JP2001302691A - ヒトｋｇｆに対する抗体 - Google Patents
ヒトｋｇｆに対する抗体Info
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ヒト表皮細胞増殖因子（Keratinocyte G
rowth Factor : KGF)に特異的に結合するポリクローナ
ル抗体。 【効果】 本抗体は、ＫＧＦに対する特異性が高いた
め、各種の臓器、組織、細胞におけるＫＧＦの検出、測
定を正確且つ迅速に行うことができ、真珠腫その他各種
腫瘍の検出、イムノアッセイに利用することができる。
rowth Factor : KGF)に特異的に結合するポリクローナ
ル抗体。 【効果】 本抗体は、ＫＧＦに対する特異性が高いた
め、各種の臓器、組織、細胞におけるＫＧＦの検出、測
定を正確且つ迅速に行うことができ、真珠腫その他各種
腫瘍の検出、イムノアッセイに利用することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＫＧＦ（Keratino
cyte Growth Factor : 表皮細胞増殖因子）と特異的に
結合する抗体及びその利用に関するものである。
cyte Growth Factor : 表皮細胞増殖因子）と特異的に
結合する抗体及びその利用に関するものである。
【０００２】ＫＧＦは、それをコードするｍＲＮＡのシ
ークエンスの特徴から、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）
ファミリー（ＦＧＦ１〜９）の内ＦＧＦ７に分類される
細胞増殖因子である。ＫＧＦ、つまりＦＧＦ７は、線維
芽細胞などが産生し、上皮細胞に特異的に作用しその増
殖を促す活性を有している。また、ＫＧＦは正常の上皮
細胞の発生・増殖に寄与しているだけでなく上皮組織由
来の様々な臓器における腫瘍の増殖にも関与している可
能性がある。したがって本発明によるＫＧＦに対する抗
体は、各種の臓器や組織、細胞におけるＫＧＦの存在の
有無を調べることにより、各種腫瘍、固形癌などの診断
に寄与するものである。
ークエンスの特徴から、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）
ファミリー（ＦＧＦ１〜９）の内ＦＧＦ７に分類される
細胞増殖因子である。ＫＧＦ、つまりＦＧＦ７は、線維
芽細胞などが産生し、上皮細胞に特異的に作用しその増
殖を促す活性を有している。また、ＫＧＦは正常の上皮
細胞の発生・増殖に寄与しているだけでなく上皮組織由
来の様々な臓器における腫瘍の増殖にも関与している可
能性がある。したがって本発明によるＫＧＦに対する抗
体は、各種の臓器や組織、細胞におけるＫＧＦの存在の
有無を調べることにより、各種腫瘍、固形癌などの診断
に寄与するものである。
【０００３】
【従来の技術】従来、ＫＧＦの組織における分布を調べ
るためには、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法
やモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を用
いた凍結組織切片の染色が行われたのみで、未だ、広く
病理領域で用いられるホルマリン固定パラフィン包埋組
織切片を他のＦＧＦファミリーの細胞増殖因子などと明
らかに区別して染色可能な抗体は使用されたことがな
い。そこで、われわれはＫＧＦを特異的に認識しかつホ
ルマリン固定パラフィン包埋された組織の薄切切片を染
色することのできる抗体を作製することにより、各種腫
瘍、固形癌などの診断に寄与するとともに、その治療法
の開発にも貢献できるものと考えるに至った。
るためには、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法
やモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を用
いた凍結組織切片の染色が行われたのみで、未だ、広く
病理領域で用いられるホルマリン固定パラフィン包埋組
織切片を他のＦＧＦファミリーの細胞増殖因子などと明
らかに区別して染色可能な抗体は使用されたことがな
い。そこで、われわれはＫＧＦを特異的に認識しかつホ
ルマリン固定パラフィン包埋された組織の薄切切片を染
色することのできる抗体を作製することにより、各種腫
