CN109633172A - 基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白g检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,属于医学体外诊断技术领域。解决了如何提供一种检测线性范围宽,检测准确度高,检测稳定性好的人尿液免疫球蛋白G含量检测试剂盒的问题。本发明的试剂盒,包括R1试剂、R2试剂和校准品;R1试剂包括缓冲液、NaCl和防腐剂,R2试剂包括缓冲液、抗体偶联胶乳微球、保护剂和防腐剂,抗体为羊抗人免疫球蛋白多抗或兔抗人免疫球蛋白多抗,校准品由多个溶液组成,每个溶液均包括人免疫球蛋白G、缓冲液和防腐剂,不同溶液中人免疫球蛋白G的浓度不同。该试剂盒检测线性范围宽,检测准确度高,稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于医学体外诊断技术领域,具体涉及一种基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒。
背景技术
免疫球蛋白(Ig)指具有抗体(Ab)活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。免疫球蛋白G是血液中主要的免疫球蛋白,多数以单体形式存在,主要由脾脏和淋巴结合成,不能通过肾小球过滤,因此人体尿液中含量极低。
在肾小球滤过膜损伤较轻微时,尿液中以中分子量的尿微量白蛋白(MA)和转铁蛋白(TRF)滤出增多为主,随着肾小球滤过膜的损伤的加重,尿液中开始出现IgG,当肾小球滤过膜损伤较严重时,尿液中除IgG被滤出外,分子量较大的IgM也可被滤出。故临床上常采用同时测定尿液和血液中的TRF及IgG的含量,计算选择性蛋白尿指数(SPI),以此来评估肾小球滤过膜破坏程度及观察治疗效果和预后。选择性蛋白尿指数计算公式为:SPI=(尿IgG/血清IgG)/(尿TRF/血清TRF)。
尿内IgA在原发性肾小球肾病和慢性肾炎肾病时含量最高,在慢性肾炎高血压型及普通型可轻度增高,而在隐匿性肾炎及急性肾炎时含量很少;尿内IgG在原发性肾小球肾炎和慢性肾炎时含量较高,其他类型肾小球疾病时仅轻度增高;尿内IgM仅出现在慢性肾炎,而原发性肾小球肾炎和隐匿性肾炎时含量甚微。故可分析尿内Ig增高的类型来帮助鉴别诊断肾小球疾病的种类。
目前国内外市场上检测免疫球蛋白G的方法有ELISA和免疫比浊法。但这两种方法都存在一定的缺陷,随着人们对检测准确性、稳定性等提出了更高的要求,现有技术中的检测方法已无法满足人们的需求。
发明内容
本发明的目的是解决如何提供一种检测线性范围宽,检测准确度高,检测稳定性好的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒的问题。
本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下。
本发明的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,包括R1试剂、R2试剂和校准品;
所述R1试剂包括缓冲液、NaCl和防腐剂;
所述R2试剂包括缓冲液、抗体偶联胶乳微球、保护剂和防腐剂,抗体为羊抗人免疫球蛋白多抗或兔抗人免疫球蛋白多抗;
所述校准品由多个溶液组成,每个溶液均包括人免疫球蛋白G、缓冲液和防腐剂,不同溶液中人免疫球蛋白G的浓度不同。
优选的,所述R2试剂中,还包括活化剂,活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC),活化剂与胶乳微球的质量比为1:(20~50)。
优选的,所述R2试剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤一、向试剂瓶中加入胶乳微球、缓冲液和抗体,放置于混匀器上混匀60min以上,12000rmp/min离心20min,弃上清;
步骤二、向步骤一弃去上清液的试剂瓶中加入含有活化剂的缓冲液,12000rmp/min离心20min弃上清;
步骤三、将步骤二得到的试剂瓶放置于混匀器上混匀60min,加入缓冲液、保护剂和防腐剂,超声,超声条件为:功率500W,超声5s,间隔5s,超声时间共20min,得到R2试剂。
优选的,所述R1试剂中,NaCl的浓度为0.6%~1.2%。
优选的,所述R2试剂中,胶乳微球的粒径为95nm、130nm、150nm、172nm、200nm中的一种或几种。
优选的,所述R2试剂中,抗体偶联胶乳微球的浓度为0.05~0.3%,抗体和胶乳微球质量比为(10~30):1。
优选的,所述R2试剂中,保护剂为酪蛋白、BSA、脱脂奶粉、蔗糖、甘氨酸中的一种或几种,保护剂的浓度为0.2~1%。
