RU2250213C2 - Выделенный белок фактора роста кератиноцита (kgf), рекомбинантная молекула днк, вектор, способ конструирования клетки-хозяина, способ получения белка, фармацевтическая композиция - Google Patents
Выделенный белок фактора роста кератиноцита (kgf), рекомбинантная молекула днк, вектор, способ конструирования клетки-хозяина, способ получения белка, фармацевтическая композиция Download PDFInfo
- Publication number
- RU2250213C2 RU2250213C2 SU5001740/13A SU5001740A RU2250213C2 RU 2250213 C2 RU2250213 C2 RU 2250213C2 SU 5001740/13 A SU5001740/13 A SU 5001740/13A SU 5001740 A SU5001740 A SU 5001740A RU 2250213 C2 RU2250213 C2 RU 2250213C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- kgf
- protein
- cells
- kcf
- protein according
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 122
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 title claims abstract description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 title claims abstract description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 72
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 title description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 title description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 105
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 93
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 55
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 54
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 52
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 63
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 57
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 36
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 36
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 35
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 25
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims description 22
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 20
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 16
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 9
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 8
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 11
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 76
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 10
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract description 7
- 230000008556 epithelial cell proliferation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 70
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 68
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 63
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 63
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 57
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 40
- QCHPKSFMDHPSNR-UHFFFAOYSA-N 3-aminoisobutyric acid Chemical compound NCC(C)C(O)=O QCHPKSFMDHPSNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 35
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 33
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 22
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 17
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 14
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 14
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 14
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 13
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 12
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 101100446506 Mus musculus Fgf3 gene Proteins 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 8
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 7
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 7
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 6
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 6
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 6
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000003752 saphenous vein Anatomy 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 5
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 5
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 4
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 3
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 3
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 3
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 3
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 3
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 241000272184 Falconiformes Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 2
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 101150109894 TGFA gene Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000069 breast epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 230000001114 myogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- BQIMPGFMMOZASS-CLZZGJSISA-N (6r,7r)-7-amino-3-(hydroxymethyl)-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Chemical compound S1CC(CO)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](N)[C@H]21 BQIMPGFMMOZASS-CLZZGJSISA-N 0.000 description 1
- QDUDQAJMMWFNEO-UHFFFAOYSA-N 2-(sulfoamino)propane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)CC(CC(O)=O)(NS(O)(=O)=O)C(O)=O QDUDQAJMMWFNEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- FXWALQSAZZPDOT-NMUGVGKYSA-N Arg-Thr-Cys-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N FXWALQSAZZPDOT-NMUGVGKYSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100395863 Caenorhabditis elegans hst-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 1
- 102100036723 Discoidin domain-containing receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 101000993347 Gallus gallus Ciliary neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 206010061968 Gastric neoplasm Diseases 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241001622557 Hesperia Species 0.000 description 1
- 101000661592 Homo sapiens Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit STT3A Proteins 0.000 description 1
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101100133458 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nit-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007940 bacterial gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001043 capillary endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- RJYSYRSELCQCSO-UHFFFAOYSA-M cesium;2,2,2-trifluoroacetate Chemical compound [Cs+].[O-]C(=O)C(F)(F)F RJYSYRSELCQCSO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000011037 discontinuous sequential dilution Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000057239 human FGF7 Human genes 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 235000021018 plums Nutrition 0.000 description 1
- 229920000307 polymer substrate Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000015721 regulation of epithelial cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011268 retreatment Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000008684 selective degradation Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factors [FGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factors [FGF]
- C07K14/501—Fibroblast growth factors [FGF] acidic FGF [aFGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к факторам роста эпителиальных клеток, и может быть использовано для получения нового фактора роста кератиноцитов (KGF). Белок KGF получают путем культивирования рекомбинантной клетки-хозяина, трансформированной вектором, содержащим молекулу ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность белка KGF. Полученный белок KGF в составе фармацевтической композиции используют для стимуляции пролиферации эпителиальных клеток. Изобретение позволяет получить белок KGF, обладающий специфической митогенной активностью 3,4·104 единиц на мг белка в отношении кератиноцитных клеток. 7 н. и 45 з.п. ф-лы, 3 табл., 14 ил.
Description
Область изобретения.
Настоящее изобретение относится к факторам роста, особенно к выделению фактора роста, полипептида, аналогичного семейству факторов, включающему известные факторы роста фибробласта (FCF).
Настоящее изобретение относится также к конструированию сегментов комплементарной ДНК (cДНК) из информационной РНК (мРНК), кодирующей новый фактор роста. Кроме того, настоящее изобретение относится к синтезу продуктов таких ДНК сегментов рекомбинантными клетками, а также к производству и использованию некоторых других новых продуктов, получаемых в результате идентификации и клонирования ДНК, кодирующих такой фактор роста.
Сокращения, используемые в заявке
аFСF - фактор роста кислотного фибробласта
bFСF - фактор роста основного фибробласта
ЕСF - эпидермальный фактор роста
HCA - гепарин-Сефарозная сродственная хроматография
кb – килооснования
кДа – килодальтоны
КСF - фактор роста кератиноцита
NаДоdSО4/РАGЕ электрофорез в системе додецилсульфат натрия/SДS/полиакриламидный гель
RР-НРLС - обратимо-фазная хроматография высокого разрешения
ТGFа - трансформирующий фактор роста а.
Предпосылка создания изобретения
Факторы роста являются важными медиаторами межклеточной коммуникации. Такие мощные молекулы обычно выделяются клеткой одного типа и оказывают влияние на пролиферацию клеток другого типа (см. ссылку I-1 в Экспериментальном разделе I, ниже). Интерес к факторам роста усилился в результате получения свидетельств их потенциального участия в неоплазии (ссылка II-2 в Экспериментальном разделе II, ниже). У-sis трансформирующий ген вируса саркомы обезьян кодирует протеин гомологичный В цепи фактора роста - производного тромбоцита (I-1, I-2) Кроме этого, ряд онкогенов является гомологом генов, кодирующих рецепторы фактора роста (I-1). Таким образом, углубленное понимание путей сигнальной трансдукции, усиленной факторами роста или их рецепторами, по-видимому, может обеспечить проникновение в механизмы роста как нормальных, так и злокачественных клеток.
Известное семейство факторов роста, оказывающее влияние на клетки соединительной ткани, включает фактор роста кислотного фибробласта (аFcF), фактор роста основного фибробласта (bFСF) и родственные продукты hst и int-2 онкогенов.
Кроме того, известно, что некоторые факторы роста, включающие следующие разновидности, обладают гепарин-связующими свойствами aFcF (I-20, I-21), bFcF (I-19, I-20), фактор, стимулирующий гранулоцит/макрофаговую колонию (I-1), и интерлейкин 3 (I-1). Каждый из таких полипептидных факторов продуцируется стромальными клетками (I-1, I-2, I-25). По-видимому, такие факторы отлагаются во внеклеточной матрице или на протеогликанах, покрывающих поверхность стромальной клетки (I-1, I-25). Постулируется, что их хранение, выделение и контактирование с конкретными клетками-мишенями регулируется таким взаимодействием (I-25, I-28).
Однако хорошо известно, что большое число человеческих злокачественных образований является производными эпителиальных тканей (I-5). Были описаны эффекторы пролиферации эпителиальных клеток из мезенхимальных тканей (I-1, I-2, I-3), однако их молекулярная идентичность и структуры установлены не были. В свете дефицита сведений о мезинхимальных факторах роста, влияющих на эпителиальные клетки, совершенно понятно, что имеется необходимость в способах, композициях и биологических анализах, которые обеспечили бы углубленное знание и анализ механизмов регуляции пролиферации эпителиальных клеток и, особенно, необходимость в новых диагностических и терапевтических средствах, содержащих такие факторы.
Настоящее изобретение предусматривает применение методов выделения протеина и технологий на основе рекомбинантной ДНК для удовлетворения указанных потребностей и для создания средства продуцирования протеиновых факторов мезенхимального происхождения, которые, по-видимому, относятся к процессам пролиферации эпителиальных клеток и которые не могут быть получены иным путем. Настоящее изобретение также предусматривает применение механизмов действия таких факторов в отношении процессов роста эпителиальных клеток.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к разработке технологий выделения протеина и рекомбинантной ДНК, которые включают получение новых протеинов фактора роста, влияющих на эпителиальные клетки, которые не содержат других пептидных факторов. В сферу изобретения входят также новые сегменты ДНК и методы биологического анализа.
Главным образом настоящее изобретение относится к новому протеину, обладающему структурными и/или функциональными характеристиками известного семейства факторов роста, которое включает фактор роста кислотного фибробласта (аFCF), фактор роста основного фибробласта (bFBF) и родственные продукты hst и nit–2 - онкогенов. Такой новый член семейства FcF полипептидов сохраняет гепарин - связующие свойства FcF, но, кроме того, обладает уникальной специфичностью в отношении клетки-мишени. Такой фактор роста, по-видимому, специфичен по отношению к эпителиальным клеткам и проявляет особенную активность в отношении кератиноцитов. Поэтому такой новый фактор обозначен, как "фактор роста кератиноцита" (КСF). Несмотря на отсутствие активности в отношении фибробластов, поскольку такой фактор является шестым известным членом FCF полипептидного семейства, КСF может быть также обозначен, как FCF - 6.
В связи с этим, настоящее изобретение частично относится к очищенным КСF или КСF-подобным протеинам и способам получения таких протеинов. Такие очищенные факторы могут быть получены культивацией человеческих клеток, которые по своей природе секретируют такие протеины и применением методов выделения согласно практическому аспекту настоящего изобретения. Такие протеины могут использоваться для биохимических и биологических исследований, приводящих, например, к выделению сегментов ДНК, кодирующих KGF или КGF-подобные полипептиды.
Настоящее изобретение также относится к таким сегментам ДНК, которые кодируют KGF или КCF-подобные протеины. Согласно принципиальному воплощению настоящее изобретение относится к ДНК-сегментам, которые кодируют КGF-родственные продукты, состоящим из: человеческих сДНК клонов 32 или 49, полученных из полиаденилированной РНК экстрагированной из клеточной линии М426 человеческого эмбрионного легочного фибробласта; рекомбинантов и мутантов таких клонов; и родственных сегментов ДНК, которые могут детектироваться гибридизацией с любым из указанных выше сегментов человеческой ДНК; причем такие родственные сегменты кодируют КCF-подобные протеины или их части.
При практической реализации одного из воплощений настоящего изобретения ДНК-сегменты изобретения способны экспрессироваться в клетки подходящего хозяина в результате чего продуцируются КСF или КCF-подобные протеины. Настоящее изобретение также относится к мРНК, продуцированным в результате транскрипции чувствительных тяжей сегментов ДНК настоящего изобретения.
Согласно другому воплощению настоящее изобретение относится к молекуле рекомбинантной ДНК, включающей вектор и ДНК настоящего изобретения. Такие рекомбинантные молекулы могут быть представлены молекулами, включающими KCF сДНК и любую из следующих векторных ДНК: вектор, клонирующий бактериофаг λ (в качестве примера которого можно привести λ рСЕУ9); плазмидный вектор, устанавливающий последовательность ДНК (например, вариант рУС) вектор экспрессии бактериального гена (например, РКК233-2); или вектор экспрессии гена млекопитающего (такой как рММТ).
Согласно еще одному воплощению настоящее изобретение включает клетку, предпочтительно, клетку млекопитающего, трансформированную с помощью ДНК изобретения. Кроме этого, настоящее изобретение включает клетки, например, клетки насекомых, дрожжевые клетки и бактериальные клетки разновидностей Escherichia coli u B. subtilis, трансформированные ДНК настоящего изобретения. Согласно другому решению такого аспекта изобретения трансформирующая ДНК способна экспрессироваться в клетке, в результате чего в ней повышается количество KCF или КСF-подобного протеина закодированного такой ДНК.
Первичный продукт трансляции KCF, предсказанный на основании его сДНК последовательности, содержит N-терминальный гидрофобный участок, который вероятно служит сигнальной последовательностью для секреции и отсутствует в зрелой молекуле KCF. Согласно наиболее предпочтительному воплощению генно-экспрессионного аспекта изобретения клетка, трансформированная с помощью ДНК изобретения, секретирует протеин закодированный этой ДНК в такой форме (транкатированной), которая секретируется клетками человеческого эмбрионного легочного фибробласта.
Кроме этого, настоящее изобретение предусматривает KCF или КСF-подобные протеины, продуцированные экспрессией ДНК изобретения, или трансляцией РНК изобретения. Предпочтительно когда такие протеины находятся в секретированной форме (например, при отсутствии сигнальной последовательности). Такие протеиновые факторы могут использоваться для функциональных исследований и могут быть очищены для дополнительного структурного и функционального анализа, такого как качественный и количественный анализ на связывание рецептора.
Кроме этого, возможность продуцирования больших количеств такого нового фактора роста рекомбинантными методами позволяет осуществить испытание на его клиническую применимость в тех ситуациях, когда особенно важна специфическая стимуляция роста эпителиальных клеток. В соответствии с этим настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие KCF или КСF-подобные полипептиды предназначенные для использования при лечении болезненных состояний включающем, например, заживление ран от ожогов или стимуляцию трансплатированной роговичной ткани.
В соответствии с таким воплощением настоящего изобретения новые КCF-подобные протеины представляют собой протеиновые продукты "немодифицированных" ДНК и мРНК настоящего изобретения, или модифицированные либо полученные методами генной инженерии протеиновые продукты. В результате инженерных мутаций в последовательностях ДНК модифицированные КCF-подобные протеины приобретают одно или более отличий в аминокислотной последовательности от соответствующих природных протеинов "дикого типа". В соответствии с одним из воплощений такого аспекта настоящего изобретения модифицированные КCF-подобные протеины будут включать "химерные" молекулы, содержащие сегменты аминокислотных последовательностей КCF, и, по крайней мере, один другой член FCF пептидного семейства.
Результаты аналогичных успешных подходов с использованием других пептидных факторов, обладающих аналогичными свойствами, позволяют заключить, что разработка таких химерных KCF-подобных полипептидов должна привести к улучшенным формам КCF-подобных пептидов "второго поколения", предназначенным для клинических целей. Так, например, такие модифицированные КСF-подобные продукты могут иметь меньший размер, могут быть более устойчивыми, более мощными и/или их получение может быть более легким или менее дорогостоящим.
Настоящее изобретение также охватывает новые методы биоанализа для определения экспрессии в человеческих клетках мРНК и протеинов, полученных из генов родственных сегментов ДНК изобретения. Согласно одному из таких воплощений ДНК настоящего изобретения могут использоваться в качестве зондов на определение уровней содержания стационарных состояний или кинетики индукции родственных мРНК. Доступность КСF-родственных cДНК клонов позволяет определять те случаи, когда аномальная экспрессия такого фактора роста имеет место в клинических состояниях, характеризующихся избыточным ростом эпителиальных клеток, включающих дисплазию и неоплазию (например, псориаз, злокачественные или доброкачественные опухоли).
Настоящее изобретение также предусматривает новые антитела для пептида закодированного ДНК сегментов настоящего изобретения. Согласно такому воплощению изобретения такие антитела могут быть моноклонального или поликлонального происхождения и их вырабатывают с помощью КСF-родственных полипептидов из природных, рекомбинантных или синтетических химических источников.
