CN106053862A - 血清淀粉样蛋白a(saa)测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒及其测定方法,属于医学生物检测技术领域。该试剂盒包括试剂1、试剂2、校准品及质控品,试剂1包含Tris‑HCl、叠氮钠、PEG‑6000,试剂2包含Tris‑HCl、包被了抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒、叠氮钠、辛基苯酚聚氧乙烯和尼泊金甲酯,校准品包含血清淀粉样蛋白A抗原、叠氮钠,质控品包含血清淀粉样蛋白A抗原、叠氮钠。本发明提供的一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒及其测定方法,采用胶乳免疫比浊技术,具有分析灵敏度高、结果准确、操作简单、成本适合等优点,便于推广。
Description
技术领域
本发明属医学生物检测技术领域,具体涉及一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒及其使用方法。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA)是一种急性时限反应蛋白,属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质,相对分子量约12 000。在急性时限反应中,经IL-1、IL-6和TNF刺激,SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成,可升高到最初浓度的100-1000倍,但半衰期极短,只有50分钟左右。血清淀粉样蛋白A与高密度脂蛋白(HDL)有关,它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢。血清淀粉样蛋白A一个特别重要的特性是其降解产物能以淀粉样蛋白A(AA)原纤维的方式沉积在不同的器官中,在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症。
与C反应蛋白(CRP)类似,血清淀粉样蛋白A的含量浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标,有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗。但是,血清淀粉样蛋白A检测在诊断发生病毒感染、肾移植排斥反应的患者(特别是进行免疫抑制治疗的患者)以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面,比C反应蛋白更确凿。研究发现,在患炎性关节炎的案例中,血清淀粉样蛋白A与疾病活动性的关系最密切。同时检测C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A能提高对感染的诊断灵敏度。对于淀粉样蛋白A淀粉样变性患者,以将血清淀粉样蛋白A水平回复至正常为宗旨的治疗,能改善病情。
目前已知检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒较少,方法也存在较大的缺陷,如测定灵敏度不足,操作繁琐,成本昂贵等,均不利于临床推广使用。
发明内容
本发明提供一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒。
本发明还提供上述试剂盒的检测方法。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒,它包括:试剂1(缓冲液)、试剂2(反应液)、校准品及质控品。
上述血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒,具体包括如下组分:
(1)试剂1:Tris 100mM,叠氮钠5g/L,PEG-6000 4g/L,PH值为8.1;
(2)试剂2:Tris 100mM,叠氮钠1g/L,辛基苯酚聚氧乙烯1g/L,尼泊金甲酯1g/L,抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L,PH值为6.0;
(3)校准品:水平1含血清淀粉样蛋白A抗原6.25mg/L,叠氮钠5g/L,水平2含血清淀粉样蛋白A抗原12.5mg/L,叠氮钠5g/L,水平3含血清淀粉样蛋白A抗原25mg/L,叠氮钠5g/L,水平4含血清淀粉样蛋白A抗原50mg/L,叠氮钠5g/L;
(4)质控品:血清淀粉样蛋白A抗原10mg/L,叠氮钠5g/L。
所述的试剂1、试剂2、校准品及质控品的溶剂为电导率(25℃)不大于0.1mS/m的纯净水。
所述的抗人血清淀粉样蛋白A抗体为兔抗人多克隆抗体。
所述的胶乳颗粒为粒径为80-100nm。
所述的PH值调节试剂为1mM的盐酸溶液。
所述检测试剂盒用于定量测定血清中血清淀粉样蛋白A的含量。
本发明第二方面提供所述测定试剂盒的检测方法,包括如下步骤:
1)准备编号为1、2、3、4的4支反应管;
2)同时在第1反应管内加入试剂1 150μL,水平1校准品3μL混合均匀,在第2反应管内加入试剂1 150μL,水平2校准品3μL混合均匀,在第3反应管内加入试剂1 150μL,水平3校准品3μL混合均匀,在第4反应管内加入试剂1 150μL,水平4校准品3μL混合均匀,4支反应管均孵育5分钟;
3)5分钟孵育结束后,同时在第1反应管内加入试剂2 150μL混合均匀,在第2反应管内加入试剂2 150μL混合均匀,在第3反应管内加入试剂2 150μL混合均匀,在第4反应管内加入试剂2 150μL混合均匀,均孵育半分钟;
4)半分钟孵育结束后,分别读取1、2、3、4反应管吸光度A11,A12,A13,A14;
5)继续孵育5分钟后,再次分别读取1、2、3、4反应管吸光度A21,A22,A23,A24;
6)分别以4个不同浓度水平校准品浓度为横坐标,以(A21-A11)、(A22-A12)、(A23-A13)、(A24-A14)为纵坐标作一标准曲线图;
7)再次准备1支反应管,在反应管内加入试剂1 150μL,检测样本3μL混合均匀并孵育5分钟;
8)5分钟孵育结束后,在反应管内加入试剂2 150μL混合均匀并孵育半分钟,读取吸光度A1;
9)继续孵育5分钟,读取吸光度A2;
10)计算A2-A1,然后在标准曲线上找出对应的浓度值,即为样本中血清淀粉样蛋白A的含量。
所述的反应孵育温度为37℃。
本发明的有益效果为:
本发明所提供的一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒,采用胶乳免疫比浊技术,并提供配套的校准品及质控品,具有测定结果准确、检测灵敏度高、方便快捷、稳定性好、特异性高、成本低廉等优点,利于临床推广使用。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:抗血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒制备
1)配制50mM的MES缓冲液,PH值为6.0;
2)用上述MES缓冲液稀释胶乳微球,浓度为1%(v/v);
3)在胶乳微球悬浮液中加入EDAC,加入浓度为40mg/ml,在室温孵育40分钟;
4)用相同体积的MES缓冲液洗涤胶乳微球,然后13000g/min离心30分钟,再次用相同体积的MES缓冲液洗涤胶乳微球,然后13000g/min离心30分钟,然后再将胶乳微球溶于MES缓冲液中;
5)将兔抗人血清淀粉样蛋白A抗体溶于上述MES缓冲液中,浓度为1mg/mL;
6)将抗体溶液和胶乳微球悬浮液混合,37℃搅拌反应3小时;
7)在混合液中加入乙醇胺,加入量为2.5μL/mL,搅拌反应10分钟;
8)除去未结合的抗体,将包被好的抗体胶乳颗粒贮存在MES缓冲液中。
实施例2:试剂盒的制备方法
(1)试剂1:Tris 100mM,叠氮钠5g/L,PEG-6000 4g/L,PH值为8.1;
(2)试剂2:Tris 100mM,叠氮钠1g/L,辛基苯酚聚氧乙烯1g/L,尼泊金甲酯1g/L,抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L,PH值为6.0;
(3)校准品:水平1含血清淀粉样蛋白A抗原6.25mg/L,叠氮钠5g/L,水平2含血清淀粉样蛋白A抗原12.5mg/L,叠氮钠5g/L,水平3含血清淀粉样蛋白A抗原25mg/L,叠氮钠5g/L,水平4含血清淀粉样蛋白A抗原50mg/L,叠氮钠5g/L;
(4)质控品:血清淀粉样蛋白A抗原10mg/L,叠氮钠5g/L。
实施例3:检测方法
本实施例描述的血清淀粉样蛋白A测定试剂盒,在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪,如日立7180全自动生化分析仪等,利用两点终点法进行测定。将试剂1和试剂2按1:1放于仪器试剂位上,在样本盘相应位置上放置好纯净水、校准品和样本,操作如下表:
表1 实施例2试剂检测方法
计算:SAA含量(mg/L)=ΔA测定/ΔA测定×C标准
实施例4:分析灵敏度验证实验
用实施例2试剂盒测定已知浓度的样本,记录吸光度差值。检测结果如表2所示。
表2 分析灵敏度实验结果
测定浓度(mg/L) | 实施例1检测结果ΔA |
2.0 | 0.0097 |
8.0 | 0.0156 |
全自动生化分析仪在吸光度大于0.001时均可准确的获得检测结果,且仪器噪音对检测结果影响较少。本实验在参考范围下限(2.0mg/L)及参考范围上限(8.0mg/L)均取得了远大于0.001的吸光度,说明本发明试剂盒具有很好的分析灵敏度,能很好的满足临床检测需求。
实施例5:稳定性研究
(1)在2-8℃储存条件下,分别在0个月、12个月和24个月对同一标准品样本(血清淀粉样蛋白A抗原含量2.0mg/L)进行测定,每个样本测定10次,取均值。结果表明(见表3),测值差异非常小,说明实施例2制备的检测试剂盒在2-8度储存条件下至少可以稳定24个月以上。
对比例试剂盒除试剂2组成与实施例2存在区别外,其他均同实施例2,具体如下:
对比例1:试剂2组成为:Tris 100mM,叠氮钠2g/L,BSA 1g/L,抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L,PH值为7.5;
对比例2:试剂2组成为:Tris 100mM,叠氮钠1g/L,抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L,PH值为6.0;
对比例3:试剂2组成为:Tris 100mM,叠氮钠1g/L,尼泊金甲酯1g/L,抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L,PH值为6.0;
对比例4:试剂2组成为:Tris 100mM,叠氮钠1g/L,辛基苯酚聚氧乙烯1g/L,抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L,PH值为6.0。
(2)将上述试剂盒中的试剂2在37℃下放置7天,通过仪器检测放置3天和7天后的试剂2本身的吸光度变化(A检测-A0天),具体如下:
3天后吸光度变化 | 7天后吸光度变化 | |
实施例2 | 0.0004 | 0.0007 |
对比例1 | 0.0011 | 0.0024 |
对比例2 | 0.0012 | 0.0019 |
对比例3 | 0.0017 | 0.0028 |
对比例4 | 0.0009 | 0.0018 |
Claims (5)
1.一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒,它包括:试剂1(缓冲液)、试剂2(反应液)、校准品及质控品。
2.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒,其特征在于,所述试剂1组成为:Tris 100mM,叠氮钠5g/L,PEG-6000 4g/L,PH值为8.1。
3.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒,其特征在于,所述试剂2组成为:Tris 100mM,叠氮钠1g/L,辛基苯酚聚氧乙烯1g/L,尼泊金甲酯1g/L,抗人血清淀粉样蛋白A抗体胶乳颗粒1g/L,PH值为6.0。
4.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒,其特征在于,所述校准品为:水平1含血清淀粉样蛋白A抗原6.25mg/L,叠氮钠5g/L,水平2含血清淀粉样蛋白A抗原12.5mg/L,叠氮钠5g/L,水平3含血清淀粉样蛋白A抗原25mg/L,叠氮钠5g/L,水平4含血清淀粉样蛋白A抗原50mg/L,叠氮钠5g/L。
5.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒,其特征在于,所述质控品为:血清淀粉样蛋白A抗原10mg/L,叠氮钠5g/L。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |