CN101088010B - 用于测定抗原的试剂以及抗原的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于，提供一种不使用特殊的抗体就可简便且正确地测定抗原的试剂和测定方法。提供一种测定试剂和测定方法，与游离型抗原和复合体型抗原两者具有反应性且识别部位不同的三种单克隆抗体中，将至少一种单克隆抗体致敏到粒径不同的两种以上载体中粒径小的载体上，将剩下的单克隆抗体致敏到粒径大的载体上，由此调节游离型抗原和复合体型抗原的反应性。

Description

用于测定抗原的试剂以及抗原的测定方法

技术领域

本发明涉及通过免疫凝集反应测定抗原的测定试剂和抗原的测定方法。详细地说，涉及一种通过胶乳免疫比浊法(LTIA法)测定抗原时，通过调节游离型抗原(例如fPSA)和与被测物中的共存物质形成了复合体的复合体型抗原(例如PSA-ACT)的反应性来进行测定的抗原测定试剂和测定方法。 

背景技术

前列腺癌是男性中出现的恶性疾病，尤其在美国和日本，是急剧增加的肿瘤。前列腺癌是增殖缓慢的肿瘤，且放射疗法、抗男性激素疗法易奏效，由于具有上述特征，因此早期发现是重要的课题。 

在此，由前列腺上皮细胞分泌并且也由前列腺癌细胞产生的前列腺特异抗原(下面简称为PSA)是丝氨酸蛋白酶的一种，是分子量为33000～34000道尔顿的糖蛋白。另外，PSA有在血中与蛋白酶抑制剂结合的复合体型和非结合的游离型前列腺特异抗原(下面称为fPSA)，但血中的P SA大多是复合体型，有α1-抗糜蛋白酶复合前列腺特异抗原(下面称为PSA-ACT)和α2-巨球蛋白复合前列腺特异抗原等。其中，可以用免疫法测定的是fPSA和P SA-ACT两种，目前在日本被实用化的测定超过20种血清中的PSA总量的试剂盒中，有以下问题：因被测液不同，其测定值与真值背离的程度不同。其主要原因被认为是由于每个试剂盒中测定试剂对fPSA和PSA-ACT的反应性不同所导致的。 

即，在免疫法中，利用使用胶乳等的凝集反应的所谓免疫 凝集反应测定法中，抗原抗体反应是在1个阶段进行的，因此，存在如下问题：PSA的单克隆抗体与fPSA的反应性和PSA的单克隆抗体与PSA-ACT的反应性不同，其结果，测定结果产生误差。 

作为解决这种问题的现有技术，例如，专利文献1中记载：在fPSA的可与α1-抗糜蛋白酶结合的区域结合抗体，使fPSA和PSA-ACT的分子量接近，使抗原决定部位的数目均匀，从而使fPSA对PSA的抗体的反应性和PSA-ACT对PSA的抗体的反应性接近，从而可以以等摩尔反应性测定用该抗体致敏的载体和两种PSA。 

专利文献1：日本特开2001-311733号公报 

发明内容

发明要解决的课题 

但是，上述现有的测定方法存在如下问题：需要预先仅与fPSA反应的特殊的抗体。另外，必须进行2个阶段的反应，即，在进行使用该特殊抗体与fPSA反应的前处理之后，使用用两PSA的抗体致敏的载体来测定PSA的总量。 

因此，期待开发出更简便并正确地测定PSA的总量的方法。另外，只要没有特别说明，PSA的测定是指测定PSA的总量。 

用于解决问题的方法 

本发明人们对使用免疫凝集法的抗原的测定法进行深入研究，结果发现：测定用试剂，其组成包含至少三种抗体，这些抗体对包含于被测物中的游离型抗原以及由该游离型抗原与共存物质形成复合体的复合体型抗原的识别部位不同，该抗体中的至少两种抗体被致敏到载体上并且与两抗原反应，采用上述组成时，通过调节各抗体的混合比例，可调节该两抗原的反应 性，从而完成了本发明。 