Антитела настоящего изобретения специфически связываются с KCF или КСF-подобным протеином, который включает последовательность такого пептида, предпочтительно в том случае, когда такой протеин находится в его природной (биологически активной) конформации. Такие антитела могут использоваться для детекции или очистки KCF либо они могут применяться для детекции или очистки KCF или KCF-подобных протеиновых факторов. Согласно наиболее предпочтительному воплощению этого аспекта изобретения антитела нейтрализуют промотирующую рост активность КСF, что позволяет осуществлять механистические исследования и, в конечном счете, проводить терапию клинических состояний, включающих избыточные уровни содержания КCF.
Краткое описание чертежей
На рис.I-1 представлены результаты гепарин-Сефарозной сродственной хроматографии кондиционированной среды из м426 человеческих эмбрионных фибробластов, показывающие, что более 90% митогенной активности мышинных кератиноцитов (BAIB/MK) элюируется 0,6М NаСl.
На рис.I-2 проиллюстрированы результаты дополнительной очистки митогена из человеческих фибробластов с использованием HPIC и адсорбционной матрицы. На фотографии (А) показан профиль обратимо-фазной (C4) HPIC BAIB/MK миогенной активности. На фотографии (В) представлены данные электрофорезного (NаДоdSО4/PAGE) анализа фракций, выбранных со стадии хроматографии С4, показанной на фотографии А, демонстрирующие тот факт, что пиковые HPIC фракции содержат единственную полосу на геле, окрашенном серебром. На фотографии (С) представлен график синтеза ДНК в клетках BAIB/MK, под действием фракций проанализированных на фотографии В, причем полученные результаты показывают, что относительная митогенная активность хорошо корредирует с интенсивностью протеиновой полосы в профиле активности.
На рис.I-3 показана альтернативная стадия с помощью очистки RP-HPIC, с использованием ситовой хроматографии с операциями на колонке (ТSК C3000SW GIaSPac) в водном растворе со значением рН, близким к значению физиологического раствора, в результате чего основной пик митогенной активности обнаруживается в BAIB/MK биологическом анализе.
На рис.I-4 приведено сравнение синтезов ДНК в BAIB/MK при воздействии ТSК-очищенного митогена и других факторов роста.
На рис.I-5 представлены данные сравнения роста клеток BAIB/MK в химически установленной среде при воздействии различных комбинаций факторов роста.
В таблице 1-1 суммированы результаты различных стадий очистки, демонстрирующие, что ситовая хроматография обеспечивает значительно лучшую регенерацию активности, чем использование адсорбционной RР-НPIС.
В таблице 1-2 суммированы данные по специфичности действия различных факторов роста в отношении клетки-мишени, демонстрирующие, что новый выделенный фактор обладает сильным митогенным действием на кератиноциты (BAIB/MK) и в резком отличие от этого не обнаруживает детектируемого действия на фибробласты или эндотелиальные клетки подкожной вены человека.
На рис.II-1 представлена нуклеотидная последовательность и установленная аминокислотная последовательность KCF сДНК, а также идентификация РНК транскрибированных из KCF гена. На фотографии (А) схематично представлены клоны сДНК человеческого KCF. На фотографии (В) изображен KCF СДНК нуклеотид и предсказанные аминокислотные последовательности. (C) - идентификация матриц РНК KCF генов анализом на окрашивание, по Нортерну.
На рис.II-2 представлены данные топологического сравнения семейства FCF родственных молекул, включая KCF, причем особое внимание уделено тем протеиновым областям, которые разделяют высокую гомологию, предполагаемым сигнальным пептидным последовательностям и двум консервированным цистеиновым остаткам.
На рис.II-3 представлены данные анализа (окрашивание по Нортерну) экспрессии KCF-родственной мРНК в отобранных нормальных человеческих клеточных линиях и тканях, которые позволяют установить, что одна матрица размером 2,4 кb присутствует в РНК из человеческих эмбрионных легочных фибробластов и из фибробластов кожи взрослых особей, тогда как матрица не была обнаружена в (В5/589) эпителиальной или (НА83) глиальных клеточных линиях, или в первичных культурах эндотелиальных клеток подкожной вены человека.
В таблице II-1 суммированы данные сравнения влияния гепарина на митогенную активность KCF с соответствующим влиянием на другие факторы роста, причем показано, что введение тимидина в ДНК с помощью клеток BAIB/MK при воздействии КCF ингиибируется гепарином в отличие от активностей как aFCF, так и bFCF, которые повышаются при такой обработке.
Описание конкретных воплощений.
Настоящее изобретение частично относится к очищенным KCF- или KCF-подобным протеинам и способам получения таких протеинов. Главное воплощение такого аспекта настоящего изобретения относится к гомогенному KCF, характеризующемуся кажущимся молекулярным весом порядка 28 кДа на основании миграции в NаДоdSО4/РАСЕ, движением одним пиком при анализе обратимо-фазной хроматографией высокого разрешения и удельной активностью по крайней мере 3,4×104 единиц на мг, предпочтительно, по крайней мере 3,2×105, единиц на мг, причем одна единица активности определяется как количество, вызывающее половину максимально возможной стимуляции синтеза ДНК в некоторых эпителиальных (кератиноцит) клетках в стандартных условиях анализа указанных ниже.
Для идентификации новых факторов роста специфичных к эпителиальным клеткам, клональную кератиноцитную клеточную линию мышей разновидности ВАIВ/с, обозначенную как ВАIВ/MK (I-6), использовали в качестве индикаторной клетки для детекции таких факторов. Такие клетки зависимы от их роста на экзогенном источнике митогена эпителиальной клетки даже в среде, содержащей сыворотку (I-6). Разработка химически определенной среды для таких клеток делает возможным демонстрацию того факта, что для пролиферации BAIB/MK требуется два главных митогенных пути. Один из них предполагает участие инсулиноподобного фактора роста I (или инсулина в высокой концентрации), а другой - эпидермального фактора роста (ЕСF), трансформирующего фактора роста а (ТСFа), фактора роста кислотного фибробласта (АFСF) или фактора роста основного фибробласта (bFВF) (I-7).
С использованием BAIB/MK в качестве прототипной эпителиальной клеточной линии и NIH/3ТЗ в качестве ее фибробластовой противочасти, кондиционированную среду из различных человеческих клеточных линий анализировали на наличие новых специфичных митогенов эпителиальных клеток. Такие методы биологического анализа настоящего изобретения позволяют осуществлять очистку до гомогенности одного из таких новых факторов роста, выделяемого человеческой эмбрионной легочной фибробластовой линией и обозначенного как фактор роста кератин опита (KCF).
Вкратце, биоанализ на KCF-подобную активность в стандартных условиях включает следующие стадии:
(I) Мышинные кератиноциты (BAIB/MK клетки) выращивают в культуре до слияния и затем выдерживают в течение 24-72 часов в среде не содержащей сыворотки;
(II) После добавления испытуемых образцов стимуляцию синтеза ДНК определяют путем введения 3Н-тимидина в кислотно-осаждаемую ДНК.
С целью определения специфичности действия митогенного фактора роста в отношении клетки-мишени, стимуляцию синтеза ДНК, выраженную отношением стимулированного синтеза к фоновому внедрению тимидина в отсутствие добавленного испытуемого образца, можно сравнить с аналогичной стимуляцией наблюдаемой в клетках отличных от кератиноцитов в аналогичных условиях анализа. В рамках такого сравнения было установлено, что митогенная активность KCF имеет ярко выраженную специфичность в отношении кератиноцитов в отличие от специфичности в отношении фибробластов (по крайней мере, 500-кратное увеличение стимуляции) и наблюдается меньшая, но значительно (по крайней мере, 50-кратная) более высокая активность по отношению к кератинопитам, чем по отношению к другим типам эпителиальных клеток (см. таблицу I-2 и раздел Материалы и методы исследования в Экспериментальном разделе I для более детального ознакомления со стандартными условиями биоанализа).
В результате использования метода продуцирования KCF, включающего культурирование клеток и выделение митогенной активности, причем такой метод включает ультрафильтрацию, гепарин-Сефарозную сродственную хроматографию (НSАС) и адсорбционную обратимофазную жидкостную хроматографию высокого разрешения (RР-НРIC), или согласно другому варианту HPIC на молекулярных ситах (TSK-HPIC), согласно настоящему изобретению было выделено количество препарата, достаточное для достаточного охарактеризования физических и биологических свойств такой молекулы.
Таким образом, способ получения KCF из таких продуцирующих клеток, как М426 человеческие эмбрионные фибробласты (I-8), включают, например, следующие стадии:
(I) Приготовление кондиционированной среды (например, 10 л) с использованием монослойных культур, полученных циклической обработкой в системе от среды, не содержащей сыворотки, до среды, содержащей ее, и хранение не содержащего сыворотки урожая при -70°С до последующего использования.
(II) Концентрирование ультрафильрацией с использованием мембран с молекулярным весом 10 кДа в несколько последовательных стадий при разбавлении в буффере (с целью облегчения удаления низкомолекулярных материалов), с последующим необязательным хранением при -70°С.
(III) Хроматографию по сродству на гепарине, связанном с полимерной подложкой (например, Сефарозой) при элюировании градиентом, повышающей концентрации NaCl.
(IV) Концентрирование до 10-20 кратного уменьшения объема с помощью мелкомасштабных ультрафильтрационных устройств с запором из материала с молекулярным весом 10 кДа (например, микроконцентратор Центрикон-10 от Амикон) и хранение при -70°С.
Следующая стадия процесса очистки включает приведенные ниже стадию (V) или (VI):
(V) Обратимо-фазная HPIC активных фракции (0,6М NаСl) с предыдущей стадии HSAC в системе органических растворителей, или
(VI) Молекулярно-ситовая HPIC (например, на ТSK-С3000 Глас-Пак колонке фирмы ЛКБ) в водном буфере при значении рН, близком к физиологическому (например, Трис-HCI, рН 6.8/0,5М NaCl) с последующим хранением при -70°С.
Препарат, полученный на стадии TSK (VI) имеет практически ту же чистоту, что и препарат, полученный с использованием RР-HPIC, согласно анализу серебрянного окрашивания NаДоdSO4/РAGЕ (данные не приведены). Однако использование ТSK обеспечивает значительно лучшую регенерацию активности (таблица I). Кроме этого, очищенный методом TSK материал обладал более высокой удельной активностью, чем материал, полученный методом RР-HPIC, KCF, полученный по описанной выше методике с участием ТSК, стимулирует синтез ДНК в эпителиальных клетках в субнаномольных концентрациях, но не индуцирует внедрение тимидина в ДНК фибробластов или эндотелиальных клеток при сравнимых или более высоких концентрациях (вплоть до 5 нМ). Такая активность чувствительна к кислотам, теплу и растворителям, используемым на стадии RP-HPIC (см. данные по чувствительности в разделе у Экспериментальной части, а также дополнительные подробности способа получения).
С использованием стандартной методологии, хорошо известной из литературы, была установлена аминокислотная последовательность для положений 2-13 из амино-окончания очищенного KCF: Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Thr-Asn-Val (см. Экспериментальный раздел I).
Настоящее изобретение также включает ДНК сегменты, кодирующие KCF и KCF-подобные полипептиды. Примерами ДНК настоящего изобретения могут служить следующие материалы: клоны 32-49 человеческой сДНК, полученные из полиаденилированных РНК, экстрагированных из клеточной линии М426 человеческого эмбрионного легочного фибробласта; рекомбинанты и метанты таких клонов; а также родственные ДНК сегменты, которые могут детектироваться гибридизацией в такие сегменты ДНК.
Как указывается в Экспериментальном разделе II, с целью поиска клонов сДНК, соответствующих известной части аминокислотной последовательности KCF, создавали две партии олегонуклеотидных зондов, базируясь на всех возможных нуклеотидных последовательностях, кодирующих девятую аминокислотную последовательность, Аsn-Аsn-Меt-Тhr-Рro-Glu-Gln-Met-Ala. Библиотеку сДНК конструировали в клонирующем векторе сДНК, λрСЕУ9, с использованием полиаденилированной РНК экстрагированной из клеточной линии М426 человеческого эмбирионного легочного фибробласта, которая представляла собой исходный источник фактора роста. В результате скрининга библиотеки (9×105 бляшек) с помощью 32Р-меченных олигонуклеотидов идентифицировали 88 бляшек, которые гибридизировали с обоими зондами.
Из 10 очищенных от бляшек клонов, которые подвергали анализу, один, обозначенный как клон 49, имел вставку сДНК в 3,5 кb, тогда как остальные имели вставки в интервале 1,8-2,1 кb. Анализ более мелких клонов позволил обнаружить несколько общих ограничительных сайтов, а установление аминокислотной последовательности одного из представителей мелких клонов, обозначенного, как клон 32, совместно с клоном 49, показано, что они представляют собой перекрывающиеся сДНК (рис.II-IA). Рассмотрение двух таких сДНК позволило установить наличие непрерывной последовательности в 3,8 кb, содержащей полную KCF кодирующую последовательность. Нуклеотидная последовательность чувствительного тяжа ДНК и закодированная предсказанная последовательность первичного протеина представлены для композитной KCF сДНК последовательности полной длины на рис.II-IB.
Такие ДНК, сДНК клоны 32 и 49, а также рекомбинантные формы таких сегментов, включающие полную KCF кодирующую последовательность, являются наиболее предпочтительными ДИК настоящего изобретения.
Из последовательности сДНК ясно следует, что продукты трансляции первичного KCF и hst содержат гидрофобные N-терминальные участки, которые, по-видимому, являются сигнальными последовательностями на основании схожести таких последовательностей в большом числе других протеинов. В соответствии с этим, такой Н-терминальный участок не присутствует в молекуле очищенного зрелого КСF, которая секретируется человеческими эмбрионными фибробластами.
Кроме того, KCF разделяет со всеми другими членами FСF семейства два основных участка гомологии, аминокислоты 65-156 и 162-189 в предсказанной последовательности KCF, которые разделены негомологическими сериями аминокислот различной длины у различных членов семейства. Последовательность очищенной формы KCF содержит пять цистеиновых остатков, два из которых сохраняются во всем семействе FСF-родственных протеинов. В последовательности KCF встречаются пять пар основных остатков. Та же картина наблюдается и у других членов семейства FCF.
Специалисту в данной области должно быть понятно, что в результате использования ДНК и РНК настоящего изобретения в методах гибридизации (таких как анализ геномных человеческих сДНК пятнением по Сaутерну), особенно наиболее предпочтительных ДНК перечисленных выше, без нежелательного экспериментирования можно осуществить скрининг геномной или сДНК библиотек с целью отыскивания других KCF подобных ДНК, охватываемых сферой настоящего изобретения. Кроме того, в результате такого использования ДНК настоящего изобретения, генетические маркеры, ассоциированные с КСF геном, такие как рестрикционные фрагменты длины полиморфизмов (PFIP), могут быть идентифицированы и связаны с унаследованными клиническими состояниями, включающими такие или близкие к ним гены.
