JPH11344493A

JPH11344493A - 免疫的測定法

Info

Publication number: JPH11344493A
Application number: JP15585398A
Authority: JP
Inventors: Mitsuaki Yamamoto; 光章山本; Sachiko Odawara; 祥子小田原
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 1998-03-30
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 1999-12-14
Anticipated expiration: 2018-06-04
Also published as: JP3920458B2

Abstract

(57)【要約】【解決手段】測定対象となる抗原又は抗体を含有する
試料に当該測定対象に対する抗体又は抗原を担持させた
不溶性担体粒子を添加し、抗原抗体反応による免疫複合
体の形成の程度を測定する免疫的測定法であって非特異
反応が測定結果に影響を与えない程度に少ないものにお
いて、グアニジン、グアニジン塩又はその誘導体を反応
系中に共存させる免疫的測定法。【効果】高感度なあるいは測定範囲の広い凝集イムノ
アッセイが可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検試料中の抗原
又は抗体の測定法に関し、更に詳しくは、高感度化した
又は測定範囲を拡大した免疫的測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、抗原抗体反応に基づく免疫的測定
法には、凝集反応を利用するものや、検出用の酵素で標
識した抗体を利用するものなどが知られている。これら
の免疫的測定法においては、特異的な抗原抗体反応によ
り生ずる免疫複合体の量を目視によりあるいは光学的な
変化として測定している。特に測定対象の抗原（又は抗
体）と、不溶性担体に測定対象に対応する抗体（又は抗
原）を担持させた不溶化粒子（以下、「固定化粒子」と
略す）との抗原抗体反応に基づく凝集反応あるいは凝集
阻止反応を利用した被検試料中の抗原（又は抗体）測定
法（以下、「凝集法」と略）は、測定の自動化が可能な
ことから自動分析装置を利用して広く普及している。

【０００３】従来行われている凝集法の多くは、ラテッ
クス粒子にポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を
感作した固定化粒子を被検試料中の目的抗原と反応させ
て免疫凝集体を形成させ、その凝集の程度を測定するも
のであるが、これらの凝集法においては、測定可能な濃
度域が一定濃度範囲に限定される。そこで、従来、低濃
度域から高濃度域までの広範囲な測定範囲を獲得するた
めに、免疫凝集体の形成を反映する光学的な変化あるい
は変化量を制御する試みが考え出されている。このよう
な試みとしては、例えば、測定系の濃度に応じて、(1)
粒子径を小さくしたり大きくしたりすることで、同一測
定対象量に対応する光学的な変化速度を元来の粒子径に
比べて相対的に小さくしたり大きくしたりする方法、
(2) 一回の測定に使用する固定化粒子の量を単純に増減
する方法、(3) ２つの異なる量の抗体を担持させた２種
の粒子径の異なるラテックス粒子を用いる方法（特開昭
55-15126号公報）、(4) 固定化粒子と遊離の抗体を競合
的に抗原と反応させることにより高濃度域での測定範囲
拡大を意図した方法（特開昭59-92353号公報）などが知
られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
従来の方法には以下のような欠点がある。つまり、(1)
の不溶性担体の粒子を変える方法では、一般に測定でき
る範囲は粒子径により制限されてしまう。(2)の固定化
粒子の使用量を変える方法では、固定化粒子の使用量と
免疫凝集体による光学的な変化量の関係は一次的に変化
しないこともあり、低値域での精度や高値域での測定範
囲が元来のものより劣る可能性がある。(3)の方法は(1)
及び(2)の方法の改良法として開発されたものである
が、試薬を調製する毎に、抗体の量と粒子径の異なる不
溶性担体をそれぞれ組み合わせる煩雑さを伴う。(4)の
方法では２つの特異抗体を準備しなければならないこと
や低値域での光学的変化量の減少による精度低下などの
問題がある。

【０００５】従って、本発明は、上記のような欠点を伴
わずに、測定対象と固定化粒子との反応による凝集を利
用した免疫的測定法における測定範囲を拡大することを
目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】かかる実情において本発
明者らは鋭意研究を重ねた結果、従来、凝集法において
非特異反応を消去する目的で使用されていたグアニジン
類（特開昭56-2556号公報，特開昭56-158947号公報）
を、非特異反応が実質的に起こらない系において使用す
ると、全く意外にも、測定可能な範囲が拡大しあるいは
測定感度が高まることを見出し、本発明を完成するに至
った。

