JPH02242158A - ヒトアポリポ蛋白c―3の測定法 - Google Patents
ヒトアポリポ蛋白c―3の測定法Info
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、モノクローナル抗体を使用することを特徴と
するヒトアポリポ蛋白C−■の測定法に関する。さらに
詳しくは、ヒトアポリポ蛋白CIIIを特異的に認識し
、かつサブクラスがIgG、である抗ヒトアポリポ蛋白
C−■モ/クローナル抗体の1種または2種を用いるこ
とを特徴とするヒトアポリポ蛋白C−■の測定法に関す
る。
するヒトアポリポ蛋白C−■の測定法に関する。さらに
詳しくは、ヒトアポリポ蛋白CIIIを特異的に認識し
、かつサブクラスがIgG、である抗ヒトアポリポ蛋白
C−■モ/クローナル抗体の1種または2種を用いるこ
とを特徴とするヒトアポリポ蛋白C−■の測定法に関す
る。
従来波 および発明が解決しようとする課題食糧事情の
高栄養化や高齢化社会の進展に伴い、脂質代謝異常によ
ってひきおこされる高脂血症、動脈硬化症等の疾患は、
近年ますます増加の傾向を強めている。これら疾患の診
断に当たって血中脂質、とりわけリポ蛋白やその蛋白成
分であるアポリポ蛋白の測定を行うことが臨床分野にお
いて広く行われている。
高栄養化や高齢化社会の進展に伴い、脂質代謝異常によ
ってひきおこされる高脂血症、動脈硬化症等の疾患は、
近年ますます増加の傾向を強めている。これら疾患の診
断に当たって血中脂質、とりわけリポ蛋白やその蛋白成
分であるアポリポ蛋白の測定を行うことが臨床分野にお
いて広く行われている。
ヒトアポリポ蛋白C−III(以下、[アポC−111
Jという)は、ヒト血中脂質のうち超低比重リポ蛋白(
以下、rVLDLJという)中に主に存在し、アポリボ
蛋白C−■によるリポ蛋白リパーゼの活性化や肝細胞に
よるカイロミクロンレムナンドの取り込みを抑制する機
能を有することから特に注目されているアポリボ蛋白で
ある。その血中濃度の測定は、脂質代謝を把握する上で
重要な指針となる。
Jという)は、ヒト血中脂質のうち超低比重リポ蛋白(
以下、rVLDLJという)中に主に存在し、アポリボ
蛋白C−■によるリポ蛋白リパーゼの活性化や肝細胞に
よるカイロミクロンレムナンドの取り込みを抑制する機
能を有することから特に注目されているアポリボ蛋白で
ある。その血中濃度の測定は、脂質代謝を把握する上で
重要な指針となる。
近年、特異性が高(、かつ試薬として取り扱いが容易な
各種モノクローナル抗体の開発が進められている。こう
して得られたモノクローナル抗体は、ある種の蛋白、た
とえば血清中に存在するIgG、IgA、IgMなどの
免疫グロブリン[Jap。
各種モノクローナル抗体の開発が進められている。こう
して得られたモノクローナル抗体は、ある種の蛋白、た
とえば血清中に存在するIgG、IgA、IgMなどの
免疫グロブリン[Jap。
J 、clin、 CheIll、、 Vol、 l
4.185〜191(1985)]やアアポリポ白A−
1およびB[第28回日本臨床化学会年会プログラム・
要旨集、66〜67(1988)]などの免疫学的定量
に応用されている。
4.185〜191(1985)]やアアポリポ白A−
1およびB[第28回日本臨床化学会年会プログラム・
要旨集、66〜67(1988)]などの免疫学的定量
に応用されている。
一方、アポC−■の定量に関しては、アポC−■に対す
るモノクローナル抗体がすでに公知であるにもかかわら
ず、−元免疫拡散法や免疫比濁法に抗血清(動物をアポ
C−111で免疫して得られるもの)を用いており、モ
ノクローナル抗体を用いた定量法は知られていない。し
かし、動物から得られる抗血清を用いる免疫学的測定法
では抗血清中に含まれるポリクローナル抗体を利用する
ものであるため、免疫に用いる抗原の精製度の違いや免
疫される動物の個体差などに起因して口・ノド間の特異
性や力価等の差を生じ、一定した測定値を得るのが困難
であった。また試薬キ、ソトとして応用した場合にも一
定した性能の製品を製造することが困難であった。
るモノクローナル抗体がすでに公知であるにもかかわら
ず、−元免疫拡散法や免疫比濁法に抗血清(動物をアポ
C−111で免疫して得られるもの)を用いており、モ
ノクローナル抗体を用いた定量法は知られていない。し
かし、動物から得られる抗血清を用いる免疫学的測定法
では抗血清中に含まれるポリクローナル抗体を利用する
ものであるため、免疫に用いる抗原の精製度の違いや免
疫される動物の個体差などに起因して口・ノド間の特異
性や力価等の差を生じ、一定した測定値を得るのが困難
であった。また試薬キ、ソトとして応用した場合にも一
定した性能の製品を製造することが困難であった。
課題を解決するための手段
本発明者らは、かかる現状に鑑み鋭意研究を重ねた結果
、ヒトアポリポ蛋白C−■に特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体をヒトアポC−Iの定量に応用することに成
功し、本発明を完成するに至った。
、ヒトアポリポ蛋白C−■に特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体をヒトアポC−Iの定量に応用することに成
功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、試料の希釈を必要としない免疫比
濁法によるヒトアポC−■の定量法であって、ヒトアポ
C−■に特異的に反応し、かつサブクラスがIgG+で
あるモノクローナル抗体の1種または2種を用いたヒト
アポリポ蛋白C−■の免疫比濁法を提供するものである
。本発明の測定法の原理は、ヒトアポC−Hに特異的に
反応し、かつサブクラスが[gG、であるモノクローナ
ル抗体の1種または2種を試料(ヒト血清、血漿など)
中のヒトアポC−■と抗原抗体反応をさせ、生じた抗原
/抗体複合体による濁度を分光学的に測定することによ
るものである。
濁法によるヒトアポC−■の定量法であって、ヒトアポ
C−■に特異的に反応し、かつサブクラスがIgG+で
あるモノクローナル抗体の1種または2種を用いたヒト
アポリポ蛋白C−■の免疫比濁法を提供するものである
。本発明の測定法の原理は、ヒトアポC−Hに特異的に
反応し、かつサブクラスが[gG、であるモノクローナ