Настоящее изобретение также включает модифицированные формы KCF ДНК. В соответствии с главным воплощением такого аспекта изобретения такие модифицированные ДНК кодируют KCF-подобные протеины, включающие сегменты аминокислотных последовательностей KCF, по крайней мере, один другой член семейства пептидов FCF, Так, например, поскольку не имеется существенной N-терминальной гомологии между секретированной формой KCF и аналогичными положениями в других FСF-росдственных протеинах, полипептиды с новыми структурными и функциональными свойствами могут быть созданы прививкой ДНК сегментов кодирующих N-терминальные сегменты другого полипептида в семействе FCF на сегмент ДНК КCF вместо его обычной NН2-терминальной последовательности.
Полипептидные химеры, продуцированные такими модифицированными ДНК, используются для определения достаточности NH2-терминального участка КСF в объяснении его уникальной специфичности в отношении клетки-мишени. Исследование таких химер должно также обеспечить информацию относительно природы участков, определяющей различное влияние гепарина на их биологическую активность.
Разумеется, что применимость такого подхода была уже подтверждена успешной генной инженерией и экспрессированием химерной молекулы, в которой около 40 аминокислот от NH2-окончания секретированной формы KCF (начиная от цисаминоокончания зрелого KCF, под номером 32 на рис.II-1 и кончая arg, остатком 78 КСF) связано со 140 аминокислотами СО2-окончания оболочки аFСF (начиная с остатка 39, arg и продолжаясь до С-окончания аFСF кодирующей последовательности. Такой химерный продукт превосходит кератиноциты, например KCF, по отношению к клетке-мишени, но уступает в восприимчивости к гепарину, что делает его более похожим на аFCF, а не на KCF. Такой новый КСF-подобный фактор роста может иметь преимущества в клинической практике, где желательно применение питедиально-специфичного фактора роста в присутствии гепарина, общепринятого антикоагулянта. Дополнительные детали конструкции такой химерной молекулы и свойства полипептида описаны в Экспериментальном разделе II.
Другие ДНК настоящего изобретения включают следующие молекулы рекомбинантной ДНК, содержащие KCF сДНК и любую из следующих векторных ДНК; клонирующий вектор бактериофага λ (λрСЕУ9), вектор устанавливающей аминокислотную последовательность плазмиды ДНК (вариант рУС), вектор бактериальной экспрессии (рКК233-2), вектор экспрессии млекопитающих (рММТ/neo). Такие рекомбинантные ДНК представлены примерами конструкций в Экспериментальных разделах.
Наиболее предпочтительные рекомбинантные молекулы включают: молекулы, содержащие последовательность, кодирующую секретированную форму KCF, и вектор бактериальной экспрессии (например, рКК233-2) или сДНК, кодирующую весь продукт первичной трансляций (включая NH2-терминальный сигнальный пептид), а также вектор экспрессии млекопитающего (например, рМMMT) способный экспрессировать вставленную ДНК в клетках млекопитающих (например, NIH/3Т3).
Конструкция рекомбинантных ДНК, содержащая КСF-ДНК и вектор бактериальной экспрессии, описана в экспериментальном разделе II. КСF сДНК была экспрессирована с продуцированием полипептида в E. coli путем помещения его кодирующей последовательности под контролем гибридного trk промотора в плазмидный экспрессионный вектор рКК233-2/(II-31).
Конструирование рекомбинантной ДНК, содержащей КСF-ДНК и вектор млекопитающего, способный к экспрессии вставленной ДНК в культивированных человеческих или животных клетках, можно осуществлять по стандартной технологии генной экспрессии с использованием хорошо известных методов, применимых для экспрессирования такого относительно простого полипептида. Одно конкретное воплощение рекомбинантной ДНК такого аспекта настоящего изобретения, включающее вектор млекопитающего рММТ, описано ниже в разделе, касающемся рекомбинантных клеток настоящего изобретения.
ДНК и РНК с чувствительными цепями настоящего изобретения могут использоваться совместно с методами продуцирования протеинов для получения большого количества практически чистых KCF или КСF-подобных протеинов. Полученный таким образом практически чистый протеин КСF может применяться, с использованием хорошо известных методик, в диагностических анализах на определение наличия рецепторов для такого протеина в различных образцах ткани и жидкостной среды тела.
В соответствии со сказанным, настоящее изобретение также охватывает клетку, предпочтительно клетку бактерии или млекопитающего, трансформированную с помощью ДНК изобретения, в которой трансформирующая ДНК способна к экспрессированию. Согласно предпочтительному воплощению такого аспекта изобретения клетка трансформированная ДНК изобретения производит протеин КCF в полностью митогенной форме. Наиболее предпочтительно, когда такие протеины находятся в секретированной форме (например, у них отсутствует сигнальная последовательность). Такие протеиновые факторы могут использоваться для функциональных исследований и могут быть очищены для дополнительного биохимического и функционального анализа, например качественный и количественный анализ на связывание рецептора.
Рекомбинантные E. coli клетки конструировали в бактериальном экспрессионном векторе, рКК233-2, для получения KCF, как это подробно описано в Экспериментальном разделе II. Некоторые рекомбинантные бактериальные клоны испытывали на продуцирование протеина обычными мелкомасштабными методами. Все испытанные рекомбинанты синтезировали протеины, о чем свидетельствовали антитела, возникающие у аминотерминального KCF пептида (см. ниже). Один рекомбинант выращивали в одном литре культуры, которая продуцировала рекомбинантный KCF, который эффективно стимулировали внедрение тимидина в ДНК клепки к ВАIВ/MK кератиноцита, но проявляя лишь незначительную активность в отношении NIH/3Т3 фибробластов. Половина максимальной стимуляции клеток BAIB/MK в стандартном биоанализе на керетиноцит достигалась при концентрации 2-5 нг/мл, по сравнению с концентрацией 10-15 кг/мл для КCF очищенного от клеток М426.
Один литр бактериальных клеток давал примерно 50 мкг моноочищенного рекомбинантного KCF. Специалисту в области генной экспрессии должно быть ясно, что такой первоначальный выход может быть значительно улучшен без нежелательного дополнительного экспериментирования путем применения различных известных приемов рекомбинантной ДНК технологии.
Рекомбинантные клетки млекопитающего (NIН/3Т3 также были сконструированы с использованием полной KCF сДНК последовательности (включая NН2-терминальный сигнальный пептид) и вектора рММТ/nео, который несет мышинный металлотиониновый (ММТ) промотор и селективный маркерный ген на устойчивость к неомицину. Такие клетки оценивали на продуцирование KCF. Особенно на секрецию зрелой формы (отсутствие сигнального пептида) продуцируемой человеческими фибробластами с использованием биоанализов настоящего изобретения. Такая комбинация вектора и клетки-хозяина были с успехом использованы для экспрессирования некоторых других аналогичных рекомбинантных полипептидов, включая цепи факторов роста А и В, являющихся производными тромбоцитов (РДСЕ, II-32). Таким образом, специалисту в данной области должно быть ясно, что высокие выходы рекомбинантного KCF могут быть достигнуты таким образом с использованием указанных выше рекомбинантных ДНК и трансформированных клеток настоящего изобретения.
Крупномасштабное производство может использоваться для клинических испытаний в условиях, требующих специфической стимуляции роста эпителиальных клеток. Материалы и методы получения фармацевтических композиций для локального применения полипептидов (на коже или роговице глаза) или их системного применения хорошо известны в данной области и они могут быть легко приспособлены для применения КСF и KCF-подобных пептидов без дополнительного экспериментирования.
Настоящее изобретение также охватывает новые антитела против пептида закодированного сегментом ДНК изобретения. Такое воплощение изобретения представлено примерами нескольких видов антител, которые распознают KCF. Они были получены с использованием стандартных методов хорошо известных в данной области экспериментальной иммунологии, как указывается в экспериментальном разделе II. Такие антитела включают: моноклональные антитела, вырабатываемые мышами против неповрежденного очищенного протеина из человеческих фибробластов; поликлональные антитела, вырабатываемые кроликами против синтетических пептидов с последовательностями на основе аминокислотных последовательностей, предсказанных из последовательности KCF сДНК (примеры которых может служить пептид с последовательностью остатков KCF 32-45, а именно, NДМТРЕОМАТNVR (с использованием стандартного однобуквенного кода для аминокислотных последовательностей, см. фиг.II-1)); поликлональные антитела, вырабатываемые кроликами против как природно-секретированного KCF из человеческих фибробластов, так и рекомбинантного КCF, продуцированного в E. coli; (см. выше). Все испытанные антитела распознают рекомбинант, а также встречающийся в природе КCF, как с помощью твердофазного (ЕIISА) анализа, так и анализа пятнением по Вестерну. Некоторые антитела, которые представляют собой предпочтительные антитела настоящего изобретения, предназначены для нейтрализации митогенной активности KCF в BAIB/MK биоанализе.
Фрагменты антител настоящего изобретения, такие как Fab или F/аb/’, которые сохраняют антигенсвязывающую активность и могут быть получены способами хорошо известными в данной области также охватываются сферой настоящего изобретения. Кроме этого, настоящее изобретение охватывает фармацевтические композиции антител изобретения или их активные фрагменты, которые могут быть получены с использованием материалов и методов, предназначенных для получения фармацевтических композиций для применения полипептидов, которые хорошо известны в данной области и могут быть легко адаптированы к применению КСF и КCF-подобных пептидов без дополнительного экспериментирования.
Такие антитела и их активные фрагменты могут использоваться, например, для детекции KCF в биоанализах или для очистки протеиновых факторов. Они могут также применяться в методах, хорошо известных в данной области для выделения рецептора на KCF, который, как указывается в Экспериментальном разделе II, по-видимому, отличается от рецепторов всех других известных факторов роста.
Такие предпочтительные антитела и фрагменты, а также их фармацевтические комбинации, которые нейтрализуют митогенную активность КCF в отношении эпителиальных клеток, о чем свидетельствует BAIB/MK анализ, могут использоваться для лечения клинических состояний, характеризующихся избыточным ростом эпителиальных клеток, включающих дисплазию и неоплазию (например, псориаз, или злокачественные либо доброкачественные опухоли).
Настоящее изобретение также охватывает новые методы биоанализа для детекции генов родственных ДНK настоящего изобретения. В некоторых примерах воплощения изобретения, ДНК настоящего изобретения использовали в качестве зондов для определения промежуточных уровней содержания родственных мРНК. Методы такого биоанализа настоящего изобретения с использованием KCF ДНК, а также стандартные методы окрашивания по Нортону подробно описаны в Экспериментальном разделе II.
Специалист в данной области без дополнительных экспериментов сумеет понять, что такие методы могут быть легко применены для анализа генной экспрессии для KCF подобного протеина как в изолированных клетках, так и в различных тканях. Такие биоанализы могут, например, использоваться для идентификации различных классов опухолевых клеток или генетических дефектов в процессах эпителиального роста.
Предполагается, что средний специалист в данной области, используя предыдущее описание и следуя методам, описанным ниже в Экспериментальных разделах, сможет применить настоящее изобретение в его наиболее полном контексте. Материал, изложенный в Экспериментальных разделах, если особо не оговорено, приведен в целях иллюстрации и никоим образом не ограничивает прилагаемую формулу изобретения.
Экспериментальный раздел I
Идентификация и охарактеризование нового фактора роста, специфичного в отношении эпителиальных клеток.
В этом разделе описывается экспериментальная работа, приводящая к идентификации фактора роста, специфичного в отношении эпителиальных клеток в кондиционированной среде клеточной линии человеческого эмбрионного легочного фибробласта. Фактор, условно названный фактором роста кератиноцита (KCF) из-за его доминирующей активности в отношении клеток такого типа, очищали до гомогенности комбинацией методов ультрафильтрации, гепарин-Сефарозной сродственной хроматографии и гидрофобной хроматограции на С4 обратимо-фазной HPIC колонке согласно методам настоящего изобретения. Было обнаружено, что KCF лабилен в отношении действия кислот и тепла и состоит из одной полипептидной цепи с кажущимся молекулярным весом примерно 28000 дальтонов. Очищенный KCF представляет собой мощный митоген в отношении эпителиальных клеток, способный стимулировать синтез ДНK в находящихся в покое ВАIВ/МК эпидермальных кератиноцитах с более чем 500-кратным повышением активности при 0,1 нМ и максимумом при 1,0 нМ. Отсутствие митогенной активности как в отношении фибробластов, так и эндотелиальных клеток указывает на то, что KCF обладает специфичностью в отношении клетки-мишени, которая отличается от предварительной охарактеризованного фактора роста. Установление аминокислотной последовательности микрометодами позволило обнаружить аминотерминальную последовательность, не содержащую значительной гомологии с любым известным протеином. Выделение такого нового фактора роста человеческими эмбрионными фибробластами указывает, на то, что KСF играет определенную роль в мезенхимальной стимуляции пролиферации нормальной эпителиальной клетки.
Способ и материалы
Приготовление кондиционированной среды.
Ранний перенос М426 человеческих эмбрионных фибробластов (1-8) высевали в Т-образных склянках площадью 175 см2 и выращивали в течение 10-14 дней в Дульбекко модифицированной среде Игла (ДМЕМ, CIBCO) дополненной 10% телячей сывороткой (CIBCO). После завершения операции монослои в течение недели подвергали циклической обработке в диапазоне сред от содержащей до не содержащей сыворотки, причем последняя среда содержала только ДМЕМ. Клетки дважды промывали 5 мл фосфатного буфферного раствора перед добавлением 20 мл ДМЕМ. Через 72 часа культивированные жидкости собирали и заменяли на 35 мл среды, содержащей сыворотку. Кондиционированную среду хранили при -70°С до последующего использования.
Ультрафильтрация.
Примерно 10 л кондиционированной среды оттаивали, предварительно фильтроали через 0,5 микронный фильтр (Миллипор НАWР 142 50) и концентрировали до объема 200 мл с использованием кассетной системы (Миллипор ХХ42 00K 60) и кассетного запора, имеющего молекулярный вес 10 КДа Миллипор РТСС 000 05). После концентрирования образец подвергали последовательному разбавлению одним литром 20 мМ Триc-HCl, рН 7.5/0,3М NaCl, причем каждую стадию такого разбавления сопровождали стадией ультрафильтрации с использованием системы Пелликон. Активность, регенерированную в ретентате, сразу применяли на гепарин-Сефарозной смоле или хранили при -70°С.
Гепарин-Сефарозное сродство
Хроматография (НSAC).
Ретентат со стадии ультрафильтрации загружали на гепарин-Сефарозную смолу (Фармация), которую уравновешивали в 20 мМ Трис-HCI, рН 7.5/0,3М NаСl. Смолу интенсивно промывали до возвращения оптической плотности к фоновому значению и затем подвергали воздействию линейного градиента с увеличивающимися концентрациями NаСl. После удаления аликвот из фракций для биоанализа с внедрением тимидина, отобранные фракции концентрировали до уменьшения объема в 10-20 раз с помощью микроконцентратора Центрикон-10 (Амикон) и хранили при -70°С.
Обратимо-фазная HPIC (RP-НРIС).
Активные фракции (0,6м NаСl слив) со стадии HSАС оттаивали, сливали и дополнительно концентрировали с помощью Центрикона-10 до конечного объема ≤200 мкл. Образец загружали в колонку Видак С4 HPIC (Группа разделения, Гесперия, СА), которую уравновешивали в 0,1% трифторуксусной кислоте (ТFА, Флюка) 20% ацетонитрила (Байкер, сорт HPIC) и элюировали линейным градиентом увеличивающихся концентрацией ацетонитрила. Аликвоты для биоанализа немедленно разбавляли 10-кратным избытком 50 мкг/мл BSIA (Фракция У, Сигма) 20 мМ TPc-HCI pH 7.5. Оставшуюся часть образца сушили в системе Спид-Вак (Савант) в препарате для структурного анализа.
Молекулярно-ситовая HPIC.
Примерно 50 мкл дважды концентрировали гепарин-Сефарозных фракций загружали в ТSK-С30000 Глас-Пак колонку (ЛКБ), которую уравновешивали в 20 мМ Трис-HCI, pH 6,8/0,5M NaCl. Образец элюировали в указанный буфер с линейной скоростью 0,4 мл/мин. После удаления аликвот для биоанализа, фракции хранили при -70°С.
NаДоdSO4 - Полиакриламидный гель электрофорез (NаДоdSO4/РАСЕ)
Полиакриламидные гели получали в присутствии NаДоdSО4 согласно методике Лазммли (I-9). Образцы в течение 3 минут кипятили в присутствии 2,5% 2-меркаптоэтанола (об. об.). Гели фиксировали и окрашивали серебром (I-10) с использованием реагентов и методики согласно БиоРад. Молекулярновесовые маркеры получали от фирмы Фармации.
Стимуляция синтеза ДНК.
96-пластин для микротитрования (Фалкон №3596) предварительно покрывали человеческим фибронектином (Коллаборэйтив Рисерч) с плотностью 1 мкг/см2 перед засеванием клетками BAIB/MK. После этого клетки выдерживали в течение 24-72 часов в среде, не содержащей сыворотки и содержащей 5 мкг/мл трансферина (Коллаборэйтив Рисерч) и 30 нМ Nа2SeО3 (Бэйкер).
Внедрение 3Н-тимидина (конечная концентрация 5 мкС (мл, NЕN) в ДНК измеряли в течение 6-чаоового периода, начинающегося через 16 ч после добавления образцов. Анализ прекращали промыванием клеток, охлажденным на льду фосфатно-буферным раствором и двойным промыванием 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты. Осадок повторно растворяли в 0,25М NаОН, переносили в жидкую сцинтилляционную жидкость (Биофлуор, NЕN) и проводили подсчет.
За стимуляцией синтеза ДНК следи в соответствии с методикой, описанной выше для клеток ВАIВ/MK с использованием большого числа других клеточных линий. NIH/3T3 фибробласты (I-11) получали от Национального Института здоровья, тогда как бронхиальные эпителиальные клетки резусных обезьян CC1208 (I-12) получали из Американской коллекции типовых культур. Клеточную линию эпителия грудной железы человека В5/589, приготовленную согласно описанному в ссылке (I-13), получали от Марта Стампфер (Калифорнийский Университет, Беркли). Клетки грудной железы выращивали в RРМI 1640 дополненной 10% сыворотки телячьего плода и 4 нг/мл ЕСF. После выдерживания в бессывороточных условиях основная среда представляла собой ДМЕМ. Первичные культуры эндотелиальных клеток подкожной вены человека готовили и выдерживали в соответствии с описанным в ссылке (I-14). Фактор эпидермального роста и инсулин получали из Коллаборэйтив Рисерч. Кислотный FCF и bFСF получали из Калифорния Биотехнолоджи, Инк. Рекомбинантный ТСFа получали из Генетикс Инк. Среду и сыворотку получали либо от ГИБКО, Биофлюидс, Инк. или среда представляла собой среду NIН.
Анализ на пролиферацию.
Чаши для культивирования диаметром 35 мм предварительно последовательно покрывали поли-Д-лизином (20 мкг/см3 (Сигма) и человеческим фибропектином и затем засеевали 2,5×104 клеток BAIB/MK. Основная среда представляла собой смесь в соотношении 1:1 минимальной существенной среды Игла с низким содержанием Ca2+ и среды FI2 Хамса, дополненную 5 мкг/мл трансферина, 30 нМ Nа2SеО3 и 0,2 мМ этаноламина (Сигма). Среду заменяли каждые 2-3 дня. Через 10 дней клетки закрепляли в формалине (Фишер Сайнтифик Ко.) и Окрашивали с помощью Гиемза (Фишер Сайнтифик Ко.).
Микроопределение последовательности протеина.
Примерно 40 мкг (150 пмоль) протеина из активных фракций с колонки С4 повторно растворяли в 50% ТFА и загружали в устройство для газофазного определения аминокислотной последовательности протеина фирмы Эпплайл Биосистемс. Проводили двадцать циклов деградации по Эдману и идентификацию аминокислотных производных осуществляли с помощью автоматизированной HPIC /Модель 120A, Эпплайл Биосистемс/.
Результаты.
Детекция и выделение фактора роста.
Предварительный скрининг кондиционированной среды из различных клеточных линий показал, что среда из некоторых фибробластовых линий содержит митогенную активность, детектируемую как на клетках ВАIВ/MK, так и NIН/3Т3. В то время как кипячение разрушает активность у ВАIВ/MK, митогенная активность клеток NIH/3Т3 остается незатронутой. Основываясь на известных данных о том, что ЕСF (I-15) и ТСFа (I-16) являются термически стабильными материалами, разумно предположить, что ВАIВ/MK миогенная активность связана с наличием агента отличного от известных факторов роста эпителиальных клеток.
Линию человеческого эмбрионного легочного фибробласта М426 выбирали в качестве наиболее продуктивного источника такой активности для очистки факторов роста. Ультрафильтрация с помощью системы Пелликон обеспечивает удобный путь уменьшения объема образца до значения, подходящего для последующей хроматографии. В ходе разработки схемы очистки испытывали различные комбинации ситовой, ионообменной хроматографии и хроматографии с изоэлектрической фокусировкой. Однако в результате получали недопустимо низкие выходы. С другой стороны - стороны гепарин-Сефарозная сродственная хроматография (НSAС), которую использовали для очистки других факторов роста (I-17 I-22), оказалась полезной в качестве ранней стадии очистки настоящего изобретения. Хотя оценки регенерированной удельной активности на этой стадии были неточными из-за возможного присутствия других факторов, кажущийся выход активности составил 50-70% с соответствующим обогащением примерно в 1000 раз.
Как показано на рис.I-1, более 90% ВAIВ/МК митогенной активности элюируется с колонки HSAC с помощью 0,6М NaCl. Такой пик активности не связан с какой-либо активностью на клетках NIН/3Т3 Сданные не показаны). Значительно меньший пик ВАIВ-MK митогенной активности проявляется в присутствии 0,8-1,2М NaCl.
В связи с воспроизводимостью образца НSАС, активные фракции могут быть идентифицированы на основе профиля градиента и оптической активности. 10-20 кратное концентрирование с помощью Центрикона-10 оказалось существенным для стабильности, которая могла сохраняться при -70°С в течение нескольких месяцев.
Окончательную очистку осуществляли методом RP-HPIC на колонке С4 Видак, представляющим собой препаративный метод анализа установления аминокислотной последовательности. Поскольку выход активности со стадии С4 обычной составляет лишь несколько процентов, такая потеря может быть приписана применяемым растворителям. В других экспериментах 1-часовое экспонирование системой 0,1% ТFА/50% ацетонитрил при комнатной температуре понижает митогенную активность препарата до 98%. Как показано на рис.I-2, был получен единственный пик ВАIВ/MK стимуляторной активности, что согласуется с ответливым пиком в профиле оптической плотности. Пиковые фракции дают единственную полосу в ходе NаДоdSO4/РАСЕ и серебрянного окрашивания геля (рис.I-2В), а относительная митогенная активность каждой испытанной фракции (рис.I-2C) хорошо коррелирует с интенсивностью полос в профиле активности.
Стадия очистки альтернативная описанной выше методике HPIC с использованием ситовой хроматографии в присутствии TSK С3000 ГласПак колонки в водном растворе со знамением рН, близким к физиологическому, давала в анализе BAIB/MK основной пик активности (рис.I-3). Такой препарат имел практически такую же чистоту, что и препарат, полученный со стадии RP-HPIC, согласно данным по серебрянному окрашиванию NаДоdSО4/РАСЕ (данные не показаны), но обеспечивал значительно лучшую регенерацию активности (Таблица I-1). TSK-очищенный материал использовали общепринятым способом для биологических исследований, поскольку он имел более высокую удельную активность.
Для обоих типов очищенных препаратов (т.е. очищенного методом HPIC или с помощью молекулярных сит), профиль митогенной активности был связан с отчетливой полосой на NаДоdSО4/РАСЕ, которая не различина для обоих препаратов.
Физические и биологические характеристики фактора роста.
Очищенный фактор имел молекулярный вес порядка 28 КДа на основе данных NаДоdSО4/РАСЕ в восстановительных (рис.I-2) и невосстановительных условиях (данные не приведены). Это значение хорошо согласуется с положением элюирования на двух колонках различного размера в тех растворителях, которые, как ожидалось, сохраняют природную конформацию (TSK-С3000-SW, фиг.I-3, и супероза-12, данные не приведены). Из этих данных следует, что митоген, по-видимому, состоит из одной полипептидной цепочки с молекулярным весом 25-30 кДа.
Термическая и кислотная лабильность митогенной активности были продемонстрированы с использованием ВАIВ/MK биоанализа на митогенезис. Хотя активность не изменялась за 10 мин инкубирования при 50°С. Она понижалась на 68% через 10 мин при 60°С и не детектировалась через 3 ч при 100°С. Воздействие 0,5 М уксусной кислоты в течение 60 мин при комнатной температуре приводило в результате к понижению активности до 14% от контрольного значения. В целях сравнения следует отметить, что митогенная активность известного фактора роста, ЕСF, не уменьшается при любой из таких обработок. Кривая доза-отклик для очищенного фактора роста, изображенная на рис.I-4 иллюстрирует тот факт, что всего лишь 0,1 нМ приводит к детектируемой стимуляции синтеза ДНК. Таким образом, интервал активности сравним с интервалом для других факторов роста проанализированных к настоящему времени. В интервале концентраций 0,1-1,0 нМ наблюдается линейная зависимость, причем максимальная 600-кратная стимуляция наблюдается при концентрации 1,0 нМ. Новый фактор индуцирует более высокий уровень максимального внедрения тимидина, чем ЕСF, аFСF или bFСF в ВАIВ/MK кератиноциты (рис.I-4).
Выраженная специфичность в отношении клетки-мишени такого фактора демонстрируется сравнением его активности на большем числе типов клеток с активностью других факторов роста, которые, как известно, обладают митогенной активностью в отношении эпителиальных клеток.
Как показано в таблице I-2, новый выделенный фактор оказывает сильное митогенное действие на ВАIВ/MK, но также индуцирует демонстрируемое внедрение тимидина в ДНК других испытанных эпителиальных клеток. В отличие от этого, такой фактор не обладает детектируемым митогенным эффектом на мышинных или человеческих (данные не приведены) фибробластах или эндотелиальных клетках подкожной вены человека.
В целях сравнения следует отметить, что ни один из других известных факторов роста преимущественно не стимулирует кератиноцита. ТСFа и ЕСF обладают мощной активность в отношении фибробластов, тогда как FCF являются митогенно-активными в отношении эндотелиальных клеток и фибробластов (I-2). Из-за специфичности в отношении эпителиальных клеток и особенно, чувствительности в отношении кератиноцитов, новый митоген был условно обозначен, как фактор роста кератиноцита (KCF).
С целью установления того факта, что KCF способен не только стимулировать синтез ДНК, но и поддерживать длительный рост клеток, оценивали способность клеток BAIВ/MK расти в полностью определенной, не содержащей сыворотки среде, дополненной фактором роста. Как показано на рис.I-5, KCF служит отличным заменителем ЕСF, но не инсулина (или инсулино-подобного фактора роста I) в такой химически определенной среде. Таким образом, КСF, по-видимому, действует по главному сигнальному маршруту, конкурируя с ECF, аFСF и bFСF за пролиферацию клеток ВAIВ/MK.
Микроопределение аминокислотной последовательности обнаруживает уникальную N-терминальную аминокислотную последовательность КСF. С целью дополнительного охарактеризования фактора роста, примерно 150 пмоля С4 у очищенного материала подвергали анализу на аминокислотную последовательность. Одну последовательность детектировали при особом вникании на циклы 2-13: Х-Аsn-Asp-Met-Тhr-Рrо-Glu-Gln-Met-Ala-Thr-Аsn-УAI. Высокий финовый шум затрудняет отнесение для первой позиции, которая, поэтому, указана, как Х.
Компьютерный поиск с использованием программы FАSТР/I-24/ показал, что N-терминальная аминокислотная последовательность КСF не обладает значительной гомологией с любым из протеинов в банке данных Национального биомедицинского исследовательского фонда, что подтверждает новизну такого эпителиального фактора роста.
Обсуждение.
Исследования, описанные в настоящем Экспериментальном разделе, позволили идентифицировать человеческий фактор роста, который обладает уникальной специфичностью в отношении эпителиальных клеток. В результате использования ультрафильтрации, НSАС и RР-НРIС или TK ситовой хроматографии согласно настоящему изобретению, было выделено количество препарата, достаточное для детального охарактеризования физических и биологических свойств такой молекулы.
Единственная окрашенная серебром полоса, соответствующая молекулярному весу около 28.000 дальтонов детектируется в активных фракциях из RP-HPIC и интенсивность такой полосы пропорциональна уровню митогенной активности таких фракций. Полоса неразличима с полосой, полученной методом RP-HPIC наблюдается в активных фракциях, полученных ТSК хроматографией. Очищенный протеин стимулирует синтез ДНК в эпителиальных клетках при субнаномолярных концентрациях, но не способен индуцировать какое-либо внедрение тимидина в фибробласты или эндотелиальные клетки при сравнимых или более высоких концентрациях (вплоть до 5 нМ). Такая выраженная специфиность в отношении клетки-мишени совместно с единственной новой N-терминальной аминокислотной последовательностью определенной в очищенной молекуле, приводит к выводу о том, что KCF представляет собой новый факт роста.
В химически определенной среде очищенный фактор способен дополнять инсулиноподобный фактор роста I (потребности в инсулине клеток ВАIВ/MK и поэтому должен действовать по пути сигнальной трансдукции, конкурируя с ECF, TCFa и FСF. Кроме этого, новый фактор обладает большей мощностью, чем любой из известных митогенов эпителиальных клеток при стимуляции внедрения тимидина в клетки ВАIВ/MK. Предварительные данные свидетельствуют о том, что такой фактор также способен поддерживать пролиферацию вторичных культур человеческих кератиноцитов (данные не представлены).
В ходе очистки КСF манипуляции с ним и его хранение являются проблематичными операциями. Помимо присущей ему лабильности в отношении действия тепла и кислот, этот фактор неустойчив в отношении лиофилизации или диализа. После операции НSAС происходит полная потеря активности за 24 ч несмотря на использование протеинов-носителей, гепарина, ингибиторов протеазы, силиконизированных трубок или хранения при 4 или -20°С. Лишь концентрирование образца на этой стадии может сохранить его активность.
Кроме этого, с целью переноса высушенного, очищенного фактора необходимо использовать сильную кислоту или детергент, соответствующие адсорбционной тенденции или нерастворимости. Таким образом, для сохранения активности очищенный фактор выдерживают в растворе при высокой концентрации при -70°С, где он остается стабильным в течение нескольких месяцев.
Способность КCF связывать гепарин может представлять собой функламентальное свойство такого фактора, которое переносится на его функцию in vivo. Факторы роста с гепаринсвязующими свойствами включают aFCF (I-20 - I-22), bFСF (I-19, I-22), фактор, стимулирующий гранулоцит/макрофаговую колонию и интерлейкин 3 (I-25). Каждый из таких факторов производится стромальными клетками (I-25 - I-27). Такие факторы, по-видимому, отлагаются в межклеточной матрице, или на протеогликанах, покрывающих поверхность стромальной клетки (I-25, I-28). Было постулировано, что их хранение, выделение и контактирование со специфическими клетками-мишенями регулируется такими взаимодействиями (I-25, I-28). Хотя эффекторы пролиферации эпительной клетки мезенхимального происхождения также были описаны (I-29 - I-31) их идентичность не установлена. Гепаринсвязующие свойства, выделение стромальными клетками человеческого эмбрионного фибробласта и тропизм эпителиальных клеток наделяет KCF всеми свойствами, ожидаемыми для такого паракринового медиатора роста нормальных эпителиальных клеток.
Неполная аминокислотная последовательность, установленная для такого нового фактора роста, дает возможность молекулярного клонирования его кодирующей последовательности и определения его структурной взаимосвязи с известным семейством факторов роста, как это описано ниже в Экспериментальном разделе II.
Литературные ссылки по Экспертиментальному разделу I.
References for experimental section I
I-1. James, R. and Bradshaw, R.A. (1984) Ann.
Rev. Biochem. 53, 259-292.
I-2. Doolittle, R.F., Hunkapiller, M.W.,
Hood, L.E., Devare, S.G., Robbins, K.C.,
Aaronson, S.A. and Antoniades, H.M.
(1983) Science 221, 275-277.
I-3. Waterfield, M.D., Scrace, G.J., Whittle,
N., Strooband, P., Johnson, A.,
Wasteton, A., Westermark, В., Heldin,
C.-H., Huang, J.S. and Deuel, T.F.
(1983.) Nature 304, 35-39.
I-4. Hunter, Т. and Cooper, J.A. (1985) Ann.
Rev. Biochem. 54, 897-930.
I-5. Wright, N. and Allison, M. (1984) The
Biology of Epithelial Cell Populations (Oxford
University Press, New York) Vol. 1, pp.
3-5.
I-6. Weissman, B.E. and Aaronson, S.A. (1983)
Cell 32, 599-606.
I-7. Falco, J.P., Taylor, W.G., DiFiore,
P.P., Weissnan, B.E., and Aaronson, S.A.
(1988) Oncogene 2, 573-578.
I-8. Aaronson, S.A. and Todaro, G.J. (1968)
Virology 36, 254-261.
I-9. Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685.
I-10. Merril, C.R., Goldman, D., Sedman, S.A.
and Ebert, M.H. (1981) Science 211,
1437-1438.
I-11. Jainchill, J.L., Aaronson, S.A. and
Todaro, G.J. (1969) J. Virol. 4, 549-553.
I-12. Caputo, J.L., Hay, R.J. and Williams,
C.D. (979) In Vitro 15, 222-223.
I-13. Staaipfer, M.R. and Bartley, J.C. (1985)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2394-2398.
I-14. Sharefkin, J.B., Fairchild, K.D., Albus,
R.A., Cruess, D.F. and Rich, N.M. (1986)
J. Surgical Res. 41, 463-472.
I-15. Cohen, S. (1962) J. Biol. Chem. 237, 1555-1562.
I-16. DeLarco, J.E. and Todaro, G.J. (1978)
Proc. Nail. Acad. Sci. USA 75, 4001-4005.
I-17. Raines, E.W. and Ross, R. (1982) J.Biol.
Chem. 257, 5154-5160.
I-18. Shing, Y., Folkman, J., Sullivan, R.,
Butterfield, C., Murray, J. and
Klagsburn, M. (1984) Science 223, 1296-1299.
I-19. Gospodarowics, D., Cheng, J., Lui, G.-
M., Baird, A. and Bohlen, P. (1984)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6963-6967.
I-20. Maciag, Т., Hehlman, Т., Friesel, R. and
Schreiber, A.B. (1984) Science 225,
932-935.
I-21. Conn, G. and Hatcher, V.B. (1984)
Biochem. Biophys. Res. Comm. 124, 262-268.
I-22. Lobb, R.R. and Fett, J.W. (1984)
Biochemistry 23, 6295-6299.
I-23. Bradford, H. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254.
Экспериментальный раздел II
Последовательность сДНК нового специфического фактора роста эпителиальных клеток, представляющего новый член семейства FСF.
Исследование результатов, приведенные в предыдущем Экспериментальном разделе I, позволили идентифицировать и очистить новый гепаринсвязующий фактор роста, обозначенный как фактор роста кератиноцита (КCF), который проявляет особую активность в отношении кератиноцитов и, по-видимому, является специфичным в отношении эпителиальных клеток. В настоящем втором Экспериментальном разделе описывается выделение и охарактетеризование сДНК клонов, кодирующих КСF, с использованием синтетических олигонуклеотидов, основываясь на экспериментально установленной NH2-терминальной аминокислотной последовательности, в качестве гибридизационных зондов. В результате анализа аминокислотного состава нуклеотида идентифицирован открытый каркас считывания размером в 582 bр, который может кодировать полипептид из 194 аминокислот, на 41-33% идентичный гепаринсвязующим факторам роста кислотного и основного фибробласта (FCF), и родственные продукты hst и int-2 онкогенов. KCF матрицы генной РНК экспрессирует в нормальных фибробластах как эмбрионного, так и взрослого происхождения, но не в эпителиальных, эндотелиальных или глиальных клетках. Таким образом, KCF обычно экспрессируется механизмом, это указывает на его роль в регуляции проилиферации эпителиальных клеток.
Материалы и методы исследования.
Выделение клонов сДНК. Очистка и определение аминокислотной последовательности N-окончания KCF описано ранее (см. Экспериментальный раздел I и ссылку II-3). Сливы (50 пмолей) деоксиолигонуклеотидов, описанных в разделе "Результаты" метили по окончанию 5’ с использованием 83 пмолей -32Р-АТР (3000 Ci) ммоль, Амершам и 10 единиц Т4 полинуклеотидной киназы. Рекомбинантный фаг, несущий клоны сДНК, представлял собой реплику, высеенную на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизированную с 32P-меченными деоксилигонуклеотидами в 20% формамида, 10% сульфата декстрана, 10 мМ Трис-НСl (рН 7.5), 8х SSС, 5xДенхардт и 50 мкг/мл ДНК денатурированной спермы лосося, в течение ночи при 42°С. Фильтры промывали в 0,5х SSС, 0,1% SДS при 50°С и экспонировали на пленке Кодак Х-0мат АR.
Определение аминокислотной последовательности ДНК.
Нуклеотидную последовательность сДНК KCF определяли методом обрыва дидеокси цепи (II-26) перекрывающихся ограничительных фрагментов субклонированных в рУС векторы (II-27).
Конструирование бактериального экспрессионного вектора для KCF сДНК.
KCF сДНК кодирующую зрелую секретированную форму полипептида помещали под контролем гибридного trk промотора в вектор экспрессии плазмиды рКК233-2 (II-31) согласно следующей методике. Конкретную длину KCF cДНК, которая содержала информацию для кодирования молекулы зрелой KCF (т.е. без его сигнального пептида) усиливали с использованием метода цепной реакции полимеразы (PCR, II-32). Фрагмент направленно вставляли между двумя сайтами в вектор, сайтом Ncol, с затупленными концами в результате SI нуклеазного переваривания и сайтом Hind III, с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК технологии. Окончания KCF сДНК, полученного методом PCR, были следующими;
окончание 5’ было тупым и начиналось с ATG кодона, после чего шел кодон TGC для цисостатка, номер 32, который представлял собой аминотерминальный остаток зрелой формы KCF (см. рис.II-1) и затем полная KCF кодирующая последовательность. Стоп-кодон ТДА и следующие за ними четыре основания, TTGC, также включены в 3’ окончание сДНК. Затравка, используемая в методе PCR для направления синтеза ДНК в желаемое положение на окончании 3’ сДНК включает Нind III сайт для внедрения усиленной сДНК в векторную ДНК.
Продуцирование антител к KCF и KCF-родственным пептидом.
Моноклональные антитела вырабатывали в мышах против неповрежденного очищенного протеина человеческих фибробластов с использованием 5 или более подкожных инъекций. Испытуемые образцы крови подвергали скринингу с помощью твердофазного (ELISA) анализа с использованием высокоочищенного KCF из человеческих эпителиальных клеток в качестве антигена. Гибридом готовили обычными методами и надосадочные жидкости подвергали скринингу с помощью анализа ЕLISА. с целью детекции КСF-реакционноспособных антител.
Положительные клоны серийно субклонировали обычными методами и отобранные субклоны выращивали в виде опухолей у мышей с целью продуцирования больших количеств антител. Антитела очищали от асцитных жидкостей с использованием стандартных приемов (например, с помощью гидроксиапатита или иммуносродственных смол).
Поликлональные антитела против синтетического пептида выращивали в кроликах следующими стандартными методами. Пептиды получали твердофазной технологией и соединяли с тироглобулином по реакции с глутаровым альдегидом. Производили серийные подкожные инъекции и образцы крови подвергали скринингу анализом ЕLISА, а также другими методами, включая анализа пятнения по Вестерну и биоанализа на митогенезис. IgC иммуноглобулины выделяли методом хроматографии по сродству с использованием иммобилизованного протеина С.
Поликлональные антитела выращивали в кроликах против как природно секретированного KCF из человеческих фибробластов, так и рекомбинантного КCF продуцированного в E. coli (см. следующий раздел) с использованием следующей последовательности операции:
I) Начальную инъекций и первую иммунизацию осуществляли в паховых лимфотических узлах,
II) последующие иммунизации проводили внутримышечно.
Скрининг испытуемых образцов осуществляли с использованием анализа ЕLISA и анализа на окрашивание по Вестерну, а также биоанализа на митогенезис, а IgС очищали по методике, описанной выше для антител к синтетическим пептидам.
Результаты
Выделение сДНК клонов, кодирующих новый фактор роста.
С целью поиска сДНК клонов, соответствующих KCF кодирующей последовательности, получали две группы олигонуклеотидов с длинами в 26 оснований, основываясь на девятой аминокислотной последовательности, Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala, как это было установлено микроустановлением аминокислотной последовательности очищенного KCF (см. Экспериментальный раздел I и ссылку II-3). Одна нуклеотидная группа содержала смесь всех из 256 возможных кодирующих последовательностей для девяти аминокислот, тогда как другой содержал инозиновые остатки в дегенерированном третьем положении кодонов для Тhr и Pro.
Такая последняя конструкция понижает число возможных кодирующих последовательностей в группе до 16. Инозин в антикодоне тРНК может образовывать водородные связи с А, С или У (II-4), а олигонуклеотиды, которые содержат деоксинозин, как было показано, может эффективно гибридизироваться с соответствующей сДНК (II-5).
сДHK библиотеку конструировали в клонирующем векторе сДHК, рСЕУ9 (II-6) с использованием полиаденилированной РНК, экстрагированной из клеточной линии М426 человеческого эмбрионного легочного фибробласта (II-7), исходного источника фактора роста. В результате скрининга библиотеки (9×10 тромбоцитов) с помощью 32Р-меченных 26-mer олигонуклеотидов, идентифицировали 88 тромбоцитов, которые гибридизировали с обеими группами олигонуклеотидных зондов.
Охарактеризование и установление аминокислотной последовательности выбранных клонов сДНК. Из 10 очищенных от тромбоцитов клонов, подвергнутых анализу, один, обозначенный как клон 49, имел сДНК вставку размером 3,5 кb, тогда как оставшиеся клоны имели вставки размерами 1,8-2,1 кb.
Анализ мелких клонов позволил обнаружить несколько общих рестрикционных сайтов. Установление аминокислотной последовательности представителя мелких клонов, обозначенного как клон 32, совместно с клоном 49, продемонстрировало тот факт, что они представляют собой перекрывающиеся сДНК (рис.II-IA). В то время как клон 49 подвергали действию затравки из поли(А) отростка информации, клон 32 возникает в ходе конструирования библиотеки гибридизацией олиго (dТ) затравки с А-обогащенной последовательностью в 3’ некодирующей области KCF мРНК.
Описание последовательности кодирующей полипептид KCF.
Исследование двух таких сДНК (клоны 32 и 49) позволило установить непрерыную последовательность из 3.85 кb, содержащую полную КCF кодирующую последовательность (рис.II-IВ). АТC, по-видимому, являющий инициирующим кодоном, находится в положении 446 нуклеотида, создавая каркас открытого считывания из 582-оснований, который заканчивается на ТАA обрывающем кодоне в положении 1030. Такой каркас открытого считывания может кодировать полипептид из 194 аминокислот с расчитанным молекулярным весом 22,512 дальтонов.
Боковая последовательность AТС кодона не соответствует предполагаемой GСС(G/A)ССАТСG согласованности для оптимального инициирования эквариотными рибосомами (II-8), однако в направлении вверх от АТС кодона имеется три нуклеотида. В этом положении А представляет собой наиболее высокосохраненный нуклеотид в такой согласованности. Такому АТС кодону предшествует 85 нуклеотидов расположенных вверх от ТСА стоп-кодана в рамках того же каркаса считывания.
Аминокислотная последовательность 19, которая гомологична экспериментально определенному NН2-окончанию очищенного KCF начинается с 32 аминокислот, расположенных вниз от предполагаемого инициирующего кодона. Предсказанная и экспериментально установленная аминокислотные последовательности полностью согласуются друг с другом в результате чего может быть проведено недвусмысленное отнесение.
С целью поиска гомологии между KCF и любым известным протеином был осуществлен компьютерный поиск в банке данных Национального Биомедицинского исследовательского фонда с использованием программы FASТР Липмана и Пирсона (II-9). В результате такого подхода была выявлена поразительная родственность между предсказанной структурой KCF и структурой кислотного и основного FСF, а также родственных hst и int-2 закодированных протеинов.
Экспрессия матриц мРНК КCF гена в человеческих клетках.
В предварительных попытках исследования экспрессии KCF мРНК в человеческих клетках зонд, охватывающий большую часть KCF кодирующей последовательности (зонд А, рис.II-IA), позволил детектировать с помощью анализа пятнением по Нордерну одну матрицу размером 2,4 кb из всей М426 РНК (рис.II-IC). Эта величина значительно меньше, чем длина композитной сДНК последовательности, 3,85 кb.
Однако при скрининге поли(А)-селекционированной М426 РНК, была установлена дополнительная матрица размером примерно 5 кb. Кроме этого, зонд на основе нетранслированной области клона 49 от окончания 3’ до клона 32 (зонд В, рис.II-IA), гибридизируется только с большей частью информации (рис.II-IC). Таким образом, видно, что KCF ген подвергается транскрипции только в тех участках, которые касаются альтернативных РНК. Два других члена семейства FСF гена, bFСF (II-29) и int 2-(II-30), также экспрессируют большое число РНК, важность которых требует дополнительного выяснения.
С целью исследования нормальной функциональной роли KCF исследовали экспрессию его матрицы в большем числе человеческих клеточных линий и тканей. Как показано на рис.II-3, доминирующая матрицы КСF размером 2,4 кb определяется в каждой из нескольких стромальных фибробластовых линий, являющихся производными эпителиальных тканей из эмбрионных, новорожденных и взрослых источников, но не из эпителиальных клеточных линий обычного происиождения. Такую матрицу также детектировали в РНК экстрагированной из нормальных взрослых почек и органов желудочно-кишечного тракта, но не из легких или мозга. Выраженная спефифичность KCF РНК экспрессии в стромальных клетках эпителиальных тканей указывает на то, что такой фактор играет нормальную роль в мезенхимальной стимуляции роста эпителиальных клеток.
В целях сравнения мРНК других факторов роста с известной активностью в отношении эпителиальных клеток также анализировали в тех же тканях, что перечислены выше. Среди проанализированных эпителиальных и стромальных клеточных линий не было обнаружено согласующейся картины экспрессии аFСF или bFСF матриц (рис.II-3). ЕСF матрица не экспрессировала каких-либо одинаковых клеточных линий и наблюдалась лишь в почках среди различных тканей. Наконец ТСFа не детектировался в какой-либо из стромальных фибробластовых линий и экспрессировался с различными уровнями в каждой из эпителиальных клеточных линий. Его также обнаруживали в низких количествах в почках среди изученных тканей С фиг.II-3).
Ингибирование KCF митогенной активности гепарином. Было обнаружено, что гепарин значительно повышает митогенную активность аFСF в отношении большого числа клеток-мишеней в культуре и стабилизирует его в отношении термической дезактивации (II-21, II-22). Несмотря на прочное присоединение к bFСF гепарин оказывает минимальное влияние на его митогенную активность (II-22). Основываясь на родственности КCF к FСF изучали влияние гепарина на митогенную активность KCF. Как показано в таблице II-1 внедрение тимидина клетками ВАIВ/MK под действием KCF 16-кратно ингибируется при включении гепарина в культурную среду. В отличии от этого, активности aFCF и bFСF в результате такой обработки повышались.
Продуцированне анти-КСF антител.
Некоторые виды антител, которые распознают KCF или КОF-подобные полипептиды были получены с использованием стандартных методов хорошо известных в области экспериментальной иммунологии и суммированных выше в разделе. Методы. Они включают: моноклональные антитела, выращенные в мышах против целого, очищенного протеина из человеческих фиброблатов; поликлональные антитела, выращенные в кроликах против синтетических пептидов с последовательностями на основе аминокислотных последовательностей, предсказанных из последовательности KCF сДНК поликлональные антитела, выращенные в кроликах против как естественно секретированного KCF человеческого фиброблаета, так и рекомбинантного КСF продуцированного в Е. соli (см. следующий раздел).
Были очищены моноклональные тела из трех различных гибридов. Все три таких антитела распознают рекомбинант, а также встречающийся в природе KCF с помощью твердофазного (ЕLISА) анализа. Ни один из них не вступает в перекрестные реакции с KCF в условиях денатурации (согласно пятнению по Вестерну) и не нейтрализует митогенную активность KCF в биоанализе ВAIВ/MK.
Поликлональные антитела получали с использованием синтетического пептида с аминокислотной последовательностью NДMTРЕОМАТNУ, соответствующей остаткам 32-44 в KCF (см. рис.II-1), плюс R (аrg) остаток вместо действительного аsр остатка, закодированного сДHК в положении 45. asp остаток возможно гликозилирован в природном KCF полипептиде и поэтому представляет собой аrg в данных по аминокислотной последовательности, полученных непосредственно для такого полипептида (см. раздел "Обсуждение"). Поликлональные антитела генерированные с помощью такого синтетического пептида распознают как встречающийся в природе, так и рекомбинантный KCF в анализах ЕLISА и пятнения по Вестерну, при уровне чувствительности, по крайней мере, 10 нг протеина. Однако такие антитела не нейтрализуют митогенную активность КCF в биоанализе ВАIВ/MK.
Поликлональная антисыворотка против целого природного KCF протеина распознает КСF в анализах ЕLISА и пятнения по Вестерну. Такие антитела также ингибируют митогенную активность KCF в биоанализе BAIB/MK.
Экспрессия КCF сДНК в Е. соli.
KCF сДНК подвергали экспрессии с целью продуцирования полипептида в E. coli путем помещения его кодирующей последовательности под контролем гибридного trk промотора (включающего элементы trp и Iac промоторов) в плазмиду рКК233-2 (II-31). Для совершения такой операции, специальную длину KCF сДНК, которая содержала информацию для кодирования зрелой молекулы KCF (т.е. без его сигнальной последовательности) усиливали с использованием метода полимеразной цепной реакции (II-32). Фрагмент направленно вставляли между двумя сайтами в вектор, а именно между сайтом Ncol, полученный затуплением окончаний в результате SI нуклеазного переваривания и сайтом Hind III, с использованием методов рекомбинантной ДНК. В выбранных рекомбинантах осуществляли установление аминокислотной последовательности на их сДНК 5’ окончаниях, что способствовало корректному выравниванию АТG инициирующего кодона с регуляторными элементами trk промотора.
Некоторые рекомбинанты испытывали на продуцирование протеина с помощью обычных микрометодов. Клоны выращивали в мидэкспоненциальной фазе (ОД595-0,5), обработанной 1 мМ изопропил β-Д-тиогалактопиранозида (I С) в течение 90 минут и клеточные экстракты переносили на SДS-полиакриламидные гели для анализа окрашиванием по Вестерну. Все испытанные рекомбинанты синтезировали протеин, который распознавался антителами против аминотерминального KCF пептида. Выбирали один рекомбинант, который демонстрировал наивысшую индукцию из IPTC с целью последующего анализа протеина.
Один литр бактерий выращивали в NZУ бульоне, содержащем 50 мкг/мл ампициллина и 12,5 мкг/мл тетрациклина до значения ОД595-0,5 и обрабатывали в течение 90 минут с помощью IPTC. Клетки собирали центрифугированием ресуспендировали в 50 мМ фосфата натрия (рН 7.3), 0,2 М NaCl и лизировали с помощью ультразвука. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием и лизат непосредственно применяли в колонке с гепарин-Сефаразой.
Как было установлено анализом пятнения по Вестерну и определениием митогенной активности в кератиноцитах, рекомбинантный KCF алюировали в 0,5-0,6 М NaCl. Последующая очистка НSАС материала с помощью Моно-(FPIC) колонки (Фармация) давала препарат KCF с чистотой ≥90%, о которой судили с помощью электрофоретического анализа с использованием SДS-полиакриламидных гелей и окрашивания серебром.
Рекомбинантный KCF эффективно стимулирует внедрение тимидина в ВАIВ/MK кератиноцитные клетки, но лишь незначительно активен в отношении фибробластов NIН/3Т3. Половинная от максимального значения стимуляции клеток ВАIВ/МК в стандартном кератиноцитном анализе достигалась при концентрации 2-5 нг/мл, по сравнению с концентрацией 10-15 нг/мл для KCF очищенного от клеток М426. Один литр бактериальных клеток давал примерно 50 мкг Моноочищенного рекомбинантного KCF.
Конструирование химеры, содержащей KCF и аFСF последовательности.
Проведенные выше исследования показали, что KCF обладает двумя выраженными характеристиками, которые могут быть закодированы определенными частями или областями полипептидной последовательности, что, как известно, имеет место в кодирующих последовательностях других полифункциональных полипептидов. С целью испытания такой возможности, сегмент химерной ДНК кодирующей NН2-терминальную последовательность KCF привитого на ядро С-окончания аFСF конструировали следующим образом. Сайт реетрикционного энзима San ЗAI (САТС) на 5’ окончании KCF сДНК внутри кодонов для остатков 78 и 79 (аrg и tle соответственно; см. рис.II-1) разрезали и присоединяли к гомологическому сайту в аFСF cДНК внутри кодонов для аминокислот 39 (аrg) и 40. Окончания 3’ и 5’ такой химерной ДНК соединяли с векторной ДНK плазмиды рКК233-2 тем же способом, что использовали для внедрения KCF сДНК кодирующего секретированную форму полипептида (см. раздел "Методы" приведенный выше).
В том случае когда рекомбинантные клетки E. coli конструировали с использованием вектора несущего химеру, а экспрессионные испытания проводили в соответствии с описанным выше для зрелого KCF, получали новый продукт со свойствами, как KCF так и аFСF. Пептид обогащали с помощью гепарин-Сефарозной хроматографии и было обнаружено, что предпочтение в качестве клетки-мишени отдается кератиноцитам, подобно KCF, при минимальной активности в отношении фибробластов (NIН/3Т3). Однако митогенная активность такого химерного полипептида теряет восприимчивость к ингибированию гепарином, т.е. характеристику, которая присуща аFCF, а не KCF. Фактически, митогенная активность кератиноцитов в действительности усиливается гепарином, как это имеет место в случае аFСF. Таким образом, согласно практическому воплощению настоящего изобретения пептидные области, ответственные за специфичность в отношении клетки-мишени и чувствительность в отношении гепарина, обладают выраженной индивидуальностью и могут быть легко выделены из KCF.
Обсуждение.
Эксперименты, описанные в этом разделе, иллюстрируют практическую реализацию нескольких главных воплощений настоящего изобретения. Они включают выделение сДНК кодирующих КСF, экспрессирование таких сДНК в рекомбинантных клетках, продуцирование различных антител реакционноспособных в отношении KCF и конструирование и экспрессию химерной сДНК, кодирующей новый фактор роста с аминокислотными последовательностями и родственными функциональностями присущими как KCF, так и аFСF. Следующие ниже пункты, относящиеся к таким воплощениям, могут улучшить понимание настоящего изобретения.
Последовательность, предсказанная на основании KCF сДHK, согласуется с аминокислотной последовательностью, определенной из очищенной формы KCF секретированной человеческими фибробластами. Кроме этого, такая последовательность предполагает потенциальное объяснение положений, где определенное отнесение аминокислот не может быть сделано прямым установлением аминокислотной последовательности. Остатки 32 и 46, предсказанные из сДHK последовательности, являются цистеинами, а гидролизованные производные немодифицированных цистеиновых остатков не детектируются с помощью деградации по Эдману. Предсказанная аминокислотная последовательность KCF содержит также один потенциальный N-связанный сайт гликозиляции (Аsn-Х-Ser/Тhr) из остатков 45-47. Если Аsn 45 гликозилирован, то он не может быть детектирован используемыми методами установления аминокислотной последовательности. Фактически, KCF мигрирует в виде широкой полосы на NаДоdSО4/PACE при более высоком молекулярном весе, чем предсказано для очищенного протеина. Это может быть отнесено за счет гликозилирования.
FCF представляют собой гепаринсвязующие митогены с широким спектром специфичности в отношении клетки-мишени (II-10). Нst ген были идентифицирован как трансформирующий ген из желудочной опухоли человека (II-11), по соседству с обычной желудочной тканью (II-12) и на саркомы Капоши (II-13), с помощью стандартного NIH/ТЗТ трансфекционного анализа. Продукт int-2 гена нормально экспрессируется в ходе эмбриогеноза мышей (II-14) и c отклонениями от нормы после провирусной интеграции вируса опухоли молочной железы мышей (II-15).
KCF представляет собой шестой член семейства факторов роста фибробластов подлежащего идентификации (II-28). Хотя название FСF-6 по-видимому не подходит из-за того, что KCF не обладает активностью в отношении фибробластов, такая номенклатура может также использоваться для такого фактора роста с целью отражения его структурной взаимосвязи с семейством FСF. Поскольку все ранее охарактеризованные факторы роста либо исключают эпителиальные клетки в качестве мишеней или включают их в ряд чувствительных клеток-мишеней, высокоспецифичная природа KCF митогенной активности в отношении эпителиальных клеток и, в особенности чувствительность к кератиноцитам, делают этот фактор уникальным.
Согласно проведенным исследованиям экспрессия матрицы KCF, по-видимому, является специфичной в отношении стромальных клеток эпителиальных тканей, что предполагает ее участие в пролиферации нормальных эпителиальных клеток. Доступность KCF сДНК клона позволяет определять те случаи, когда анормальная экспрессия такого фактора роста может принимать участие в клинических состояниях, характеризующихся дисплазией и/или неоплазией эпителиальных клеток. Кроме того, возможность получения больших количеств такого нового фактора роста с помощью рекомбинантной технологии позволяет осуществлять испытание его клинической применимости в тех случаях, когда особую важность имеет специфический рост эпитеальных клеток.
Трассировка KCF последовательности пятью другими протеинами семейства FСF обнаруживает два основных участка гомологии, охватываемых аминокислотами 65-156 и 162-189 в предсказанной последовательности KCF, которые разделены короткими, негомологическими сериями аминокислот различной длины в различных членах семейства (риc.II-2). В случае int-2 длина такой последовательности составляет 17 остатков, тогда как в случае hst, два таких гомологических участка являются соприкасающимися. В KCF такая последовательность состоит из пяти аминокислот. В регулируемых областях KCF аминокислотная последовательность была на 44% идентична int-2 (мышиная), на 39% идентична bFСF (человеческий), на 30% идентична aFCF (человеческая) и на 33% идентична hst (человеческая). В этой же области все шесть протеинов были идентичны 19% остатков, а при осуществлении консервативных замещений они проявляли 28% гомологию.
Как показано на рис.II-2 аминоокончания таких родственных протеинов были негомологичными и имели разную длину. Первичный KCF и hst трансляционные продукты содержат гидрофобные N-терминальные области, которые, по-видимому, служат сигнальными последовательностями (II-16). Такое предположение подтверждается также тем фактом, что такая N-терминальная область отсутствует у молекулы зрелого KCF (рис.II-18). В отличии от этого FСF синтезируются без сигнальных пептидов (II-10). Int-2-протеин содержит нетипично короткую область N-терминальных гидрофобных остатков II-17), однако она неизвестна, если протеин секретирован. Более того, int-2-протеин содержит длинное C-терминальное удлинение, сравнимое с другими членами семейства.
Очищенный KCF содержит пять цистеиновых остатков, два из которых сохраняются во всем семействе FCF-родственных протеинов (рис.II-2). Следует также отметить пять пар основных остатков последовательности KCF. Та же картина наблюдается у других членов семейства FCF и это обстоятельство следует учитывать в их взаимодействии с гепарином (II-18). Двухосновные сайты также являются обычными мишенями в отношении протеолитического воздействия и такое воздействие может быть причиной микрогетерогенности, наблюдаемой в одинаковых KCF препаратах (неопубликованные данные).
KCF сДНК последовательность обогащена AT по ее длине, но особенно это проявляется в 3’ нетранслированной области, где содержание AT составляет 70% по сравнению с 60% в предполагаемой кодирующей последовательности и 63% в 5’ нетранслированной области 3’ нетранслированная область содержит большое число ATТТА последовательностей, которые, как предполагается, принимают участие в селективной деградации промежуточно экспрессированных, неустойчивых РНК (II-19). Классический сигнал ААТААА полиаденилирования отсутствует, однако детектируются две вариантные последовательности ААТТАА и ААТАСА (II-20), содержащие 24 и 19 нуклеотидов, соответственно вверх от поли(А) последовательности на 3’ окончании сДНК.
Было предположено, что влияние гепарина на кислотный FCF связан либо со стабилизацией активной конформации фактора роста или с образованием тройного комплекса с кислотным FCF и его рецептором (II-21, II-22). Если это так, то гепарин может стабилизировать конформацию KCF, которая не столь активна, как свободная молекула или образовывать прочный комплекс, способный эффективно взаимодействовать с его рецептором.
Хотя способность связывать гепарин отражает структурное подобие KCF и FСF, различие в специфичностях в отношении клетки-мишени у этих родственных митогенов является значительным. FCF индуцируют деление большинства нетерминально дифференцированных клеток как эмбрионного мезодермального, так и нейтроэктодермального происхождения. Помимо фибробластов и мышечных эндотелиальных тканей мишени мезобермального происхождения в культуре включают миобласты, хонцроциты и остеобласты (II-23). FCF также проявляют митогенность в отношении глиальных астроцитов и нейтробластов (II-24).
Продукт онкогена, выделенный из саркомы Калоши, который идентичен hst, также стимулирует пролиферацию NIH/3T3 и капиллярных эндотелиальных клеток (II-25). К настоящему времени, KCF индуцированный мутогениз наблюдался лишь в эпителиальных клетках и было также продемонстрировано отсутствие какой-либо детектируемой активности в фибробластах или эндотелиальных клетках (см. Экспериментальный раздел I, II-3). Поэтому, представляется вероятным, что KCF действует через другой клеточный поверхностный рецептор, чем FCF.
Не наблюдается значительной N-терминальной гомологии между KCF и другими FCF родственными протеинами. Так, например, была создана конструкция из химерных молекул между KCF и прототипом FCF с целью установления достаточности KCF- N-терминальной области для его уникальной специфичности в отношении клетки-мишени. Результаты исследования такой рекомбинантной полипептидной последовательности показали, что N-терминальная область KCF существенно кодирует клеточное предпочтение в пользу кератиноцитов, тогда как восприимчивость КСF к гепарину закодирована где-то в области ядра С-окончания, которое заменено последовательностями аFСF. Такой новый KCF-подобный фактор роста может иметь преимущества при клиническом применении, где желательно применение эпителиально-специфичного фактора роста в присутствии гепарина, традиционно применяемого антикоагулянта. Дополнительное изучение химер также должно обеспечить информацию о природе конкретных областей ядра С-окончания, которые обеспечивают различные эффекты гепарина на их биологическую активность.
References for experimental II
II-1. Janes, R. and Bradshaw, R.A. (1984)
Ann. Rev. Biochem. 53, 259-292.
II-2. Sporn, M.В. and Todaro, G.J. (1980) N.
Eng. J. Med. 303, 878-880.
II-3. Rubin, J.S., Osada, H., Finch, P.W.,
Taylor, W. G., Rudikoff, S. and
Aaronson, S.A. (1989) Proc. Netl. Acad. Sci.
USA (in press).
II-4. Crick, F.H.C. (1966) J. Mol. Biol. 19,
548-555.
II-5. Ohtsuka, E., Matsuki, S., Ikehara, M.,
Takashi, Y. and Matsubara, K. (1985) J.
Biol. Chem. 260, 2605-2608.
II-6. Miki, Т., Matsui, Т., Heidaran, M. and
Aaronson, S.A. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.
(in press).
II-7. Aaronson, S.A. and Todaro, G.J. (1968)
Virology 36, 254-261.
II-8. Kozak, M. (1987) Nucl. Acids Res. 13,
8125-8148.
II-9. Lipman, D.J. and Pearson, R.W. (1985)
Science 227, 1435-1441.
II-10. Thomas, К. (1987) FASEB J. 1, 434-440.
II-11. Taira, M., Yoshida, Т., Miyagawa, К.,
Sakamoto, H., Terada, M. and Sugimara,
T. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,
2980-2984.
II-12. Yoshida, Т., Miyagava, К., Odagiri, H.,
Sakamoto, H., Little, P.F.R., Terada,
M. and Sugimara, T. (1987) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84, 7305-7309.
II-13. Delli-Bovi, P. and Basillico, С. (1987)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5660-5664.
II-14. Jakobovits, A., Shackleford, -. М.,
Varmus, Н. Е. and Martin, G. R. (1986)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7806-7810.
II-15. Peters, G., Brookes, S. and Dickson, S.
(1983) Cell 33, 364-377.
II-16. von Heijne, G. (1986) Nucl. Acids Res. 14,
4683-4690.
II-17. Moore, R. Casey, G., Brookes, S., Dixon,
M., Peters, G. and Dickson, C. (1986)
EMBO J. 5, 919-924.
II-18. Schwarzbauer, J.E., Tamkum, J.M.,
Lemischka, I.R. and Hynes, R.O. (1983)
Cell 35, 421-431.
II-19. Shaw, G. and Kamen, R. (1986) Cell 46,
659-667.
II-20. Birnsteil, M.L., Busslinger, M. and
Strub, K. (1985) Cell 41, 349-359.
II-21. Schrieber, А.В., Kenny, J., Kowalski,
W., Friesel, J., Mehlman, T. and Maciag,
T. (1985) Proc Natl. Acad. Sci. USA 82,
6138-6142.
II-22. Gospodarowizc, O. and Cheng, J. (1986)
J. Cell Physiol. 128, 475-485.
II-23. Thomas, К.A. and Giminez-Gallego, G.
(1986) Trends Biochem. Soc. 11, 81-84.
II-24. Gensburger С., Labourdette, J. and
Sensembrenner, M. (1987) FEBS Lett. 217, 1-5.
II-25. Delli-Bovi, P, Curatola, АН., Kern, F.
G., Greco, A., Ittman, M. and Basilico,
C. (1987) Cell 50, 729-737.
II-26. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.
R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463
5467.
II-27. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and
Messing, J. (1985) Gene 33, 103-119.
II-28. Zhan, X., Bates, В., Нu, X. and
Goldfarb, M. (1988) Mol. Cell. Biol. 8,
3487-3495
II-29. Abrahams J. A., Mergia, A., Whang, J.L.,
Tumolo, A., Friedman, J., Hjerrild, K.
A., Gospodarowicz, D. and Fiddes, J.C.
(1986) Science 233, 545-548.
II-30. Mansour, S.L. and Martin, G.R. (1988)
EMBO J. 1, 2035-2041.
II-31. Amman, E. and Brosius, J. (1985) Gene 40,
183.
II-32. Sakai, R.К., Scharf, S., Faloona, F.,
Mullis, K.B., Norn, G.T.. Eriich, H.A.
and Arnheim, N. (1985) Science 230, 1350- 1354.
II-33. Bectman, P.M., Betsholtz, С. Heldin, C-
H., Westermark, B. DiMarco, E., DiFiore,
P.P., Robbins, K.C. and Aaronson, S.A.
(1988) Science 241, 1346-1349.
Регенерации вычисляли, полагая что вся митогенная активность в исходном материале была обусловлена изолированным фактором.
Таблица I-2 Специфичность факторов роста к клетки-мишени |
|||||
Фактор роста | Эпителиальные | Фибробласт | Эндотелиальные | ||
BALB/MK | BS/589 | ССL208 | NIН/3Т3S | Подкожная вена человека | |
КGF | 500-1000 | 23 | 5-10 | <1 | <1 |
EGF | 100-200 | 20-40 | 10-30 | 10-20 | Не определяемо |
TGFa | 150-300 | Не определяемо | Не определяемо | 10-20 | Не определяемо |
aFGF | 300-500 | 2-3 | 5-10 | 50-70 | 5 |
вFGF | 100-200 | 2-3 | 2-5 | 50-70 | 5 |
xМаксимальная стимуляция посредством aFGF-требовала присутствия гепарина (Sigma), 20 мкг/мл. n.d. = не определяемо |
Сравнение максимального внедрения тимидина, стимулированного KGF и другими факторами роста, в целом ряде линий клеток, выраженное в виде кратности увеличения стимуляции по сравнению с фоновым значением.
Эти данные представляют собой итог четырех различных экспериментов.
Рисунок I-1. Хроматография гепарин-сефарозного сродства кондиционированной среды из М426 человеческих эмбриональных фибробластов. Приблизительно 150 мл ультрафильтрационного ретентата, извлеченного из литров М426 кондиционированной среды наносили в течение 1 часа на гепарин-сефарозную колонку (объем слоя 6 мл). После промывки колонки 150 мл уравновешивающего буффера, 20 мМ Тris-HCl, рН 7,5/0,3 М NаСl, удержанный протеин (<5% от общего протеина в ретентате) вымывали элюентом с модифицированным линейным градиентом увеличения концентрации NаСl. Объем пробы был 3,8 мл, а скорость потока при градиентном элюировании составляла 108 мл/ч. Для проведения анализа на внедрение 3H-тимидина в BALB/MK клетки, который описан в Методах, два мкл указанных фракций переносили в ячейки для микротитрования, вмещающие конечный объем 0,2 мл.
Рисунок I-2. (А) Обратимо-фазовая C2HPLC митогенная активность ВАLВ/МК. Активные фракции, элюированные 0-6М NaCL из гепарин-сефарозы, обрабатывали центриконом - 10 и тотчас же наносили на С4Уydаc колонку (4,6×250 мм), которая была уравновешена в 0,1% трифторуксусной кислоте 20% ацетонитриле (ACN). После промывки колонки 4 мл уравновешивающего буфера, пробу вымывали элюентом с модифицированным линейным градиентом увеличения % АСN. Объем пробы был 0,2 мл, а скорость потока составляла 0,5 мл/мин. Для проведения анализа внедрения 3H-тимидина в клетки BALB/MK, аликвоты разбавляли сразу 10-кратно 50 мкг/мл бычьим сывороточным альбумином/ 20 мМ Tris-HCl, рН 7,5, и проводили анализ при окончательном 200-кратном разбавлении. (В) NаДоdSО4/РАGЕ анализ фракций, отобранных после C4 хроматографии, приведен на фотоснимке А. Половицу каждой фракции высушивали, повторно растворяли в NаДоdSО4 (2-меркапто-этаноле, денатурировали нагреванием и проводили электрофорез в 14%-ном полиакрилоамидном геле, который впоследствии окрашивали серебром. Расположение каждого молекулярного веса отмечено стрелкой (масса в кДа). (С) Синтез ДHK в клетках ВАLВ/MK под действием фракций проанализирован на фотоснимке. В. Активность выражена в виде кратности увеличения стимуляции по сравнению с фоновым значением, которое составляло 100 срm.
Рисунок I-3. HPIC (TSK 3000 SW) хроматография BALВ/МК митогенной активности на молекулярных ситах. Приблизительно 50 мкл центрикон-обработанного, 0,6 М NaCl слива из НSАС наносили на LKВ Glas Рас TSK G-3000Sw колонку (8×300 мм), предварительно уравновешенную в 20 мМ Tris HCl, рН 6,8/0,5 М NaCl, и элюировали в виде фракций по 0,2 мл со скоростью потока 0,4 мл/мин. Для проведения анализа на внедрение 3H-тимидина в ВАLВ/MK клетки, аликвоты объемом 2 мкл переносили в ячейки для микротитрования. Нахождение молекулярных весов при элюировании (масс в кДа) указаны стрелками.
Рисунок I-4. Сравнение BALB/MK ДНК синтеза под воздействием ТSK-очищенного митогена и других факторов роста. Внедрение 3Н-тимидина в ДНК, нерастворимую в трихлоруксусной кислоте, выраженное как кратность увеличения стимуляции по сравнению с фоновым значением, было измерено как зависимость от концентрации указанных факторов роста. Значения фона в отсутствие образцов составляли 150 срm. Результаты представляют средние значения двух независимых экспериментов. Отклонения от средних величин в каждом эксперименте не превышали 10%. ТSК-очищенный митоген, •------•; EGF, Δ------Δ, аFGF, □------□, вFGF, о--------o.
Рисунок I-5. Сравнительный рост ВАLВ/MK клеток в химически определенной среде под воздействием различных сочетаний факторов роста. Культуры высевали с плотностью 2,5×104 клеток на одну чашку Петри (диаметр 35 мм), предварительно покрытую поли-Д-лизином/фибронектином в 1:1 смеси минимальной основной среды Eagle и среды Ham F12, дополненной трансферрином, Nа2SeО3, этаноламином и факторами роста, указанными ниже. Через 10 дней чашки фиксировали и окрашивали Giemsa.
Расшифровка:
а) не содержит фактора роста,
в) только ЕGF,
с) только инсулин, d) только KGF, е) EGF + инсулин. Конечные концентрации факторов роста были следующие: EGS, 20 нг/мд, инсулин, 10 мг/мл и КGF, 40 нг/мд.
Таблица II-2 Влияние гепарина на KGFмитогенную активность |
||||
Фактор роста | ВАДВ/MK | NIН/3Т3 |
||
+ | - | + | - | |
KGF | 150 | 9,5 | 1 | 1 |
аFGF | 106 | 259 | 10,4 | 68 |
вFGF | 30 | 124 | 45,7 | 70 |
Клетки высевали в чашках для микротитрования, культивировали до слияния в среде, содержащей сыворотку, а затем, перед добавлением образца, помещали на 24-72 часа в среду, не содержащую сыворотку. Анализы на митогенез проводили по методикам, описанным выше (смотреть экспериментальную часть, ранее описанные в II-3). Если указано, что гепарин был введен в питательную среду, то его конечная концентрация составляла 20 мкг/мл. Концентрация всех факторов роста составляла 50 нг/мл. Результаты представляют кратность увеличения стимуляции внедрения 3H-тимицина в указанную испытуемую клетку в присутствии (+) или отсутствии (-) гепарина. Каждое значение представляет собой средний результат из двух независимых экспериментов, в которых каждая точка представляет, в свою очередь, среднее значение двойных анализов.
