524) 14 '* Eluaten med glycinbuffert neutraliserades med fosfat~ lbuffert~ i ** Fraktionerna med Guanidin - HCl avsaltades på PD-10-kolonner paçkade med Sephadex® G~25 (Pharmacia AB, Sverige) omedelbart efter eluering.

En spädningsserie av serum innehållande apo(a) som var *behandlat enligt 1.l.a samt en spädningsserie av en känd mängd affinitetsrenat apo(a) underkastades mät- metoden enligt 1.2. Kohcentrationen apo(a) låg i 'intervallet_O)06-20 U/l. De erhållna mätvärdena avsattes mot respektive_konoentration, så att en dos-responskurva kunde uppritas för affinitetsrenat apo(a) och en för serumprovet. De två kurvorna var helt parallella, vilket visar att uopfinningens förbehandlingssteg är fullt tillfredsställande ur immunologisk synpunkt.

Exempel 4. Korrelation mellan förbehandlade prover analyserade enligt 1.2 och obehandlade prover analyserade enligt den s k "rocket" analysmetoden' Med "rocket" analys avses electroimmunoassay (Laurell B, Annal Biochem IS (1966) s 45-). Metoden är en av de vanligast använda vid apolipoproteinanalys.

IS-serumprovet underkastades dels förbehandling enligt l.l.a följt av mätning enligt 1.2 och dels electroimmuhoassay enligt Laurell B. Resultaten framgår av tabell 5. "w (L) (h.

@®\!G\lJ1vß>~UJl\J|-l %44s 324 15 ¿ I Rocket * Metod enligt 1.2 Érovnr mg/1 7 '11 U/l çsoí 0 850 } ~5so1 ¶ . 'rvso 1' - «:.« 04701 0 1 Ä fs11 ' 420 ' ' 457 “ 420 I' 3s7É 260>1_~ 1 7 2251 1260 __ 270 ¶a21o 1 ¶ V1 230 210 140 10 1so¶ ¶ 104 11¶ 1 300 ' . _ 1 480 12 #30 ~1_072 13 ¶ -* 13- 14 -* ze¶ 15 -* ¶4 Resultaten visar att de två metoderna ger värden som korrelerarv till varandra.

Uppfinoingen skall nu preciseras i bifogade patentkrav, som ingår som en del av beskrivningen.

Claims (1)

1. ,_448 3Q4:U M PATENTKRKV Förfarande vid immunkemisk bestämning av lipoproteiner *a - (= LPfa)))*och/eller_apolipoproteiner (à apo(a)) för att exponera antigena determinanter, k ä n n e - t e c k n aft av att man innan provet reageras med .fâ-r avsedfl auti(apo(a)) eller anti(Lp(a)) antikropp, i ett förbehandlingsšteg håller pH på provet vid ett icke- denaturerande värde, som ligger över @H ca 9,0 eller- ' under pH ca 3,0, varefter pH inställes på pH-värdet för immunreaktion så att den immunkemiska bestämningen kan genomföras på i och för Sig känt sätt. ' ~Förfaranåe enligt krav 1, k ä u n e t e c k n a t av att pH i förbehandlingssteget är justerat till ett iv-ärae valt i intervallet 0-3 eller 9,_o-14,o. Eörfarande enligt krav 1 eller krav 2, 'k.ä n n e - t e c k n a t- av att pH under förbehandlingssteget är 7' justerat till ett värde sem år större än 10,0. KFörfarande enligt något av kraven I-2, kzä n nie - t~e ç k n a t justerat till ett _av att pH under förbehandlingseteget är värde valt i intervallet 9-14. 'u