【０００７】すなわち、本発明は、測定対象となる抗原
又は抗体を含有する試料に当該測定対象に対する抗体又
は抗原を担持させた不溶性担体粒子を添加し、抗原抗体
反応による免疫複合体の形成の程度を測定する免疫的測
定法であって非特異反応が測定結果に影響を与えない程
度に少ないものにおいて、グアニジン、グアニジン塩又
はその誘導体を反応系中に共存させることを特徴とする
免疫的測定法を提供するものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】前述した従来法は、不溶性担体の
大きさや使用濃度を変えて物理的に光学的な変化速度を
制御しようとしたり、競合反応により免疫反応を制御し
ようとするものであり、不溶性担体の大きさや使用濃度
を変更せず、かつ抗原抗体反応を行う物質を使用しない
本発明とはその原理が全く異なるものである。

【０００９】ところで、免疫凝集反応において、試料由
来成分による非特異的凝集を回避するために、試薬中に
塩酸グアニジン、ヨウ化塩、チオシアン酸等の化合物を
共存させる方法が知られている（特開昭56-2556号公
報，特開昭56-158947号公報）。しかし、これらは試料
中の血液由来の成分による非特異凝集の回避のみを目的
とするものであり、これら化合物の存在に関係なく特異
的な抗原抗体反応が観察される抗原抗体反応、すなわち
非特異反応が測定結果に影響を与えない抗原抗体反応の
みをその対象とし、この系にグアニジン類を添加するこ
とにより、高感度なあるいは広範囲な測定を可能にする
本発明とは、化合物の共存により奏される作用効果が全
く異なる。

【００１０】本発明において、「非特異反応が測定結果
に影響を与えない程度に少ない」とは、例えば、従来非
特異反応の回避に用いられていた化合物（塩酸グアニジ
ン、ヨウ化塩、チオシアン酸塩、尿素等）の存在しない
条件と存在する条件において導き出された測定値の相関
関数が0.7以上、あるいは、化合物が存在していない条
件での測定値と存在している条件での測定値の比が0.7
〜1.3以内の一致性を示すような場合をいう。

【００１１】本発明に使用されるグアニジン塩として
は、グアニジン塩酸塩、グアニジン炭酸塩、グアニジン
チオシアン酸塩、グアニジン硫酸塩、グアニジン硝酸
塩、グアニジンリン酸塩、グアニジンスルファミン酸塩
等が挙げられ、グアニジン誘導体としては、グアニジノ
安息香酸、グアニジノグルタル酸、グアニジノコハク
酸、グアニジノ酢酸、グアニジノプロピオン酸、グアニ
ジノベンズイミダゾール等が挙げられる。測定系中にお
けるこれらの物質の濃度は特に制限されるものではない
が、１Ｍ以下、特に0.001〜１Ｍが好ましい。

【００１２】本発明におけるグアニジン類の作用機序は
明らかではないが、測定系中の抗原又は抗体と反応しな
いことから、免疫複合体の形成速度に影響を与えている
ものと考えられる。

【００１３】本発明に使用される不溶性担体としては、
従来固定化粒子を用いて抗原又は抗体を測定する場合に
使用される公知の物質はいずれも制限なく使用でき、例
えば有機高分子物質、無機物質、細胞膜、血球、微生物
など挙げられる。

【００１４】有機高分子物質としては、例えばアクリル
酸重合体、スチレン重合体、メタクリル酸重合体等の微
粉末を均一に懸濁させたラテックス粒子が好ましい。無
機物質としては、シリカ、アルミナ等の微粒子が挙げら
れる。また不溶性担体の形状も特に限定されるものでは
なく、平均粒子径は0.02〜1.6μｍ、特に0.03〜1.2μｍ
が好ましい。

