JPH0264458A - 血清アポｂの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、血清アポＢの定量法、さらに詳しくは、認識
する抗原決定基が異なる血清アポＢに対するモノクロー
ナル抗体を２種類以上用いてヒト血清と抗原抗体反応さ
せ、そして生じる濁度を分光学的に測定することを特徴
とする血清アポＢの定量法に関する。

従来技術 血中のアポＢは、脂質の代謝・運搬に重要な役割を持つ
リポタンパクであるカイロミクロン、超低比重リポタン
パク（ＶＬＤＬ）、低比重リポタンパク（Ｌ　Ｄ　Ｌ）
を構成する主要タンパクであり、近年、高脂血症との関
係、特に動脈硬化症の促進因子として注目されているア
ポリポタンパクである。

従って、血中アポＢの測定は高脂血症の診断や治療の指
標として重要なものとなっている。

血中のアポＢを測定する方法としては、ウサギや山羊な
どの動物の抗アポＢポリクローナル抗体を用いたラジオ
イムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）、エンザイムイムノアノセ
イ（ＥＩＡ）、−元免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、エレクト
ロイムノアッセイ、免疫比濁法（Ｔ　ｌΔ）などが知ら
れており、５ＲＩＤのプレート試薬や自動分析装置で測
定できるＴＩＡ試薬が既に市販されている。しかし、こ
れらの試薬は動物で免疫して得たポリクローナル抗体を
用いているため、免疫動物の個体差から生じる力価や特
異性等の差により、一定した測定値を得ることが困難で
ある。

また、その測定においては、血清のアポＢ含量が高いた
め、適度な感度で測定するためには血清の希釈を必要と
し、５ＲＩＤやＴＩＡでは数倍から５０倍、ＥＩＡやＲ
［Ａでは１００倍から１０゜０００倍に希釈した試料を
用いなければならず、それが操作の煩雑さやバラツキの
原因ともなっている。

近年、ポリクローナル抗体のもつ欠点を改良すべく、特
異性が高く、かつ一定した測定値が得られるモノクロー
ナル抗体の開発が進められており、血清のｒｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ｒｇＭ　［特開昭６０−２３７３６３；ＪａｐＪ、
Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、、　　ｖｏｌ、１４．　　１８５
−１９１（１９８５）コやＣ反応性タンパク（ＣＲＰ）
（特開昭８２−１９２６６１）の測定においては、モノ
クローナル抗体を用いたＴＩＡ法が応用されている。こ
れらの被験物質の場合は、１つの抗原中に複数の同じ抗
原決定基を持つことから抗原抗体反応による濁度が生じ
易く、１種類のモノクローナル抗体でも濁度を生じ、モ
ノクローナル抗体の種類を調節することで適度な感度を
得ることができる。しかし、一般には、測定すべき抗原
には、ある特定の抗原決定基についてはそれが１つしか
存在していない場合が多く、その特定の抗原決定基に対
するモノクローナル抗体のみでは抗原抗体反応による濁
度は生じにくい。

従って、適度な濁度を得るためには、別種の抗原決定基
をそれぞれ認識する複数のモノクローナル抗体を組合わ
せて用いる必要があるが、ＴｌＡ法に適したモノクロー
ナル抗体を作製選択するのは困難であった。

アポＢにおいても、モノクローナル抗体の開発が行われ
、いくつか報告されている［特開昭６０１９３９２８、
特開昭６０−１９３９２７、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙＶＯｌ、３２１４８４−１４９０（１９８
６）］。しかし、その測定法は、煩雑な血清希釈を必要
とするＥＩＡあるいはＲＩＡ、または通常測定に４８時
間を要する５ＲＩＤによるものであり、日常検査法とし
ては問題があった。

発明の目的 このような状況下、本発明者等は、血清の希釈か不要で
、かつ短時間に精度良（、しかも常に一定した測定値が
得られる血清アポＢの測定法の開発を試み、本発明を完
成するに至った。

