JP4176826B2 - 凝集阻害測定法及び凝集阻害測定用試薬 - Google Patents
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Description
凝集法は、レセプターを感作した担体粒子が測定対象リガンドを介した架橋反応で凝集する度合いを測定する方法であり、微量物質の高感度測定の必要性を背景として、多くの測定項目について実用化されている。
一方、凝集阻害法は、予めリガンド又はリガンド様物質を感作した担体粒子とレセプターによる凝集が測定対象であるリガンドによって阻止される割合を測定する方法であり、凝集法では特殊なリガンドを除き2種類以上の特異的レセプターが必須であるのに対して、凝集阻害法は1種類の特異的レセプターがあれば測定系を構築できることが大きな特徴である。
さらに、免疫反応に関していえば、凝集阻害法には地帯現象(抗原過剰による見かけ上の反応低下現象)が起こらないという利点があるものの、現在までの適用は、ハプテンのような低分子リガンドすなわち2種類以上のレセプターが利用できないリガンドを測定対象としているケースがほとんどである。
一方、リガンド量に比例して凝集阻止反応が進行する凝集阻害法の測定範囲に関しては、リガンド高濃度域の測定上限値は、基本的には初期凝集(リガンド量ゼロ時の凝集)の大きさに依存し、リガンド低濃度域の測定下限値は、凝集阻止反応の感受性に依存するため、二つの要因を複合的に考慮する必要がある。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
(1)二箇所以上のレセプター結合部位を有する測定対象リガンドを含む試料と、下記(A)〜(C)、
(A)予めリガンド又はリガンド様物質を担持した不溶性担体粒子
(B)前記リガンドに特異的に反応する遊離状レセプター
(C)前記リガンドに特異的に反応し、リガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なるレセプターを担持した不溶性担体粒子
とを混合し、試料中の測定対象リガンド量に応じた粒子の凝集阻止反応を測定することを特徴とする凝集阻害測定法。
(2)不溶性担体粒子がラテックス粒子である上記(1)に記載の凝集阻害測定法。
(3)レセプターが抗体又はそれらの機能性部位を含む断片であり、リガンドが抗原であり、レセプターとリガンドとの免疫反応に基づき、粒子の凝集阻止反応を測定する上記(1)又は(2)に記載の凝集阻害測定法。
(4)遊離状レセプター及び不溶性担体粒子に担持されたレセプターが、いずれもモノクローナル抗体である上記(1)〜(3)のいずれかに記載の凝集阻害測定法。
(5)測定対象リガンドが、ヒトアルブミン、レセプターが、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体である上記(1)〜(4)のいずれかに記載の凝集阻害測定法。
(6)レセプターを担持する不溶性担体粒子の平均粒子径が、リガンド又はリガンド様物質を担持する不溶性担体粒子の平均粒子径の1/2〜1/10である上記(1)〜(5)のいずれかに記載の凝集阻害測定法。
(7)下記(A)〜(C)を含み、試料中の測定対象リガンド量に応じた粒子の凝集阻止反応を測定することを特徴とする凝集阻害測定用試薬。
(A)予めリガンド又はリガンド様物質を担持した不溶性担体粒子
(B)前記リガンドに特異的に反応する遊離状レセプター
(C)前記リガンドに特異的に反応し、リガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なるレセプターを担持した不溶性担体粒子
(8)不溶性担体粒子が、ラテックス粒子である上記(7)に記載の凝集阻害測定用試薬。
(9)レセプターが、抗体又はそれらの機能性部位を含む断片であり、リガンドが抗原であり、レセプターとリガンドとの免疫反応に基づき、粒子の凝集阻止反応を測定するための上記(7)又は(8)に記載の凝集阻害測定用試薬。
(10)遊離状レセプター及びリガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なるレセプターが、いずれもモノクローナル抗体である上記(7)〜(9)のいずれかに記載の凝集阻害測定用試薬。