优选的,所述R1试剂和R2试剂中,缓冲液分别为Tris-Hcl、PBS、MES或HEPES,缓冲液的浓度为20~200mM。
优选的,所述R1试剂、R2试剂和校准品中,防腐剂分别为叠氮纳、硫柳贡、庆大霉素、Proclin 300中的一种或几种;防腐剂的浓度为0.02%~0.25%。
优选的,所述校准品的多个溶液中,人免疫球蛋白G浓度分别为0mg/L、6.25mg/L、12.5mg/L、37.5mg/L、75mg/L和150mg/L。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明提供的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,通过胶乳增强免疫比浊法检测人尿液免疫球蛋白G的含量。
本发明提供的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,试剂为液体即用型,减少了人工稀释等步骤,节约成本,且试剂稳定性好,重复性好。
本发明提供的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,检测线性范围宽,其线性范围为2~150mg/L,最高可检测浓度为150mg/L的样本。
本发明提供的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,检测准确度高,准确度可溯源到国际参考物质ERM-DA470K,精密度<10%,可以满足临床需要。
本发明提供的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,经济适用,可以配套大多数自动生化分析仪的使用,便于推广。
附图说明
图1为本发明实施例1的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒的校准曲线;
图2为本发明实施例1的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒的线性范围检测图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明,下面对本发明优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限制。
本发明的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,包括R1试剂、R2试剂和校准品;R1试剂包括缓冲液、NaCl和防腐剂;R2试剂包括缓冲液、抗体偶联胶乳微球、保护剂和防腐剂,还可以包括活化剂;校准品由多个溶液组成,每个溶液均包括人免疫球蛋白G、缓冲液和防腐剂,不同溶液中人免疫球蛋白G的浓度不同。
上述技术方案R1试剂中:NaCl的浓度为0.6%~1.2%;缓冲液优选为Tris-Hcl、PBS、MES或HEPES,更优选为HEPES,缓冲液的浓度为20~200mM;防腐剂优选为叠氮纳、硫柳贡、庆大霉素、Proclin 300中的一种或几种,更优选为Proclin 300,防腐剂的浓度为0.02%~0.25%。
上述技术方案R2试剂中:抗体偶联胶乳微球的浓度为0.05~0.3%,抗体偶联胶乳微球中,抗体和胶乳微球质量比优选为(10~30):1。抗体为羊抗人免疫球蛋白多抗或兔抗人免疫球蛋白多抗,优选为羊抗人免疫球蛋白多抗。胶乳微球为现有技术,没有特殊限制,优选为羟基微球,胶乳微球的粒径优选为95nm、130nm、150nm、172nm、200nm中的一种或几种,更优选为130nm。活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,活化剂与胶乳微球质量比为1:(20~50)。缓冲液优选为Tris-Hcl、PBS、MES或HEPES,更优选为HEPES;缓冲液的浓度为20~200mM。防腐剂优选为叠氮纳、硫柳贡、庆大霉素、Proclin300中的一种或几种,更优选为Proclin 300;防腐剂的浓度为0.02%~0.25%。保护剂优选为酪蛋白、BSA、脱脂奶粉、蔗糖、甘氨酸中的一种或几种,更优选为BSA;保护剂的浓度为0.2~1%。
上述技术方案校准品中,缓冲液优选为Tris-HCl、PBS、MES和HEPES中的一种或几种,更优选为Tris-HCl;缓冲液的浓度为20~200mM。防腐剂优选为叠氮钠、硫柳贡、庆大霉素或Proclin 300,更优选为叠氮纳;防腐剂的浓度为0.02%~0.25%。校准品的多个溶液中,人免疫球蛋白G浓度优选分别为0mg/L、6.25mg/L、12.5mg/L、37.5mg/L、75mg/L和150mg/L。