ル抗体の1種または2種を試料(ヒト血清、血漿など)
中のヒトアポC−■と抗原抗体反応をさせ、生じた抗原
/抗体複合体による濁度を分光学的に測定することによ
るものである。
本発明の方法においては、抗ヒトアポC−I[1モノク
ロ一ナル抗体の1種または2種を用いる。これらのモノ
クローナル抗体は、アポC−1で免疫した哺乳動物の抗
体産生細胞と哺乳動物のミエローマ細胞との融合細胞(
以下、「ハイブリドーマ」という)により産生される。
ロ一ナル抗体の1種または2種を用いる。これらのモノ
クローナル抗体は、アポC−1で免疫した哺乳動物の抗
体産生細胞と哺乳動物のミエローマ細胞との融合細胞(
以下、「ハイブリドーマ」という)により産生される。
つぎに、抗ヒトアポC−■モノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドーマの作製法、該抗体の製造法および該抗
体を用いたヒトアポC−■の免疫比濁法についてさらに
詳しく説明する。
るハイブリドーマの作製法、該抗体の製造法および該抗
体を用いたヒトアポC−■の免疫比濁法についてさらに
詳しく説明する。
抗アポC−■モノクローナル抗体を産生ずるノ\イブリ
ドーマは、(i)哺乳動物の免疫、(ii)細胞融合お
よび(iii)クローニングの各工程により作製するこ
とができる。
ドーマは、(i)哺乳動物の免疫、(ii)細胞融合お
よび(iii)クローニングの各工程により作製するこ
とができる。
(+)哺乳動物の免疫
精製したアポC−IIIを抗原として、哺乳動物に投与
(免疫)することにより行う。抗原として用いるアポC
−■は、ヒト血清または血漿を超遠心して得られるカイ
ロミクロン・VLDL画分を脱脂した後、セファクリル
S−200などを用いたカラムクロマトグラフィーで精
製することにより得ることができる。免疫する吐乳動物
としては、マウス、ヌードマウス、ラット等を使用する
ことができるが、BALB/cマウスが特に好ましい。
(免疫)することにより行う。抗原として用いるアポC
−■は、ヒト血清または血漿を超遠心して得られるカイ
ロミクロン・VLDL画分を脱脂した後、セファクリル
S−200などを用いたカラムクロマトグラフィーで精
製することにより得ることができる。免疫する吐乳動物
としては、マウス、ヌードマウス、ラット等を使用する
ことができるが、BALB/cマウスが特に好ましい。
免疫方法は常法により行われ、抗原を哺乳動物の腹腔内
、皮下等の適当な部位に投与免疫させる。
、皮下等の適当な部位に投与免疫させる。
投与量は、哺乳動物の種類、投与部位等に応じて適宜決
定されるが、マウスに投与する場合は1回当たり10μ
9〜lR9/マウス程度とするのが適当である。
定されるが、マウスに投与する場合は1回当たり10μ
9〜lR9/マウス程度とするのが適当である。
(ii)細胞融合
上記工程(i)で得た免疫哺乳動物の抗体産生細胞と哺
乳動物のミエローマ細胞とを用い、常法により行う。抗
体産生細胞としては、上記BALB/Cマウスの肺細胞
が最も好適であるが、これ以外にも例えばマウスのリン
パ節細胞や末梢リンパ球、ラットのリンパ球等も使用す
ることができる。
乳動物のミエローマ細胞とを用い、常法により行う。抗
体産生細胞としては、上記BALB/Cマウスの肺細胞
が最も好適であるが、これ以外にも例えばマウスのリン
パ節細胞や末梢リンパ球、ラットのリンパ球等も使用す
ることができる。
ミエローマ細胞としては、マウスのミエローマ細胞FO
が好ましいが、これ以外のミエローマ細胞を用いること
もできる。細胞融合法としては、ポリエチレングリコー
ル法、HVJ法、電気融合法等を挙げることができる。
が好ましいが、これ以外のミエローマ細胞を用いること
もできる。細胞融合法としては、ポリエチレングリコー
ル法、HVJ法、電気融合法等を挙げることができる。
この様にして得られたハイブリドーマを1.0XIO−
’Mヒボキサンチン、4.0X10−’Mアミノプテリ
ンおよび1.6Xlo−5Mチミジンを含むダルベツコ
改変イーグル培地(DMEM)等の適当な培地で培養す
れば、ハイブリドーマのみが増殖してくる。
’Mヒボキサンチン、4.0X10−’Mアミノプテリ
ンおよび1.6Xlo−5Mチミジンを含むダルベツコ
改変イーグル培地(DMEM)等の適当な培地で培養す
れば、ハイブリドーマのみが増殖してくる。
(iii)クローニング
上記工程(ii)で増殖したハイブリドーマから抗アポ
C−111モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー
マをスクリーニングした後、限界希釈法等の公知の方法
によって行う。ハイブリドーマのスクリーニングは、ハ
イブリドーマの培養上清を、精製したアポC−■やヒト
カイロミクロン・VLDL画分を抗原とした酵素免疫測
定法やウェスタンプロット法で試験し、培養上清中の抗
アホC■モノクローナル抗体の有無を調べることにより
実施することができる。
C−111モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー
マをスクリーニングした後、限界希釈法等の公知の方法
によって行う。ハイブリドーマのスクリーニングは、ハ
イブリドーマの培養上清を、精製したアポC−■やヒト
カイロミクロン・VLDL画分を抗原とした酵素免疫測
定法やウェスタンプロット法で試験し、培養上清中の抗
アホC■モノクローナル抗体の有無を調べることにより
実施することができる。
ついで上記ハイブリドーマから抗アポC−I[1モノク
ロ一ナル抗体を製造する。すなわち、上記(i)〜(i
ii)の工程を経て得られた抗アポC−■モノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリドーマを適当な培地で培養し
、その培養上清から分離精製するか(インビトロ法)、
あるいは抗アポC−■モノクローナル抗体を産生ずるハ
イブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物の腹腔内に
投与し、増殖させ、その動物の腹水より分離精製する(
インビボ法)ことにより目的とする抗体が製造される。
ロ一ナル抗体を製造する。すなわち、上記(i)〜(i
ii)の工程を経て得られた抗アポC−■モノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリドーマを適当な培地で培養し