即ち、本発明は、血清の希釈を必要としない免疫比濁法
による血清アポＢの定量法であって、認識する抗原決定
基が異なる２種類以上の抗ヒトアポＢモノクローナル抗
体を用いて血清と抗原抗体反応をさせ、生ずる抗原抗体
複合物による濁度を分光学的に測定することを特徴とす
る血清アポＢの定量法を提供するものである。

発明の構成および効果 本発明方法においては、認識する抗原決定基が異なる２
種類以上の抗ヒトアポＢモノクローナル抗体を用いる。

このモノクローナル抗体は、以下のようにして製造する
ことができるｉ ｉ）ヒト血清または血漿から分離したＬＤＬを抗原とし
て動物を免疫し、 ｉｉ）該動物の抗体産生細胞と動物のミエローマ細胞と
を融合させ、アポＢに特異的に反応するモノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、 山）該ハイブリドーマを適当な条件下で培養し、該モノ
クローナル抗体を回収する。

工程ｉ）の動物の免疫は、ヒト血清または血漿から超遠
心でＬＤＬを分画し、生理食塩水に対して透析した後、
得られたＬＤＬ溶液を抗原として動物に没与し、一定期
間経過後さらに同一の抗原で動物を処理することによっ
て行うことができる。

通常、このＬＤＬ溶液はフロイントコンプリートアジュ
バントと混合して動物に投与する。

免疫する動物種としては、マウス、ラット等の動物が用
いられ得るが、中でもＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスか
特に好ましい。

工程ＩＩ）の細胞融合は、工程ｌ）で免疫された動物の
抗体産生細胞と動物のミニローマ細胞とを用い、常法に
よって行うことができる。

抗体産生細胞としては、上記Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマ
ウスの肺細胞が最も好ましいが、これ以外に、例えば、
マウスのリンパ節細胞や末梢リンパ球、ラットのリンパ
球も使用することができる。

ミエローマ細胞としては、マウスのミエローマ細胞ＦＯ
が好ましいが、その他の細胞も用いることができる。

細胞融合法としては、ポリエチレングリコール法、ＨＶ
Ｊ法、電気融合法などを挙げることがてきる。

また、得られたハイブリドーマの選択は、例えば、以下
のようにして行うことができる。即ち、ハイブリドーマ
を適当な培地で培養し、・その培養液を、あらかじめ調
製しておいたヒトＬＤＬ感作マイクロプレートに加えて
反応させ、次いで抗マウスＩｇＧヤギ抗体ホースラデイ
ツシュパーオキシダーゼ標識物と反応させ、そして発色
液を加えることによって目的の抗体を産生じているハイ
ブリドーマを選択すればよい。次いで、選択したハイブ
リドーマを限界希釈法によってクローニングする。

工程出）のモノクローナル抗体の回収は、例えば、工程
ｉｉ）で得られたハイブリドーマクローンを適当な動物
細胞培養用培地で培養し、その培養液から常法通り回収
することができる。また、回収した抗体を、硫酸アンモ
ニウム塩析、イオン交換クロマトグラフィー　アフィニ
ティクロマトグラフィー等で精製してもよい。

上記のように操作することによって、後記製造例におい
ては、８種類の抗アポＢモノクローナル抗体、ＭＮＨＢ
−４，７，８，１１，１３，１５，１７および２０か得
られた。この内、ＭＮＨＢｌｌとＭＮ）ＩＢ−１３の２
種抗体の組合せを除く他のすべての２種抗体の組合せ、
および３種以上の抗体の組合せで試験抗体液を調製する
と、ヒト血清アポＢとの反応で混濁を生じた。従って、
このＭＮＨＢ−１１とＭＮＨＢ−１３は同じ抗原決定基
を認識するものと考えられるが、この２種抗体とその他
の抗体、およびその他の抗体どうしは互いに異なった抗
原決定基を認識しうるものと考えられる。本発明方法で
は、ＭＮＨＢ−１１とＭＮＨＢ−１３の２種抗体の組合
せを除くその他の２種抗体の組合せ、および３種以上の
抗体の組合せを用いる。ＭＮＨＢ−７またはＭＮＨＢ−
１５と池の抗体を組合わせて用いるのが好ましい。さら
に好ましくは、ＭＮＨＢ〜７、ＭＮＨＢ−８、ＭＮＨＢ
−１１およびＭＮＨＢ−１５の４種抗体を組合せて用い
る。