即，本发明具有以下的组成。 

(1)一种抗原的测定试剂，其用于通过免疫凝集反应测定抗原， 

其包含至少三种抗体，这些抗体对包含于被测物中的游离型抗原以及由该游离型抗原与共存物质形成复合体的复合体型抗原的识别部位不同， 

该抗体中的至少两种抗体被致敏到载体上并且与该两抗原反应， 

该抗体的混合比例被调节成与该两抗原显示规定的摩尔反应性。 

(2)根据前述(1)所述的抗原的测定试剂，其中，规定的摩尔反应性是等摩尔反应性。 

(3)根据前述(1)或(2)所述的抗原的测定试剂，其中，抗体是三种。 

(4)根据前述(1)～(3)任一项所述的抗原的测定试剂，其中，全部抗体都被致敏到载体上。 

(5)根据前述(1)～(4)任一项所述的抗原的测定试剂，其中，被一种抗体致敏的载体与被另一种抗体致敏的载体的粒径不同。 

(6)根据前述(1)～(5)任一项所述的测定试剂，其中，共存物质为蛋白质。 

(7)根据前述(6)所述的测定试剂，其中，蛋白质是通过与游离型抗原形成复合体来阻碍该游离型抗原所具有的活性的物质、或者是白蛋白。 

(8)根据前述(7)所述的测定试剂，其中，通过与游离型抗原形成复合体来阻碍该游离型抗原所具有的活性的物质是 蛋白酶抑制剂或游离型抗原的转运蛋白。 

(9)根据前述(1)～(8)任一项所述的测定试剂，其中，游离型抗原是蛋白酶、激素或药物。 

(10)根据前述(1)～(9)任一项所述的抗原的测定试剂，其中，抗体是单克隆抗体。 

(11)PSA的测定试剂，该试剂用于通过免疫凝集反应测定PSA， 

其包含用三种单克隆抗体致敏的胶乳，这些单克隆抗体与PSA-ACT和fPSA两者反应且识别部位不同， 

分别用其中的两种抗体致敏的胶乳较之用另一种抗体致敏的胶乳，其粒径大， 

各抗体的混合比例被调节成与该两抗原显示规定的摩尔反应性。 

(12)根据前述(11)所述的PSA的测定试剂，其中，分别用抗体致敏的胶乳被包含在1个试剂中。 

(13)根据前述(11)或(12)所述的PSA的测定试剂，其中，用另一种抗体致敏的胶乳的粒径为0.02～0.22μm。 

(14)一种PSA测定试剂的制造方法，其为利用免疫凝集反应测定PSA的试剂的制造方法，其特征在于， 

准备用三种抗体致敏的载体，这些抗体与PSA-ACT抗原和fPSA抗原两者反应且识别部位不同， 

预先将分别用三种抗体中的两种抗体致敏的载体的混合比例设定在规定的范围， 

接着，将用另一种抗体致敏的载体添加到所述两种抗体致敏的载体的混合物中，调节成两抗原与抗体显示规定的摩尔反应性。 

(15)根据前述(14)所述的PSA测定试剂的制造方法，其中，规定的摩尔反应性是等摩尔反应性。 

(16)测定被测物中的PSA的方法，其为利用免疫凝集反应测定PSA的方法，该方法使用如下测定试剂： 

其包含用三种抗体致敏的载体，这些抗体与PSA-ACT和fPSA两者反应且识别部位不同， 

用其中的两种抗体致敏的载体较之用另一种抗体致敏的载体，其粒径大，并且， 

三种各抗体的混合比例被调节成该两抗原与抗体显示规定的摩尔反应性。 

(17)根据前述(16)所述的测定被测物中的PSA的方法，其中，规定的摩尔反应性是等摩尔反应性。 

发明效果 

本发明的抗原的测定试剂不使用具有特殊的反应性的抗体，通过适当组合利用常规方法得到的抗体即可更简便且廉价地制备试剂。另外，将全部抗体都致敏到载体上时，可期待提供作为试剂的稳定性优异、品质管理也简便且稳定的试剂。进一步，此时，可将用抗体致敏的试剂作为1个试剂来使用，测定也可通过1个阶段的反应进行，测定简便，还可谋求测定时间的缩短。 

附图说明

图1是表示各抗体对fPSA、PSA-ACT的反应性(WesternBlot法)的图像。 

图2-1是表示添加#16Lx对c/f比的效果的图表(试验例1-1)。 

图2-2是表示添加#16Lx对c/f比的效果的图表(试验例1-2)。 

图3是表示添加游离的抗体#16对c/f比的效果的图表。

图4是表示#16Lx的胶乳尺寸对c/f比的改善效果的图表。 

具体实施方式

(对象样品) 

本发明的抗原测定试剂的对象样品是包含抗原的样品，例如可列举出血液、血清、血浆、淋巴细胞培养上清液、尿、脊髓液、唾液、汗、腹水、或者细胞或脏器的提取液等。抗原为PSA的情况中，只要是有可能含有PSA-ACT复合体的前述生物体样品，则都可以作为对象。 

(抗原) 