上述试剂盒的制备中,R1试剂和校准品的制备根据需要配制即可,没有特殊限制,R2试剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤一、向试剂瓶中加入胶乳微球、缓冲液和抗体,放置于混匀器上混匀60min以上,12000rmp/min离心20min,弃上清;
步骤二、向步骤一弃去上清液的试剂瓶中加入含有活化剂的缓冲液,12000rmp/min离心20min,弃上清;
步骤三、将步骤二得到的试剂瓶放置于混匀器上混匀60min,加入缓冲液、保护剂和防腐剂,超声,超声条件为:功率500W,超声5s,间隔5s,超声时间共20min,得到R2试剂;
需要说明的是,R2试剂中各原料的用量,以最终满足上述对试剂盒R2试剂中各物质的限制为准,具体根据实际进行计算。
以下结合实施例进一步说明本发明。在以下实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1
基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,包括R1试剂、R2试剂和校准品;
R1试剂,由25mM Tris-HCl、1%NaCl和0.1%Proclin 300组成,pH为7.5±0.05(25±1℃);
R2试剂,由0.4%BSA、0.1%Proclin 300、0.2%抗体偶联胶乳微球(抗体与胶乳微球的质量比为1:10)和25mM HEPES缓冲液组成,pH为7.5±0.05(25±1℃);
校准品,由多个溶液组成,每个溶液均包括人免疫球蛋白G、20mM PBS和0.1%Procline300,人免疫球蛋白G的浓度分别为0mg/L、6.25mg/L、12.5mg/L、37.5mg/L、75mg/L和150mg/L。
上述基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒的制备,R1试剂和校准品根据需要配置即可,R2试剂的制备方法为:
步骤一、向试剂瓶中依次加入400μl胶乳微球液体(羧基微球,JSR厂家,胶乳微球浓度10%、粒径130nm),7ml MES缓冲液和0.8ml羊抗人IgG多抗(抗体与胶乳微球的质量比为1:10),放置于混匀器上混匀60min,12000rmp/min离心20min,弃上清;
步骤二、向步骤一弃去上清液的试剂瓶中加入0.8ml含有25mg/mL EDC的MES缓冲液(活化剂与胶乳微球的质量比为1:40),12000rmp/min离心20min,弃上清;
步骤三、将超声完的试剂瓶放置于混匀器上混匀60min,加入20ml HEPES缓冲液、BSA和Proclin 300,超声,超声条件为:功率500W,超声5s,间隔5s,超声时间共20min,得到R2试剂,BSA终浓度为0.4%和Proclin 30终浓度为0.1%。
对实施例1的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒的性能进行检测。
1.1检测线性范围
打开全自动生化分析仪,预热15min,在全自动生化分析仪上添加项目,设置项目参数,登记试剂位,放置R1试剂和R2试剂,测试试剂余量,保证R1试剂和R2试剂均≥15mL/瓶。取出校准品,用全自动生化分析仪对六个校准品进行检测,将吸光度变化率和对应校准品的浓度采取对数线性方程做出标准曲线,如图1所示。将接近线性范围上限(150mg/L)的高值浓度尿液样本按一定比例稀释为至少五种浓度,稀释后,低值浓度尿液样本须接近线性范围的下限(0mg/L)。对每一浓度样本均重复检测两次,计算平均值,结果如表1所示。表1样本的浓度及测试结果
从表1可以看出,在0.2mg/L~150mg/L内满足线性稀释实测值与估计值偏差小于10%,说明线性合格。
将表1中的平均值和样本的稀释比例用最小二乘法进行直线拟合,并计算线性相关系数R2,结果如图2所示。
1.2重复性
用同一批号的实施例1的试剂盒,对两个不同浓度的尿液样品(尿液样本0~10mg/L与尿液样本12~150mg/L)分别重复测定10次,计算10次测定结果的平均值(M)和标准差(SD),根据下列公式得出变异系数。
表2样本1和样本2的多次测量结果
表2中,CV为变异系数,CV=SD/M×100%,SD为10次测量结果的标准差,M为10次测量结果的平均值。从表2中可以看出,本发明的试剂盒的检测结果相对偏差小于5%,重复性符合要求。
1.3稳定性考察
1.3.1加速稳定性:将同一批次的实施例1的试剂盒一部分冷藏(2~8℃,另一部分放置于37℃恒温箱中,并分别在第3天、第5天和第8天取出,与冷藏组同时进行测试(加速组从恒温箱中取出后,放置和冷藏组至相同温度再进行测测试,测试样本为2.9mg/L正常水平尿液样本与15mg/L正常水平尿液样本(也可以测量异常水平尿液或质控品),重复测试3次,结果如表3所示。