(11)レセプターを担持する不溶性担体粒子の平均粒子径が、リガンド又はリガンド様物質を担持する不溶性担体粒子の平均粒子径の1/2〜1/10である上記(7)〜(10)のいずれかに記載の凝集阻害測定用試薬。
(12)測定対象リガンドが、ヒトアルブミン、レセプターが、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体である上記(7)〜(11)のいずれかに記載の凝集阻害測定用試薬。
本発明の測定対象となるリガンドを含む試料としては、例えばヒト又は動物の血液、血清、血漿、培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水、又は細胞あるいは組織の抽出液等が挙げられる。
本発明の測定対象となるリガンドとしては、二箇所以上のレセプター結合部位を有する物質であれば、いずれも対象とすることができる。具体的には、C反応性タンパク(CRP)、FDP、D−ダイマー、前立腺特異抗原(PSA)、ヘモグロビンA1C、アルブミン、ペプシノーゲンI(PGI)、ペプシノーゲンII(PGII)、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カテプシン等のタンパク質、その他、ペプチド、糖類、核酸、脂質、高分子薬剤などが挙げられる。理論的には二箇所以上のレセプター結合部位を有するリガンド(リガンドが抗原であれば二箇所以上のエピトープ(抗原決定基)を有するリガンド、例えば二種類以上のモノクローナル抗体を利用したサンドイッチ測定で検出可能なリガンド)は全て測定対象物質として適用可能である。
リガンド様物質とは、レセプターとの関係において前記リガンドと同等、同質の反応性(リガンドが抗原であれば抗原性)を有するものをいう。例えば、リガンド(抗原など)を分解して得られる断片、遺伝子操作で得られた組み替えリガンド、リガンド構造が類似した物質(リガンド類縁物質)等があげられる。
本発明で用いるレセプターとしては、測定対象であるリガンドに特異的に結合する物質を用いる。一般的にはウサギ、ヒツジ、ヤギ等に、測定対象のリガンドを免疫して得られる抗リガンドポリクローナル抗体や抗リガンドモノクローナル抗体を用いることができる。その中でも特異性の点からはモノクローナル抗体の使用が特に望ましい。用いる抗体は、常法に従い調製した抗体のフラグメントであってもよい。その他、リガンドの種類によってはレクチン、核酸塩基等も抗体と併用してあるいは単独でレセプターとして用いることができる。
レセプターとしてモノクローナル抗体を用いる場合、それらの選定は、例えば次のような手順で行われる。
まず、測定対象リガンドを免疫源として調製したモノクローナル抗体とリガンドとの反応性をウエスタンブロット法やELISA法等で確認し、反応性が強い抗体を2種類以上選択する。さらに、選択されたこれらの抗体を組み合わせたときの反応性をサンドイッチELISA法で確認する。このとき、反応性が強ければそれだけ、感度が高く測定範囲を拡張できる可能性が高いため、モノクローナル抗体の組み合わせは、測定対象、要求性能に応じて適宜選択することが望ましい。このようにして得られたモノクローナル抗体の組み合わせを、一方を担体に固定化させた状態で、もう一方を担体に固定化しない遊離の状態で、実際の測定系に供し、初期凝集、測定感度、測定範囲、リガンドと類似した構造を有する測定対象外の物質との交差反応性等を考慮していずれの組み合わせが適当か最終的な判断を行う。
本発明で使用するリガンドあるいはレセプターを担持させる不溶性担体粒子は、特に限定されないが平均粒子径50〜1000nmのラテックスが好ましい。ラテックスの材質としては、リガンドあるいはレセプターの担持に適したものなら良く、一般的に用いられるポリスチレンを主成分とするラテックスの他に、スチレン−ブタジエン共重合体、(メタ)アクリル酸エステル類ポリマーなどが挙げられる。また、金属コロイド、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することもできる。担体粒子に前記リガンド又はリガンド様物質及びレセプターを担持する方法としては、一般的に使用されている物理吸着法のほか化学結合法も採用できる。
本発明における凝集反応は、緩衝液中で行われ、その緩衝液は、凝集反応が最適に行われる種類、濃度、pHが選択され、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッドの緩衝液等を用いる事ができる。その緩衝液の緩衝剤の濃度は、5mM〜500mM程度で用いられ、pHは中性域から塩基性域で用いられることが多く、通常7.0〜9.5の範囲で用いられる。
凝集シグナルの測定は、通常凝集阻止反応測定に用いられる方法であればいずれでもよく、吸光度比による評価、粒子数測定、粒子サイズ測定(凝集すればサイズは大きくなる)、散乱光測定や吸収スペクトルの測定(凝集すれば増大もしくはシフトする)など当業者が用いうる手段があげられる。さらに、光学的な検出を可能な範囲で電気化学的な検出によって置き換えることも可能である。
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
(1)レセプター(抗アルブミンモノクローナル抗体)の調製
精製ヒトアルブミン(シグマ社製)100μgを1回の免疫に使用した。初回免疫は、アルブミンとフロインドの完全アジュバンドを等量混合して調製したエマルジョン200μLを用い、これをBALB/cマウスの腹腔に注射して行った。追加免疫は、フロインドの不完全アジュバンドを使用して前記と同様に調製したエマルジョン200μLを用い、2週間の間隔で3回、腹腔注射を繰り返した。
先ず、10μg/mLのアルブミン及び150mM塩化ナトリウムを含む10mMリン酸緩衝液(pH7.2;以下、PBSと略す)100μLを96穴マイクロプレートに分注し、4℃で1晩放置した。次にこれを0.05%Tween20及び1%牛血清アルブミンを含むPBS300μLで3回洗浄した後、培養を行った3枚の96穴マイクロプレート各ウェルの培養上清を50μL/ウェル加え室温で1時間放置した。その後、0.05%Tween20を含むPBSで3回洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体(第一化学薬品社製)を50μL/ウェル加え、室温で1時間放置した。これを0.5%Tween20を含むPBSで3回洗浄後、0.2%オルトフェニレンジアミン及び0.02%過酸化水素を含むクエン酸緩衝液(pH5)50μL/ウェルを加え、室温で15分間放置後、4.5N硫酸50μL/ウェルを加えて反応を停止させ、波長492nmにおける吸光度を測定した。測定の結果、吸光度の高いウェルを抗アルブミン抗体の存在する(即ち、抗アルブミン抗体産生融合細胞の存在する)ウエル(陽性ウエル)として選択した。
選択した2種類の抗アルブミンモノクローナル抗体のうち、抗体3−8を2.8mg/mL含む20mMトリス緩衝液(pH8.5)3mLに、平均粒子径50nmの4%ラテックス(積水化学工業社製)懸濁液3mLを加え、4℃にて2時間撹拌した。これに0.4%牛血清アルブミンを含む20mMトリス緩衝液(pH8.5)6mLを加え、4℃で1時間撹拌した。遠心分離後、沈殿を5mM MOPS緩衝液(pH7.0)で、波長600nmにおける吸光度が40mODとなるように再懸濁し、抗アルブミン抗体3−8感作ラテックスを調製した。遊離状態の抗体1−8と抗体3−8感作ラテックスを混合し第一試薬を調製した。
汎用型の日立7170型自動分析装置を用いて各濃度のアルブミン試料を測定し、測定感度を確認した。具体的には、第一試薬100μLに各濃度のアルブミンを含有する試料液3μLをそれぞれ加えて撹拌後、37℃で5分間加温し、さらに第二試薬100μLを添加して37℃、5分間の主波長570nm/副波長800nmにおける吸光度変化量を測定した。まず、アルブミン濃度0μg/mLの際の初期凝集を表1に示した。さらに5、12.5、25、50、100、200、400、800μg/mLのアルブミンを含有する各試料測定時の初期凝集からの吸光度変化量を測定し、アルブミン濃度対―(マイナス)吸光度(以下同様)の反応曲線として図1に実線で示した。この反応曲線の形状に基づき0、5、25、100、400、800μg/mLの6ポイントから検量線を作成し、各濃度のアルブミン試料の吸光度変化量をアルブミン濃度に換算した測定値を表2に示した。
比較例として実施例と最終の抗体濃度が同一となるように下記(A)〜(E)の5種類の第一試薬を調製した。
(A)遊離状態の抗体1−8を単独で含有する第一試薬
(B)抗体1−8感作ラテックスを単独で含有する第一試薬
(C)遊離状態の抗体1−8と抗体1−8感作ラテックスの両方を含有する第一試薬
(D)遊離状態の抗体1−8と遊離状態の抗体3−8の両方を含有する第一試薬