在本发明中作为测定对象的抗原，只要是可以通过免疫凝集法测定的抗原，则都可以作为对象。例如，在作为对象样品的被测物中具有游离型以及与共存物质生成复合体的复合体型这两种存在形态的抗原作为对象。作为共存物质，可列举出蛋白质，如通过与游离型抗原形成复合体来阻碍该游离型抗原所具有的活性的蛋白酶抑制剂、游离型抗原的转运蛋白、以及白蛋白等。更具体地，作为游离型抗原，可列举出蛋白酶(PSA、MMP(基质金属蛋白酶)、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶)、激素(T3(三碘甲状腺原氨酸)和T4(甲状腺素)等)、药物等。例如，在PSA中，存在如前所述的fPSA和PSA-ACT，在T3和T4中，存在与甲状腺素结合球蛋白(转运蛋白)结合的复合体型和游离型，在血中药物中也存在与白蛋白结合的复合体型和游离型。 

(抗体) 

本发明所使用的抗体，使用与测定对象抗原的游离型和复合体型这两者反应的至少两种抗体。抗体可使用通过对家兔、绵羊、山羊等进行免疫而得到的多克隆抗体、单克隆抗体。其 中单克隆抗体特别理想。另外，可以是抗体整体，也可以是按照常规方法用酶切割的片段。另外，所使用的单克隆抗体可以通过常规方法得到。 

在本发明中使用单克隆抗体时，可通过夹层法、竞争法等适当选择适合其组合的抗体。 

本发明所使用的抗体需要其与抗原的反应性不同。在此所谓反应性不同是指抗体对抗原的亲和力、结合力、抗原决定部位等不同。抗原决定部位不同包括了识别部位部分重复或接近的情况。 

(载体) 

本发明使用的用抗体致敏的载体没有特别限定，但优选为胶乳。作为胶乳，可使用在免疫学测定法中使用的物理吸附法所使用的由聚苯乙烯制成的普通的胶乳，材质只要适合致敏方法就不受特别限定。另外，可使用由苯乙烯-丁二烯共聚物、(甲基)丙烯酸酯类聚合物、胶乳、明胶、脂质体、微囊体、二氧化硅、氧化铝、炭黑、金属化合物、金属、陶瓷或磁性体等材质形成的颗粒。用抗体致敏胶乳的方法可采用通常所使用的物理吸附法，也可采用化学结合法。 

本发明使用的胶乳可以使用同一种类或两种以上，使用粒径不同的两种以上胶乳是理想的。还可以使用混合了不同粒径的胶乳。 

(抗体的选择) 

抗体如下选择。以抗原为PSA、选择三种抗体的情况为例进行说明。抗体优选首先通过ELISA法等选择与PSA-ACT和fPSA的反应性高、即效价高的抗体，另外，载体优选选择可得到充分的测定灵敏度的载体。接着，从所选择的效价高的抗体中，选择如下的抗体组合，即，当适当选择两种抗体分别致敏 载体、并将PSA-ACT和fPSA作为样品测定时，与两样品的反应性的差别小并且可得到充分的测定灵敏度的抗体的组合。将这些抗体作为主反应用的抗体。 

接着，选择一抗体，其为当在主反应中共存其它抗体时可调节用于主反应的抗体与PSA-ACT和fPSA的反应性的抗体。将其作为反应调节用的抗体。另外，反应调节用的抗体还可以被致敏到载体上，但致敏的情形中的载体，优选其尺寸比主反应用抗体致敏的载体的尺寸小。 

反应调节用的抗体优选为与PSA-ACT和与fPSA的反应性有差别的抗体。 

(抗体的混合比例) 

抗体的混合比例需要调节成对游离型抗原和复合体型抗原两抗原显示规定的摩尔反应性。本发明的特征在于通过调节抗体的混合比例来调节抗原的摩尔反应性，根据测定的目的、需要的精度调节到规定的范围。其中，如果调节成显示等摩尔反应性，则可以相等地测定游离型和复合体型的抗原浓度。 

在此，等摩尔反应性是指：抗原和抗体反应、被抗体致敏的载体彼此发生凝集反应而凝集的反应性，在游离型和复合体型中实质上相等。具体而言，抗原为PSA时，作为PSA存在相同浓度的fPSA和PSA-ACT时，通过凝集反应所测定的PSA浓度实质上相等。另外，实质上相等是指两抗原的凝集信号之比为80～120％、优选为90～110％。 