瘍、固形癌などの診断に寄与するとともに、その治療法
の開発にも貢献できるものと考えるに至った。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】このような技術の現状
において、各種の腫瘍や癌の早期診断の必要性から、ホ
ルマリン固定パラフィン切片を染める抗体が特に病理領
域において重要である点に鑑み、このような切片をＦＧ
Ｆ７（つまりＫＧＦ）以外の他のＫＧＦファミリーに属
する細胞増殖因子などと明らかに区別して染色すること
のできる抗体を作製することを目的として、本発明はな
されたものである。
において、各種の腫瘍や癌の早期診断の必要性から、ホ
ルマリン固定パラフィン切片を染める抗体が特に病理領
域において重要である点に鑑み、このような切片をＦＧ
Ｆ７（つまりＫＧＦ）以外の他のＫＧＦファミリーに属
する細胞増殖因子などと明らかに区別して染色すること
のできる抗体を作製することを目的として、本発明はな
されたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、各方面から検討の
結果、免疫原に着目した。そして、ＫＧＦと特異的に結
合する抗体を産生するだけでなく、作製の容易性という
特に工業的見地から可及的に短いアミノ酸配列を有する
ものであり、またそのためにキャリア蛋白質との良好な
結合性も必要であり、しかも動物への免疫がスムーズに
行われて、抗血清ないし抗体が効率的に産生されること
が必要であるとの見地から、これらの各要件を満たすこ
とのできるペプチドについて、鋭意スクリーニングを行
った。その結果、目的とするペプチドをスクリーニング
するのにはじめて成功した。
成するためになされたものであって、各方面から検討の
結果、免疫原に着目した。そして、ＫＧＦと特異的に結
合する抗体を産生するだけでなく、作製の容易性という
特に工業的見地から可及的に短いアミノ酸配列を有する
ものであり、またそのためにキャリア蛋白質との良好な
結合性も必要であり、しかも動物への免疫がスムーズに
行われて、抗血清ないし抗体が効率的に産生されること
が必要であるとの見地から、これらの各要件を満たすこ
とのできるペプチドについて、鋭意スクリーニングを行
った。その結果、目的とするペプチドをスクリーニング
するのにはじめて成功した。
【０００６】そして、この特定のアミノ酸配列を有する
ペプチドとキャリア蛋白質との複合体を免疫原として用
い、これをウサギに免疫し、得られた抗血清がＫＧＦと
特異的に結合することをはじめて確認し、これらの有用
新知見に基づいて更に研究の結果、本発明は完成された
ものである。
ペプチドとキャリア蛋白質との複合体を免疫原として用
い、これをウサギに免疫し、得られた抗血清がＫＧＦと
特異的に結合することをはじめて確認し、これらの有用
新知見に基づいて更に研究の結果、本発明は完成された
ものである。
【０００７】本発明は、特定のアミノ酸配列を有するペ
プチドを新規免疫原として使用することにより、細胞レ
ベルでのＫＧＦの存在の有無やその量を解析、測定でき
る抗体を創製するのに成功したものであって、本発明に
係る抗体はＫＧＦを特異的に認識する抗体であり、従来
未知の新規抗体である。なお、本発明において、ヒトＫ
ＧＦを単にＫＧＦということもあり、また、免疫測定に
はＫＧＦの検出、その存否の確認や解析のほか、ＫＧＦ
の定性又は定量分析も包含し、免疫組織染色、免疫沈降
その他各種のイムノアッセイすべてが包含される。
プチドを新規免疫原として使用することにより、細胞レ
ベルでのＫＧＦの存在の有無やその量を解析、測定でき
る抗体を創製するのに成功したものであって、本発明に
係る抗体はＫＧＦを特異的に認識する抗体であり、従来
未知の新規抗体である。なお、本発明において、ヒトＫ
ＧＦを単にＫＧＦということもあり、また、免疫測定に
はＫＧＦの検出、その存否の確認や解析のほか、ＫＧＦ
の定性又は定量分析も包含し、免疫組織染色、免疫沈降
その他各種のイムノアッセイすべてが包含される。
【０００８】すなわち本発明は、特定のペプチドからな
る新規免疫原、それを用いて得た新規抗体、この新規抗
体が有するＫＧＦとの特異的結合性及びそれを利用した
新規アッセイ系の構築等数多くのしかもきわめて有用な
特徴を有するものである。以下、本発明について詳述す
る。
る新規免疫原、それを用いて得た新規抗体、この新規抗