、その培養上清から分離精製するか(インビトロ法)、
あるいは抗アポC−■モノクローナル抗体を産生ずるハ
イブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物の腹腔内に
投与し、増殖させ、その動物の腹水より分離精製する(
インビボ法)ことにより目的とする抗体が製造される。
インビトロ法において用いることのできる培地としては
、DMEM、RPMI 1640培地、ASF培地10
3等の培地を挙げることができる。分離精製は、硫安分
画法(硫酸アンモニウム塩析)、DEAEセルロース等
を用いたイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の常法により行うことができる
。
、DMEM、RPMI 1640培地、ASF培地10
3等の培地を挙げることができる。分離精製は、硫安分
画法(硫酸アンモニウム塩析)、DEAEセルロース等
を用いたイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の常法により行うことができる
。
上記操作を行うことにより、本発明者らは2種類の抗ア
ポC−l11モノクローナル抗体(MNHC−■−9お
よびMNHC−I[l−10)を得た。これらのモノク
ローナル抗体の特異性をヒトカイロミクロン・VLDL
画分を抗原としたウェスタンプロット法で確かめたとこ
ろ、いずれもアポC■とのみ反応することが確認された
。また、これらのモノクローナル抗体のクラスをマウス
モノクローナル抗体タイピングキット(ICN社製)を
用いて調べたところ、いずれの抗体ともIgG、サブク
ラスに属することがわかった。さらに、β−ガラクトシ
ダーゼで標識したMNHC−III−10を、MNHC
−III−9またはMNHC−I[1−10と競合的に
ヒトカイロミクロン・VLDL画分に反応させたところ
、MNHC−II[−10は反応を阻害したが、MNH
C−I[1−9は反応を阻害しなかった。このことから
、MNHC−III−9とMNHCl−10とは、ヒト
アポC−■上のそれぞれ異なる抗原決定基を認識するも
のであると考えられる。
ポC−l11モノクローナル抗体(MNHC−■−9お
よびMNHC−I[l−10)を得た。これらのモノク
ローナル抗体の特異性をヒトカイロミクロン・VLDL
画分を抗原としたウェスタンプロット法で確かめたとこ
ろ、いずれもアポC■とのみ反応することが確認された
。また、これらのモノクローナル抗体のクラスをマウス
モノクローナル抗体タイピングキット(ICN社製)を
用いて調べたところ、いずれの抗体ともIgG、サブク
ラスに属することがわかった。さらに、β−ガラクトシ
ダーゼで標識したMNHC−III−10を、MNHC
−III−9またはMNHC−I[1−10と競合的に
ヒトカイロミクロン・VLDL画分に反応させたところ
、MNHC−II[−10は反応を阻害したが、MNH
C−I[1−9は反応を阻害しなかった。このことから
、MNHC−III−9とMNHCl−10とは、ヒト
アポC−■上のそれぞれ異なる抗原決定基を認識するも
のであると考えられる。
本発明の方法を実施するには、通常の免疫比濁法(TI
A法)に従って行えばよく、たとえば次ぎのようにして
行うことができる。すなわち、MNHC−III−10
単独またはMNHC−I[[−9とMNHC−I−10
との混合抗体を含有する試験抗体溶液を調製し、この試
験抗体溶液を適当な緩衝液中で試料溶液と反応させる。
A法)に従って行えばよく、たとえば次ぎのようにして
行うことができる。すなわち、MNHC−III−10
単独またはMNHC−I[[−9とMNHC−I−10
との混合抗体を含有する試験抗体溶液を調製し、この試
験抗体溶液を適当な緩衝液中で試料溶液と反応させる。
反応後に生じた濁度を分光光度計にて測定し、これをあ
らかじめ作成しておいた検量線と比較することによりア
ポC−■の濃度を測定することができる。
らかじめ作成しておいた検量線と比較することによりア
ポC−■の濃度を測定することができる。
抗アポC−■モノクローナル抗体の1種のみを単独で用
いるか2種を混合して用いるかは、測定感度、測定範囲
等の免疫比濁法を用いる情況に応じて適宜選択すること
ができる。2種の抗体を混合する場合の混合比は、MN
HC−I[1−9:MNHC−[1−10=2〜5:5
〜2の範囲であることが好ましく、l:1であることが
さらに好ましい。試験抗体溶液中の抗体濃度は、MNH
C−IIIlOを単独で用いる場合には20〜500μ
9/ma、好ましく l:t50〜l OOμ9/m(
1、MNHc−m〜9とMNH(、−111−10との
混合抗体を用いる場合には全抗体濃度として5〜200
μ9/対、好ましくは20〜150μ9/x(lとすれ
ばよい(抗体濃度は、波長28Or+mでの吸光度を測
定し、1%IgG溶液の吸光度が15であるとして算出
した数値より計算して求めることができる)。緩衝液と
しては、反応促進剤を含み中性付近に緩衝能を有する様
に調製した、リン酸緩衝液、トリス−HCa緩衝液、グ
ツド緩衝液等を用いることができる。反応促進剤の具体
例としては、ポリエチレングリコール6000等を挙げ
ることができる。反応は、37°C付近の温度で数分〜
30分間程度行う。
いるか2種を混合して用いるかは、測定感度、測定範囲
等の免疫比濁法を用いる情況に応じて適宜選択すること
ができる。2種の抗体を混合する場合の混合比は、MN
HC−I[1−9:MNHC−[1−10=2〜5:5
〜2の範囲であることが好ましく、l:1であることが
さらに好ましい。試験抗体溶液中の抗体濃度は、MNH
C−IIIlOを単独で用いる場合には20〜500μ
9/ma、好ましく l:t50〜l OOμ9/m(
1、MNHc−m〜9とMNH(、−111−10との
混合抗体を用いる場合には全抗体濃度として5〜200
μ9/対、好ましくは20〜150μ9/x(lとすれ
ばよい(抗体濃度は、波長28Or+mでの吸光度を測
定し、1%IgG溶液の吸光度が15であるとして算出
した数値より計算して求めることができる)。緩衝液と
しては、反応促進剤を含み中性付近に緩衝能を有する様
に調製した、リン酸緩衝液、トリス−HCa緩衝液、グ
ツド緩衝液等を用いることができる。反応促進剤の具体
例としては、ポリエチレングリコール6000等を挙げ
ることができる。反応は、37°C付近の温度で数分〜
30分間程度行う。
本発明の免疫比濁法に用いる試料としては、ヒト血清ま
たは血漿を挙げることができる。
たは血漿を挙げることができる。
MNHC−■−9およびMN)IC−III−10を上
記免疫比濁法に応用したところ、MNHC−10単独ま
たはMNHC−111−9とMNHC−[[lOとの混
合物では濁度を生じたが、MNHCIll−9単独では
濁度を生じなかった。またMNHC=II[−9とMN
HC−II[−10との混合物は、MNHC−I[1−
10を単独で用いた場合に比べて約3倍の濁度を生じさ
せることがわかった。
記免疫比濁法に応用したところ、MNHC−10単独ま
たはMNHC−111−9とMNHC−[[lOとの混
合物では濁度を生じたが、MNHCIll−9単独では
濁度を生じなかった。またMNHC=II[−9とMN
HC−II[−10との混合物は、MNHC−I[1−
10を単独で用いた場合に比べて約3倍の濁度を生じさ
せることがわかった。
一般に、アポC−111のように1つの抗原分子中に複
数個の同一の抗原決定基を有しない被験物質の場合には
、1種のモノクローナル抗体のみでは充分な濁度を生じ
させることが困難であり、充分な濁度を生じさせるため
には2種以上のモノクローナル抗体を混合して反応させ
ることが必要である。しかし、本発明におけるMNHC
−111−10の場合には単独でもアポC−111と反
応して濁度を生じさせることができ、この点で極めて特
徴的なモノクローナル抗体であることがわかった。また
、MNHC−Ill−9の場合には単独ではほとんど濁
度を生じさせることができなかったが、MNHC−in
−toの混濁反応を著しく増強させるモノクローナル抗
体であった。
数個の同一の抗原決定基を有しない被験物質の場合には
、1種のモノクローナル抗体のみでは充分な濁度を生じ
させることが困難であり、充分な濁度を生じさせるため
には2種以上のモノクローナル抗体を混合して反応させ
ることが必要である。しかし、本発明におけるMNHC
−111−10の場合には単独でもアポC−111と反
応して濁度を生じさせることができ、この点で極めて特
徴的なモノクローナル抗体であることがわかった。また
、MNHC−Ill−9の場合には単独ではほとんど濁
度を生じさせることができなかったが、MNHC−in
−toの混濁反応を著しく増強させるモノクローナル抗
体であった。
本発明方法は試料を希釈する必要がな(、また抗原抗体
反応が約15〜20分でプラトーに達するため極めて簡
便かつ短時間に測定することが可能である。本発明方法
によれば約20〜25mg/d&のアポc−ms度まで
検量線を得ることができ、従って正常値の約2倍までの
アポC−用濃度を測定することができる。
反応が約15〜20分でプラトーに達するため極めて簡
便かつ短時間に測定することが可能である。本発明方法
によれば約20〜25mg/d&のアポc−ms度まで
検量線を得ることができ、従って正常値の約2倍までの
アポC−用濃度を測定することができる。
つぎに製造例および実施例により本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。
四潰1’l (抗アポC−■モノクローナル抗体の作製
)■抗原の作製 ヒトカイロミクロン・VLDL画分の調製正常ヒト血漿
を遠心管(ベックマン社製、ウルトラクリアー、16X
76+++a+)に入れ、生理食塩水を重層した。これ
を日立55P−2超遠心機(日立RP4(C−夕−)を
用い、40.00 Orpm。
)■抗原の作製 ヒトカイロミクロン・VLDL画分の調製正常ヒト血漿
を遠心管(ベックマン社製、ウルトラクリアー、16X
76+++a+)に入れ、生理食塩水を重層した。これ
を日立55P−2超遠心機(日立RP4(C−夕−)を
用い、40.00 Orpm。
15°Cで24時間遠心した。上層のカイロミクロン・
VLDL画分を回収した。
VLDL画分を回収した。
アポc−m溶液の調製
カイロミクロン・VLDL画分に10倍量のエタノール
:エーテル(3:l)を加え、3回脱脂した。
:エーテル(3:l)を加え、3回脱脂した。
沈殿物を10%SDS溶液(2−メルカプトエタノール
を1%含む)(7,5iσ)で溶解した。得られた溶液
を、0.2%SDS、1mM EDTA。
を1%含む)(7,5iσ)で溶解した。得られた溶液
を、0.2%SDS、1mM EDTA。
0.9%塩化ナトリウムを含む10mMトリス−HCσ
緩衝液(pH7,2)で平衡化し50°Cに保温した七
フアクリルS−200(ファルマシア社製ンカラムにか
け、同緩衝液で溶出した。3つのピーク(FISF2お
よびF3)が得られ、SDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動で調べたところ、ピークF3にアポC−■が認め
られた。この画分を回収し、精製水(5,OOO+n&
)に対して2回透析した。この透析液を、7M5メンプ
ラン(アミコン社製)を用いた限外濾過法により濃縮し
た。回収した総液量は4.8mQであった。総蛋白濃度
をローリ−法にて測定したところ、2.45x9/mR
であった。得られたアポC−111溶液は小分けして、
=75°Cで保存した。
緩衝液(pH7,2)で平衡化し50°Cに保温した七
フアクリルS−200(ファルマシア社製ンカラムにか
け、同緩衝液で溶出した。3つのピーク(FISF2お
よびF3)が得られ、SDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動で調べたところ、ピークF3にアポC−■が認め
られた。この画分を回収し、精製水(5,OOO+n&
)に対して2回透析した。この透析液を、7M5メンプ
ラン(アミコン社製)を用いた限外濾過法により濃縮し
た。回収した総液量は4.8mQであった。総蛋白濃度
をローリ−法にて測定したところ、2.45x9/mR
であった。得られたアポC−111溶液は小分けして、
=75°Cで保存した。
■動物の免疫
上記工程■で得たアポC−用溶液を蛋白濃度が200μ
g/mQとなる様に生理食塩水で希釈した。
g/mQとなる様に生理食塩水で希釈した。
この希釈アポC−I溶液とフロイント完全アジュバント