在本发明中发现，在两抗原的免疫凝集反应中，通过适当调节抗体的混合比例，抗原和抗体的反应显示规定的摩尔反应性。例如，获得一种用与PSA-ACT抗原和fPSA抗原两者反应的识别部位不同的三种抗体分别致敏载体、并显示等摩尔反应性的试剂时，各抗体的混合比例如下调节。首先，使用分别用 两种抗体致敏的载体，求出等摩尔的两抗原显示的凝集信号之比(PSA-ACT/fPSA比，以下简称为c/f比)，接着，添加用另一种抗体致敏的载体，使得该c/f比成为80～120％、优选成为90～110％，由此进行调节。 

c/f比的调节中可以使用致敏于载体上的抗体，另外，还可以使用没有致敏到载体上的游离的抗体。另外，反应调节用的抗体可以是一种也可以是两种以上。此外，使用游离的抗体时，根据需要，必须另外制备包含游离抗体的试剂，以便游离的抗体不与被其它抗体致敏的载体发生凝集反应。 

将反应调节用的抗体致敏于载体上时，优选使用比被用于主反应的抗体致敏的载体粒径小的载体。那是因为这样更容易调节。具体而言，0.02～0.22μm的范围是理想的，更优选为0.05～0.09μm的范围是理想的。另外，被用于主反应的抗体致敏的载体的粒径优选为0.1～0.5μm。进一步优选，被反应调节用的抗体致敏的载体的粒径为被主反应的抗体致敏的载体的粒径的2/3～1/10、优选为1/5～1/8。 

这里所述的抗体的混合比例是抗体的浓度比例，并且，将抗体以一定比例致敏于载体上时，载体的浓度比例相当于抗体的浓度比例。 

(缓冲液) 

本发明的抗原抗体反应是在缓冲液中进行的，该缓冲液选择最适宜进行抗原抗体反应的种类、浓度、pH，可使用磷酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液、碳酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Good′s缓冲液等。该测定液中的缓冲液的浓度可使用10mM～500mM左右，另外，该pH多使用中性区到碱性区，通常使用7.0～9.5的范围。 

(凝集信号的测定方法)

凝集信号的测定，只要是凝集反应测定中通常所使用的测定方法就都可以，可列举出吸光度、颗粒数、颗粒尺寸测定、散射光测定等。 

例如，PSA的测定方法如下进行。测定试剂中包含至少三种以上抗体，其中两种以上抗体是与胶乳等载体结合并且与fPSA和PSA-ACT两者反应的抗体。因此，使这种抗体和抗原反应时，fPSA和PSA-ACT与致敏于载体上的抗体反应而凝集。这是因为，在使用致敏于载体上的抗体的凝集反应的情形中，相对于1分子抗原结合2个以上致敏于载体上的抗体时，原理上可以观察到凝集。因此，通过测定该凝集的程度并与已知PSA浓度的标准液的凝集的程度相比较，可对样品中的总PSA浓度进行定量。 

凝集信号的检测有各种方法，但使用通用的生物化学装置的方法是方便的。例如，可在包含抗原的样品中加入试剂并在一定温度下放置一定时间，测定此时的吸光度，检测吸光度的变化量，从标准液的标准曲线计算出被测液的浓度。在胶乳凝集法中通常使用500～900nm波长的吸光度，通常将反应的吸光度的变化量用于定量。 

(试剂的制造方法) 

本发明的PSA测定试剂的制造如下进行。 

准备用三种抗体致敏的载体，这些抗体与PSA-ACT抗原和fPSA抗原两者反应且识别部位不同，预先将分别用三种抗体中的两种抗体致敏的载体的混合比例设定在规定的范围，接着，将用另一种抗体致敏的载体添加到前述两种抗体的混合物中，调节成两抗原与抗体显示规定的摩尔反应性，可由此制造试剂。 

实施例 

[单克隆抗体的制造]

1.免疫 

(1)免疫原 

使用源自人精液的提纯PSA(SCIPAC公司生产，CodeNo.P117-7，提纯度96％)作为免疫原。提纯PSA是在以PBS透析后使用。 

(2)免疫方法 

将上述PSA溶液和CFA(完全弗氏佐剂：GIBCO公司生产)以1:1混合乳化，在6周龄的雌Balb/C小鼠的背部皮下以25μmPSA/只的量给药。以2周的间隔进行3次追加免疫，再在细胞融合的三天前，将PSA溶液(25μm/只)给药到小鼠的腹腔内。 

2.细胞融合 

将上述免疫PSA之后的小鼠的脾脏摘出，取出脾脏细胞。将该脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/O-Ag14以6比1的比例混合，在50％聚乙二醇1540(和光纯药公司生产)存在下，使细胞融合。以脾脏细胞为2.5×10⁶个的量在HAT培养基中悬浮融合细胞，向96孔培养板(CORNING公司生产)各注入0.2ml。将其在5％CO₂培养箱中于37℃下培养2周。 