体が有するＫＧＦとの特異的結合性及びそれを利用した
新規アッセイ系の構築等数多くのしかもきわめて有用な
特徴を有するものである。以下、本発明について詳述す
る。
【０００９】本発明に係る新規抗体を作製するために使
用する免疫原としては、配列表の配列番号１に示される
アミノ酸配列を有するペプチド（１）（図１）、及び／
又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプ
チド（２）（図２）が挙げられる。これらのペプチド
（１）、（２）は、抗ＫＧＦ抗体作製用免疫原として新
規であるが、ペプチド合成装置を使用する等従来既知の
方法によって適宜製造される。
用する免疫原としては、配列表の配列番号１に示される
アミノ酸配列を有するペプチド（１）（図１）、及び／
又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプ
チド（２）（図２）が挙げられる。これらのペプチド
（１）、（２）は、抗ＫＧＦ抗体作製用免疫原として新
規であるが、ペプチド合成装置を使用する等従来既知の
方法によって適宜製造される。
【００１０】免疫は常法にしたがって行えばよく、該ペ
プチドをＢＳＡ、ＫＬＨ、ウシサイログロブリンその他
既知のキャリア蛋白質と結合せしめ、この結合体（複合
体）を免疫原とし、必要あればフロイントの完全アジュ
バント又は不完全アジュバント等各種アジュバントと共
に、動物に必要回数注射することによって行う。注射す
る動物としては、マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ等を
使用することができ、注射する方法は公知の方法に従う
事ができる。そして注射した動物より採血し、抗血清を
得る。得られた抗血清より本発明の抗体を得るには従来
知られているいずれの方法でも構わない。例えば、アフ
ィニティクロマトグラフィー、硫安塩析、イオン交換ク
ロマトグラフィー等蛋白質の精製方法が適宜採用され
る。
プチドをＢＳＡ、ＫＬＨ、ウシサイログロブリンその他
既知のキャリア蛋白質と結合せしめ、この結合体（複合
体）を免疫原とし、必要あればフロイントの完全アジュ
バント又は不完全アジュバント等各種アジュバントと共
に、動物に必要回数注射することによって行う。注射す
る動物としては、マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ等を
使用することができ、注射する方法は公知の方法に従う
事ができる。そして注射した動物より採血し、抗血清を
得る。得られた抗血清より本発明の抗体を得るには従来
知られているいずれの方法でも構わない。例えば、アフ
ィニティクロマトグラフィー、硫安塩析、イオン交換ク
ロマトグラフィー等蛋白質の精製方法が適宜採用され
る。
【００１１】このようにして作製した抗体は、ヒトＫＧ
Ｆに対する特異性がきわめて高く、ＫＧＦを特異的、選
択的に認識して反応し、これと結合する特質を有するた
め、本抗体を利用して各種方法によってヒトＫＧＦのイ
ムノアッセイを行うことができる。
Ｆに対する特異性がきわめて高く、ＫＧＦを特異的、選
択的に認識して反応し、これと結合する特質を有するた
め、本抗体を利用して各種方法によってヒトＫＧＦのイ
ムノアッセイを行うことができる。
【００１２】イムノアッセイとしては、既述したよう
に、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、免疫組織
化学染色法、免疫沈降法その他が例示され、本抗体を第
一抗体及び／又は酵素標識した第二抗体として使用すれ
ばよい。
に、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、免疫組織
化学染色法、免疫沈降法その他が例示され、本抗体を第
一抗体及び／又は酵素標識した第二抗体として使用すれ
ばよい。
【００１３】例えば免疫組織化学染色の場合は、組織切
片上で検出すべき物質（ＫＧＦ）を特異的に認識する抗
体（本発明に係る抗ＫＧＦ抗体：第１抗体）を反応させ
る。この場合、第１抗体に酵素を結合しておけば、その
酵素活性により着色性の基質を発色させることで、ＫＧ
Ｆ（又はＫＧＦを産生するあるいはそれを含有する細
胞）の検出が可能となる。すなわち、１）標識した第１
抗体との反応、２）酵素試薬との反応、３）発色という