とをl:l(容量比)に混合し、抗原乳剤を作製した。
とをl:l(容量比)に混合し、抗原乳剤を作製した。
この抗原乳剤(l d)をBALB/cマウス(雄、6
週齢)の背部皮下に投与した(初回免疫)。初回免疫の
1ケ月後、上記の希釈アポC相溶液(0,25mのをさ
らに腹腔内に投与した(追加免疫)。
週齢)の背部皮下に投与した(初回免疫)。初回免疫の
1ケ月後、上記の希釈アポC相溶液(0,25mのをさ
らに腹腔内に投与した(追加免疫)。
■細胞融合
追加免疫3日後のマウスより肺臓を摘出し、DMEM(
ギブコ社製;グルコース4,500m9/12含有、ペ
ニシリンおよびストレプトマイシンをそれぞれ100単
位/mQ、100 μg/m(lとなる様に添加、ウシ
胎児血清未添加;以下、「基礎培地」という)中で肺臓
から肺細胞を取り出した。取り出した肺細胞は基礎培地
中に浮遊させ、細胞融合に用いる時まで4°Cにて保存
した。1.86X10’個の肺細胞が得られた。
ギブコ社製;グルコース4,500m9/12含有、ペ
ニシリンおよびストレプトマイシンをそれぞれ100単
位/mQ、100 μg/m(lとなる様に添加、ウシ
胎児血清未添加;以下、「基礎培地」という)中で肺臓
から肺細胞を取り出した。取り出した肺細胞は基礎培地
中に浮遊させ、細胞融合に用いる時まで4°Cにて保存
した。1.86X10’個の肺細胞が得られた。
ミエローマ細胞の調製
ミエローマ細胞はFOを用いた。10%ウシ胎児血清、
1111Mピルビン酸ナトリウムを含む基礎培地(以下
、「基本培地」という)で培養したFOを基礎培地で2
回洗浄した後、基礎培地中に浮遊させた。細胞密度は8
XlO”個/mQとした。
1111Mピルビン酸ナトリウムを含む基礎培地(以下
、「基本培地」という)で培養したFOを基礎培地で2
回洗浄した後、基礎培地中に浮遊させた。細胞密度は8
XlO”個/mQとした。
岨胞融倉
上記肺細胞浮遊液に上記ミエローマ細胞浮遊液(約6+
++のを混合し、1,000rpmで5分間遠心した後
、上清を除去した。これに、37℃に保温した滅菌50
%ポリエチレングリコール4000溶液(1m□を攪拌
しながら1分間かけて滴下した。
++のを混合し、1,000rpmで5分間遠心した後
、上清を除去した。これに、37℃に保温した滅菌50
%ポリエチレングリコール4000溶液(1m□を攪拌
しながら1分間かけて滴下した。
1分間混合物を攪拌した後、基礎培地(2m12)を攪
拌しながら2分間かけて滴下した。さらに、基礎培地(
8n+のを攪拌しながら2分間で滴下した。■。
拌しながら2分間かけて滴下した。さらに、基礎培地(
8n+のを攪拌しながら2分間で滴下した。■。
000 rpmで5分間遠心して上清を除去した後、1
.0Xlo−’Mヒボキサンチン、4.0XlO−’M
アミノプテリン、1.6X10−’Mチミジンを含む基
本培地(以下、「■]AT培地」という)(50mのを
加え、ハイブリドーマ浮遊液を作製した。
.0Xlo−’Mヒボキサンチン、4.0XlO−’M
アミノプテリン、1.6X10−’Mチミジンを含む基
本培地(以下、「■]AT培地」という)(50mのを
加え、ハイブリドーマ浮遊液を作製した。
■ハイブリドーマの培養および抗アポC−■モノクロー
ナル抗体を産生ずるバイブリド′−マのスクリーニング 上記ハイブリドーマ浮遊液を、あらかじめHAT培地を
200μρずつ分注しである5枚の培養用96ウエルマ
イクロプレート(コース9−社’A)に100μρずつ
加え、37°C15%二酸化炭素のインキュベーター内
で培養した。ヒトカイロミクロン・VLDL感作マイク
ロプレートを用い、酵素免疫測定法(EIA法)によっ
て抗アポC−111モノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマのスクリーニングを行った。
ナル抗体を産生ずるバイブリド′−マのスクリーニング 上記ハイブリドーマ浮遊液を、あらかじめHAT培地を
200μρずつ分注しである5枚の培養用96ウエルマ
イクロプレート(コース9−社’A)に100μρずつ
加え、37°C15%二酸化炭素のインキュベーター内
で培養した。ヒトカイロミクロン・VLDL感作マイク
ロプレートを用い、酵素免疫測定法(EIA法)によっ
て抗アポC−111モノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマのスクリーニングを行った。
ヒトカイロミクロン・VLDL感作マイクロプレートの
作製 アポC−■の精製過程で得られたヒトカイロミクロン・
VLDL画分を50mM炭酸緩衝液(pH9,6)で適
宜希釈しく50〜200倍)、EIA用96ウエルマイ
クロプレート(コースタ−1)に1ウェル当り100μ
ρずつ分注した後、37°Cで1時間加温した。次いで
、25IIMリン酸緩衝生理食塩水(pH7,3、ツイ
ーン20を0.1%含む;以下、rPBsJという)で
洗浄した後、3%ウシ血清アルブミン溶液(PBSで調
1)(200μm2)を分注し、37°Cで1時間加温
した。この様にして得たヒトカイロミクロン・VLDL
感作マイクロプレートを使用時まで4°Cで保存した。
作製 アポC−■の精製過程で得られたヒトカイロミクロン・
VLDL画分を50mM炭酸緩衝液(pH9,6)で適
宜希釈しく50〜200倍)、EIA用96ウエルマイ
クロプレート(コースタ−1)に1ウェル当り100μ
ρずつ分注した後、37°Cで1時間加温した。次いで
、25IIMリン酸緩衝生理食塩水(pH7,3、ツイ
ーン20を0.1%含む;以下、rPBsJという)で
洗浄した後、3%ウシ血清アルブミン溶液(PBSで調
1)(200μm2)を分注し、37°Cで1時間加温
した。この様にして得たヒトカイロミクロン・VLDL
感作マイクロプレートを使用時まで4°Cで保存した。
EIA法
ハイブリドーマが増殖しているウェルの培養上ン青(1
00μQ)をヒトカイロミクロン・VLDL感作マイク
ロプレートに分注し、37°Cで1時間加温した。PB
Sで洗浄した後、抗マウスIgG(H十L)ヤギ抗体の
ホースラデイツシュパーオキシダーゼ標識物(バイオラ
ンド社製、3%ウシ血清アルブミン溶液で500倍希釈
X100μI2)を分注し、37°Cで1時間加温した
。PBSで洗浄し、発色溶液(0−フェニレンジアミン
ニ塩酸塩20w9.30%過酸化水素水lOμa1クエ