本発明方法は、通常の免疫比濁法に従って実施すればよ
く、例えば、次のようにして実施することができる。抗
アポＢモノクローナル抗体２〜４種を適当な緩衝液で希
釈して試験抗体液を調製しく総抗体量は血清１μＱに対
して０．４〜１６０μ９、好ましくは１．６〜４０μ９
を用い、また各抗体の比は、２種抗体を用いるときは１
〜３：１〜３．３種抗体を用いるときは１〜６：１〜６
；１〜６．４種抗体を用いるときは１〜９：ｌ〜９．１
〜９：１〜９、好ましくは各抗体を等量ずつ用いる）、
この試験抗体液とヒト血清とを反応させることによって
生じる濁度を分光光度計で測定し、あらかじめ作成して
おいた検量線から血清アポＢ濃度を得ることができる。

本発明方法は、後記実施例に示すように、血清の希釈が
不要であり、そして極めて短時間に測定することが可能
なアポＢの定量法である。例えば、４種のモノクローナ
ル抗体を組合せて用いたときには、抗原抗体反応は約９
分でプラトーに達する。

さらに、本方法によれば、少なくとも約２３０ｘｙ／ｄ
（までの血清アポＢを精度よ（測定することができる。

以下に製造例および実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明するが、これらは本発明を限定するものではない
。

’Ａ　ｉＭ　Ｆｌ抗ヒトアポＢモノクローナル抗体の調
製 ■動物の免疫 ヒトＬＤＬの調製 健常人の血漿に臭化カリウムを加えてその比重を１．０
０６とし、これを遠心管（ベックマン社製、ウルトラク
リアー、１６ｘ７６ａｘ）に入れ、比重１．００６の臭
化カリウム溶液を重層した。これを、日立５５Ｐ−２超
遠心機（日立ＲＰ４Ｑローター）を用い、４０．ＯＯＯ
ｒｐｍ、１５°Ｃで２４時間遠心した。上層のカイロミ
クロン、ＶＬＤＬＬＤＬ画分除いた後、下層部分を集め
、臭化カリウムを加えて比重を１．０６３とした。これ
に比重１゜０６３の臭化カリウム溶液を重層した後、４
０゜０００ｒｐｍ、１５°Ｃで２４時間遠心し、上層の
ＬＤＬ画分を回収した。このＬＤＬ画分を３．００Ｏｘ
Ｑの生理食塩水に対して３回透析してＬＤＬ溶液を得た
。

免疫 アポＢ１００μ９に相当するＬＤＬ溶液とフロイントフ
ンプリートアジコバントとをに１（液量比）に混合し、
抗原乳剤を調製した。この抗原乳剤ＩｘＱをＢ　Ａ　Ｌ
　Ｂ　／　ｃマウス（雄、６週齢）の背部皮下に投与し
た（初回免疫）。初回免疫の１ケ月後に上記のＬＤＬ溶
液０．２５１１Ｑをさらに腹腔内投与した（追加免疫）
。

■細胞融合 肺細胞浮遊液の調製 追加免疫の３日後に肺臓を摘出し、ダルベツコ改変イー
グル培地（ギブコ社製；グルコース４，５００ｍｖ／ρ
、ベニシリア１００単位／ｌａ、ストレプトマイシン１
００μｇ／　ｘ（ｌ含有、ウシ胎児血清未添加；以下、
「基礎培地」という）中で肺臓から牌細胞を取り出した
。取り出した牌細胞は基礎培地に浮遊させ、細胞融合に
用いる時まで４℃で保存した。２．１１ｘｌＯ’個の牌
細胞が得られた。