操作で染色が実施されるのである。また、必要あれば、
感度を高める等の目的で、第１抗体（非標識）との反応
後、第１抗体と特異的に結合する第２抗体（標識化）と
を反応させてもよい。
片上で検出すべき物質（ＫＧＦ）を特異的に認識する抗
体（本発明に係る抗ＫＧＦ抗体：第１抗体）を反応させ
る。この場合、第１抗体に酵素を結合しておけば、その
酵素活性により着色性の基質を発色させることで、ＫＧ
Ｆ（又はＫＧＦを産生するあるいはそれを含有する細
胞）の検出が可能となる。すなわち、１）標識した第１
抗体との反応、２）酵素試薬との反応、３）発色という
操作で染色が実施されるのである。また、必要あれば、
感度を高める等の目的で、第１抗体（非標識）との反応
後、第１抗体と特異的に結合する第２抗体（標識化）と
を反応させてもよい。
【００１４】また、ＥＩＡ、例えばサンドイッチ法によ
るＥＩＡの場合には、１）特定の物質（ＫＧＦ）と結合
する抗体（本発明に係る抗ＫＧＦ抗体：第１抗体）をマ
イクロタイタープレート又はポリスチレンビーズ等に固
相化し、２）次にアルブミン等の蛋白質でプレート又は
ビーズをブロッキングし、３）特定の物質（ＫＧＦ）が
含まれる溶液を加えて一定時間反応させ、４）酵素標識
した特定の物質に結合する抗体（酵素標識化抗ＫＧＦ抗
体：第２抗体）を加えて一定時間反応させ、５）酵素の
基質を加え、その発色の程度を分光光度計で測定すると
いう操作でＥＩＡが実施される。
るＥＩＡの場合には、１）特定の物質（ＫＧＦ）と結合
する抗体（本発明に係る抗ＫＧＦ抗体：第１抗体）をマ
イクロタイタープレート又はポリスチレンビーズ等に固
相化し、２）次にアルブミン等の蛋白質でプレート又は
ビーズをブロッキングし、３）特定の物質（ＫＧＦ）が
含まれる溶液を加えて一定時間反応させ、４）酵素標識
した特定の物質に結合する抗体（酵素標識化抗ＫＧＦ抗
体：第２抗体）を加えて一定時間反応させ、５）酵素の
基質を加え、その発色の程度を分光光度計で測定すると
いう操作でＥＩＡが実施される。
【００１５】これら二種の抗体は、互いに異なるエピト
ープを認識する必要があるが、本発明においては、ペプ
チド（１）を免疫原として得た抗体を第１抗体、ペプチ
ド（２）を免疫原として得た抗体を第２抗体として用い
ることができるし、その逆も可能である。
ープを認識する必要があるが、本発明においては、ペプ
チド（１）を免疫原として得た抗体を第１抗体、ペプチ
ド（２）を免疫原として得た抗体を第２抗体として用い
ることができるし、その逆も可能である。
【００１６】また、本発明に係るイムノアッセイにおい
て、酵素標識抗体を使用するほか、アビジン−ビオチン
系を利用して、酵素標識抗体にかえてビオチン標識した
抗体を用い、そして酵素としてアビジン標識酵素を用い
てアッセイ系を組み立ててもよい。アビジンとしては、
卵白由来のアビジン、微生物由来のアビジン（例えばス
トレプトアビジン）等がいずれも使用可能である。
て、酵素標識抗体を使用するほか、アビジン−ビオチン
系を利用して、酵素標識抗体にかえてビオチン標識した
抗体を用い、そして酵素としてアビジン標識酵素を用い
てアッセイ系を組み立ててもよい。アビジンとしては、
卵白由来のアビジン、微生物由来のアビジン（例えばス
トレプトアビジン）等がいずれも使用可能である。
【００１７】標識酵素としては、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ小腸アルカリフォスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオ
キシダーゼ等の酵素免疫分析法（ＥＩＡ）に常用される
酵素が適宜使用され、これらの酵素に適合しＥＩＡで常
用される発色基質が適宜使用される。発色基質として
は、例えばＨＲＰの場合は、３，３′，５，５′−テト
ラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、ＴＭＢＺ・ＨＣｌ、
ＴＭＢＺ・ＰＳ、ＡＢＴＳ、ｏ−フェニレンジアミン、
ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸等が使用され、アルカリフ
ォスファターゼの場合は、ｐ−ニトロフェニルフォスフ
ェート、４−メチルウンベリフェリルフォスフェート等
が使用され、β−ガラクトシダーゼの場合は、ｏ−ニト
ロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチル
ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が使
用される。
ダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ小腸アルカリフォスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオ
キシダーゼ等の酵素免疫分析法（ＥＩＡ）に常用される
酵素が適宜使用され、これらの酵素に適合しＥＩＡで常
用される発色基質が適宜使用される。発色基質として
は、例えばＨＲＰの場合は、３，３′，５，５′−テト
ラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、ＴＭＢＺ・ＨＣｌ、
ＴＭＢＺ・ＰＳ、ＡＢＴＳ、ｏ−フェニレンジアミン、
ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸等が使用され、アルカリフ
ォスファターゼの場合は、ｐ−ニトロフェニルフォスフ
ェート、４−メチルウンベリフェリルフォスフェート等
が使用され、β−ガラクトシダーゼの場合は、ｏ−ニト
ロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチル
ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が使
用される。
【００１８】また本発明は、上記した新規免疫原、それ
を用いて得た新規抗体、それを利用するＫＧＦの検出、
測定方法、ひいてはそれを発現生成している細胞の染
色、検出、測定方法を新たに提供するだけでなく、抗ヒ
トＫＧＦ抗体、標識化抗ヒトＫＧＦ抗体、酵素基質、発
色試薬、緩衝液、その他必要な物質を含有するヒトＫＧ
Ｆ（又はその産生ないし含有細胞）測定用キットも提供
するものである。
を用いて得た新規抗体、それを利用するＫＧＦの検出、
測定方法、ひいてはそれを発現生成している細胞の染
色、検出、測定方法を新たに提供するだけでなく、抗ヒ
トＫＧＦ抗体、標識化抗ヒトＫＧＦ抗体、酵素基質、発
色試薬、緩衝液、その他必要な物質を含有するヒトＫＧ
Ｆ（又はその産生ないし含有細胞）測定用キットも提供
するものである。
【００１９】以下、本発明の実施例について述べる。
【００２０】
【実施例１】下記にしたがって免疫原を作製し、これを
用いてポリクローナル抗体を作製した。
用いてポリクローナル抗体を作製した。
【００２１】（１）免疫原の作製 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチド（２）
の合成を、自動ペプタイド合成装置（ベックマン社製）
を用いて、固相化法によって得た後、高速クロマトグラ
フィーによって精製した。得られたペプチドのアミノ酸
組成は、１規定の塩酸で１２０℃、一晩加水分解した
後、アミノ酸分析装置を用いて測定し、理論値と一致す
ることを確認した。ペプチド（１）も同様にして作製し
た。
の合成を、自動ペプタイド合成装置（ベックマン社製）
を用いて、固相化法によって得た後、高速クロマトグラ
フィーによって精製した。得られたペプチドのアミノ酸
組成は、１規定の塩酸で１２０℃、一晩加水分解した
後、アミノ酸分析装置を用いて測定し、理論値と一致す
ることを確認した。ペプチド（１）も同様にして作製し
た。
【００２２】このペプチドにキャリア−蛋白質を以下の
ように結合した。即ち、抗原ペプタイド１０ｍｇとウシ
サイログロブリン３ｍｇを１ｍｌの蒸留水に溶解し、３
０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボンイミド塩酸を加え遮光し室温で一晩反応さ
せた後、蒸留水で十分に透析した。抗原ペプタイドとキ
ャリア−蛋白質とが結合したか否かはＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により確認した。
ように結合した。即ち、抗原ペプタイド１０ｍｇとウシ
サイログロブリン３ｍｇを１ｍｌの蒸留水に溶解し、３
０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボンイミド塩酸を加え遮光し室温で一晩反応さ
せた後、蒸留水で十分に透析した。抗原ペプタイドとキ