ン酸525x9、リン酸二ナトリウム・12水和物1゜
79g、精製水50mの(100μ&)を加え、室温で
約20分間酵素反応させた後、2N硫酸(50μのを加
えて反応を停止させた。
00μQ)をヒトカイロミクロン・VLDL感作マイク
ロプレートに分注し、37°Cで1時間加温した。PB
Sで洗浄した後、抗マウスIgG(H十L)ヤギ抗体の
ホースラデイツシュパーオキシダーゼ標識物(バイオラ
ンド社製、3%ウシ血清アルブミン溶液で500倍希釈
X100μI2)を分注し、37°Cで1時間加温した
。PBSで洗浄し、発色溶液(0−フェニレンジアミン
ニ塩酸塩20w9.30%過酸化水素水lOμa1クエ
ン酸525x9、リン酸二ナトリウム・12水和物1゜
79g、精製水50mの(100μ&)を加え、室温で
約20分間酵素反応させた後、2N硫酸(50μのを加
えて反応を停止させた。
■限界希釈法によるクローニング
抗体陽性ウェルのハイブリドーマを24ウエルマイクロ
プレート(コースタ−社製)に移し、HAT培地で3〜
5日間培養した。この培養液を攪拌して細胞浮遊液とし
、その一部をトリバンブルー染色液(ギブコ社製)で染
色し、細胞数を計測した。
プレート(コースタ−社製)に移し、HAT培地で3〜
5日間培養した。この培養液を攪拌して細胞浮遊液とし
、その一部をトリバンブルー染色液(ギブコ社製)で染
色し、細胞数を計測した。
次いで、細胞密度がlO〜25個/m(lとなる様に細
胞浮遊液をHAT培地で希釈した。この細胞希釈液を、
あらかじめフィーダー細胞(マウス胸腺細胞)を100
μρ分注した96ウエルマイクロプレートに200μσ
ずつ加え、37°C,5%二酸化炭素のインキュベータ
ー内で培養した。このクローニングを2回行った。
胞浮遊液をHAT培地で希釈した。この細胞希釈液を、
あらかじめフィーダー細胞(マウス胸腺細胞)を100
μρ分注した96ウエルマイクロプレートに200μσ
ずつ加え、37°C,5%二酸化炭素のインキュベータ
ー内で培養した。このクローニングを2回行った。
このクローニングの結果、本発明抗体を産生ずるハイブ
リドーマが2種類得られた。この2種類の抗アポC−I
IIモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをNHC−
I[−9およびNHC−I[1−1゜と命名し、これら
のハイブリドーマが産生ずる抗体をそれぞれMNHC−
III−9およびMNHCIII−10と命名した。
リドーマが2種類得られた。この2種類の抗アポC−I
IIモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをNHC−
I[−9およびNHC−I[1−1゜と命名し、これら
のハイブリドーマが産生ずる抗体をそれぞれMNHC−
III−9およびMNHCIII−10と命名した。
上記2種の抗アポC−■モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマ、NHC−III−9およびNHC−m−to
は、それぞれ、微工研閑寄第10600号(FERM
P−10600)および第10601号(FERM
P−10601)として寄託しである。
リドーマ、NHC−III−9およびNHC−m−to
は、それぞれ、微工研閑寄第10600号(FERM
P−10600)および第10601号(FERM
P−10601)として寄託しである。
■抗アポC−I[1モノクロ一ナル抗体産生)−イブリ
ドーマの凍結保存 クローニングを2回行った後の抗アポC−111モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを24ウエルマイクロ
プレートに移し、1.OX 10−’Mヒボキサンチン
、1.6XlO−’Mチミジンを含む基本培地(以下、
rHT培地」という)で培養した。
ドーマの凍結保存 クローニングを2回行った後の抗アポC−111モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを24ウエルマイクロ
プレートに移し、1.OX 10−’Mヒボキサンチン
、1.6XlO−’Mチミジンを含む基本培地(以下、
rHT培地」という)で培養した。
次いで、約1週間かけて培地を徐々にHT培地から基本
培地に変換した。細胞を基本培地で培養した後、細胞を
回収し、細胞密度が105〜106個/mQとなる様に
10%ジメチルスルホオキサイド(DMSO)を含むウ
シ胎児血清に浮遊させ、2IIIQ容のセラムチューブ
(コーニング社製)にln+12ずつ分注した。このセ
ラムチューブを脱脂綿で包み、−75°Cの冷凍庫内に
一夜放置して内容物を凍結させた後、液体窒素保存容器
に移して保存した。
培地に変換した。細胞を基本培地で培養した後、細胞を
回収し、細胞密度が105〜106個/mQとなる様に
10%ジメチルスルホオキサイド(DMSO)を含むウ
シ胎児血清に浮遊させ、2IIIQ容のセラムチューブ
(コーニング社製)にln+12ずつ分注した。このセ
ラムチューブを脱脂綿で包み、−75°Cの冷凍庫内に
一夜放置して内容物を凍結させた後、液体窒素保存容器
に移して保存した。
■抗体の精製
凍結保存しである各抗アポC−■モノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ(NHC−Ill−9およびNH(、
−I[[−10)をそれぞれ基本培地で前培養した後、
ASF培地103(動物細胞培養用無血清培地、味の素
社製)(1,000d)で約10日間培養した。50%
飽和となる様に培養上清に硫酸アンモニウムを加え、4
°Cで一夜塩析した。7゜000 rpa+で30分間
遠心し、その沈殿物を150+M塩化ナトリウムを含む
20mMリン酸緩衝液(pH7,2;以下、「基本緩衝
液」という)に溶解し、同緩衝液に対して透析した。こ
の様にして得られた粗精製抗体液と3M塩化ナトリウム
を含む1゜5Mグリシン−NaOH緩衝液(pH9,o
;以下、「結合用緩衝液」という)を等量混合し、結合
用緩衝液で平衡化した固定化rプロティンA(レプリゲ
ン(Repl iG en)社製)カラムにかけた。ベ
ツドボリュームの15倍容量の結合用緩衝液でカラムを
洗浄した後、0.1Mクエン酸緩衝液(pH3,0)で
溶出した。この溶出液を1Mトリス−HC(緩衝液(p
H9,0)で直ちに中和した。基本緩衝液に対して透析
