CN105675891A - 脂蛋白a(Lp(a))测定试剂盒 - Google Patents

脂蛋白a(Lp(a))测定试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为的缓冲液；所述的试剂R2为脂蛋白a(Lp(a))抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒与缓冲液的混合物。1.本发明的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。2.本发明采用的脂蛋白a(Lp(a))检测方法为胶乳增强免疫比浊法，该方法使得脂蛋白a(Lp(a))的检测更为经济、方便和快速，适用于绝大多数医院的自动生化分析仪，特别是对急诊能实现快速定量检测。

Description

脂蛋白a(Lp(a))测定试剂盒
技术领域
本发明是属于医学免疫领域，涉及一种免疫检测试剂，进一步说，本发明涉及脂蛋白a(Lp(a))测定试剂盒检测试剂盒。
背景技术
脂蛋白a测定试剂盒，该产品用于体外定量测定人血清中脂蛋白(a)（Lp(a)）含量，作辅助诊断用。脂蛋白(a)是一种独特的脂蛋白，脂质组成结构与LDL极其相似，因含有特殊的载脂蛋白(a)而得名。1987年发现脂蛋白(a)的一级结构与纤溶酶原具有显著同源性，其增高有导致血栓形成的倾向。Lp(a)体内水平高低与血脂、载脂蛋白不相关，是动脉粥样硬化性心脑疾病的重要的独立危险因素。对冠心病、急性心梗的发病、病程变化以及转归极具诊断价值。
诊断方法：Lp(a)的测定一般采用RIA法、ELISA法与CLlA法、乳胶免疫比浊法等，但在临床上多采用乳胶免疫比浊法
血清（含Lp(a)）+试剂（乳胶抗人Lp(a)抗体）━━━━抗原抗体复合物
产生浊度变化,在一定的波长下检测,其浊度的变化与其含量成正相关。
目前抗体与乳胶的连接通常使用化学偶联法，其作为R2试剂，非常容易发生聚结，使得试剂质量随着存放时间的延长而下降。使试剂的稳定性差。
发明内容
本发明根据R2试剂稳定性不佳，提供了一种方法来克服现有技术的不足，使得其保持质量稳定，提供了一种灵敏度高，稳定性好的脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种脂蛋白a(Lp(a))测定试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；
所述的试剂R2是用Lp(a)抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒置于缓冲液中，所述试剂R2的制备步骤包括：
步骤(1)：在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒(胶乳)中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDAC)，得到激活的胶乳颗粒；
步骤(2)：将步骤(1)激活的胶乳颗粒和Lp(a)抗体混合，待反应结束后再加入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球即Lp(a)抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于缓冲液中。
作为进一步优选：步骤(2)中Lp(a)抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒在试剂R2中的浓度为0.08～0.28克/100ml。
作为进一步优选：所述试剂R1中的缓冲液为PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液缓冲液中至少一种。
作为进一步优选：所述试剂R2中的缓冲液为PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液缓冲液中至少一种。
作为进一步优选：步骤(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺∶聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为0.2～5∶100。
作为进一步优选：所述Lp(a)抗体包括多克隆抗体或单克隆抗体。
作为进一步优选：所述步骤（1）中的聚苯乙烯胶乳颗粒其平均粒径在0.01~0.2mm之间。
本发明所述试剂盒所采用的检测原理为胶乳增强免疫透射比浊法，其原理是Lp(a)抗体的胶乳颗粒，与Lp(a)发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物形成所产生的浊度，即可测出Lp(a)的含量。
本发明的优点和有益效果：
1.本发明的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。
2.本发明采用的Lp(a)检测方法为胶乳增强免疫比浊法，该方法使得Lp(a)的检测更为经济、方便和快速，适用于绝大多数医院的自动生化分析仪，特别是对急诊能实现快速定量检测。
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。
实施例1：Lp(a)检测试剂盒的制备
本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下：
1.Lp(a)抗体：单克隆抗体(市售)。
2.胶乳：本发明仅示例性的采用直径为80～200nm带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒(市售)进行实验。
本实施例的主要试剂的配制如下：
试剂R1：含1.5％PEG6000(聚乙二醇6000)、95mmol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，该试剂为无色透明溶液。
试剂R2：用抗人Lp(a)抗体致敏粒径为80nm的聚苯乙烯胶乳颗粒。该试剂为乳白色溶液。具体步骤如下：
1.取1ml(100mg/ml)胶乳，用0.02M(mol/L)，pH5.0的MES溶液(2-吗啉乙磺酸缓冲液)洗涤3次，超声分散；
2.然后加入0.22ml用0.02M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的EDAC(配制的溶液中EDAC的浓度为10mg/ml)混合完全，室温混和15min；
3.然后用0.05M，pH5.0的MES溶液洗涤2次，0.1M，pH7.5的磷酸盐溶液洗涤1次，超声分散备用；