ャリア−蛋白質とが結合したか否かはＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により確認した。
【００２３】（２）抗体の作製 得られたキャリアー蛋白質とペプタイド結合物（１００
μｇのペプタイドに相当する）をフロインドの完全アジ
ュバントと共にウサギの背部に注射した。以降、毎週１
００μｇのペプタイド相当の抗原蛋白質をフロインドの
不完全アジュバントと混合して同様に合計８回免疫し
た。最後免疫後、１０日目に全採血を行ない抗血清を分
離した。この抗血清をプロテインＡを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィー法によりＩｇＧ分画を単離し
た。即ち、プロテインＡセファロースＣＬ４Ｂ（ファル
マシア社製）２ｍｌをカラムに充填し、１０ｍｌの１．
５Ｍグリシン溶液（ｐＨ８．７）で平衡化した。血清を
同量の１．５Ｍグリシン溶液（ｐＨ８．７）で希釈して
カラムに流してプロテインＡにＩｇＧを結合させた後、
３．０ｍｌの１．５Ｍグリシン溶液（ｐＨ８．７）でカ
ラムを洗った。次に、０．１Ｍグリシン溶液（ｐＨ３．
０）で溶出させＩｇＧ分画を得た。この精製抗体の純度
はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて検定した。同様にし
て、ペプチド（１）に対する抗体を作製した。
μｇのペプタイドに相当する）をフロインドの完全アジ
ュバントと共にウサギの背部に注射した。以降、毎週１
００μｇのペプタイド相当の抗原蛋白質をフロインドの
不完全アジュバントと混合して同様に合計８回免疫し
た。最後免疫後、１０日目に全採血を行ない抗血清を分
離した。この抗血清をプロテインＡを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィー法によりＩｇＧ分画を単離し
た。即ち、プロテインＡセファロースＣＬ４Ｂ（ファル
マシア社製）２ｍｌをカラムに充填し、１０ｍｌの１．
５Ｍグリシン溶液（ｐＨ８．７）で平衡化した。血清を
同量の１．５Ｍグリシン溶液（ｐＨ８．７）で希釈して
カラムに流してプロテインＡにＩｇＧを結合させた後、
３．０ｍｌの１．５Ｍグリシン溶液（ｐＨ８．７）でカ
ラムを洗った。次に、０．１Ｍグリシン溶液（ｐＨ３．
０）で溶出させＩｇＧ分画を得た。この精製抗体の純度
はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて検定した。同様にし
て、ペプチド（１）に対する抗体を作製した。
【００２４】
【実施例２】（真珠腫組織の免疫組織化学染色）ホルマ
リン固定した後、パラフィン包埋した真珠腫組織ブロッ
クを薄切し、スライドガラスに付着、固定した。その
後、脱パラフィン処理及び脱ペルオキシダーゼ処理を行
った。一方、実施例１で製造したペプチド（２）に対す
る抗体を、常用される標識方法にしたがって、ペルオキ
シダーゼで標識した。このペルオキシダーゼ標識抗ＫＧ
Ｆポリクロナール抗体を上記に加えて５分間反応させた
後、よく洗浄し、基質溶液（ジアミノベンチジン、過酸
化水素）を滴下して反応させ、精製水で洗浄、封入を行
い、顕微鏡にて検鏡した。
リン固定した後、パラフィン包埋した真珠腫組織ブロッ
クを薄切し、スライドガラスに付着、固定した。その
後、脱パラフィン処理及び脱ペルオキシダーゼ処理を行
った。一方、実施例１で製造したペプチド（２）に対す
る抗体を、常用される標識方法にしたがって、ペルオキ
シダーゼで標識した。このペルオキシダーゼ標識抗ＫＧ
Ｆポリクロナール抗体を上記に加えて５分間反応させた
後、よく洗浄し、基質溶液（ジアミノベンチジン、過酸
化水素）を滴下して反応させ、精製水で洗浄、封入を行
い、顕微鏡にて検鏡した。
【００２５】その結果、図３（図面代用写真）に示すよ
うに、上皮細胞（ケラチノサイト）が染色された（矢印
の部位に陽性像を示す）。また、この染色は、予じめ免
疫原であるペプチドと反応させた抗ＫＧＦポリクローナ
ル抗体では観察されなかった。これにより、真珠腫を構
成する上皮細胞の増殖にＫＧＦが関与していることが明
らかとなった。なお、ペプチド（１）に対する抗体を用
いた場合も、同様の結果が得られた。
うに、上皮細胞（ケラチノサイト）が染色された（矢印
の部位に陽性像を示す）。また、この染色は、予じめ免
疫原であるペプチドと反応させた抗ＫＧＦポリクローナ