した後、ウルトラフィルターPO200(アトバンチツ
ク東洋社製)を用いた限外濾過法で濃縮した。
生ハイブリドーマ(NHC−Ill−9およびNH(、
−I[[−10)をそれぞれ基本培地で前培養した後、
ASF培地103(動物細胞培養用無血清培地、味の素
社製)(1,000d)で約10日間培養した。50%
飽和となる様に培養上清に硫酸アンモニウムを加え、4
°Cで一夜塩析した。7゜000 rpa+で30分間
遠心し、その沈殿物を150+M塩化ナトリウムを含む
20mMリン酸緩衝液(pH7,2;以下、「基本緩衝
液」という)に溶解し、同緩衝液に対して透析した。こ
の様にして得られた粗精製抗体液と3M塩化ナトリウム
を含む1゜5Mグリシン−NaOH緩衝液(pH9,o
;以下、「結合用緩衝液」という)を等量混合し、結合
用緩衝液で平衡化した固定化rプロティンA(レプリゲ
ン(Repl iG en)社製)カラムにかけた。ベ
ツドボリュームの15倍容量の結合用緩衝液でカラムを
洗浄した後、0.1Mクエン酸緩衝液(pH3,0)で
溶出した。この溶出液を1Mトリス−HC(緩衝液(p
H9,0)で直ちに中和した。基本緩衝液に対して透析
した後、ウルトラフィルターPO200(アトバンチツ
ク東洋社製)を用いた限外濾過法で濃縮した。
上記のようにして得た各モノクローナル抗体の抗体濃度
を測定し、抗体の回収量を求めた。生理食塩水で10倍
希釈した各モノクローナル抗体溶液の波長280na+
での吸光度を測定し、1%IgG溶液の吸光度が15で
あるとして各抗体濃度を計算した。その結果を第1表に
示す。
を測定し、抗体の回収量を求めた。生理食塩水で10倍
希釈した各モノクローナル抗体溶液の波長280na+
での吸光度を測定し、1%IgG溶液の吸光度が15で
あるとして各抗体濃度を計算した。その結果を第1表に
示す。
工土嚢 モノクローナル抗体の回収量
実施例1(混濁反応のタイムコース)
製造例の工程■で得た各モノクローナル抗体の原液、基
本緩衝液および10%PEG緩衝液(ポリエチレングリ
コール6000を10%含む基本緩衝液)を用い、抗体
濃度が80μg/m(lとなる様に、そしてポリエチレ
ングリコール6000の濃度が4.5%となる様に試験
抗体溶液をそれぞれ調製した。また、MNHC−III
−9とMNHCI[[−1oを等量混合した試験抗体溶
液(各抗体濃度は20μy/xi2)をも調製した。
本緩衝液および10%PEG緩衝液(ポリエチレングリ
コール6000を10%含む基本緩衝液)を用い、抗体
濃度が80μg/m(lとなる様に、そしてポリエチレ
ングリコール6000の濃度が4.5%となる様に試験
抗体溶液をそれぞれ調製した。また、MNHC−III
−9とMNHCI[[−1oを等量混合した試験抗体溶
液(各抗体濃度は20μy/xi2)をも調製した。
上記のようにして調製した試験抗体溶液をキュベツトに
1.5−ずつ分注し、37°C恒温装置付きの分光光度
計(富津UV160)にセットし、約10分間ブレイン
キュベーションした。次いで、ヒト血清[−元免疫拡散
法(SRID法)を原理とするアポC−[プレート「第
一](第一化学薬品社製)で測定したアポC−1濃度が
6.45R9/dσのもの](50μのを加えて転倒混
和し、波長34Qnmの吸光度を37℃で2分ごとに、
30分まで測定した。なお、ブランクは4.5%PEG
緩衝液(ポリエチレングリコール6000を4,5%含
む基本緩衝液)を用いて測定した。結果を第1図に示す
。
1.5−ずつ分注し、37°C恒温装置付きの分光光度
計(富津UV160)にセットし、約10分間ブレイン
キュベーションした。次いで、ヒト血清[−元免疫拡散
法(SRID法)を原理とするアポC−[プレート「第
一](第一化学薬品社製)で測定したアポC−1濃度が
6.45R9/dσのもの](50μのを加えて転倒混
和し、波長34Qnmの吸光度を37℃で2分ごとに、
30分まで測定した。なお、ブランクは4.5%PEG
緩衝液(ポリエチレングリコール6000を4,5%含
む基本緩衝液)を用いて測定した。結果を第1図に示す
。
実施例2(アポC−I[1量と吸光度との関係)抗体濃
度が50μ9/x(lとなる様に調製したMNHC−D
I−10の試験抗体溶液(ポリエチレングリコール60
00の濃度および緩衝液は実施例1と同じ)と5RID
法でアポC−1濃度が17゜in/df2のヒト血清、
および実施例1で調製したMNHC−1−9とMNHC
−II[−10を等量混合した試験抗体溶液と5RID
法でアポC−1濃度が13 、9197M(lのヒト血
清をそれぞれ用い、アポC−1濃と吸光度との関係を調
べた。試験管にヒト血清を2,5.5.10および15
μρずつサンプリングし、これに各試験抗体溶液を1m
f2ずつ加え、37°Cで20分間反応させた後、波長
340r+mにおける吸光度を測定した。なお、ブラン
クは4.5%PEG緩衝液を用いて測定した。MNHC
−I[1−10単独の試験抗体溶液を用いた場合および
MNHC−III−9とMNHC−III−10との混
合試験抗体溶液を用いた場合の結果をそれぞれ第2図お
よび第3図に示す。
度が50μ9/x(lとなる様に調製したMNHC−D
I−10の試験抗体溶液(ポリエチレングリコール60
00の濃度および緩衝液は実施例1と同じ)と5RID
法でアポC−1濃度が17゜in/df2のヒト血清、
および実施例1で調製したMNHC−1−9とMNHC
−II[−10を等量混合した試験抗体溶液と5RID
法でアポC−1濃度が13 、9197M(lのヒト血
清をそれぞれ用い、アポC−1濃と吸光度との関係を調
べた。試験管にヒト血清を2,5.5.10および15
μρずつサンプリングし、これに各試験抗体溶液を1m
f2ずつ加え、37°Cで20分間反応させた後、波長
340r+mにおける吸光度を測定した。なお、ブラン
クは4.5%PEG緩衝液を用いて測定した。MNHC
−I[1−10単独の試験抗体溶液を用いた場合および
MNHC−III−9とMNHC−III−10との混
合試験抗体溶液を用いた場合の結果をそれぞれ第2図お
よび第3図に示す。
実施例3(免疫比濁法(TIA法)と5RID法の相関
性) ヒト血清38試料を用い、TIA法と5RID法とによ
る測定値の相関性を調べた。TIA法は次のようにして
行った。ヒト血清および標準液(SRID法でのアポC
−1濃度が8.8yy/d(2のヒトブール血清)をそ
