CN104749375A - 人血清中c肽含量的检测方法及其用试剂盒和试剂盒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定人血清中C肽含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其制备方法以及利用该试剂盒来检测人血清中C肽含量的方法，试剂盒包括第一试剂、第二试剂和校准品，第一试剂包含缓冲液、电解质、表面活性剂、稳定剂、反应增强剂及防腐剂；第二试剂包含缓冲液、电解质、表面活性剂、防腐剂以及包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，校准品包含缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂和人C肽蛋白。本发明提供的试剂盒与目前临床使用试剂盒相比，特异性、灵敏度、准确性一致，且本发明的试剂盒适用于一般检测机构都具有的生化分析仪上使用，检测时间短、操作方便、检测成本低、无放射性污染，更适合临床推广使用。

Description

人血清中C肽含量的检测方法及其用试剂盒和试剂盒的制备方法

技术领域

本发明属于医学检验学领域，具体涉及一种用于临床测定人血清中C肽含量的试剂盒，该试剂盒的制备方法以及利用该试剂盒检测人血清中C肽含量的方法。 

背景技术

糖尿病是一组由胰岛素分泌绝对或相对不足所导致的以慢性高血糖为特征的代谢综合征。近30年来，我国糖尿病患病率显著增加。根据中华医学会糖尿病学分会（CDS）的调查结果，2007至2008年，我国20岁以上的成年人糖尿病患病率为9.7%，另外还有月1482万成年人具有前驱糖尿病症状，约占总人口数的1.55%。目前临床诊断筛查中，血清C肽和胰岛素水平对糖尿病的分型诊断、治疗方案选择和疗效监测具有重要的临床参考意义，是筛查诊断糖尿病患者主要的常规必检项目。在体内，C肽(C-peptide)与胰岛素(insulin)均来自于胰岛β细胞的分泌产物胰岛素原，一个分子的胰岛素原经酶切后，裂解成一个分子的胰岛素和一个分子的C肽。二者以等分子数共存于分泌颗粒，并同时释放至毛细血管循环中，且C肽不被肝脏破坏，半寿期较胰岛素明显为长。治疗用的胰岛素不含C肽，因此，测定血循环中C肽水平，能更好的反映胰岛β细胞合成与释放胰岛素的功能。 

目前临床上检测C肽主要采用化学发光法和酶联免疫法，极少数还在使用放射免疫分析方法。化学发光法检测必须使用化学发光仪。酶联免疫法必须使用酶标仪进行检测，两种方法检测时间长（一般30分钟以上），且检测设备复杂昂贵，必须配备专人负责操作，从而导致检测费用也较为昂贵；而放射免疫分析方法需要使用放射性标记物，不仅需配备专用放射性探测器对检测结果进行测定，也易对操作人员造成放射性污染和伤害，此外，该方法常用的I-125，I-131，P-32等放射性元素，由于其半衰期短，导致试剂保存时间也短，在临床使用上非常不便。 

胶乳颗粒增强免疫比浊法测定试剂盒是利用抗原、抗体特异结合的免疫学原理，将单克隆或多克隆抗体分别结合到胶乳颗粒上，病人血清（或 标准品）中的抗原在缓冲液中与胶乳表面的抗体结合，从而使胶乳颗粒彼此交联致使溶液浊度增加，并在一定范围内反应液浊度与所加抗原的量呈线性相关，因此可使用生化分析仪（或其他光学检测仪器）在一定波长处测定反应液吸光度值，反应液吸光度值与所测抗原浓度呈正比。使用已知浓度的标准品绘制曲线，即可根据被测标本的反应吸光度变化计算出抗原的浓度。胶乳颗粒增强免疫比浊法无需配备专用仪器，可在一般医疗检测机构都具有的生化分析仪上使用，灵敏度高、稳定性好、特异性强，且该方法检测时间短，检测成本低，不存在放射性污染的问题。然而，由于制备难度较高，目前还没有胶乳颗粒增强免疫比浊法的商业化C肽测定试剂盒，也没有应用胶乳颗粒增强免疫比浊法来测定人体血液中C肽含量的相关报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题克服现有技术的不足，提供一种操作方便、价格低廉、可用于临床测定人血清中C肽含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其制备方法以及利用该试剂盒来检测人血清中C肽含量的方法，解决目前临床应用中C肽检测时间长、检测成本高、存在放射性污染的问题。 