ル抗体では観察されなかった。これにより、真珠腫を構
成する上皮細胞の増殖にＫＧＦが関与していることが明
らかとなった。なお、ペプチド（１）に対する抗体を用
いた場合も、同様の結果が得られた。
【００２６】
【実施例３】（複数症例の陽性率）３２例の真珠腫瘍組
織について、実施例２と同様の染色を行ったところ、陽
性率は９１％であることが確認された。
織について、実施例２と同様の染色を行ったところ、陽
性率は９１％であることが確認された。
【００２７】
【発明の効果】本発明により抗ＫＧＦ抗体が創製され
た。本抗体は、ＫＧＦと特異的に結合するという特質を
有する新規抗体であって、ＫＧＦを認識する特性が高い
ため、本抗体を利用することにより、すぐれたＫＧＦの
免疫測定がはじめて可能となった。
た。本抗体は、ＫＧＦと特異的に結合するという特質を
有する新規抗体であって、ＫＧＦを認識する特性が高い
ため、本抗体を利用することにより、すぐれたＫＧＦの
免疫測定がはじめて可能となった。
【００２８】本測定法は再現性のある結果が得られ、癌
その他の疾患の診断に非常に有効である。また、本抗体
を用いる本測定法ないし検出法としては、ＥＩＡ、ＲＩ
Ａ、免疫組織染色法、免疫沈降法、ウエスタンブロット
法等が挙げられ、これらの方法を総合的に利用すること
により、更に正確な前立腺癌等の癌その他の疾患の診断
が可能となった、例えば、本発明によってはじめて、Ｋ
ＧＦ発現細胞の腫瘍組織での分布を明らかにすることが
可能となった。このような方法で、各種腫瘍組織などで
の存在の有無を解析することが可能となり、本発明は病
理学領域においても重要な役割を果すものである。
その他の疾患の診断に非常に有効である。また、本抗体
を用いる本測定法ないし検出法としては、ＥＩＡ、ＲＩ
Ａ、免疫組織染色法、免疫沈降法、ウエスタンブロット
法等が挙げられ、これらの方法を総合的に利用すること
により、更に正確な前立腺癌等の癌その他の疾患の診断
が可能となった、例えば、本発明によってはじめて、Ｋ
ＧＦ発現細胞の腫瘍組織での分布を明らかにすることが
可能となった。このような方法で、各種腫瘍組織などで
の存在の有無を解析することが可能となり、本発明は病
理学領域においても重要な役割を果すものである。
【００２９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING 〈110〉 Nichirei Corporation 〈120〉 Antibody against Human KGF 〈130〉 6288 〈141〉 2000-4-17 〈160〉 2 〈210〉 1 〈211〉 13 〈212〉 PRT 〈213〉 Artificial sequence 〈400〉 1 Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val 1 5 10 〈210〉 2 〈211〉 15 〈212〉 PRT 〈213〉 Artificial sequence 〈400〉 2 Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile 1 5 10 15
【図１】抗原ペプチド（１）のアミノ酸配列を示す。
【図２】抗原ペプチド（２）のアミノ酸配列を示す。
【図３】ホルマリン固定した後、パラフィン包埋した真
珠腫組織の薄切標本をポリクローナル抗体によって染色
した図面代用写真である。
珠腫組織の薄切標本をポリクローナル抗体によって染色
した図面代用写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (6)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１又は２に示されるア
ミノ酸配列を有するペプチド（１）又は（２）からなる
抗原。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１又は２に示されるア
ミノ酸配列を有するペプチド（１）又は（２）を抗原と
して得られる抗体。 - 【請求項３】 請求項２に記載の抗体がヒトＫＧＦに対
する抗体であること、を特徴とする同項記載の抗体。 - 【請求項４】 ヒトＫＧＦと特異的に結合する抗体。
- 【請求項５】 請求項２〜４のいずれか１項に記載の抗
体を使用すること、を特徴とするヒトＫＧＦの免疫測定