れぞれ試験管にlOμρずつサンプリングし、これに実
施例1で調製したMNHC−1−9とMNHC−I−1
0を等量混合した試験抗体溶液を1xRずつ加えて37
°Cで30分間反応させ、ついで波長340nmにおけ
る吸光度を測定した。ブランクは4.5%PEG緩衝液
を用いて測定した。結果を第4図に示す。第4図から明
らかなように、TIA法と5RID法の相関性は非常に
高い。
性) ヒト血清38試料を用い、TIA法と5RID法とによ
る測定値の相関性を調べた。TIA法は次のようにして
行った。ヒト血清および標準液(SRID法でのアポC
−1濃度が8.8yy/d(2のヒトブール血清)をそ
れぞれ試験管にlOμρずつサンプリングし、これに実
施例1で調製したMNHC−1−9とMNHC−I−1
0を等量混合した試験抗体溶液を1xRずつ加えて37
°Cで30分間反応させ、ついで波長340nmにおけ
る吸光度を測定した。ブランクは4.5%PEG緩衝液
を用いて測定した。結果を第4図に示す。第4図から明
らかなように、TIA法と5RID法の相関性は非常に
高い。
第1図は、抗アポC−■モノクローナル抗体としてMN
HC−1−9単独、MNHC−I−10単独およびMN
HC−II[−9とMNHC−I[−10との混合物を
用いて血清アポC−■と免疫混濁反応させた時の吸光度
のタイムコースを示すグラフ、第2図は、MNHC−I
[1−10の試験抗体溶液を用いたときのアポc−mu
と吸光度の関係を示すグラフ、第3図は、MNHC−I
ll−9とMNHC−I[1−10を等量混合して調製
した試験抗体溶液を用いたときのアポC−[[量と吸光
度の関係を示すグラフ、第4図は、MNHC−III−
9とMNHC−III−10を等量混合して調製した試
験抗体溶液を用いて免疫比濁法を行った結果と5RID
法を用いて血清アポC−IIIを定量したときの結果の
相関関係を示すグラフである。 第2図
HC−1−9単独、MNHC−I−10単独およびMN
HC−II[−9とMNHC−I[−10との混合物を
用いて血清アポC−■と免疫混濁反応させた時の吸光度
のタイムコースを示すグラフ、第2図は、MNHC−I
[1−10の試験抗体溶液を用いたときのアポc−mu
と吸光度の関係を示すグラフ、第3図は、MNHC−I
ll−9とMNHC−I[1−10を等量混合して調製
した試験抗体溶液を用いたときのアポC−[[量と吸光
度の関係を示すグラフ、第4図は、MNHC−III−
9とMNHC−III−10を等量混合して調製した試
験抗体溶液を用いて免疫比濁法を行った結果と5RID
法を用いて血清アポC−IIIを定量したときの結果の
相関関係を示すグラフである。 第2図
Claims (1)
- ヒトアポリポ蛋白C−IIIを特異的に認識し、かつサブ
クラスがIgG_1であるモノクローナル抗体の1種ま
たは2種を用いることを特徴とするヒトアポリポ蛋白C
−IIIの免疫比濁法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6330289A JPH02242158A (ja) | 1989-03-15 | 1989-03-15 | ヒトアポリポ蛋白c―3の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6330289A JPH02242158A (ja) | 1989-03-15 | 1989-03-15 | ヒトアポリポ蛋白c―3の測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02242158A true JPH02242158A (ja) | 1990-09-26 |
Family
ID=13225376
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6330289A Pending JPH02242158A (ja) | 1989-03-15 | 1989-03-15 | ヒトアポリポ蛋白c―3の測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02242158A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006214765A (ja) * | 2005-02-01 | 2006-08-17 | Bml Inc | ヒトApoA−V蛋白質に対する抗体、及び、当該抗体を用いたヒトApoA−V蛋白質定量測定系 |
JP2014516516A (ja) * | 2011-04-27 | 2014-07-17 | アイシス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッド | アポリポタンパク質ciii(apociii)発現の調節 |
CN106810606A (zh) * | 2015-11-27 | 2017-06-09 | 西藏自治区人民医院 | 一种载脂蛋白c-ⅲ抗原多肽及其多克隆抗体的制备与应用 |
CN106811443A (zh) * | 2015-11-27 | 2017-06-09 | 西藏自治区人民医院 | 载脂蛋白c-ⅲ单克隆抗体的制备及应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPS58191967A (ja) * | 1982-04-23 | 1983-11-09 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 体液中の低密度リポ蛋白質を測定する方法及び試薬 |
JPS63501037A (ja) * | 1985-09-27 | 1988-04-14 | フア−マシア・ア−・ベ− | リポタンパク質及びアポリポタンパク質の測定方法 |
JPS63237363A (ja) * | 1987-03-25 | 1988-10-03 | Hitachi Ltd | メタノ−ル燃料電池 |
-
1989
- 1989-03-15 JP JP6330289A patent/JPH02242158A/ja active Pending
Patent Citations (3)
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