ミエローマ細胞浮遊液の調製 ミエローマ細胞はＦＯを用いた。１０％０％ラン血清、
１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含む基礎培地（以下、「
基本培地」という）で培養したＦＯを基礎培地で２回洗
浄した後、基礎培地に浮遊させた。細胞密度は８ｘｌＯ
８個／Ｍａとした。

顛 上記肺細胞浮遊液に６．６ｍＱの上記ミエローマ細胞浮
遊液を混合し、１．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心した後、
上清を除去した。これに、３７°Ｃに保温した滅菌５０
％ポリエチレングリコール４０００溶ｉ（Ｎ　ｌ　ｘＱ
を撹拌しなから１分間で滴下した。１分間撹拌した後、
基礎培地２屑ρを撹拌しながら２分間で滴下した。さら
に、基礎培地８ｔｔｔ（ｌを撹拌しながら２分間で滴下
した。次に、１．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心して上清を
除去した後、１．０ｘｌＯ−’Ｍヒボキサンチン、４．
０ｘｌＯ−’Ｍアミ／プテリン、１．６ｘｌＯ−’Ｍチ
ミンンを含む基本培地（以下、ｒＨＡＴ培地」という）
５０．ｖｃを加え、融合細胞浮遊液を調製した。

■融合細胞の培養および抗体産生細胞のスクリニング 上記融合細胞浮遊液を５枚の培養用９６ウエルマイクロ
プレート（コースタ−社製）に蒔キ、３７００１５％二
酸化炭素のインキュベーター内で培養した。

ヒトＬＤＬ感作マイクロプレートを用い、ＥＩＡ法によ
って抗体産生細胞のスクリーニングを行った。

ヒトＬＤＬ感作マイクロプレートの作製ヒトＬＤＬを５
０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）で適宜希釈しく５０〜
２００倍）、ＥＩＡ用９６ウエルマイクロプレート（コ
ースタ−社製）に１ウエルあたり１００ｕＱずつ分注し
、１時間、３７°Ｃで加温した。次いで、２５ｍＭ！Ｊ
ン酸緩衝生理食塩水液（ｐＨ７，３；ツイーン２０を０
１％含む；以下、「リン酸緩衝液」という）で洗浄した
後、３％ウシ血清アルブミン溶液（リン酸緩衝液で調製
）２００μＱを分注し、１時間、３７°Ｃで加温した。

このようにして得たヒトＬＤＬ感作マイクロプレートを
使用時まで４°Ｃで保存した。

ＥＩＡ法 細胞が増殖しているウェルの培養上清１００μぐをヒト
ＬＤＬ感作マイクロプレートに分注し、１時間、３７°
Ｃで加温した。リン酸緩衝液で洗浄した後、抗マウスｒ
ｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギ抗体ホースラディノンユバーオ亭シ
ダーゼ漂識物（バイオラッド社製；３％ウシ血清アルブ
ミン溶液で５００倍希釈）１００μＱを分注し、１時間
、３７°Ｃで加温した。リン酸緩衝液で洗浄し、発色液
（０−フェニレンジアミン２０巧、過酸化水素１０μＱ
、クエン酸５２５η、リン酸二ナトリウム・１２水和物
１．７９ｇ、精製水５０ｄ）　１００μ（ｌを加え、室
温で約２０分間酵素反応させた後、２Ｎ硫酸５０μ夕を
加えて反応を停止させた。

■抗体産生細胞のクローニングおよび抗体の特異性 限界希釈法によるクローニング 抗体陽性ウェルの細胞（ハイブリドーマ）を２４ウエル
マイクロプレート（コースタ−社製）に移シ、ＨＡＴ培
地で３〜５日間培養した。この培養液を撹拌して細胞浮
遊液とし、その一部をトリパンフルー染色液（ギブコ社
製）で染色し、細胞数を計測した。次いで、細胞密度が
１０〜２５個／酎となる耐うに細胞浮遊液をＨＡＴ培地
で希釈した。この細胞希釈液を、あらかじめフィーダー
細胞（マウス胸腺細胞）１００μＱを分注した９６ウエ
ルマイクロプレートに２００μρずつ蒔き、３７°Ｃ１
５％二酸化炭素のインキュベーター内で培養した。