【００１５】不溶性担体への抗体又は抗原の固定化法に
ついても、物理吸着、共有結合、免疫的結合等、通常の
固定化法を用いることができる。免疫複合体の形成速度
に影響を与える物質及び固定化粒子を溶解及び懸濁する
液としては、特に制限はないが、一般には、リン酸緩衝
液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッドの緩衝液等
の緩衝液が使用でき、必要に応じて塩化ナトリウム等の
添加剤を加えることもできる。反応におけるpHは５〜10
が好ましく、より好ましくは６〜９である。最終的に調
製される試薬中における固定化粒子の濃度は特に制限さ
れるものではないが、懸濁液中0.1〜10mg/mlが好まし
い。

【００１６】本発明において使用される抗体は、モノク
ローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれでもよ
い。また抗体は、単独で使用しても複数種混合して使用
してもよい。

【００１７】本発明における測定対象物質は、特に制限
されず、抗原抗体反応を利用して測定されるものであれ
ばいずれも本発明を適用することができる。

【００１８】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００１９】実施例１ (1) 抗CRP抗体の調製精製ヒトCRP（ケミコン社製）の100μｇを１回の免疫に
使用した。初回免疫はフロインドの完全アジュバンド
を、追加免疫には不完全アジュバンドを使用した。１回
の免疫には、CRPとフロインドのアジュバンドを等量混
合して調製したエマルジョン200μｌを用い、これをBAL
B/cマウスの腹腔に注射した。免疫は２週間間隔で４回
繰り返した。

【００２０】マウス眼底静脈より採取した血液中の抗体
価をELISA法にて測定し、抗体価の高いマウスを選んで
細胞融合に供した。４回目の免疫から２週間後にCRP 10
0μｇを生理食塩液200μｌに溶解したものをマウス腹腔
に注射し、３日後に脾臓を摘出した。脾臓をRPMI1640培
地中でほぐした後、1500rpm で遠心分離して集め、脾細
胞を回収した。同培地で洗浄後、15％牛胎児血清を含む
RPMI1640培地２mlを加え細胞懸濁液とした。10⁸個の脾
細胞とミエローマ細胞SP2/O-AG14の10⁷個を混合した
後、1500rpm の遠心分離で沈殿部を集め、GKN液（塩化
ナトリウム８ｇ、塩化カリウム0.4ｇ、グルコース２
ｇ、リン酸水素二ナトリウム1.41ｇ及びリン酸二水素ナ
トリウム二水和物0.78ｇを精製水に溶かして１リットル
としたもの）に懸濁し、遠心分離により洗浄後、沈殿部
を回収した。これを15％牛胎児血清を含むRPMI1640培地
30mlに入れ、HAT培地及びフィーダー細胞を96穴マイク
ロプレート３枚の１ウエルあたり200μｌ入れた中に、1
00μｌずつ分注して37℃にて５％炭酸ガス培養器中で培
養した。

【００２１】培養上清中の抗CRP抗体の存在は、CRPを固
相化したELISA法で評価した。10日後にすべてのウエル
で融合細胞の増殖を確認した。詳細には、10μｇ/mlでC
RPを含有する150mM塩化ナトリウムを含む10mMリン酸緩
衝液（pH7.2；以下、PBSと略す）100μｌを96穴マイク
ロプレートに分注し４℃で１晩放置した。放置後これを
捨て、次に0.05％Tween20及び１％牛血清アルブミンを
含むPBS300μｌで３回洗浄した後、培養上清各50μｌを
加え室温で１時間放置した。0.05％Tween20を含むPBSで
３回洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体（第
一化学薬品製）を50μｌ加え室温で１時間放置した。こ
れを0.5％Tween20を含むPBSで３回洗浄後、0.2％オルト
フェニレンジアミン及び0.02％過酸化水素を含むクエン
酸緩衝液（pH５）50μｌを加え、室温で15分間放置後、
4.5Ｎ硫酸50μｌを加えて反応を停止させ、波長492nmに
おける吸光度を測定し、吸光度の高いウエルを選択し
た。