为解决以上技术问题，本发明采取的一种技术方案是： 

一种测定血清中C肽含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂、第二试剂和校准品，其中： 

所述第一试剂的pH为7～8，包含缓冲液、电解质、表面活性剂、稳定剂、反应增强剂以及防腐剂； 

所述第二试剂的pH为7～8，包含缓冲液、电解质、表面活性剂、防腐剂以及包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，其中，所述包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径为40～500nm，通过将比原始亲代抗体高至少20倍的结合亲和力的C肽单克隆和/或多克隆抗体Fab片段标记到表面经过羧基化或氨基化基团修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒上得到，所述第二试剂中的所述包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒的质量含量为0.3%～0.5%； 

所述校准品的pH为7～8，包含缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂和人C肽蛋白。 

根据本发明，所述的C肽单克隆和/或多克隆抗体可以是羊源、兔源及鼠源中的一种或多种的组合。所使用的单克隆抗体可以为几种，多种抗人C肽单克隆抗体混合可以识别更多的抗原表位，从而在保证试剂盒特异性的同时提高试剂盒的灵敏度；本发明使用的高亲和力C肽单克隆抗体或多克隆抗体可以购买或根据已知方法自制，单克隆抗体可购自芬兰Medix Biochemica公司，多克隆抗体可购自美国Abcam公司或美国Abbiotec公司。 

进一步地，所述第一试剂、第二试剂以及校准品中，电解质的质量含量分别为3%～6%，表面活性剂的质量含量分别为0.8%～1.2%；第一试剂、校准品中，稳定剂的质量含量分别为0.1%～0.3%；第二试剂、所述校准品中，防腐剂的质量含量分别为0.005%～0.02%；第一试剂中的反应增强剂的质量含量为2%～6%。 

根据本发明，所述第一试剂、第二试剂以及校准品中所含的缓冲液可以独立地为选自Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸盐缓冲液及PIPES缓冲液中的一种；所述第一试剂、第二试剂中所含有的电解质为无机盐；所述第一试剂、第二试剂以及校准品中所含的表面活性剂可以独立地为选自Tween20、Tween40、Tween60、TritonX-100、Span40及Span80中的一种或多种的组合；所述第一试剂、校准品中所含的稳定剂可以独立地为选自蛋白质、金属螯合剂、混悬剂及抗氧化剂中的一种或多种的组合。 

优选的，所述无机盐为氯化钠、氯化镁或氯化镁；所述蛋白质为小牛血清、牛血清白蛋白或明胶；所述金属螯合剂为EDTA、EGTA、EDTP或DTPA；所述混悬剂为蔗糖、麦芽糖、乳糖、乙二醇或丙三醇。 

根据本发明，反应增强剂可以为选自聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000及聚凝胺中的一种或多种的组合。 

根据本发明，第一试剂、校准品中所含的防腐剂可以独立地为选自叠氮钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠及Proclin300中的一种或多种的组合。 

根据本发明，优选采用表面经羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒。致敏聚苯乙烯胶乳颗粒是通过交联剂将胶乳颗粒表面基团活化后再进行抗人C肽抗体的包被。羧基化的胶乳颗粒通过碳二亚胺（EDC或EDAC）进行活化，氨基化的胶乳颗粒通过戊二醛进行活化。 

根据本发明，所述第二试剂中的所述包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯 胶乳颗粒的质量含量优选为0.1%～1%； 

根据本发明，所述校准品中的人C肽蛋白可以是重组、胰岛素原纯化或化学合成中的一种或几种。 

本发明采取的又一技术方案是：一种上述的测定血清中C肽含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，其包括如下步骤： 

（1）、分别配制第一试剂和校准品； 

（2）、制备第二试剂：首先进行胶乳活化，然后向活化后的胶乳中加入所述高亲和力C肽单克隆和/或多克隆抗体进行标记，加入比例为2～6mg抗体每毫升胶乳，标记后，加入封闭缓冲液进行封闭，标记并封闭好的胶乳经清洗复溶得到胶乳原液，最后进一步对胶乳原液进行稀释至其中胶乳质量含量在0.1%～1%之间，即得第二试剂。 

上述的步骤（1）中，第一试剂和校准品的配制可采用本领域技术人员熟知的溶液配制方法。 

本发明还提供一种检测人血清中C肽含量的方法，该方法采用本发明上述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，通过胶乳增强免疫比浊法来进行检测，首先利用校准品进行多点定标制作校准曲线，校准点不少于4个，校准曲线采用Spline或Logit/log方程拟合，相关系数r≥0.990；然后对待测样本进行检测，检测实施如下：将第一试剂与待测样本混合均匀，37℃孵育至少3分钟后加入第二试剂，反应5分钟，记录反应0.5分钟后和5分钟后在检测波长为340nm～800nm下的吸光度值，计算出两个吸光度的差值，根据校准曲线计算出待测样本中C肽的含量。 

