CN106018299A - 一种测定血清淀粉样蛋白a的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：试剂R1：缓冲液、无机盐离子、促凝剂、防腐剂、稳定剂，试剂R2：缓冲液、稳定剂、防腐剂、胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的血清淀粉样蛋白A的浓度。本发明具有测定准确度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒及其制备方法。
背景技术
血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA)是一种急性时相反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子量约12000，在急性时相反应中，经IL-1、IL-6和TNF刺激，SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，可升高到最初浓度的100-1000倍，但半衰期极短，只有50分钟左右，血清淀粉样蛋白 A 与高密度脂蛋白 (HDL)有关，它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢，血清淀粉样蛋白 A 一个特别重要的特性是其降解产物能以淀粉样蛋白 A (AA) 原纤维的方式沉积在不同的器官中，在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症。与 C 反应蛋白 (CRP) 类似，血清淀粉样蛋白 A 的含量浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标，有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗，但是，血清淀粉样蛋白 A 检测在诊断发生病毒感染、肾移植排斥反应的患者，特别是进行免疫抑制治疗的患者以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面，比 C 反应蛋白更确凿 ，研究发现，在患炎性关节炎的案例中，血清淀粉样蛋白 A 与疾病活动性的关系最密切 ，同时检测 C 反应蛋白和血清淀粉样蛋白 A 能提高对感染的诊断灵敏度，对于淀粉样蛋白 A淀粉样变性患者，以将血清淀粉样蛋白 A 水平恢复至正常为宗旨的治疗，能改善病情 。
目前检测血清淀粉样蛋白A的主要方法为酶联免疫吸附法，但该法操作复杂，耗时长，且不易于大规模的快速检测，而且测定的准确度低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术操作复杂、测定准确度低的缺陷，而提供一种测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
无机盐离子 150~350 mmol/L
促凝剂 10~35 g/L
防腐剂 0.1~0.9 g/L
稳定剂 24~56 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 15~185 mmol/L
稳定剂 4~18 g/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体 1~8 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明公开了一种测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 100 mmol/L
无机盐离子 180 mmol/L
促凝剂 20 g/L
防腐剂 0.7 g/L
稳定剂 30 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 125 mmol/L
稳定剂 11 g/L
防腐剂 0.7g/L
胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体 4g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种的组合，所述的无机盐离子采用氯化钠、氯化钾、氯化铵中的一种或多种的组合，所述的促凝剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的组合，所述的防腐剂为叠氮钠，所述的稳定剂为牛血清白蛋白。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种的组合，所述的稳定剂为牛血清白蛋白，所述的防腐剂为叠氮钠。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体的制备方法为：
先用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80-500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-5%的溶液，然后每毫升溶液中加入0.5 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在20℃-37℃的条件下反应1小时，使用离心机，在20000rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，用50mmol/L的MES缓冲液对沉淀进行稀释，再使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，用50mmol/L的MES缓冲液继续对沉淀进行稀释，使得聚苯乙烯微球的质量浓度为0.5%-2.0%，再使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，保留沉淀，再用50mmol/L的MES缓冲液对沉淀进行稀释，并加入等体积的含8mg/ml抗血清淀粉样蛋白A抗体的MES缓冲液，搅拌均匀，使得最终聚苯乙烯微球的质量浓度为1%，在20℃-37℃的条件下反应2小时，加入牛血清白蛋白使得牛血清白蛋白的最终浓度为20 g/L，4℃条件下封闭24小时即可制备得到胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体。
作为优选，本发明还公开了上述测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
无机盐离子 150~350 mmol/L
促凝剂 10~35 g/L
防腐剂 0.1~0.9 g/L
稳定剂 24~56 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 15~185 mmol/L
稳定剂 4~18 g/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体 1~8 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的血清淀粉样蛋白A的浓度。
作为优选，步骤（b）中，所述的试剂R1和试剂R2的体积比为5:1；
作为优选，步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:150之间。
本发明的检测原理是：本发明利用的是抗原抗体反应的原理，胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体，当与含有SAA 抗原的样品混合时，会发生凝集反应，从而引起吸光度的变化，其大小与样品中SAA 抗原含量成比例，将吸光度变化与已知浓度的校准品比较，可以定量得出样品中血清淀粉样蛋白A 的含量。
样本中血清淀粉样蛋白A（SAA）的活性（mg/L）= CS ×（mg/L）
式中：ΔAT 以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值
ΔAS 以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值
CS 校准液中SAA的浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：本发明主要采用了胶乳增强免疫比浊法，比传统的酶联免疫法准确度更高，实现了定量检测，试剂R1中添加了加速剂，反应更迅速，易于检测，检测准确度更高，而且不含有任何放射性污染物质，而且操作比较方便。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
Tris缓冲液 100 mmol/L
氯化钾 180 mmol/L
聚乙二醇-2000 20 g/L
叠氮钠 0.7 g/L
牛血清白蛋白 30 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 125 mmol/L
牛血清白蛋白 11 g/L
叠氮钠 0.7g/L
胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体 4g/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
PBS缓冲液 185 mmol/L
氯化钠 350 mmol/L
聚乙二醇-8000 10 g/L
叠氮钠 0.9 g/L
牛血清白蛋白 56 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
PBS缓冲液 15 mmol/L
牛血清白蛋白 4 g/L
叠氮钠 0.6 g/L
胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体 3 g/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体的制备：先用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为5%的溶液，然后每毫升溶液中加入0.5 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在25℃的条件下反应1小时，使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，用50mmol/L的MES缓冲液对沉淀进行稀释，再使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，用50mmol/L的MES缓冲液继续对沉淀进行稀释，使得聚苯乙烯微球的质量浓度为2.0%，再使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，保留沉淀，再用50mmol/L的MES缓冲液对沉淀进行稀释，并加入等体积的含8mg/ml抗血清淀粉样蛋白A抗体的MES缓冲液，搅拌均匀，使得最终聚苯乙烯微球的质量浓度为1%，在25℃的条件下反应2小时，加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白的最终浓度为20 g/L，4℃条件下封闭24小时即可制备得到胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体；
2、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Tris缓冲液 100 mmol/L
氯化钾 180 mmol/L
聚乙二醇-2000 20 g/L
叠氮钠 0.7 g/L
牛血清白蛋白 30 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 125 mmol/L
牛血清白蛋白 11 g/L
叠氮钠 0.7g/L
胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体 4g/L
其溶剂为纯化水；
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长546nm、副波长800nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取200μl试剂R1与2.4μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入40μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据样本中的血清淀粉样蛋白A（SAA）的活性（mg/L）= CS × （mg/L）计算出样本中的血清淀粉样蛋白A的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体的制备：先用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为5%的溶液，然后每毫升溶液中加入0.5 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在25℃的条件下反应1小时，使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，用50mmol/L的MES缓冲液对沉淀进行稀释，再使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，用50mmol/L的MES缓冲液继续对沉淀进行稀释，使得聚苯乙烯微球的质量浓度为2.0%，再使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，保留沉淀，再用50mmol/L的MES缓冲液对沉淀进行稀释，并加入等体积的含8mg/ml抗血清淀粉样蛋白A抗体的MES缓冲液，搅拌均匀，使得最终聚苯乙烯微球的质量浓度为1%，在25℃的条件下反应2小时，加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白的最终浓度为20 g/L，4℃条件下封闭24小时即可制备得到胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体；
2、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
PBS缓冲液 185 mmol/L
氯化钠 350 mmol/L
聚乙二醇-8000 10 g/L
叠氮钠 0.9 g/L
牛血清白蛋白 56 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
PBS缓冲液 15 mmol/L
牛血清白蛋白 4 g/L
叠氮钠 0.6 g/L
胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体 3 g/L
其溶剂为纯化水；
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长546nm、副波长800nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取200μl试剂R1与2.4μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入40μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据样本中的血清淀粉样蛋白A（SAA）的活性（mg/L）= CS × （mg/L）计算出样本中的血清淀粉样蛋白A的浓度。
表1为实施例1所制得的测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒以及实施例2所制得的测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的血清淀粉样蛋白A的浓度为 10 mg/L，测定结果见表1：
表1
| 第1次（mg/L） | 第2次（mg/L） | 第3次（mg/L） | 均值（mg/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 10 | 10 | 9 | 9.67 | 3.30 |
| 实施例2 | 9 | 9 | 10 | 9.33 | 6.70 |
由表1可知，本发明所制得的测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒以及实施例2所制得的测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的血清淀粉样蛋白A的浓度为 35 mg/L，测定结果见表2：
表2
| 第1次（mg/L） | 第2次（mg/L） | 第3次（mg/L） | 均值（mg/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 33 | 34 | 34 | 33.67 | 3.81 |
| 实施例2 | 38 | 37 | 37 | 37.33 | 6.66 |
由表2可知，本发明所制得的测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒的精密度比较好，而且由表3可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
无机盐离子 150~350 mmol/L
促凝剂 10~35 g/L
防腐剂 0.1~0.9 g/L
稳定剂 24~56 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 15~185 mmol/L
稳定剂 4~18 g/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体 1~8 g/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 100 mmol/L
无机盐离子 180 mmol/L
促凝剂 20 g/L
防腐剂 0.7 g/L
稳定剂 30 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 125 mmol/L
稳定剂 11 g/L
防腐剂 0.7g/L
胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体 4g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种的组合，所述的无机盐离子采用氯化钠、氯化钾、氯化铵中的一种或多种的组合，所述的促凝剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的组合，所述的防腐剂为叠氮钠，所述的稳定剂为牛血清白蛋白。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用Tris缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种的组合，所述的稳定剂为牛血清白蛋白，所述的防腐剂为叠氮钠。
5.根据权利要求1或2所述的一种测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体的制备方法为：先用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80-500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-5%的溶液，然后每毫升溶液中加入0.5 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在20℃-37℃的条件下反应1小时，使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，用50mmol/L的MES缓冲液对沉淀进行稀释，再使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，用50mmol/L的MES缓冲液继续对沉淀进行稀释，使得聚苯乙烯微球的质量浓度为0.5%-2.0%，再使用离心机，在20000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，保留沉淀，再用50mmol/L的MES缓冲液对沉淀进行稀释，并加入等体积的含8mg/ml抗血清淀粉样蛋白A抗体的MES缓冲液，搅拌均匀，使得最终聚苯乙烯微球的质量浓度为1%，在20℃-37℃的条件下反应2小时，加入牛血清白蛋白使得牛血清白蛋白的最终浓度为20 g/L，4℃条件下封闭24小时即可制备得到胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体。
6.根据权利要求1或2所述的一种测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 15~185 mmol/L
无机盐离子 150~350 mmol/L
促凝剂 10~35 g/L
防腐剂 0.1~0.9 g/L
稳定剂 24~56 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 15~185 mmol/L
稳定剂 4~18 g/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
胶乳包被抗血清淀粉样蛋白A抗体 1~8 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的血清淀粉样蛋白A的浓度。
7.根据权利要求6所述的一种测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的试剂R1和试剂R2的体积比为5:1。
8.根据权利要求6所述的一种测定血清淀粉样蛋白A的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:150之间。
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