CN101915849B

CN101915849B - 一种方便加样的用于测定糖化血红蛋白百分比的检测试剂

Info

Publication number: CN101915849B
Application number: CN 201010213811
Authority: CN
Inventors: 陈明峰; 余嘉陵; 杨青; 郑筱雯
Original assignee: SHENZHEN GOLDSITE DIAGNOSTICS Inc
Current assignee: SHENZHEN GOLDSITE DIAGNOSTICS Inc
Priority date: 2010-06-30
Filing date: 2010-06-30
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2030-06-30
Also published as: CN101915849A

Abstract

本发明涉及测定糖化血红蛋白百分比的方法，其包括如下步骤：a.将全血样本与溶血液混合均匀；b.取适量溶血后的样本加入悬浮在甘氨酸缓冲液中的乳胶；c.经预定时间后再分别加入抗体B试剂及抗体A试剂；d.混合均匀后在单波长光照射条件下，通过特定蛋白分析仪读取散射值；e.最后根据散射值从标准曲线图中读取糖化血红蛋白的百分比。该方法以定时散射比浊法为检测原理，无需单独测定血液样本中的总血红蛋白及糖化血红蛋白含量即可直接确定其中的糖化血红蛋白百分比，无需预先配制抗体工作液，既延长了试剂的有效使用时间，又简化了操作步骤，且缩短了样本的测定时间。

Description

一种方便加样的用于测定糖化血红蛋白百分比的检测试剂

技术领域

本发明涉及医学免疫，具体而言是涉及一种可以直接测定糖化血红蛋白百分比的方法及其试剂。

背景技术

糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin,HbAlc）是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物。糖化血红蛋白可以稳定可靠地反映出检测前120天内的平均血糖水平，且受抽血时间，是否空腹，是否使用胰岛素等因素干扰不大。因此，国际糖尿病联盟推出了新版的亚太糖尿病防治指南，明确规定糖化血红蛋白是国际公认的糖尿病监控“金标准”。如果空腹血糖或餐后血糖控制不好，糖化血红蛋白就不可能达标。

常用的测定糖化血红蛋白百分比的方法有离子交换层析、高效液相色谱、免疫法、酶法等。其中离子交换层析、高效液相色谱法需要特定的仪器，价格昂贵，不适用于中小型医院的使用。酶法检测糖化血红蛋白是利用氧化还原反应，需要多种酶的参与。而临床上常使用的免疫学方法有两种，一种是需要单独测定血液样本中的总血红蛋白和糖化血红蛋白的浓度，并且随后计算糖化血红蛋白与总血红蛋白的比值的免疫竞争抑制法，另一种是可以直接测定糖化血红蛋白百分比的胶乳凝集法，此法需要在使用前配制抗体工作液，且配制好的抗体工作液稳定期较短。

临床上常使用的可以直接测定糖化血红蛋白百分比的胶乳凝集法，均需要在使用前配制抗体工作液，且配制好的抗体工作液稳定期较短，一般在10－15天左右即失效，虽然放置在－10℃以下冷冻可保存数月，但不能反复冻融，不利于日常使用，而且低温冰箱较难获得。

发明内容

介绍本发明的技术方案前，首先对其原理进行分析说明，以便能够被更好的理解。本发明检测技术采用定时散色比浊法为检测原理，可溶性抗原与特异性的抗体反应形成不溶性复合物，当光线通过反应悬液时发生散射并由特定蛋白分析仪检测到，散射光值的多少与测试样品中的特定蛋白浓度成一定比例。在本发明中，利用抗原抗体反应直接测定总血红蛋白中糖化血红蛋白的百分含量，样品中总血红蛋白和HbA1c与乳胶有相同的非特异性吸附而固相化，当加入HbA1c的特异性单克隆抗体后形成乳胶-HbA1c-鼠抗人HbA1c单克隆抗体的复合物，此复合物由于羊抗鼠IgG抗体而形成凝集，凝集量与乳胶表面固相化的HbA1c量成一定比例关系。

为克服以上现有技术的不足，本发明提供一种无需在使用前配制抗体工作液即可直接测定糖化血红蛋白百分比的方法，其包括如下步骤：

a.将全血样本与溶血液混合均匀；

b.取适量溶血后的样本加入悬浮在甘氨酸缓冲液中的乳胶；

c.经预定时间后再分别加入抗体A试剂及抗体B试剂；

d.混合均匀后在单波长光照射条件下，通过特定蛋白分析仪读取散射值；

e.最后根据所述散射值从标准曲线图中读取所述糖化血红蛋白的百分比；

所述抗体A试剂是羊抗鼠IgG抗体和甘氨酸缓冲液的混合液，抗体B是鼠抗人HbAlc单克隆抗体和甘氨酸缓冲液的混合液。

优选的，所述步骤c中的预定时间为6.5分钟，所述步骤d中的单波长光的波长为630nm。

再优选的，所述步骤a中的溶血液是H₂O，所述步骤b中的乳胶浓度为0.1%、甘氨酸缓冲液的浓度为15mmol/L，所述步骤c中的羊抗鼠IgG抗体浓度为0.005mg/ml～0.007mg/ml、鼠抗人HbAlc单克隆抗体浓度为0.05mg/ml、甘氨酸缓冲液的浓度为60mmol/L。

进一步优选的，所述羊抗鼠IgG的浓度为0.006mg/ml。

本发明的有益效果是：

本发明的测定方法以定时散射比浊法为检测原理，不需要单独测定血液样本中的总血红蛋白及糖化血红蛋白含量即可直接确定其中的糖化血红蛋白百分比，且无需在使用前配制抗体工作液即可直接测定，即延长了试剂的有效使用时间，又简化了操作步骤。

将步骤c中的预定时间设为6.5分钟，步骤d中的单波长光的波长为630nm～690nm，时间是，同类产品都需要10分钟以上的测试时间。采用波长范围在630nm～690nm的单波长光（可见光里面最长的波长），可获得最稳定的测试结果；同时，在以上预定的波长范围内，6.5分钟是最佳的测试时间，也即此时间是基于确保测试结果准确及稳定的最快时间。

羊抗鼠IgG的浓度范围为0.005mg/ml～0.007mg/ml，是因为此抗体的需要量很少，采用此低浓度的目的是为了方便加样。因为两种抗体是分别加入的，如果浓度过高，无法加样（极小体积的加样很难操作且易导致加样重复性差），如浓度过低，则抗体稳定性不好。所以采用此浓度范围，既方便加样，抗体稳定性又好。

附图说明

图1是不同百分比的糖化血红蛋白标准品的标准曲线（每个点代表了一种百分比的标准品，其中X轴表示糖化血红蛋白的百分比，Y轴表示散射值）；

图2是本发明的一个实施例的糖化血红蛋白试剂和现有技术中的一个糖化血红蛋白试剂测定样本的相关图（其中X轴表示本试剂的测定结果，Y轴表示现有技术中的一个试剂的测定结果）。

具体实施方式

以下结合实施例并对照附图对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

本实施例的糖化血红蛋白检测试剂包含溶血液、乳胶、抗体A试剂及抗体B试剂，其中：溶血液为H2O；乳胶浓度为0.1％，悬浮在浓度为15mmol/l的甘氨酸缓冲液中；抗体A为浓度为0.006mg/ml的羊抗鼠IgG抗体，混合在浓度为60mmol/l的甘氨酸缓冲液中；抗体B为浓度为0.05mg/ml的鼠抗人HbA1c单克隆抗体，混合在浓度为60mmol/l的甘氨酸缓冲液中；全血样本的用量为5μl，溶血液的用量为500μl，乳胶用量为210μl，抗体A和抗体B的用量分别为50μl和70μl。其中，所述溶血液、乳胶、羊抗鼠IgG抗体及鼠抗人HbA1c单克隆抗体用量的百分比为1.49％：62.69％：14.92％：20.90％。

本实施例中，如将所述羊抗鼠IgG的浓度改为0.005mg/ml或0.007mg/ml及两者之间的其它值，也同样能够得到合格的糖化血红蛋白检测试剂。

实施例2

本实施例以定时散射比浊法为检测原理，直接测定糖化血红蛋白百分比的方法包括：

a．糖化血红蛋白测定标准曲线的制作，即散射值与多个糖化血红蛋白标准品的糖化血红蛋白百分比-散射值对应数据库：以定时散射比浊法为检测原理，所需材料包括如前实施例所述的糖化血红蛋白检测试剂，其中的溶血液500μl，乳胶210μl，抗体A（即浓度为0.006mg/ml的羊抗鼠IgG抗体）50μl，抗体B（即浓度为0.05mg/ml的鼠抗人HbA1c单克隆抗体）70μl；糖化血红蛋白标准品和特定蛋白分析仪。