法。 - 【請求項６】 請求項２〜４のいずれか１項に記載の抗
体を含有すること、を特徴とするヒトＫＧＦ測定用キッ
ト。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000115167A JP2001302691A (ja) | 2000-04-17 | 2000-04-17 | ヒトｋｇｆに対する抗体 |
| AU17347/01A AU1734701A (en) | 2000-04-17 | 2000-12-08 | Antibody against human kgf |
| PCT/JP2000/008693 WO2001079265A1 (fr) | 2000-04-17 | 2000-12-08 | Anticorps anti-facteur de croissance du keratinocyte humain |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000115167A JP2001302691A (ja) | 2000-04-17 | 2000-04-17 | ヒトｋｇｆに対する抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001302691A true JP2001302691A (ja) | 2001-10-31 |
Family
ID=18626866
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000115167A Pending JP2001302691A (ja) | 2000-04-17 | 2000-04-17 | ヒトｋｇｆに対する抗体 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001302691A (ja) |
| AU (1) | AU1734701A (ja) |
| WO (1) | WO2001079265A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8278816B2 (en) | 2004-09-30 | 2012-10-02 | Global Tungsten & Powders Corp. | High CRI electroluminescent lamp |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2250213C2 (ru) * | 1989-01-31 | 2005-04-20 | Джеффри С. РУБИН | Выделенный белок фактора роста кератиноцита (kgf), рекомбинантная молекула днк, вектор, способ конструирования клетки-хозяина, способ получения белка, фармацевтическая композиция |
-
2000
- 2000-04-17 JP JP2000115167A patent/JP2001302691A/ja active Pending
- 2000-12-08 AU AU17347/01A patent/AU1734701A/en not_active Abandoned
- 2000-12-08 WO PCT/JP2000/008693 patent/WO2001079265A1/ja active Application Filing
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8278816B2 (en) | 2004-09-30 | 2012-10-02 | Global Tungsten & Powders Corp. | High CRI electroluminescent lamp |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU1734701A (en) | 2001-10-30 |
| WO2001079265A1 (fr) | 2001-10-25 |
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