CN106053862A - 血清淀粉样蛋白a（saa）测定试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒及其测定方法，属于医学生物检测技术领域。该试剂盒包括试剂1、试剂2、校准品及质控品，试剂1包含Tris‑HCl、叠氮钠、PEG‑6000，试剂2包含Tris‑HCl、包被了抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒、叠氮钠、辛基苯酚聚氧乙烯和尼泊金甲酯，校准品包含血清淀粉样蛋白A抗原、叠氮钠，质控品包含血清淀粉样蛋白A抗原、叠氮钠。本发明提供的一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒及其测定方法，采用胶乳免疫比浊技术，具有分析灵敏度高、结果准确、操作简单、成本适合等优点，便于推广。

Description

血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒
技术领域
本发明属医学生物检测技术领域，具体涉及一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒及其使用方法。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A，SAA)是一种急性时限反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子量约12 000。在急性时限反应中，经IL-1、IL-6和TNF刺激，SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，可升高到最初浓度的100-1000倍，但半衰期极短，只有50分钟左右。血清淀粉样蛋白A与高密度脂蛋白(HDL)有关，它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢。血清淀粉样蛋白A一个特别重要的特性是其降解产物能以淀粉样蛋白A(AA)原纤维的方式沉积在不同的器官中，在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症。
与C反应蛋白(CRP)类似，血清淀粉样蛋白A的含量浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标，有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗。但是，血清淀粉样蛋白A检测在诊断发生病毒感染、肾移植排斥反应的患者(特别是进行免疫抑制治疗的患者)以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面，比C反应蛋白更确凿。研究发现，在患炎性关节炎的案例中，血清淀粉样蛋白A与疾病活动性的关系最密切。同时检测C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A能提高对感染的诊断灵敏度。对于淀粉样蛋白A淀粉样变性患者，以将血清淀粉样蛋白A水平回复至正常为宗旨的治疗，能改善病情。
目前已知检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒较少，方法也存在较大的缺陷，如测定灵敏度不足，操作繁琐，成本昂贵等，均不利于临床推广使用。
发明内容
本发明提供一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒。
本发明还提供上述试剂盒的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒，它包括：试剂1(缓冲液)、试剂2(反应液)、校准品及质控品。
上述血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒，具体包括如下组分：
(1)试剂1：Tris 100mM，叠氮钠5g/L，PEG-6000 4g/L，PH值为8.1；
(2)试剂2：Tris 100mM，叠氮钠1g/L，辛基苯酚聚氧乙烯1g/L，尼泊金甲酯1g/L，抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L，PH值为6.0；
(3)校准品：水平1含血清淀粉样蛋白A抗原6.25mg/L，叠氮钠5g/L，水平2含血清淀粉样蛋白A抗原12.5mg/L，叠氮钠5g/L，水平3含血清淀粉样蛋白A抗原25mg/L，叠氮钠5g/L，水平4含血清淀粉样蛋白A抗原50mg/L，叠氮钠5g/L；
(4)质控品：血清淀粉样蛋白A抗原10mg/L，叠氮钠5g/L。
所述的试剂1、试剂2、校准品及质控品的溶剂为电导率(25℃)不大于0.1mS/m的纯净水。
所述的抗人血清淀粉样蛋白A抗体为兔抗人多克隆抗体。
所述的胶乳颗粒为粒径为80-100nm。
所述的PH值调节试剂为1mM的盐酸溶液。
所述检测试剂盒用于定量测定血清中血清淀粉样蛋白A的含量。
本发明第二方面提供所述测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
1)准备编号为1、2、3、4的4支反应管；
2)同时在第1反应管内加入试剂1 150μL，水平1校准品3μL混合均匀，在第2反应管内加入试剂1 150μL，水平2校准品3μL混合均匀，在第3反应管内加入试剂1 150μL，水平3校准品3μL混合均匀，在第4反应管内加入试剂1 150μL，水平4校准品3μL混合均匀，4支反应管均孵育5分钟；
3)5分钟孵育结束后，同时在第1反应管内加入试剂2 150μL混合均匀，在第2反应管内加入试剂2 150μL混合均匀，在第3反应管内加入试剂2 150μL混合均匀，在第4反应管内加入试剂2 150μL混合均匀，均孵育半分钟；
4)半分钟孵育结束后，分别读取1、2、3、4反应管吸光度A11,A12,A13,A14；
5)继续孵育5分钟后，再次分别读取1、2、3、4反应管吸光度A21,A22,A23,A24；
6)分别以4个不同浓度水平校准品浓度为横坐标，以(A21-A11)、(A22-A12)、(A23-A13)、(A24-A14)为纵坐标作一标准曲线图；
7)再次准备1支反应管，在反应管内加入试剂1 150μL，检测样本3μL混合均匀并孵育5分钟；
8)5分钟孵育结束后，在反应管内加入试剂2 150μL混合均匀并孵育半分钟，读取吸光度A1；
9)继续孵育5分钟，读取吸光度A2；
10)计算A2-A1，然后在标准曲线上找出对应的浓度值，即为样本中血清淀粉样蛋白A的含量。
所述的反应孵育温度为37℃。