3.筛选 

使用注入了融合细胞的培养板的各孔的培养上清液，利用如下所示的ELISA法选择与fPSA和PSA-ACT两者反应的孔。 

(1)材料：抗原 

1)PSA(PROSTATE SPECIFIC ANTIGEN)：SCIPAC，CodeNo.P117-7 

2)PSA-ACT Complex(PSA-α1-ANTICHYMOTRYPSIN)：SCIPAC，Code No.P192-3 

(2)方法 

1)在ELISA用板(Nun c)上涂上5μg/ml山羊抗小鼠IgG(Fc) 抗体(Jackson公司生产)(50μl/well)，在4℃下静置一夜。 

2)以洗涤液(0.05％Tween20-PBS)洗涤3次后(400μl/well)，以每孔200μl的量注入封闭液(0.05％Tween20-PBS)，在室温下静置1小时。 

3)除去封闭液后，将注入了融合细胞的板的各孔的培养上清液各注入50μl到ELISA用板的各孔内，在室温下静置1小时。 

4)以洗涤液(0.05％Tween20-PBS)洗涤3次后，在各孔内各注入50μl用0.05％Tween20-PBS稀释成5ng/ml的fPSA或PSA-ACT，在室温下静置1小时。 

5)以洗涤液洗涤3次后，在各孔内各注入50μl HRP-山羊抗人PSA抗体(x500)，在室温下静置1小时。另外，HRP-山羊抗人PSA抗体使用山羊抗人PSA(DAKO公司)和过氧化物酶(东洋纺公司生产)，利用高碘酸法制备。 

6)洗涤3次后，在各孔内各注入50μl OPD显色液，在室温下静置10分钟。 

7)在各孔内注入50μl停止液(1.5N硫酸)，停止反应后，使用平板读取器在492nm波长下测定吸光度。 

4.克隆 

通过上述筛选，利用有限稀释法对与fPSA和PSA-ACT两者反应的孔的细胞株进行克隆化，建立杂交瘤。结果，所建立的杂交瘤得到了20种。 

5.单克隆抗体的制备 

对预先在2周前腹腔内注射了0.5ml姥鲛烷的8周龄雌Balb/C小鼠，以细胞数0.5×10⁶个的量腹腔内给予前述通过克隆得到的各杂交瘤。2周后提取腹水，利用蛋白A柱(Amersham Co.生产)提纯IgG流分。结果可得到20种各单克隆抗体的提纯流分。

[单克隆抗体和载体的选择] 

针对上述所得的20种单克隆抗体，用抗体致敏胶乳并如下进行胶乳凝集的研究，得到信号大的三种抗体#14MoAb、#16MoAb、#17MoAb(各自的定义在后面记载)以及它们与胶乳的组合。 

1.抗体的一次选择 

(1)以1vol:1vol，将用20mM Tris-HCl(pH8.5)稀释的1％的0.312μm胶乳溶液与20种MoAb溶液(0.6Abs)混合，4℃下搅拌2小时。 

(2)添加2vol0.4％BSA in20mM Tris-HCl(pH8.5)，4℃下搅拌1小时。 

(3)通过离心分离除去上清液，在5mM MOPS(pH7.0)中悬浮剩余物，用Abs600nm调整为2Abs。 

(4)将从20种中选出的两种MoAb-Lx(抗体致敏胶乳)以1vol:1vol混合并制成试剂2(对于全部组合，都同样制备并研究)。 

(5)使用试剂1(30mM HEPES pH7.0，0.1％BSA，0.5MNaCl)和试剂2，用日立7170型自动分析装置测定26ng/ml的free-PSA、PSA-ACT。 

(6)凝集的MoAb组合(吸光度高的)有12种，选择8种作为MoAb。 

2.抗体的二次选择 

(7)用日立7170型自动分析装置测定2.9ng/ml、8.7ng/ml、26ng/ml的fPSA、PSA-ACT，选择吸光度高且各浓度中的PSA-ACT/fPSA比接近1的组合作为主反应用的抗体(#14MoAb、#17MoAb)。 

另外，在二次选择的组合的抗体的各自的组合中，选择反 应有强弱的单克隆抗体作为反应调节用的抗体(#16MoAb)。 

3.胶乳的选择 

(8)胶乳的种类：使用0.39μm、0.31μm、0.30μm、0.23μm(高反应性用:吸光度变高的胶乳)、0.22μm、0.087μm、0.055μm(反应调节用)，按照上述(1)～(4)制备抗体致敏胶乳。 