このクローニングを２回行った。

このクローニングの結果、抗ヒトアポＢモノクローナル
抗体を産生ずるハイプリドーマ株が８種類得られた。こ
の８種類の抗体産生ハイプリドーマ株を、ＮＨＢ−４、
ＮＨＢ−７、ＮＨＢ−８、ＮＨＢ−１１、ＮＨＢ−１３
、ＮＨＢ−１５、ＮＨＢ１７およびＮＨＢ−２０と命名
し、これらの株が産生ずる抗体をそれぞれ、ＭＮＨＢ−
４、Ｍ　Ｎ　ＨＢ−７、ＭＮＨＢ−８、ＭＨＩ（Ｂ−１
１、ＭＮＩ（Ｂ１３、ＭＮＨＢ−１５、ＭＮＨＢ−１７
およびＭＮＨＢ−２０と命名した。

上記８種の抗体産生ハイプリドーマ株の内の４種、ＮＨ
Ｂ−７、ＮＨＢ−８、ＮＨＢ−１１およびＮ　［（Ｂ　
−１５は、それぞれ微工研菌寄第１０２４２号（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−１０２４２）、第１０２４３号（ＦＥＲＭ　Ｐ
−１０２４３）、第１０２４４号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０
２４４）および第１０２４５号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０２
４５）として寄託されている。

抗体の特異性 抗体の特異性をウェスタンブロッティングで確かめたと
ころアポＢにのみ反応した。８種のハイプリドーマ株が
産生ずる抗体のクラスをマウスモノクローナル抗体タイ
ピングキット（＋ＣＮ社ラフ）で調べたところ、ＭＮＨ
Ｂ−８はｌ　ｇＧ　ｔｂ、池の７種抗体はいずれも１ｇ
Ｇ、クラスに属することがわかった。

抗体産生細胞の凍結保存 クローニングを２回行った後の抗体陽性ウェルの細胞を
２４ウエルマイクロフツートに移し、１．０ｘｌＯ−’
Ｍヒポキサンチア、１．６Ｘ１０−５Ｍチミジンを含む
基本培地（以下、ｒＨＴ培地」という）で培養した。次
いで、約１週間かけて培地を除々に）（Ｔ培地から基本
培地に変換した。細胞を基本培地で培養した後、細胞を
回収し、細胞密度か１０５〜１０６個／Ｕ＆となるよう
に１０％ジメチルスルホキシドを含むラン胎児血清に浮
遊させ、２ｆｆＣのセラムチューブ（コーニング社製）
に１ｍＱずつ分注した。このセラムチューブを脱脂綿で
包み、−７５°Ｃの冷凍庫内に一夜放置して内容物を凍
結させた後、液体窒素保管容器に移して保存した。

■抗アポＢモノクローナル抗体の精製 凍結保存の抗体産生細胞株を基本培地で前培養した後、
ＡＳＦ培地１０３（動物細胞培養用無血清培地；味の素
社製）１５０＋Ｃで約１週間培養した。５０％飽和とな
るように培養上清に硫酸アンモニウムを加え、４°Ｃで
一夜塩折した。７，００Ｑ　ｒｐｍで３０分間遠心し、
その沈澱物を２０　ｍＭ　’）ン酸緩衝生理食塩水液（
ｐＨ７、’２　）に溶解し、同緩衝液に対して透析した
。このようにして得られた粗精製抗体液と、３ＭＮａＣ
Ｑを含む１．５Ｍグリ／７−Ｎ　ａｏ　ｌ（暖？Ｊｉ液
（ｐＨ９、Ｏ；以下、「結合用緩衝液」という）を等量
混合し、結合用緩衝液で平衡化した固定化「プロティン
Ａ　（ＲｅｐｌｉＧｅｒｌｆ製）カラムにかけた。ヘッ
ドボリュームの１５倍容量の結合用緩衝液てカラムを洗
浄した後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３，０）で溶
出した。この溶出液をｌ　Ｍ　トリス州ｃ（！緩衝液（
ｐＨ９，０）で直ちに中和した。限外濾過で濃縮した後
、２０ｍＭリン酸緩ｉ＋１生理食塩水液（ｐｔ４７．２
）に対して透析した。Ｉｇ（ＪＪ度をマウスＩｇＧＲＩ
Ｄフッート（セロチック社製）で測定した。各モノクロ
ーナル抗体の回収量を第１表に示す。

第１表モノクローナル抗体回収量 尤旌男抗アポＢモノクローナル抗体を用いる免疫比濁法 ■混濁反応のタイムコース 上記８種のモノクローナル抗体を単独で、または２〜４
種組合わせて用い、ヒト血清と反応させて、反応液か混
濁するか否か、および混濁反応のタイムコースを調へた
。２種の抗体を用いるときはすべての組合わせについて
、３種または４種の抗体を用いるときはＭＮＨＢ−７、
ＭＮＨＢ−８、ＭＮＨＢ−１１およびＭＮＨＢ−１５を
中心に試験した。

ＰＥＧ緩衝ｉ＆（１５％ポリエチレングリコール６００
０．１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ’ノン酸緩衝
液、ｐＨ７，２）をキュベツトに０．５１Ｙｒ２ずつ分
注し、これに製造例の■で得た精製抗体４０μ７（抗体
を２種類用いるときは各２０μ９．３種類用いるときは
各１３．３μ９．４種類用いるときは各１０μ９）およ
び１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液を加えて液量をｌ　、
　５１１（ｌとした。このキュヘットを３７°Ｃ恒昌装
置付きの分光光度計（島津ＵＶ−１６Ｏ）にセントし、
約１０分間プレインキユベーンヨンした。次いて、ヒト
血清（Ｓ　ＲＩ　Ｄｆｉで測定したときのアポＢ濃度は
２２２　ｍ９／ｄ０’）を５μσずつ加えて転倒混和し
、波長３４０ｎｍの吸光度を３７°Ｃで２分ごとに３０
分まで、または１分ごとに１９分まで測定した。尚、検
体ブランクはＰＥＧ緩？ｊｉ　液と１５０ｍＭ塩化ナト
リウム溶液をｌ：２の割合てｌ見合して用いた。

結果を第１図、第２図および第３図に示すか、［腫類の
抗体だけを使用した場合はほとんど混濁反応を起こさな
かった。しかし、抗体を２種類組合せて使用するとＭＮ
ＨＢ−１１とＭＮＨＢ−１３との組合せを除（すべての
組合せで混濁反応が起こり、特にＭＮＨＢ−７と他の抗
体を組合せたとき、およびＭＮＨＢｉ５と池の抗体を組
合せたときに大きな濁度を生じた。抗体を２種類組合せ
て使用した場合、ｆ１１蜀反応かプラトーに達するのに
は３０分以上の時間を要したが、３種類あるいは４種類
組合せて使用した場合には、プラトーに達する時間が１
９分あるいは９〜１３分と速くなる組合せかあった。４
種のモノクローナル抗体、ＭＮ）（Ｂ−７、ＭＮＴ（Ｂ
−８、ＭＮＨＢ−１１およびＭＮＨＢ−１５を組合せて
使用したときが最も速く、約９分て反応はプラトーに達
した。

■アポＢｆｉｔと吸光度との関係 ２〜４種のモノクローナル抗体を組合わせて用い、アポ
Ｂ量と吸光度との関係を調べた。

製造例の■で得た精製抗体、１５０ｍＭ塩化ナトリウム
／８液およびＰＥＧ緩衝液を混合し、総抗体濃度か２６
．７ＡＩ９／ｍρとなるように、モしてボｊエチレング
リコール６０００濃度か５％となるように試験抗体液を
調製した。精製モノクローナル抗体を２種類用いるとき
はＭＮＨＢ−７およびＭＮＨＢ−３を、３種類用いると
きはＭ、ＮＨＢ−７、Ｍ　Ｎ　ＨＢ　−３およびＭＮＨ
Ｂ−１５を、４種類用いるときはＭＮＨＢ−７、ＭＮＩ
（Ｂ−８、ＭＮＨＢｌｌおよびＭＮＨＢ−１５を使用し
た。各抗体はそれぞれ等量ずつ用いた。

ヒトプール血清（ＳＲＩＤ法で測定したアポＢ濃度は７
５ｍｇ／ｄのを試験管に２．５．５．１０および１５μ
ρサンブリン−グし、これに試験抗体液を１．５１ずつ
加え、３７°Ｃで３０分間反応させた後、波長３４０ｎ
ｍの吸光度を測定した。尚、検体フランクはＰＥＧ緩衝
液と１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液を１：２の割合に混
合した溶液を用いて測定した。

結果を第４図に示すか、検体量を５μρとし、試験抗体
液を１．５１ＮＱ、とじた測定系では少なくともアポＢ
ｔ農度約２３０　肩？／ｄ１２までは測定可能であった
。

また、１０分間測定法についても試験した。製造例の■
で得た精製抗体Ｍ　Ｎ　ＨＢ　−７、Ｍ　Ｎ　ＨＢ８、
ＭＮＨＢ−１１およびＭＮＨＢ−１５を等全混合し、さ
らにそれに１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよびＰＥＧ緩衝
液を混合し、総抗体濃度が２４０μ９／村となるように
、そしてポリエチレングリコール６０００濃度か５％と
なるように抗体液を調製した。ヒト血清（４段階希釈）
９μＱ１およびＰＥＧ緩衝液と１５０ｍＭ塩化ナトリウ
ムを１：２で混合した溶液９００μＱをキュベツトに入
れ、転倒混和した後、前記３７°Ｃ恒温装置付き分光光
度計にセ、トシ、５分間加温した後、検体ブランクとな
る波長３４０ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。次いで、
直ちに上記抗体液１５０ＡＩＱをこのキュベツトに加え
、転倒混和し、３７°Ｃでさらに５分間加温した後、波
長３４０ｎｍの吸光度（Ｂ）を測定した。

抗原抗体反応により生じた濁度は、吸光度（Ｂ）吸光度
（Ａ）ｘ９０９／１０５９で求めた。その結果、生じた
濁度は検体量に比例し、原点を通る直線が得られた。

■５ＲＩＤ法との比較 本方法および５ＲＩＤ法（アポＢプレート「第一」、第
一化学薬品社製）を用いて、ヒト血清５検体のアポＢ濃
度を測定し、両方法による３則定値を比較した。

本方法による測定は次のようにして行った。ヒト血清を
試験管に５μρずつサンプリングし、これに上記■で調
製した４種抗体（ＭＮＨＢ−７，８，１１および１５）
を用いる試験抗体液を１．Ｆｌｉずつ加え、３７°Ｃで
３０分間反応させた後、波長３４０ｎｍの吸光度を測定
した。尚、検体ブランクはＰＥＧ緩衝液と１５０ｍＭ塩
化ナトリウム溶液を１２の割合に混合した溶液を用いて
測定した。

標準血清としては上記ヒトブール血清（７５ｍ９／ｄの
を用い、検体と同様の操作を行って１測定した。

血清アポＢ値（ｍｙ／ｄのは、７５Ｘ（検体吸光度検体
ブランク吸光度）／（標準血清吸光度−標準血清ブラン
ク吸光度）で求めた。

結果を第２表に示すが、両方法による測定値はほぼ同等
であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は１種または２種のモノクローナル抗体を用いて
、第２図は３種のモノクローナル抗体を用いて、第３図
は４種のモノクローナル抗体を用いて、血清アポＢを測
定したときのタイムコースをそれぞれ示すグラフであり
、第４図は本方法によって血清アポＢを測定したときの
アポＢ量と吸光度の関係を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、認識する抗原決定基が異なる２種類以上の抗アポＢ
   モノクローナル抗体を用いることを特徴とする免疫比濁
   法による血清アポＢの定量法。