优选的，所述检测波长为450～700nm。 

由于采取以上技术方案，本发明与现有技术相比具有如下优点： 

本发明提供的试剂盒与目前临床使用试剂盒相比，特异性、灵敏度、准确性一致，且本发明的试剂盒适用于一般检测机构都具有的生化分析仪上使用，检测时间短、操作方便、检测成本低、无放射性污染，更适合临床推广使用。 

附图说明

图1为采用本发明的试剂盒进行人血清中C肽含量检测时所制作的校准曲线。 

图2显示了本发明的试剂盒与罗氏诊断产品（上海）有限公司生产的C肽检测试剂盒（电化学发光法）用于检测人血清C肽时的相关性。 

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明不限于以下实施例。 

实施例1 

本例提供第一试剂及其制备方法。 

（1）第一试剂的主要成分和浓度，参见下表： 

Tris缓冲液	pH7.5 40mM
		聚乙二醇6000	4%
氯化镁	5%
		Tween20	1%
TritonX-100	0.05%
		牛血清白蛋白	0.2%
EDTA	0.04%
		叠氮钠	0.01%

（2）、第一试剂的制备方法：按顺序依次加入相应浓度的上述成分于适当容器中，低速搅拌至全部溶解，调节pH至7.5，再加蒸馏水定容至所需体积，室温混合约30分钟，用0.45μm孔径滤器过滤，完成后2～8℃保存。第一试剂为无色或微黄色透明液体。 

实施例2 

本例提供第二试剂及其制备方法。 

（1）第二试剂的主要成分和浓度，参见下表： 

（2）第二试剂的制备方法： 

a)、胶乳活化：取适量胶乳，用10倍于胶乳体积的40mM Tris缓冲液（pH7.5）清洗，再用0.04M Tris缓冲液稀释至4倍体积，加入1倍胶乳体积的1%EDC均匀振摇活化，活化时间为30min； 

b）、抗体标记：活化好的胶乳中加入C肽抗体（加入比例为每ml胶乳2～6mg抗体）于37℃轻微均匀振摇2小时，再加入二分之一体积的封闭缓冲液于室温均匀摇晃2小时，其中封闭缓冲液主要成分及浓度见下表： 

牛血清白蛋白	Tris pH7.5	甘氨酸	Tween20
				0.2%	40mM	0.5%	1%

c）、清洗复溶：标记并封闭好的胶乳于20000rpm的条件下离心20min，弃去上清，再用0.04M Tris缓冲液（pH7.5）清洗复溶，重复3次，最后用胶乳贮存缓冲液稀释复溶至4倍胶乳体积，得到的胶乳原液于2～8℃保存待用，胶乳贮存缓冲液主要成分及浓度见下表： 

Tris pH7.5	牛血清白蛋白	Tween20	TritonX-100	叠氮钠
					40mM	0.2%	1%	0.05%	0.01%

d）、确定稀释比例：取胶乳原液小样进行测试，根据试样的结果确定稀释比例，优选控制胶乳浓度在0.3%～0.5%之间。 

e）、R2配制：取胶乳原液，根据确定的稀释比例加入胶乳贮存缓冲液，低速搅拌至全部混匀，2～8℃保存。制备好的第二试剂为乳白色液体。 

实施例3 

本例提供校准品及其制备方法。 

（1）校准品的主要成分和浓度，参见下表： 

C肽蛋白纯品	20ng/ml
		Tris缓冲液	pH7.540mM
牛血清白蛋白	0.2%
		Tween20	1%
TritonX-100	0.05%
		叠氮钠	0.01%

（2）校准品的制备方法：按顺序依次加入相应浓度的上述成分于适当容器中，低速搅拌至全部溶解，调节pH至7.5，再加蒸馏水定容至所需体积， 室温混合约30分钟，用0.45μm孔径滤器过滤，即制备完成最高浓度校准品。系列校准品可由最高浓度校准品通过倍比稀释得到。制备好的校准品短期放置时于2～8℃保存，长期放置时于零下20℃保存。校准品为微黄色透明液体。 

实施例4 

本例提供一种利用实施例1～3制备的试剂盒来检测人血清中C肽含量的方法，具体如下： 

样本量：10μl 

R1：R2=150μl:50μl 

测定波长：500nm 

测定温度：37℃ 

反应方向：上升反应 

分析方法：两点终点法 

校准曲线拟合函数：Spline、Polygon或Logit-Log 

操作步骤：先加入第一试剂和样本（校准品、质控品或临床标本），37℃孵育反应至少3分钟，再加入第二试剂，延迟约30秒，开始读数，读数时间约5分钟，ΔA=A2-A1。主波长500nm附近，不建议使用副波长。 