(E)抗体1−8感作ラテックスと抗体3−8感作ラテックスの両方を含有する第一試薬
上記(A)〜(E)の各第一試薬と、(2)で調製した第二試薬を組み合わせ、(3)の方法に従って測定を行った。実施例と同様に初期凝集の結果を表1に、アルブミン濃度対―吸光度の反応曲線を図1に、各比較例の反応曲線の形状に基づき0〜800μg/mLの範囲から選択した至適な濃度ポイントから検量線を作成し、各濃度のアルブミン試料の吸光度変化量をアルブミン濃度に換算した測定値を表2に示した。
表1に示したように、実施例の初期凝集(吸光度)に対して、比較例A、B、Cは約半分、比較例Dは2/3程度の初期凝集しか得られておらず、凝集阻害法における基本的な測定性能が劣っていることが容易に推察された。一方、比較例Eでは実施例よりも大きい初期凝集が得られた。
表3に示したように、実施例では低濃度から高濃度まで再現性良く、変動係数6%以下の値が得られ、測定平均値もアルブミン濃度レベルと同等の測定値が得られた。比較例A、C、Dでは再現性が悪く、特に低濃度の変動係数が20%を上回る場合があった。比較例B、Eでは、再現性良く測定できているものの、高濃度域における測定平均値はアルブミン濃度レベルと乖離しており、正確性が低かった。
Claims (12)
- 二箇所以上のレセプター結合部位を有する測定対象リガンドを含む試料と、下記(A)〜(C)
(A) 予めリガンド又はリガンド様物質を担持した不溶性担体粒子
(B) 前記リガンドに特異的に反応する遊離状レセプター
(C) 前記リガンドに特異的に反応し、リガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なるレセプターを担持した不溶性担体粒子
とを混合し、試料中の測定対象リガンド量に応じた粒子の凝集阻止反応を測定することを特徴とする凝集阻害測定法。 - 不溶性担体粒子がラテックス粒子である請求項1に記載の凝集阻害測定法。
- レセプターが抗体又はそれらの機能性部位を含む断片であり、リガンドが抗原であり、レセプターとリガンドとの免疫反応に基づき、粒子の凝集阻止反応を測定する請求項1又は2に記載の凝集阻害測定法。
- 遊離状レセプター及び不溶性担体粒子に担持されたレセプターが、いずれもモノクローナル抗体である請求項1〜3のいずれかに記載の凝集阻害測定法。
- 測定対象リガンドが、ヒトアルブミン、レセプターが、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体である請求項1〜4のいずれかに記載の凝集阻害測定法。
- レセプターを担持する不溶性担体粒子の平均粒子径が、リガンド又はリガンド様物質を担持する不溶性担体粒子の平均粒子径の1/2〜1/10である請求項1〜5のいずれかに記載の凝集阻害測定法。
- 下記(A)〜(C)を含み、試料中の測定対象リガンド量に応じた粒子の凝集阻止反応を測定することを特徴とする凝集阻害測定用試薬。
(A) 予めリガンド又はリガンド様物質を担持した不溶性担体粒子
(B) 前記リガンドに特異的に反応する遊離状レセプター
(C) 前記リガンドに特異的に反応し、リガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なるレセプターを担持した不溶性担体粒子 - 不溶性担体粒子が、ラテックス粒子である請求項7に記載の凝集阻害測定用試薬。
- レセプターが、抗体又はそれらの機能性部位を含む断片であり、リガンドが抗原であり、レセプターとリガンドとの免疫反応に基づき、粒子の凝集阻止反応を測定するための請求項7又は8に記載の凝集阻害測定用試薬。
- 遊離状レセプター及びリガンド上の結合部位が前記遊離状レセプターとは異なるレセプターが、いずれもモノクローナル抗体である請求項7〜9のいずれかに記載の凝集阻害測定用試薬。
- レセプターを担持する不溶性担体粒子の平均粒子径が、リガンド又はリガンド様物質を担持する不溶性担体粒子の平均粒子径の1/2〜1/10である請求項7〜10のいずれかに記載の凝集阻害測定用試薬。
- 測定対象リガンドが、ヒトアルブミン、レセプターが、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体である請求項7〜11のいずれかに記載の凝集阻害測定用試薬。
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