本发明的有益效果为：
本发明所提供的一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒，采用胶乳免疫比浊技术，并提供配套的校准品及质控品，具有测定结果准确、检测灵敏度高、方便快捷、稳定性好、特异性高、成本低廉等优点，利于临床推广使用。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：抗血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒制备
1)配制50mM的MES缓冲液，PH值为6.0；
2)用上述MES缓冲液稀释胶乳微球，浓度为1％(v/v)；
3)在胶乳微球悬浮液中加入EDAC，加入浓度为40mg/ml,在室温孵育40分钟；
4)用相同体积的MES缓冲液洗涤胶乳微球，然后13000g/min离心30分钟，再次用相同体积的MES缓冲液洗涤胶乳微球，然后13000g/min离心30分钟，然后再将胶乳微球溶于MES缓冲液中；
5)将兔抗人血清淀粉样蛋白A抗体溶于上述MES缓冲液中，浓度为1mg/mL；
6)将抗体溶液和胶乳微球悬浮液混合，37℃搅拌反应3小时；
7)在混合液中加入乙醇胺，加入量为2.5μL/mL，搅拌反应10分钟；
8)除去未结合的抗体，将包被好的抗体胶乳颗粒贮存在MES缓冲液中。
实施例2：试剂盒的制备方法
(1)试剂1：Tris 100mM，叠氮钠5g/L，PEG-6000 4g/L，PH值为8.1；
(2)试剂2：Tris 100mM，叠氮钠1g/L，辛基苯酚聚氧乙烯1g/L，尼泊金甲酯1g/L，抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L，PH值为6.0；
(3)校准品：水平1含血清淀粉样蛋白A抗原6.25mg/L，叠氮钠5g/L，水平2含血清淀粉样蛋白A抗原12.5mg/L，叠氮钠5g/L，水平3含血清淀粉样蛋白A抗原25mg/L，叠氮钠5g/L，水平4含血清淀粉样蛋白A抗原50mg/L，叠氮钠5g/L；
(4)质控品：血清淀粉样蛋白A抗原10mg/L，叠氮钠5g/L。
实施例3：检测方法
本实施例描述的血清淀粉样蛋白A测定试剂盒，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动生化分析仪等，利用两点终点法进行测定。将试剂1和试剂2按1：1放于仪器试剂位上，在样本盘相应位置上放置好纯净水、校准品和样本，操作如下表：
表1 实施例2试剂检测方法
计算：SAA含量(mg/L)＝ΔA测定/ΔA测定×C标准
实施例4：分析灵敏度验证实验
用实施例2试剂盒测定已知浓度的样本，记录吸光度差值。检测结果如表2所示。
表2 分析灵敏度实验结果
测定浓度(mg/L) 实施例1检测结果ΔA
2.0 0.0097
8.0 0.0156
全自动生化分析仪在吸光度大于0.001时均可准确的获得检测结果，且仪器噪音对检测结果影响较少。本实验在参考范围下限(2.0mg/L)及参考范围上限(8.0mg/L)均取得了远大于0.001的吸光度，说明本发明试剂盒具有很好的分析灵敏度，能很好的满足临床检测需求。
实施例5：稳定性研究
(1)在2-8℃储存条件下，分别在0个月、12个月和24个月对同一标准品样本(血清淀粉样蛋白A抗原含量2.0mg/L)进行测定，每个样本测定10次，取均值。结果表明(见表3)，测值差异非常小，说明实施例2制备的检测试剂盒在2-8度储存条件下至少可以稳定24个月以上。
对比例试剂盒除试剂2组成与实施例2存在区别外，其他均同实施例2，具体如下：
对比例1：试剂2组成为：Tris 100mM，叠氮钠2g/L，BSA 1g/L，抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L，PH值为7.5；
对比例2：试剂2组成为：Tris 100mM，叠氮钠1g/L，抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L，PH值为6.0；
对比例3：试剂2组成为：Tris 100mM，叠氮钠1g/L，尼泊金甲酯1g/L，抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L，PH值为6.0；
对比例4：试剂2组成为：Tris 100mM，叠氮钠1g/L，辛基苯酚聚氧乙烯1g/L，抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L，PH值为6.0。
(2)将上述试剂盒中的试剂2在37℃下放置7天，通过仪器检测放置3天和7天后的试剂2本身的吸光度变化(A检测-A0天)，具体如下：
3天后吸光度变化 7天后吸光度变化
实施例2 0.0004 0.0007
对比例1 0.0011 0.0024
对比例2 0.0012 0.0019
对比例3 0.0017 0.0028
对比例4 0.0009 0.0018

Claims (5)

1.一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒，它包括：试剂1(缓冲液)、试剂2(反应液)、校准品及质控品。
2.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒，其特征在于，所述试剂1组成为：Tris 100mM，叠氮钠5g/L，PEG-6000 4g/L，PH值为8.1。
3.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒，其特征在于，所述试剂2组成为：Tris 100mM，叠氮钠1g/L，辛基苯酚聚氧乙烯1g/L，尼泊金甲酯1g/L，抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L，PH值为6.0。
4.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒，其特征在于，所述校准品为：水平1含血清淀粉样蛋白A抗原6.25mg/L，叠氮钠5g/L，水平2含血清淀粉样蛋白A抗原12.5mg/L，叠氮钠5g/L，水平3含血清淀粉样蛋白A抗原25mg/L，叠氮钠5g/L，水平4含血清淀粉样蛋白A抗原50mg/L，叠氮钠5g/L。
5.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒，其特征在于，所述质控品为：血清淀粉样蛋白A抗原10mg/L，叠氮钠5g/L。
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