【００２２】単クローン化は限界希釈法で行った。すな
わちフィーダー細胞としてBALB/cマウスの胸腺細胞を10
⁶個ずつ分注した96穴マイクロプレートに陽性ウエル中
のハイブリドーマを10個／mlとなるように希釈したもの
を0.1mlずつ分注した。培地は初回はHT培地を、２回目
以降は15％牛胎児血清を含むRPMI1640を用い、37℃にて
５％炭酸ガス培容器中で10日間培養した。ELISA法によ
る陽性ウエルの選択及び限界希釈法による単クローン化
操作を各３回繰り返して抗CRPモノクローナル抗体産生
細胞（ハイブリドーマ08204；工業技術院生命工学工業
技術研究所にFERM P-16765として寄託した）を得た。本
細胞の約10⁵個をプリスタン前処理したマウス腹腔に投
与し、生成した腹水を採取した。遠心分離により不溶物
を除去後、等量の飽和硫安液を加え、撹拌しながら１晩
放置後、遠心分離で沈殿を回収した。沈殿を20mMトリス
緩衝液（pH８）に溶解し、透析した。同緩衝液で平衡化
したDEAE−セファロースカラムに透析内容物を吸着させ
た後、同緩衝液中の塩化ナトリウム０〜0.3Ｍの濃度勾
配で溶出させ、IgG画分を0.05Ｍグリシン緩衝液で透析
し、精製抗体を得た。

【００２３】単独種類の使用により免疫凝集を生じさせ
るモノクローナル抗体（以下「抗CRPモノクローナル抗
体」と称する。）は次のようにして選択した。精製抗体
を1.4mg/mlの濃度で0.05Ｍグリシン緩衝液（pH８）に混
和した液５mlに、平均粒径0.1μｍのポリスチレン系ラ
テックス（積水化学工業社製）５％懸濁液５mlを加え、
摂氏４度にて２時間撹拌した。遠心分離により上清を除
去した後、沈殿部に２％牛血清アルブミンを含む0.05Ｍ
グリシン緩衝液（pH８）を加え、摂氏４度で一晩撹拌し
た。遠心分離により沈殿部を集めた後、これを２％牛血
清アルブミンを含む0.05Ｍトリス緩衝液（pH7.5）で波
長600nmにおける吸光度が２ODとなるように懸濁し、各
抗CRP抗体固定化粒子懸濁液を調製した。0.2Ｍ塩化ナト
リウムを含む0.02Mトリス緩衝液（pH8.5）150μｌに、C
RPを含有する試料液２μｌを加え、摂氏37度で５分間加
温後、抗CRP抗体固定化粒子懸濁液50μｌを加えて撹拌
後１〜５分の波長600nmにおける吸光度変化量を測定
し、吸光度変化のある抗体を選択した。

【００２４】(2) 抗CRP抗体固定化粒子懸濁液の調製抗CRPモノクローナル抗体を1.4mg/mlの濃度で0.05Ｍグ
リシン緩衝液（pH８）に混和した液５mlに平均粒径0.1
μｍのポリスチレン系ラテックス（積水化学工業社製）
５％懸濁液５mlを加え、摂氏４度にて２時間撹拌した。
遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に２％牛血清
アルブミンを含む0.05Ｍグリシン緩衝液（pH８）を加
え、摂氏４度で一晩撹拌した。遠心分離により沈殿部を
集めた後、これを２％牛血清アルブミンを含む0.05Ｍト
リス緩衝液（pH7.5）で波長600nmにおける吸光度が２OD
となるように懸濁し、抗CRP抗体固定化粒子懸濁液を調
製した。

【００２５】(3) グアニジン塩酸塩溶液の調製グアニジン塩酸塩（キシダ化学社製）を0.1〜１Ｍの濃
度で0.2Ｍ塩化ナトリウムを含む0.02Ｍトリス緩衝液（p
H8.5）に混和し、グアニジン塩酸塩溶液を調製した。

【００２６】(4) CRPの測定グアニジン塩酸塩溶液150μｌに、CRPを含有する試料液
２μｌを加え、摂氏37度で５分間加温後、抗CRP抗体固
定化粒子懸濁液50μｌを加えて撹拌後１〜５分の波長60
0nmにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度
とCRP濃度の関係を図１に示す。

【００２７】比較例１グアニジン塩酸塩溶液に代えて0.2Ｍ塩化ナトリウムを
含む0.02Ｍトリス緩衝液（pH8.5）を150μｌ使用し、実
施例１の(4)と同様にCRPの測定を実施し、得られた吸光
度とCRP濃度の関係を図１に示す。