4.取2ml抗体(5mg/ml)溶液，加入0.3ml用0.02M，pH7.5的磷酸盐溶液配制，室温混合15min，
5.然后加入0.32ml10％BSA(小牛血清白蛋白)溶液，4℃混合4h；
6.再加入0.4ml10％葡萄糖溶液，4℃混合过夜；
7.然后用0.015M，pH7.5的甘氨酸溶液洗涤3次，再加入0.015M，pH7.5的甘氨酸溶液(含1％BSA，0.2％NaN3,15%庶糖，0.01%EDTA-Na2,0.01%trtonX-100的甘氨酸缓冲液)至胶乳(结合抗体以后的胶乳重量)终浓度为0.18％(质量体积比即0.18克/100ml)。
实施例2：Lp(a)的测定
检测工具：日立7060型自动分析仪。
分析方法：两点终点法；主波长：570nm，副波长：700nm：样品量：2ul(微升)；R1：200ul；R2：50ul；反应方向：上升；测定温度：37℃；样品与R1混匀后，于第10秒读取吸光度A1；于3～5min时加入R2，于5min后读取吸光度A2。反应吸光度的计算为A2与A1的差值。
计算方法：多点定标，根据吸光度与参考血清的值作剂量/响应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。
实施例3：Lp(a)检测试剂盒性能评价
1.分析灵敏度评估
采用5％牛血清白蛋白溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连续检测20次，计算20次结果的均值与标准差SD。以空白均值加两倍标准差(+2SD)作为报告方法的检测限。从表1可见，灵敏度为6.42mg/L。
表1
2.高值线性评估
将1份低值血清(10mg/L)和1份高值血清(1000mg/L)按9∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶9(样本顺序编号为1～6号)，制备出6个不同浓度样本，每个样本重复测定2次，从表2可见，
本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到901mg/L，判定依据r2≥0.990。
表2
3.精密度评估
使用2个不同Lp(a)含量的人血清样品，测定本发明检测试剂盒的批内精密度。使用3个批号试剂盒分别测定1个人血清样品20次，计算本发明检测试剂盒的批间相对极差。结果表明，本发明检测试剂盒的批内精密度为3.2％和2.8％(见表3)，而批间相对极差为3.04％(见表4)。
表3
表4
4.准确性(回收实验)评估
选择合适浓度的常规检测样本，分为体积相同的3份。在其中2份样本中加入不同量的待测物标准，制成2个不同加入浓度的回收样本，计算加入的待测物的浓度。在另一份样本中加入同样量的无被测物的溶剂，制成基础样本。对回收样本和基础样本进行3次重复测定分析，取其均值进行计算。(见表5)
表5
5.干扰试验
在同一份人血清样品中分别加入不同含量的干扰物质后进行测定。加入干扰物质后的测定值除以加入干扰物质前的测定值即为回收率，试验结果表明胆红素、血红蛋白、甘油三酯以及类风湿性因子的不同浓度以下时，对检测结果无显著干扰(以Lp(a)的回收率在90％～110％之间为准)。(见表6)。
表6
本发明的优点和有益效果：
1.本发明的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。
2.本发明采用的Lp(a)检测方法为胶乳增强免疫比浊法，该方法使得Lp(a)的检测更为经济、方便和快速，适用于绝大多数医院的自动生化分析仪，特别是对急诊能实现快速定量检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种脂蛋白a(Lp(a))测定试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；
所述的试剂R2是用Lp(a)抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒置于缓冲液中，所述试剂R2的制备步骤包括：
步骤(1)：在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒(胶乳)中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDAC)，得到激活的胶乳颗粒；
步骤(2)：将步骤(1)激活的胶乳颗粒和Lp(a)抗体混合，待反应结束后再加入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球即Lp(a)抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于缓冲液中。
2.根据权利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒，其特征在于：步骤(2)中Lp(a)抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒在试剂R2中的浓度为0.08～0.28克/100ml。
3.根据权利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的缓冲液为PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液缓冲液中至少一种。
4.根据权利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中的缓冲液为PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液缓冲液中至少一种。
5.根据权利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒，其特征在于：步骤(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺∶聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为0.2～5∶100。
6.根据权利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒，其特征在于：所述Lp(a)抗体包括多克隆抗体或单克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的脂蛋白a(Lp(a))检测试剂盒，其特征在于：所述步骤（1）中的聚苯乙烯胶乳颗粒其平均粒径在0.01~0.2mm之间。
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