CN105067815A - 一种测定人血清中胃蛋白酶原i/ii含量的试剂盒 - Google Patents

一种测定人血清中胃蛋白酶原i/ii含量的试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种测定人血清中胃蛋白酶原I/II含量的试剂盒,包含试剂R1,R2以及校准液;所述试剂R1为PH值为7.2-8.6的缓冲液,所述试剂R2为抗人PGI抗体胶乳试剂或抗人PGII抗体胶乳试剂;所述标准品为含有定量的PGI或PGII的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然PGI或PGII;其特征在于,所述试剂盒还包括用于消除乳糜的试剂R3,所述试剂R3的由辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁组成。本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度,抗乳糜干扰能力极强,可适用于含有重度乳糜的检测。

Description

一种测定人血清中胃蛋白酶原I/II含量的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种采用乳胶增强免疫比浊法测定人血清中胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II含量的试剂盒。
背景技术
胃蛋白酶原(Pepsinogen,PG)是胃液中胃蛋白酶的无活性前体,是胃粘膜分泌的一种门冬氨酸蛋白酶前体,是分子量42000Da的单链多肽,在胃内转变为具有活性的胃蛋白酶。
根据生化性质、免疫原性、细胞来源及组织内分布,胃蛋白酶原可分成胃蛋白酶原Ⅰ(PGⅠ)、胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)两个亚群:其中1~5组分免疫原性近似,称为PGⅠ(PGA),主要由胃底腺的主细胞和颈粘液细胞分泌;6~7组分被称为PGⅡ(PGC),除由上述两种细胞分泌外,幽门腺的黏液细胞、贲门腺以及十二指肠上段的Brunner腺也能产生PGⅡ,胃粘膜合成的PGⅡ约为总量的25%。
目前检测血清胃蛋白酶原含量的方法主要有酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、化学发光法和胶乳免疫比浊法等。
ELISA方法精确、定量,具有很高的敏感性,但操作程序繁琐,耗时长,不能适应大规模体检筛查或急诊的需要;RIA方法灵敏度高,特异性强,但放射免疫反应是竞争性的反应,测得的值是相对量而非绝对量,且存在辐射和放射性污染;化学发光法精确度高,检测速度快,但成本高昂,对配套设施要求高,无法应用于广大中、基层的医院和医疗卫生机构;胶乳免疫比浊法具有操作简便快速、自动化、定量准确、敏感度高等优点,可满足门、急诊和大规模体检筛查等需要。
现有胶乳免疫比浊试剂,由于其检测原理是测定反应形成的免疫复合物的浊度,因此极易受到乳糜干扰的影响。目前应对这个问题的方法,主要是使用专门的乳糜消除剂对样本进行预处理。而在大规模的人群普查、健康体检筛查和临床病人检验时,经常会遇到大量的乳糜、溶血等浑浊样本,此时通过购置样本处理剂,对这些样本进行单独处理,将会极大地增加操作人员的工作量,提高运营成本,也为临床检验的组织安排带来难题。中国专利文献CN103698525A公开了一种试剂盒,利用脂肪酶或聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁来消除乳糜干扰,这种方法提高了试剂盒的抗乳糜干扰能力,但是对于重型乳糜检测效果不够理想;其次,仅公开了适用胃蛋白酶原I的方法,没有提及胃蛋白酶原II。
因此,研制一种能够更好地消除乳糜干扰的胶乳免疫比浊法的胃蛋白酶原I/II检测试剂盒,显得十分必要。
发明内容
为了解决上述的技术问题,本发明实现了以下技术:
一种测定人血清中胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II含量的试剂盒,包含试剂R1,R2以及校准液;所述试剂R1为PH值为7.2-8.6的缓冲液,所述试剂R2为抗人PGI抗体胶乳试剂或抗人PGII抗体胶乳试剂;所述标准品为含有定量的PGI或PGII的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然PGI或PGII;其特征在于,所述试剂盒还包括用于消除乳糜的试剂R3,所述试剂R3的由辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁组成。
所述试剂R3组分的重量份组成为:
辛基甲氧基肉桂酸酯20-50
聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100
聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁100-200。
所述的PGI/PGII检测试剂盒中的R1试剂主要包含缓冲液,无机盐,加速剂和防腐剂。
所述的PGI/PGII检测试剂盒中R2试剂主要包含稳定剂,抗人单(多)克隆抗体胶乳颗粒,缓冲液,稳定剂和防腐剂。其中乳胶微球直径为80-200nm。
试剂R1所述的无机盐选自氯化钠,氯化钾,硫酸钾一种或几种。缓冲液为:Tris缓冲液,MES缓冲液,磷酸盐缓冲液,碳酸盐缓冲液,甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中一种或几种。加速剂为聚乙二醇4000,聚乙二醇6000,聚乙二醇8000中一种或几种。
试剂R2所选用的抗体为鼠抗人PGI/PGII单克隆抗体,羊抗人PGI/PGII单克隆抗体,兔抗人PGI/PGII单克隆抗体一种或者几种混合。也可以选鼠抗人PGI/PGII多克隆抗体,羊抗人PGI/PGII多克隆抗体,兔抗人PGI/PGII多克隆抗体其中一种。
试剂R2中的稳定剂选自小牛白蛋白,明胶,甘氨酸,吐温20,曲拉通中的一种或者几种。
本发明所述的试剂R2为抗人PGI/PGII抗体胶乳试剂,采用的是抗人的PGI/PGII抗体与胶乳颗粒相偶联。经过离心(过滤)的方法去掉未反应的偶联剂以及未反应的抗体,在含有稳定剂和防腐剂的缓冲液中分散而成。
所述抗人PGI抗体和抗人PGII抗体的胶乳试剂的制备包括以下步骤:
步骤1:将羧化的胶乳在PH7.0的溶液活化;
步骤2:洗涤去掉溶液中的碳化二亚胺,加PH7.5-9.0的缓冲液,加入PGI或PGII抗体,在37度反应4小时;
步骤3:将步骤2所得的液体用PH7.5-9.0的固定液固定6小时;