【００２８】実施例２ (1) 抗Lp(a)抗体固定化粒子懸濁液の調製精製ヒトapo(a)を免疫源として、定法によりマウスから
得られた、単独種類の使用により免疫凝集を生じさせる
モノクローナル抗体（工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されたハイブリドーマ28205（FERM BP-3755）
により生産されるもの。以下「抗Lp(a)モノクローナル
抗体」と称する。〕を1.4mg/mlの濃度で0.05Ｍグリシン
緩衝液（pH９）に混和した液５mlに平均粒径0.1μｍの
ポリスチレン系ラテックス（積水化学工業社製）５％懸
濁液５mlを加え、摂氏４度にて２時間撹拌した。遠心分
離により上清を除去した後、沈殿部に２％牛血清アルブ
ミンを含む0.05Ｍグリシン緩衝液（pH９）を加え、摂氏
４度で一晩撹拌した。遠心分離により沈殿部を集め、こ
れを２％牛血清アルブミンを含む0.05Ｍグリシン緩衝液
（pH９）で波長600nmにおける吸光度が２ODとなるよう
に懸濁し、抗Lp(a)抗体固定化粒子懸濁液を調製した。

【００２９】(2) グアニジン塩酸塩溶液の調製グアニジン塩酸塩（キシダ化学社製）を0.1〜１Ｍの濃
度で0.2Ｍ塩化ナトリウムを含む0.05Ｍグリシン緩衝液
（pH９）に混和し、グアニジン塩酸塩溶液を調製した。

【００３０】(3) Lp(a)の測定グアニジン塩酸塩溶液240μｌに、Lp(a)を含有する試料
液４μｌを加え、摂氏37度で５分間加温後、抗Lp(a)抗
体固定化粒子懸濁液80μｌを加えて撹拌後１〜５分の波
長600nmにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸
光度とLp(a)濃度の関係を図２に示した。

【００３１】比較例２グアニジン塩酸塩溶液に代えて0.2Ｍ塩化ナトリウムを
含む0.05Ｍグリシン緩衝液（pH９）を240μｌ使用し、
実施例２の(3)と同様にLp(a)の測定を実施し、得られた
吸光度とLp(a)濃度の関係を図２に示した。

【００３２】実施例３ (1) 抗ミオグロビン抗体固定化粒子懸濁液の調製抗ミオグロビン−ウサギ抗体（オリエンタル酵母工業社
製）を1.4mg/mlの濃度で0.05Ｍグリシン緩衝液（pH８）
に混和した液５mlに平均粒径0.2μｍのポリスチレン系
ラテックス（積水化学工業社製）５％懸濁液５mlを加
え、摂氏４度にて２時間撹拌した。遠心分離により上清
を除去した後、沈殿部に２％牛血清アルブミンを含む0.
05Ｍグリシン緩衝液（pH８）を加え、摂氏４度で一晩撹
拌した。遠心分離により沈殿部を集め、これを２％牛血
清アルブミンを含む0.05Ｍトリス緩衝液（pH7.5）で波
長600nmにおける吸光度が２ODとなるように懸濁し、抗
ミオグロビン抗体固定化粒子懸濁液を調製した。

【００３３】(2) グアニジン塩酸塩溶液の調製グアニジン塩酸塩（キシダ化学社製）を250mMの濃度で
0.15Ｍ塩化ナトリウムを含む0.05Ｍトリス緩衝液（pH7.
5）に混和しグアニジン塩酸塩溶液を調製した。

【００３４】(3) ミオグロビンの測定グアニジン塩酸塩溶液150μｌに、ミオグロビンを含有
する試料液２μｌを加え、摂氏37度で５分間加温後、抗
ミオグロビン抗体固定化粒子懸濁液50μｌを加えて撹拌
後１〜５分の波長600nmにおける吸光度変化量を測定し
た。得られた吸光度とミオグロビン濃度の関係を図３に
示した。

【００３５】比較例３グアニジン塩酸塩溶液に代えて0.15Ｍ塩化ナトリウムを
含む0.05Ｍトリス緩衝液（pH7.5）を150μｌ使用し、実
施例３の(3)と同様にミオグロビンの測定を実施し、得
られた吸光度とミオグロビン濃度の関係を図３に示し
た。

【００３６】実施例４ (1) 抗CRP抗体固定化粒子懸濁液の調製実施例１と同様に抗CRP抗体固定化粒子懸濁液を調製し
た。

【００３７】(2) グアニジン塩溶液の調製グアニジン炭酸塩（シグマ社製）を0.05〜0.25Ｍの濃度
で0.2Ｍ塩化ナトリウムを含む0.02Ｍトリス緩衝液（pH
8.5）に混和しグアニジン炭酸塩溶液を調製した。

【００３８】(3) CRPの測定グアニジン炭酸塩溶液150μｌに、CRPを含有する試料液
２μｌを加え、摂氏37度で５分間加温後、抗CRP抗体固
定化粒子懸濁液50μｌを加えて撹拌後１〜５分の波長60
0nmにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度
とCRP濃度の関係を図４に示した。

【００３９】比較例４グアニジン炭酸塩溶液に代えて0.2Ｍ塩化ナトリウムを
含む0.02Ｍトリス緩衝液（pH8.5）を150μｌ使用し、実
施例４の(3)と同様にCRPの測定を実施し、得られた吸光
度とCRP濃度の関係を図４に示した。

【００４０】実施例５ (1) 抗CRP抗体固定化粒子懸濁液の調製実施例１と同様に抗CRP抗体固定化粒子懸濁液を調製し
た。

【００４１】(2) グアニジン塩溶液の調製グアニジン・チオシアン酸塩（シグマ社製）を0.05〜0.
25Ｍの濃度で0.2Ｍ塩化ナトリウムを含む0.02Ｍトリス
緩衝液（pH8.5）に混和しグアニジン・チオシアン酸塩
溶液を調製した。

【００４２】(3) CRPの測定グアニジン・チオシアン酸塩溶液150μｌに、CRPを含有
する試料液２μｌを加え、摂氏37度で５分間加温後、抗
CRP抗体固定化粒子懸濁液50μｌを加えて撹拌後１〜５
分の波長600nmにおける吸光度変化量を測定した。得ら
れた吸光度とCRP濃度の関係を図５に示した。

【００４３】比較例５グアニジン・チオシアン酸塩溶液に代えて0.2Ｍ塩化ナ
トリウムを含む0.02Ｍトリス緩衝液（pH8.5）を150μｌ
使用し、実施例５の(3)と同様にCRPの測定を実施し、得
られた吸光度とCRP濃度の関係を図５に示した。

【００４４】実施例６ (1) 抗CRP抗体固定化粒子懸濁液の調製実施例１と同様に抗CRP抗体固定化粒子懸濁液を調製し
た。

【００４５】(2) グアニジン塩酸塩溶液の調製グアニジン塩酸塩（キシダ化学社製）を100mMの濃度で
0.2Ｍ塩化ナトリウムを含む0.02Ｍトリス緩衝液（pH8.
5）に混和しグアニジン塩酸塩溶液を調製した。

【００４６】(3) CRPの測定グアニジン塩酸塩溶液150μｌに、CRPを含有する血清２
μｌを加え、摂氏37度で５分間加温後、抗CRP抗体固定
化粒子懸濁液50μｌを加えて撹拌後１〜５分の波長600n
mにおける吸光度変化量を測定した。また、グアニジン
塩酸塩溶液に代えて0.2Ｍ塩化ナトリウムを含む0.02Ｍ
トリス緩衝液（pH8.5）を150μｌ使用して同様に測定
し、CRP濃度既知の試料の吸光度変化量からCRP濃度を算
出し相関性を評価した。この結果を図６に示す。また、
同時に市販のラテックス免疫比濁法による試薬（CRPラ
テックス「生研」：デンカ生研社製）を用いて血清25例
のCRP濃度を測定し、相関性を評価した結果を図７に示
す。

【００４７】実施例７ (1) 抗Lp(a)抗体固定化粒子懸濁液の調製実施例２と同様に抗Lp(a)抗体固定化粒子懸濁液を調製
した。

【００４８】(2) グアニジン塩酸塩溶液の調製グアニジン塩酸塩（キシダ化学社製）を100mMの濃度で
0.2Ｍ塩化ナトリウムを含む0.05Ｍグリシン緩衝液（pH
９）に混和しグアニジン塩酸塩溶液を調製した。