(9)用日立7170型自动分析装置测定2.9ng/ml、8.7ng/ml、26ng/ml的fPSA、PSA-ACT，选择吸光度高且各浓度中的PSA-ACT/fPSA比接近1的组合。 

(10)选择#14MoAb-0.299μm、#17MoAb-0.385μm、#16MoAb-0.055μm。 

(11)设定各自的组合中MoAb浓度、胶乳浓度、抗体致敏胶乳浓度、致敏条件(缓冲液、pH、时间)、抗体致敏胶乳混合比例的最佳条件，用于以下的试验例子中。 

[利用蛋白印迹法分析各单克隆抗体] 

关于前述所得的三种单克隆抗体(#14MoAb、#16MoAb#17MoAb)对fPSA和PSA-ACT的反应性，利用如下所示的蛋白印迹法进行分析。 

1.材料 

(1)抗原 

1)PSA(PROSTATE SPECIFIC ANTIGEN)：SCIPAC，CodeNo.P117-7 

2)PSA-ACT Complex(PSA-α1-ANTICHYMOTRYPSIN)：SCIPAC，Code No.P192-3 

(2)抗体 

1)Anti-PSA MoAb(63214(简称#14))：按照上述“单克隆抗体的制备”得到的抗体 

2)Anti-PSA MoAb(63216(简称#16))：同上

3)Anti-PSA MoAb(63217(简称#17))：同上 

4)Anti-PSA MoAb(No.56)：(株)日本医学临床检查研究所生产，lot.031-02-003 

5)Anti-PSA MoAb(4D10)：(株)日本医学临床检查研究所生产，lot.031-01-004 

6)Normal mouse IgG：(本公司制备) 

7)Rabbit Anti-Human PSA(Rb抗PSA PoAb)：DAKO公司生产、Code No.A0562 

8)Rabbit Anti-Human ACT(Rb抗ACT PoAb)：DAKO公司生产、Code No.A0022 

(3)标记抗体 

1)Goat Anti-Rabbit Ig’s HRP Conjugate：BioSource、ALI3404、lot.5701 

2)Goat(F(ab’2)Anti-Mouse Ig’s HRP Conjugate：BioSource、AMI4404 

(4)其它 

3)封闭液、稀释液：1％BSA-PBS-Tween(0.05％-Tween20) 

洗涤液：PBS-Tween(0.05％-Tween20) 

4)OPD显色液、停止液(ELISA)：常规方法 

5)DAB染色液(Western Blot法)：常规方法 

2.方法 

1)将各抗原(fPSA或PSA-ACT)与SDS处理液(2-巯基乙醇-free)混合，进行5分钟煮沸处理。 

2)将其添加到PAG Mini10/20中(2μg/lane)，进行SDS-PAGE(40mA，1小时)。 

3)电泳后，使用半干印记仪按照常规方法将蛋白质从凝胶 转印到PVDF膜。 

4)用5％Skim Milk-PBS-Tween将转印后的膜封闭(4℃/整夜) 

5)将稀释成5μg/ml浓度的各MoAb在室温下反应2小时。 

6)洗涤3次后，在室温下使Goat(F(ab’2)Anti-MouseIg’s HRP Conjugate(稀释5000倍)反应1小时。 

7)洗涤3次后，使用DAB染色液以常规方法染色。 

8)在得到适度的染色图像的时刻洗涤、干燥。 

3.结果 

利用蛋白印迹法得到的染色图像在图1中示出。根据图1可确认，本发明的单克隆抗体#14、#16、#17都与fPSA和PSA-ACT反应。 

抗体致敏胶乳的制备方法 

通过如下所示的材料、方法，将前述所得的三种单克隆抗体致敏到载体上。 

1.材料 

(1)抗PSA单克隆抗体 

63214(#14) 

63217(#17) 

63216(#16) 

(上述单克隆抗体都是PBS溶液) 

(2)胶乳 

#14用：聚苯乙烯胶乳，平均粒径0.23μm(积水化学公司生产) 

#17用：聚苯乙烯胶乳，平均粒径0.39μm(积水化学公司生产) 

#16用：聚苯乙烯胶乳，平均粒径0.05μm(积水化学公司 生产) 

2.含有抗体-胶乳复合体的溶液的制备方法 

(1)含有#14抗体-胶乳复合体(#14Lx)的溶液的制备方法 

1)用20mM甘氨酸pH9分别稀释胶乳、抗体，制备1％胶乳液、0.4mg/ml#14抗体液。以1:1(1体积:1体积)将其混合，搅拌约1小时。 

2)在2体积上述混合液中添加0.1体积封闭液(10％BSA)，搅拌约1小时。 

3)用5mM MOPS(pH7.0)溶液透析后，稀释成3Abs/ml(600nm)，得到含有#14抗体-胶乳复合体(#14Lx)的溶液。 

(2)含有#17抗体-胶乳复合体(#17Lx)的溶液的制备方法 

1)用20mM Tris pH8.0分别稀释胶乳、抗体，制备0.3％胶乳液、0.1mg/ml#17抗体液。以1:1(1体积:1体积)将其混合，搅拌约1小时。 

2)在2体积上述混合液中添加0.03体积封闭液(10％BSA)，搅拌约1小时。 

3)用5mM MOPS(pH7.0)溶液透析后，稀释成2.7Abs/ml(600nm)，得到含有#17抗体-胶乳复合体(#17Lx)的溶液。 

(3)含有#16抗体-胶乳复合体(#16Lx)的溶液的制备方法 

1)用20mM Tris pH8.5分别稀释胶乳、抗体，制备5％胶乳液、0.6mg/ml#16抗体液。以1:1(1体积:1体积)将其混合，搅拌约2小时。 

2)在2体积上述混合液中添加0.4体积封闭液(10％BSA)，搅拌约1小时。

3)用5mM MOPS(pH7.0)溶液透析后，稀释成3Abs/ml(600nm)，得到含有#16抗体-胶乳复合体(#16Lx)的溶液。 

[试验例1] 

通过添加#16抗体-胶乳复合体(#16Lx)来调节c/f比(1-1) 

将相同浓度(40ng/ml)的fPSA和PSA-ACT作为测定样品，在下述PSA测定试剂的基本配方中仅使用作为第二试剂的#14Lx和#17Lx，进行凝集反应，测定fPSA和PSA-ACT的浓度，求出其浓度比PSA-ACT/fPSA(c/f比)，结果约为80％。在此，即使改变#14Lx和#17Lx的混合比，c/f比也几乎没有变化，因此，作为最佳条件，选择含有#14Lx的溶液:含有#17Lx的溶液＝2:1，向其中以0mg/ml、0.24mg/ml、0.32mg/ml、0.41mg/ml、0.49mg/ml、0.57mg/ml的浓度添加#16Lx，测定#16Lx的各添加量下的c/f比。结果在图2-1中示出。 

根据图2-1，随着#16Lx的添加量，c/f比从约80％增加到110％。选择c/f比成为100％的条件、即fPSA和PSA-ACT显示等摩尔反应性的条件的结果，载体的混合比例计算出为含有#14Lx的溶液:含有#17Lx的溶液:含有#16Lx的溶液＝2:1:约0.27。 

(1)PSA测定试剂的基本配方 

第一试剂(缓冲液) 

0.5M KCl， 

0.1％BSA(proliant) 

30mM HEPES缓冲液pH7.0 

第二试剂(抗体致敏胶乳液) 

抗PSA·小鼠单克隆抗体致敏胶乳颗粒(*)， 

5mM MOPS pH7.0

^*三种抗体致敏胶乳颗粒的混合比 

含有#14Lx的溶液:含有#17Lx的溶液:含有#16Lx的溶液＝2:1:约0.27 

(2)测定条件 

测定装置：H7170 

参数： 

分析方法2Point End(测定点19～34) 

液量8/100/100 

测定波长570(主)/800(副) 

校准Spline 

(3)测定样品 

将fPSA、PSA-ACT(都是Fitzgerald公司生产)溶解于1％BSA、0.1NaN₃/PBS中作为样品。 

[试验例1-2] 

通过添加#16抗体-胶乳复合体(#16Lx)来调节c/f比(1-2) 

关于上述试验例1-1通过添加#16Lx调节c/f比，对#16Lx添加量低的情况，提高级别进行试验。 

将试验例1-1的测定样品的浓度(40ng/ml)改为36ng/ml，将#16Lx的添加量的级别改为0mg/ml、0.16mg/ml、0.24mg/ml、0.32mg/ml、0.40mg/ml，除此以外，与试验例1同样操作，测定#16Lx的各添加量下的c/f比。结果在图2-2中示出。 

由图2-1和图2-2可知，通过适当调节#16Lx的添加量，c/f比可以在90～110％之间调节。 

[试验例2] 

保存稳定性 

在试验例1所求得的c/f比为100％的条件下，在4℃下保存并 测定c/f比的经时变化，结果在7个月以上的保存期间中c/f比维持90％～110％。 

[试验例3] 

添加游离的抗体#16的效果 

#16不致敏到载体上，而以游离的状态添加，除此以外，与试验例1同样测定c/f比。结果在图3中示出。使用试验例1所列举的PSA测定试剂的基本配方，与作为第二试剂的#14Lx、#17Lx一起添加#16(0.43mg/ml)。 