样本处理：将5μl糖化血红蛋白标准品，加入500μl溶血液中溶血，溶血完全后即可检测。

准备每个样品要用的测量杯，在测量杯中加入5μl上述溶血样本，用移液器加入210ul乳胶，等待3分钟之后加入70μl抗体B和50μl抗体A，混匀后用特定蛋白分析仪（特定蛋白分析仪是指可测定人体液中的特定蛋白质的分析仪）测定标准品散色值，并于第30秒读取此时间段的最低散射值S1，第180秒后读取散射值S2，反应散射值的计算为S2与S1的差值。依据多个散射值与多个标准品定值浓度百分比作不同百分比的糖化血红蛋白标准品的标准曲线，即浓度百分比-散射值曲线图，如图1所示，其中每个点代表了一种百分比的标准品，X轴表示糖化血红蛋白的百分比，Y轴表示散射值。为提高精确度，可将每个浓度重复测试三次，取平均值。

为得到较为准确的检测结果，检测过程中测定温度为37℃；检测时特定蛋白分析仪采用波长为630nm光。

b．糖化血红蛋白快速检测试剂全血样本的测定：用手指微量全血作为样本，将5μl新鲜手指末梢血，加入500μl溶血液中溶血，溶血完全，在测量杯中加入5μl上述溶血样本，用移液器加入210ul乳胶，等待3分钟之后加入70μl抗体B和50μl抗体A，混匀后用特定蛋白分析仪测定标准品散色值，检测时特定蛋白分析仪采用波长为630nm光，并于第30秒读取此时间段的最低散射值S1′，第180秒后读取散射值S2′，散色值为S2′与S1′的差值为700。

c．依据前述b步骤测定得到的散色值700，与图1对照，算出样本中糖化血红蛋白的百分比含量为8.2％。

本实施例中也可采用静脉抗凝血作为全血样本；本实施例的整个检测过程仅需6.5分钟，而目前临床上使用的可以直接测定糖化血红蛋白百分比的胶乳凝集法，需要在使用前配制抗体工作液，且配制好的抗体工作液稳定期较短，使用繁琐且费时。

如图2所示，显示了本试剂和现有技术中一个试剂的测定样本的相关图。其中X轴表示本试剂测定结果，Y轴表示现有技术中一个试剂的测定结果，相关系数r²=0.9901,回归方程为y=1.0039x＋0.0074。二者测定结果采用假设检验配对t检验得出p＞0.05，说明二者之间无差异。

实施例3

糖化血红蛋白快速检测试剂的灵敏度验证实施例：准备测定用糖化血红蛋白快速检测试剂，如前述实施例所述的试剂，以及高值及低值质控品，特定蛋白分析仪。取具有溯源性的高值质控物、低值质控物各一份，对每份质控物进行10次检测，将检测结果计算平均值、标准差和变异系数。结果见表1：

表1

由表1中变异系数可知，本发明提供的糖化血红蛋白检测方法具有较高的精密度。

实施例4

准确度验证实施例：取具有溯源性的血清高值质控物、血清低值质控物各一份，用试剂分别进行检测，各检测5次,计算平均值，与质控物靶值进行对照。结果见表2：

表2

	高值质控	低值质控
			测定次数	5	5
最大值	11.608％	5.337％
			最小值	10.985％	5.127％
平均值	11.3％	5.23％
			靶值	11.9％	5.20％

由表2的测试数据与靶值的对比可知，本发明提供的糖化血红蛋白检测方法具有较高的准确度。

实施例5

灵敏度的验证实施例：取具有朔源性的质控品稀释至检测范围下限附近进行测定，重复测定3次，计算平均值，与质控物靶值进行对照。结果见表3：

表3

	浓度一	浓度二
			测定次数	3	3
平均值	2.284％	3.332％
			靶值	2.3％	3.45％

由表3测试数据与靶值的对比可知，本发明提供的糖化血红蛋白检测方法具有较高的灵敏度。

以上内容是结合具体实施实施例对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种方便加样的用于测定糖化血红蛋白百分比的检测试剂，其特征在于包括溶血液、乳胶、抗体A试剂及抗体B试剂，其中：

溶血液为H₂O；

乳胶浓度为0.1％，悬浮在浓度为15mmol/l的甘氨酸缓冲液中；

抗体A为浓度为0.005mg/ml～0.007mg/ml的羊抗鼠IgG抗体，混合在浓度为60mmol/l的甘氨酸缓冲液中；

抗体B为浓度为0.05mg/ml的鼠抗人HbA1c单克隆抗体，混合在浓度为60mmol/l的甘氨酸缓冲液中。

2.如权利要求1所述的方便加样的用于测定糖化血红蛋白百分比的检测试剂，其特征在于：所述抗体A为浓度为0.006mg/ml的羊抗鼠IgG抗体，混合在浓度为60mmol/l的甘氨酸缓冲液中。