步骤4:将步骤3所得的液体用PH7.5-9.0的封闭液体封闭12小时;
步骤5:将步骤4所得的液体离心去上清液,取沉淀后用含有稳定剂和防腐剂的缓冲液洗涤分散既得。
步骤1中所用的缓冲液为PBS缓冲液,MES缓冲液,Tris缓冲液中的任何一种缓冲液,且浓度在20-100mmol/L,PH在6.5-7.5之间。
作为优选,步骤1中所用的胶乳可以是羧基化的聚苯乙烯胶乳或者是氨基化的聚苯乙烯胶乳。其孔径在80nm-200nm均可。
作为优选,步骤1中含有1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐或N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或者多种。
作为优选,在步骤5中,所用的稳定剂是小牛血清白蛋白,明胶,甘氨酸,脱脂奶粉一种或者几种相混合。
本发明检测的原理是:利用抗原抗体反应,先加入试剂R1,使血清中的PGI和PGII的位点暴露,当加入抗人的PGI或PGII胶乳颗粒溶液,使溶液中的抗原抗体反应形成不溶于溶液的抗原抗体复合物,从而产生一定的浊度,在人血清中PGI或PGII的含量在一定的范围内PGI或PGII的含量与浊度成正比。再通过标准曲线进行计算,从而得到PGI或PGII的含量。
本发明与现有技术相比,具有如下特点:
1)本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度,PGI试剂盒最低检测能够达到3ng/ml,PGII试剂盒的最低检测能够达到2ng/ml。操作简单、快速,从检测到出结果最多只需要5分钟,甚至更短。
2)本发明的试剂盒R2试剂中的抗体胶乳的制备由于采用的化学偶联法,稳定性好,在2-8度至少可以保存12个月。
3)本发明试剂盒与进口试剂盒对样品中的PGI或PGII含量检测的数据经统计分析,无显著性差异,检测结果可靠,在临床上可以替代进口试剂,大幅降低成本以及检测时间。
4)本发明试剂盒抗乳糜干扰能力极强,可适用于含有重度乳糜的检测。
具体实施方式
下面以具体的实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种测定人血清中胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II含量的试剂盒,包含试剂R1,R2以及校准液;所述试剂R1为PH值为7.2-8.6的缓冲液,所述试剂R2为抗人PGI抗体胶乳试剂或抗人PGII抗体胶乳试剂;所述标准品为含有定量的PGI或PGII的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然PGI或PGII;其特征在于,所述试剂盒还包括用于消除乳糜的试剂R3,所述试剂R3的由辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁组成。
所述试剂R3组分的重量份组成为:
辛基甲氧基肉桂酸酯20
聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20
聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁100。
对添加了不同乳糜单位浓度的血清样本进行对照测定,重复3遍,计算均偏差。偏差范围在±10%以内视为无干扰,偏差范围超过±10%视为干扰。
表1未添加R3试剂的的血清样本结果
表2添加R3试剂的的血清样本结果
表1结果显示,随乳糜浊度从0到8000的范围变化,试剂盒A的检测值偏差也随之增大,但小于10%,而当乳糜浊度单位大于8000时,检测值与未添加干扰时检测值的偏差均大于10%,判定为存在干扰。
表2结果显示,随乳糜浊度从0到16000的范围变化,试剂盒B的检测值偏差的变化较小,检测值与未添加干扰时检测值的偏差均在±10%以内,判定为不存在干扰。
本试验显示了相比现有的免疫比浊方法试剂盒,本发明所述的胃蛋白酶原检测试剂盒明显提高了对乳糜的抗干扰能力。
实施例2
与实施例1不同的是:
所述试剂R3组分的重量份组成为:
辛基甲氧基肉桂酸酯50
聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚100
聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁200。
实施例3
与实施例1不同的是:
所述试剂R3组分的重量份组成为:
辛基甲氧基肉桂酸酯30
聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚40
聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁120。
实施例4
与实施例1不同的是:
所述试剂R3组分的重量份组成为:
辛基甲氧基肉桂酸酯40
聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚70
聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁150。
实施例5
与实施例1不同的是:
所述试剂R3组分的重量份组成为:
辛基甲氧基肉桂酸酯35
聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚55
聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁115。

Claims (2)

1.一种测定人血清中胃蛋白酶原I/II含量的试剂盒,包含试剂R1,R2以及校准液;所述试剂R1为PH值为7.2-8.6的缓冲液,所述试剂R2为抗人PGI抗体胶乳试剂或抗人PGII抗体胶乳试剂;所述标准品为含有定量的PGI或PGII的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然PGI或PGII;其特征在于,所述试剂盒还包括用于消除乳糜的试剂R3,所述试剂R3的由辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁组成。
2.根据权利1要求所述的试剂盒,其特征在于所述试剂R3组分的重量份组成为:
辛基甲氧基肉桂酸酯20-50
聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100
聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁100-200。
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