将相同浓度(各8.7ng/ml)的fPSA、PSA-ACT作为样品，求出fPSA和PSA-ACT显示的信号之比、c/f比。结果可知，未致敏到载体上的游离的抗体#16也有将c/f比改善为100％附近的效果。 

[试验例4] 

其它单克隆抗体的组合 

除了使用单克隆抗体#17和#36的组合来代替单克隆抗体#14和#17的组合以外，与试验例1同样地求出c/f比。将相同浓度(各30ng/ml)的fPSA、PSA-ACT作为样品，向其中添加抗体#16(0.43mg/ml)。结果确认，使用本试验例的抗体的组合时也可增加c/f比。 

[试验例5] 

胶乳的粒径尺寸对c/f比的影响 

添加被单克隆抗体#16致敏的下述尺寸的胶乳，其浓度为0、0.5mg/ml、1.25mg/ml，对各个浓度，与试验例1同样地测定c/f比。结果在图4中示出。 

从该结果可知，被抗体致敏的0.055～0.22μm的胶乳，都具有浓度依赖性地将c/f比改善到100％的效果。 

胶乳的尺寸：0.055μm、0.086μm、0.087μm、0.22μm

工业上的实用性 

本发明的抗原的测定试剂不使用特殊的抗体，即可通过适当组合利用常规方法得到的抗体来获得。因此，如果使用本发明的测定试剂，可简便并且正确地测定抗原，另外，可适用于通用的自动分析装置，因此可对减轻患者在检查中的经济上、时间上、身体上的负担作出巨大贡献。

Claims (9)

1.一种前列腺特异抗原的测定试剂，其为用于通过免疫凝集反应测定前列腺特异抗原的试剂，

其包含至少三种抗前列腺特异抗原抗体，这些抗前列腺特异抗原抗体是与游离型前列腺特异抗原以及α1-抗糜蛋白酶复合前列腺特异抗原这两者反应且识别部位不同的抗前列腺特异抗原抗体，

该抗前列腺特异抗原抗体中的至少两种抗前列腺特异抗原抗体被致敏到载体上并且与该两前列腺特异抗原反应，

该抗前列腺特异抗原抗体的混合比例被调节成与该两前列腺特异抗原显示等摩尔反应性。

2.根据权利要求1所述的前列腺特异抗原的测定试剂，其中，抗前列腺特异抗原抗体是三种。

3.根据权利要求1或2所述的前列腺特异抗原的测定试剂，其中，全部抗前列腺特异抗原抗体都被致敏到载体上。

4.根据权利要求1或2所述的前列腺特异抗原的测定试剂，其中，被一种抗前列腺特异抗原抗体致敏的载体与被另一种抗前列腺特异抗原抗体致敏的载体的粒径不同。

5.根据权利要求1或2所述的前列腺特异抗原的测定试剂，其中，抗前列腺特异抗原抗体是单克隆抗体。

6.一种前列腺特异抗原的测定试剂，该试剂用于通过免疫凝集反应测定前列腺特异抗原，

其包含用三种单克隆抗体致敏的胶乳，这些抗体与α1-抗糜蛋白酶复合前列腺特异抗原和游离型前列腺特异抗原两者反应且识别部位不同，

分别用其中的两种抗体致敏的胶乳较之用另一种抗体致敏的胶乳，其粒径大，

各抗体的混合比例被调节成与该两抗原显示等摩尔反应性。

7.根据权利要求6所述的前列腺特异抗原的测定试剂，其中，分别用抗体致敏的胶乳被包含在1个试剂中。

8.根据权利要求6或7所述的前列腺特异抗原的测定试剂，其中，用另一种抗体致敏的胶乳的粒径为0.02～0.22μm。

9.一种前列腺特异抗原测定试剂的制造方法，其为利用免疫凝集反应测定前列腺特异抗原的试剂的制造方法，其特征在于，

准备用三种抗体致敏的载体，这些抗体与α1-抗糜蛋白酶复合前列腺特异抗原和游离型前列腺特异抗原两者反应且识别部位不同，

预先将分别用三种抗体中的两种抗体致敏的载体的混合比例设定在规定的范围，即，所述两种抗体的混合比例被调节成该两抗原与抗体显示规定的摩尔反应性，

接着，将用另一种抗体致敏的载体添加到所述两种抗体致敏的载体的混合物中，并调节成两抗原与抗体显示规定的摩尔反应性，

所述规定的摩尔反应性为等摩尔反应性。

Images