表3实施例1的试剂盒的加速稳定性的检测结果
1.3.1机载稳定性:将同一批次的实施例1的试剂盒一部分冷藏(2~8℃),另一部分开瓶后放置于生化分析仪中,开瓶后的试剂盒分别在第7、14、21、28天从生化分析仪中取出与冷藏试剂盒同时测试。
表4实施例1的试剂盒的机械稳定性的检测结果
从表3和4可以看出,本发明的试剂盒在37℃高温环境下可稳定8天,4度条件下可以稳定28天,说明稳定性很好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应该指出:对于本技术领域的技术人员来应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例只是说明发明原理和优选实施方式,在不脱离发明范围的前提下本发明还会有各种改进,这些改进和润饰都落入要求保护的本发明内。
Claims (10)
1.基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,其特征在于,包括R1试剂、R2试剂和校准品;
所述R1试剂包括缓冲液、NaCl和防腐剂;
所述R2试剂包括缓冲液、抗体偶联胶乳微球、保护剂和防腐剂,抗体为羊抗人免疫球蛋白多抗或兔抗人免疫球蛋白多抗;
所述校准品由多个溶液组成,每个溶液均包括人免疫球蛋白G、缓冲液和防腐剂,不同溶液中人免疫球蛋白G的浓度不同。
2.根据权利要求1所述的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,其特征在于,所述R2试剂中,还包括活化剂,活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,活化剂与胶乳微球的质量比为1:(20~50)。
3.根据权利要求1所述的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,其特征在于,所述R2试剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤一、向试剂瓶中加入缓冲液、胶乳微球和抗体,放置于混匀器上混匀60min以上,12000rmp/min离心20min,弃上清;
步骤二、向步骤一弃去上清液的试剂瓶中加入含有活化剂的缓冲液,12000rmp/min离心20min,弃上清;
步骤三、将步骤二得到的试剂瓶放置于混匀器上混匀60min,加入缓冲液、保护剂和防腐剂,超声,超声条件为:功率500W,超声5s,间隔5s,超声时间共20min,得到R2试剂。
4.根据权利要求1或2所述的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,其特征在于,所述R1试剂中,NaCl的浓度为0.6%~1.2%。
5.根据权利要求1或2所述的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,其特征在于,所述R2试剂中,胶乳微球的粒径为95nm、130nm、150nm、172nm、200nm中的一种或几种。
6.根据权利要求1或2所述的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,其特征在于,所述R2试剂中,抗体偶联胶乳微球的浓度为0.05~0.3%,抗体和胶乳微球质量比为(10~30):1。
7.根据权利要求1或2所述的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,其特征在于,所述R2试剂中,保护剂为酪蛋白、BSA、脱脂奶粉、蔗糖、甘氨酸中的一种或几种,保护剂的浓度为0.2~1%。
8.根据权利要求1或2所述的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,其特征在于,所述R1试剂、R2试剂和校准品中,缓冲液分别为Tris-HCl、PBS、MES和HEPES中的一种或几种,浓度为20~200mM。
9.根据权利要求1或2所述的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,其特征在于,所述R1试剂、R2试剂和校准品中,防腐剂分别为叠氮钠、硫柳贡、庆大霉素或Proclin 300,浓度为0.02%~0.25%。
10.根据权利要求1或2所述的基于乳胶增强免疫比浊法的人尿液免疫球蛋白G检测试剂盒,其特征在于,所述校准品的多个溶液中,人免疫球蛋白G浓度分别为0mg/L、6.25mg/L、12.5mg/L、37.5mg/L、75mg/L和150mg/L。
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