测定仪器：Beckman Au480全自动生化分析仪 

采用6点定标方法，校准品系列浓度依次为：0.0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml。 

试剂盒的校准曲线参见图1。 

1）选取罗氏诊断产品（上海）有限公司生产的C肽检测试剂盒（电化学发光法）进行对照试验，对20份样本同时进行了检测，结果如表1。 

表1（浓度：ng/ml） 

2）两种试剂盒的相关性如图2所示。 

上述试验结果表明：本发明能够有效检测出血清样本中C肽的含量（ng/ml），与目前临床上已在应用的化学发光法C肽测定试剂盒具有良好的一致性，而且本发明所述的C肽测定试剂盒检测时间短、方法简便、检测成本低，特别适合医疗机构推广使用。 

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。 

Claims (10)

1.一种测定血清中C肽含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂、第二试剂和校准品，其特征在于：

所述第一试剂的pH为7～8，包含缓冲液、电解质、表面活性剂、稳定剂、反应增强剂以及防腐剂；

所述第二试剂的pH为7～8，包含缓冲液、电解质、表面活性剂、防腐剂以及包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，其中，所述包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径为40～500nm，通过将比原始亲代抗体高至少20倍的结合亲和力的C肽单克隆和/或多克隆抗体Fab片段标记到表面经过羧基化或氨基化基团修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒上得到，所述第二试剂中的所述包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒的质量含量为0.1%～1%；

所述校准品的pH为7～8，包含缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂和人C肽蛋白。

2.根据权利要求1所述的测定血清中C肽含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述的C肽单克隆和/或多克隆抗体是羊源、兔源及鼠源中的一种或多种的组合。

3.根据权利要求1所述的测定血清中C肽含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述第一试剂、第二试剂以及校准品中，所述电解质的质量含量分别为3%～6%，所述表面活性剂的质量含量分别为0.8%～1.2%；所述第一试剂、校准品中，所述稳定剂的质量含量分别为0.1%～0.3%；所述第二试剂、所述校准品中，所述的防腐剂的质量含量分别为0.005%～0.02%；所述第一试剂中的反应增强剂的质量含量为2%～6%。

4.根据权利要求1所述的测定血清中C肽含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述第一试剂、第二试剂以及校准品中所含的缓冲液独立地为选自Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸盐缓冲液及PIPES缓冲液中的一种；所述第一试剂、第二试剂中所含有的电解质为无机盐；所述第一试剂、第二试剂以及校准品中所含的表面活性剂独立地为选自Tween20、Tween40、Tween60、TritonX-100、Span40及Span80中的一种或多种的组合；所述第一试剂、校准品中所含的稳定剂独立地为选自蛋白质、金属螯合剂、混悬剂及抗氧化剂中的一种或多种的组合。

5.根据权利要求4所述的测定血清中C肽含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述无机盐为氯化钠、氯化镁或氯化镁；所述蛋白质为小牛血清、牛血清白蛋白或明胶；所述金属螯合剂为EDTA、EGTA、EDTP或DTPA；所述混悬剂为蔗糖、麦芽糖、乳糖、乙二醇或丙三醇。

6.根据权利要求1或4所述的测定血清中C肽含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述的反应增强剂为选自聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000及聚凝胺中的一种或多种的组合。

7.根据权利要求1或4所述的测定血清中C肽含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述第一试剂、校准品中所含的防腐剂独立地为选自叠氮钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠及Proclin300中的一种或多种的组合。

8.一种如权利要求1～7中任一项权利要求所述的测定血清中C肽含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）、分别配制第一试剂和校准品；

（2）、制备第二试剂：首先进行胶乳活化，然后向活化后的胶乳中加入所述高亲和力C肽单克隆和/或多克隆抗体进行标记，加入比例为2～6mg抗体每毫升胶乳，标记后，加入封闭缓冲液进行封闭，标记并封闭好的胶乳经清洗复溶得到胶乳原液，最后进一步对胶乳原液进行稀释至其中胶乳质量含量在0.1%～1%之间，即得第二试剂。

9.一种检测人血清中C肽含量的方法，其特征在于：该方法采用权利要求1至7中任一项权利要求所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，通过胶乳增强免疫比浊法来进行检测，首先利用校准品进行多点定标制作校准曲线，校准点不少于4个，校准曲线采用Spline或Logit/log方程拟合，相关系数r≥0.990；然后对待测样本进行检测，检测实施如下：将第一试剂与待测样本混合均匀，37℃孵育至少3分钟后加入第二试剂，反应5分钟，记录反应0.5分钟后和5分钟后在检测波长为340nm～800nm下的吸光度值，计算出两个吸光度的差值，根据校准曲线计算出待测样本中C肽的含量。

10.根据权利要求9所述的检测人血清中C肽含量的方法，其特征在于：所述检测波长为450～700nm。