【００４９】(3) Lp(a)の測定グアニジン塩酸塩溶液240μｌに、Lp(a)を含有する血清
４μｌを加え、摂氏37度で５分間加温後、抗Lp(a)抗体
固定化粒子懸濁液80μｌを加えて撹拌後１〜５分の波長
600nmにおける吸光度変化量を測定した。また、グアニ
ジン塩酸塩溶液に代えて0.2Ｍ塩化ナトリウムを含む0.0
5Ｍグリシン緩衝液（pH９）を240μｌ使用して同様に測
定し、Lp(a)濃度既知の試料の吸光度変化量からLp(a)濃
度を算出し、相関性を評価した結果を図８に示す。ま
た、同時に市販の免疫比濁法による試薬（Lp(a)ラテッ
クス「第一」：第一化学薬品社製）を用いて血清20例の
Lp(a)濃度を測定し、相関性を評価した結果を図９に示
す。

【００５０】評価図１〜５から明らかなように、実施例１〜５では抗原濃
度に依存した吸光度変化の割合がグアニジン塩の存在に
より影響され、比較例１〜５に比べ高感度或いは高濃度
域まで吸光度変化の測定可能な範囲が拡大した。すなわ
ち、図１、４及び５では、グアニジン塩を用いない比較
例はCRP濃度20mg/dlで吸光度が飽和に達し、これを超え
る高濃度域における測定ができないのに対し、グアニジ
ン塩を用いた実施例では20mg/dlを超えても更に吸光度
が上昇し、より高濃度域における測定が可能となってい
る。また図２及び３では、グアニジン塩を用いない比較
例に比べ、グアニジン塩を用いた実施例はより高感度な
測定が可能となっている。

【００５１】また実施例６及び７の図６〜９は、本発明
におけるグアニジン塩の効果が、従来技術における血清
試料に由来する非特異的な凝集の回避とは異なり、抗原
抗体反応の特異性には何ら影響を与えないことを示して
いる。

【００５２】

【発明の効果】本発明方法によれば、高感度なあるいは
測定範囲の広い凝集イムノアッセイが可能となる。ま
た、本発明に使用するグアニジン、グアニジン塩及びそ
の誘導体は安定な化学物質で、原理的には抗原抗体反応
や測定システムの正確性に影響を与えない特徴をもち、
製造方法も簡便であると共にコストも安い。

【図面の簡単な説明】

【図１】グアニジン塩酸塩の存在下（実施例１）及び非
存在下（比較例１）においてCRPの測定を行った結果を
示す図である。

【図２】グアニジン塩酸塩の存在下（実施例２）及び非
存在下（比較例２）においてLp(a)の測定を行った結果
を示す図である。

【図３】グアニジン塩酸塩の存在下（実施例３）及び非
存在下（比較例３）においてミオグロビンの測定を行っ
た結果を示す図である。

【図４】グアニジン炭酸塩の存在下（実施例４）及び非
存在下（比較例４）においてCRPの測定を行った結果を
示す図である。

【図５】グアニジンチオシアン酸塩の存在下（実施例
５）及び非存在下（比較例５）においてCRPの測定を行
った結果を示す図である。

【図６】グアニジン塩酸塩の存在下及び非存在下におい
てCRPの測定を行った場合の相関性を示す図である。

【図７】グアニジン塩酸塩の存在下でのCRPの測定と市
販のラテックス免疫比濁法による試薬を用いたCRPの測
定との相関性を示す図である。

【図８】グアニジン塩酸塩の存在下及び非存在下におい
てLp(a)の測定を行った場合の相関性を示す図である。

【図９】グアニジン塩酸塩の存在下でのLp(a)の測定と
市販のラテックス免疫比濁法による試薬を用いたLp(a)
の測定との相関性を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】測定対象となる抗原又は抗体を含有する
試料に当該測定対象に対する抗体又は抗原を担持させた
不溶性担体粒子を添加し、抗原抗体反応による免疫複合
体の形成の程度を測定する免疫的測定法であって非特異
反応が測定結果に影響を与えない程度に少ないものにお
いて、グアニジン、グアニジン塩又はその誘導体を反応
系中に共存させることを特徴とする免疫的測定法。
【請求項２】不溶性担体粒子の直径が、0.02〜1.6μ
ｍである請求項１又は１記載の免疫的測定法。