Рисунок II-1. Нуклеотидная последовательность и дедуцированная аминокислотная последовательность KGF сДНК, и идентификация записей KGF генов. (А) Схематическое представление клонов человеческого KGF сДНК. Перекрывающиеся рСЕУ9 клоны 32 и 49, используемые в определении последовательности, приведены выше в виде диаграммы полной структуры, в которой нетранслированные области изображены линией, а кодирующая последовательность изображена прямоугольником. Штрихованная область обозначает последовательности сигнального пептида, а незаштрихованная область - завершенный протеин. Указаны местоположения выбранных ограничений. (B)KGF сДHК нуклеотид и предсказанные аминокислотные последовательности. Нуклеотиды пронумерованы справа; аминокислоты пронумерованы с начала до конца. Подчеркнута пептидная последовательность с N-окончанием. Гидрофобная область с N-окончанием выделена курсивом. Участок возможного аспарагин связанного гликозилирования отмечен линией, проведенной сверху. Сигналы различного полиаденилирования, ААТТАА и AАТАСА, находящиеся у 3’ окончания, заключены в прямоугольник. (С) Идентификация КGF мРHK анализом Northerm blot. Ланы а и с, поли(А)-селекционированная М426 РНК; лан d, общеклеточная М426 РНК. Фильтры гибридизировали с 32Р-меченным 695 (Gp BamH1) Всl I фрагментом из клона 32 (зонд А, рис.II-IА), ланы а и в, или с 541 вр Ара I/Есо RI фрагментом из клона 49 (зонд В, рис.II-IA), ланы с и d.
Рисунок II-2. Топологическое сравнение FGF семейства родственных молекул. Темными прямоугольниками обозначены две области протеина, которые разделяют высокую гомологию. Заштрихованные прямоугольники показывают предполагаемые последовательности сигнальных пептидов. Приведены местонахождения двух сохранившихся остатков цистеина (С).
Рисунок II-3. Northern blot анализ KGF мРНК в линиях нормальных человеческих клеток и тканях, и сравнение с мРHK экспрессии других факторов роста с известной активностью на эпителиальных клетках. Все клеточные РН-кислоты выделяли градиентным центрифугированием с использованием трифторацетата цезия. 10 мкг РНК денатурировали и проводили электрофорез в 1%-ных формальдегидных гелях. После мягкой щелочной денатурации (50 мМ NаОН в течение 30 минут) РНК переносили на нитроцеллюлозные фильтры, используя в качестве конвектанта I M ацетат аммония. Фильтры гибридизировали в 32Р-меченный сДНК, зонд, содержащий 647 вр Еcо RI фрагмент у 5’ окончания КGF-кодирующей последовательности (А) или в аналогичные зонды из других ДH-кислот фактора роста. Были использованы следующие виды клеток человека: раковые клетки сквамозного эпителия (А253, А388 и A431); эпителиальные клетки молочной железы (S6 и R1); кератиноциты, законсервированные Аd12-Sv40; первичные человеческие кератиноциты; фибробласты новорожденной крайней плоти (AG 1523); фибробласты развитой кожи (50IT); и фибробласты эмбрионального легкого (WI-38 и М426).
Claims (52)
1. Выделенный белок фактора роста кератиноцита (KGF), содержащий следующую аминокислотную последовательность или содержащий сегмент следующей аминокислотной последовательности, отличающуюся делецией одной или более смежных аминокислот на N-конце указанной последовательности, где указанный белок КGF обладает предпочтительной митогенной активностью в отношении клеток эпителиального происхождения:
CNDMTPEQMATNVNCS
SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF
YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
HFLPMAIT.
2. Белок KGF по п.1, где указанный белок KGF дополнительно содержит Met на N-конце.
3. Белок KGF по любому из пп.1 и 2, где указанный белок KGF обладает способностью связывать гепарин.
4. Белок KGF по любому из пп.1-3, где 1 нМ указанного белка KGF обладает способностью стимулировать клетки BALB/MK.
5. Белок KGF по любому из пп.1-4, где количество указанного белка, которое проявляет максимальное стимулирование кератиноцитных клеток BALB/MK, проявляет менее чем однократное стимулирование фибробластов NIH/3T3, по сравнению с исходным уровнем, где кратность, равная единице, определяется как исходный уровень синтеза-ДНК в необработанных клетках.
6. Белок KGF по любому из пп.1-4, где 5 нМ белка проявляет менее чем однократное стимулирование фибробластов NIH/3T3 по сравнению с исходным уровнем.
7. Белок KGF по любому из пп.1-4, где количество указанного белка, которое проявляет максимальное стимулирование кератиноцитных клеток BALB/MK, обеспечивает менее чем 1/50 максимально-возможного уровня внедрения тимидина для фибробластов NIH/3T3, стимулированных aFGF или bFGF.
8. Белок KGF по любому из пп.1-4, где количество указанного белка, которое проявляет максимальное стимулирование кератиноцитных клеток BALB/MK, обеспечивает менее чем 1/10 максимально возможного уровня внедрения тимидина для фибробластов NIH/3T3, стимулированных EGF или альфа-TGF.
9. Белок KGF по любому из пп.1-4, где максимальное стимулирование кератиноцитов BALB/MK указанным белком, достигаемым в диапазоне концентраций 0,1-3 нМ, по меньшей мере в два раза выше, чем достигается при тех же самых концентрациях bFGF.
10. Белок KGF по любому из пп.1-9, который обладает предпочтительной митогенной активностью в отношении кератиноцитной клетки.
11. Белок KGF по любому из пп.1-10, который обладает митогенной активностью в отношении эпителиальной клетки, но не в отношении фибробластной клетки.
12. Белок KGF по любому из пп.1-11, который обладает митогенной активностью в отношении эпителиальной клетки, но не в отношении эндотелиальной клетки.
13. Белок KGF по п.11 или 12, где указанной эпителиальной клеткой является кератиноцит.
14. Белок KGF по п.11, где указанной эпителиальной клеткой является BALB/MK, а указанной фибробластной клеткой является NIH/3T3.
15. Белок KGF по любому из пп.1-14, который обладает специфической активностью, по меньшей мере, 3,4·104 единиц на мг белка, где одна единица активности определяется как такое количество, которое вызывает половину от максимально возможного стимулирования синтеза ДНК в кератиноцитных клетках BALB/MK.
16. Белок KGF по любому из пп.1-15, содержащий аминокислотную последовательность
CNDMTPEQMATNVNCS
SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF
YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
HFLPMAIT.
17. Белок KGF по любому из пп.1-15, состоящий из сегмента следующей аминокислотной последовательности:
CNDMTPEQMATNVNCS
SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF
YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
HFLPMAIT.
18. Белок KGF по п.17, где указанный сегмент обладает митогенной активностью в отношении кератиноцитной клетки и может дополнительно содержать метионин на амино-конце.
19. Белок KGF по любому из пп.1-18, где указанный белок является гликозилированным.
20. Белок KGF по любому из пп.1-18, где указанный белок является негликозилированным.
21. Выделенный белок фактора роста кератиноцита (KGF), который обладает предпочтительной митогенной активностью в отношении клеток эпителиального происхождения, где указанный белок KGF получен экспрессией в клетке-хозяине ДНК, кодирующей белок, имеющий последовательность, включающую аминокислоты 32-194 следующей последовательности, или содержащий сегмент последовательности из аминокислот 32-194 следующей аминокислотной последовательности:
MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICL
VGTISLACNDMTPEQMATNVNCS
SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF
YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA HFLPMAIT,
и выделение указанного белка KGF.
22. Белок KGF по п.21, где указанная клетка выбрана из группы, состоящей из бактериальной клетки, грибковой клетки, клетки млекопитающего и клетки насекомого.
23. Белок KGF по п.21, где указанная ДНК кодирует белок, имеющий следующую последовательность:
MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICL
VGTISLACNDMTPEQMATNVNCS
SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF
YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
HFLPMAIT.
24. Белок KGF по любому из пп.21-23, где указанный белок KGF дополнительно содержит Met на N-конце.
25. Белок KGF по любому из пп.21-24, где указанный белок KGF обладает способностью связывать гепарин.
26. Белок KGF по любому из пп.21-25, где 1 нМ указанного белка KGF обладает способностью стимулировать клетки BALB/MK.
27. Белок KGF по любому из пп.21-26, где количество указанного белка, которое проявляет максимальное стимулирование кератиноцитных клеток BALB/MK, проявляет менее чем однократное стимулирование фибробластов NIH/3T3 по сравнению с исходным уровнем, где кратность, равная единице, определяется как исходный уровень синтеза ДНК в необработанных клетках.
28. Белок KGF по любому из пп.21-26, где 5 нМ белка проявляет менее чем однократное стимулирование фибробластов NIH/3T3 по сравнению с исходным уровнем.
29. Белок KGF по любому из пп.21-26, где количество указанного белка, которое проявляет максимальное стимулирование кератиноцитных клеток BALB/MK, обеспечивает менее чем 1/50 максимально возможного уровня внедрения тимидина для фибробластов NIH/3T3, стимулированных aFGF или bFGF.
30. Белок KGF по любому из пп.21-26, где количество указанного белка, которое проявляет максимальное стимулирование кератиноцитных клеток BALB/MK, обеспечивает менее чем 1/10 максимально возможного уровня внедрения тимидина для фибробластов NIH/3T3, стимулированных EGF или альфа-TGF.
31. Белок KGF по любому из пп.21-26, где максимальное стимулирование кератиноцитов BALB/MK указанным белком, достигаемым в диапазоне концентраций 0,1-3 нМ, по меньшей мере в два раза выше, чем достигается при тех же самых концентрациях bFGF.
32. Белок KGF по любому из пп.21-31, который обладает предпочтительной митогенной активностью в отношении кератиноцитной клетки.
33. Белок KGF по любому из пп.21-32, который обладает митогенной активностью в отношении эпителиальной клетки, но не в отношении фибробластной клетки.
34. Белок KGF по любому из пп.21-33, который обладает митогенной активностью в отношении эпителиальной клетки, но не в отношении эндотелиальной клетки.
35. Белок KGF по п.33 или 34, где указанной эпителиальной клеткой является кератиноцит.
36. Белок KGF по п.33, где указанной эпителиальной клеткой является BALB/MK, а указанной фибробластной клеткой является NIH/3T3.
37. Белок KGF по любому из пп.21-36, который обладает специфической активностью, по меньшей мере, 3,4·104 единиц на мг белка, где одна единица активности определяется как такое количество, которое вызывает половину от максимально возможного стимулирования синтеза ДНК в кератиноцитных клетках BALB/MK.
38. Белок KGF по любому из пп.21-37, содержащий аминокислотную последовательность
CNDMTPEQMATNVNCS
SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF
YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
HFLPMAIT.
39. Белок KGF по любому из пп.21-37, состоящий из сегмента следующей аминокислотной последовательности:
CNDMTPEQMATNVNCS
SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF
YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
HFLPMAIT.
40. Белок KGF по п.39, где указанный сегмент обладает митогенной активностью в отношении кератиноцитной клетки и может дополнительно содержать метионин на амино-конце.
41. Белок KGF по любому из пп.21-40, где указанный белок является гликозилированным.
42. Белок KGF по любому из пп.21-40, где указанный белок является негликозилированным.
43. Рекомбинантная молекула ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность белка KGF по любому из пп.1-42.
44. Рекомбинантная молекула ДНК по п.43, кодирующая аминокислотную последовательность
MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICL
VGTISLACNDMTPEQMATNVNCS
SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF
YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
HFLPMAIT
45. Вектор для экспрессии KGF, содержащий рекомбинантную молекулу ДНК по п.43, оперативно связанную с регуляторными последовательностями.
46. Вектор по п.45, где последовательность ДНК кодирует аминокислотную последовательность
MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICL
VGTISLACNDMTPEQMATNVNCS
SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF
YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
HFLPMAIT
47. Способ конструирования клетки-хозяина для продуцирования белка KGF, включающий трансформирование клетки вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую KGF, отличающийся тем, что в качестве вектора используют вектор по п.45.
48. Способ по п.47, где вектор содержит рекомбинантную последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность
MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICL
VGTISLACNDMTPEQMATNVNCS
SPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLF
CRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKN
NYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEF
YLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFK
ELILENHYNTYASAKWTHNGGEM
FVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTA
HFLPMAIT
49. Способ получения белка KGF по любому из пп.1-42, включающий культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей молекулу ДНК по п.43, в культуральной среде в условиях, при которых продуцируется указанный белок.
50. Способ по п.49, где указанная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из бактериальной клетки, грибковой клетки, клетки млекопитающего и клетки насекомого.
51. Способ по п.50, где указанной клеткой-хозяином является клетка Е. coli.
52. Фармацевтическая композиция для стимуляции пролиферации эпителиальных клеток, содержащая белок KGF по любому из пп.1-42 в эффективном количестве, и фармацевтически приемлемый носитель.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US30428189A | 1989-01-31 | 1989-01-31 | |
US07/304.281 | 1989-01-31 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2250213C2 true RU2250213C2 (ru) | 2005-04-20 |
Family
ID=23175833
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5001740/13A RU2250213C2 (ru) | 1989-01-31 | 1990-01-30 | Выделенный белок фактора роста кератиноцита (kgf), рекомбинантная молекула днк, вектор, способ конструирования клетки-хозяина, способ получения белка, фармацевтическая композиция |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (8) | US5665870A (ru) |
EP (2) | EP1016716A3 (ru) |
JP (6) | JP3298874B2 (ru) |
KR (1) | KR950012805B1 (ru) |
AT (1) | ATE197800T1 (ru) |
AU (2) | AU647732B2 (ru) |
CA (2) | CA2349875C (ru) |
DE (2) | DE69033668T2 (ru) |
DK (1) | DK0555205T3 (ru) |
ES (1) | ES2153816T3 (ru) |
FI (1) | FI114711B (ru) |
GE (1) | GEP20022681B (ru) |
HU (1) | HU218090B (ru) |
IE (1) | IE20020188A1 (ru) |
LT (1) | LT3472B (ru) |
LU (1) | LU91237I2 (ru) |
LV (1) | LV10284B (ru) |
NL (1) | NL300230I2 (ru) |
NO (2) | NO308312B1 (ru) |
RU (1) | RU2250213C2 (ru) |
SG (1) | SG46699A1 (ru) |
WO (1) | WO1990008771A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2458069C2 (ru) * | 2007-01-05 | 2012-08-10 | Хеликс Байомедикс Инк. | Выделенный пептид для усиления ранозаживляющей активности кератиноцитов, композиция для заживления ран у млекопитающего и лекарственное средство для применения при заживлении ран у млекопитающего |
Families Citing this family (48)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69033668T2 (de) | 1989-01-31 | 2001-04-12 | Jeffrey S Rubin | Dns kodierend für einen für epithelzellen spezifischen wachstumsfaktor |
GB9203533D0 (en) * | 1992-02-19 | 1992-04-08 | Erba Carlo Spa | Use of the conjugate between a fibroblast growth factor and a saporin in treating ocular pathologies |
US5814605A (en) * | 1993-03-26 | 1998-09-29 | Amgen Inc. | Therapeutic uses of keratinocyte growth factor |
JP3578761B2 (ja) * | 1993-03-26 | 2004-10-20 | アムジエン・インコーポレーテツド | 表皮ケラチン細胞成長因子の治療目的での使用 |
US7084119B2 (en) | 1993-06-29 | 2006-08-01 | Chiron Corporation | Truncated keratinocyte growth factor (KGF) having increased biological activity |
WO1995001434A1 (en) * | 1993-06-29 | 1995-01-12 | Chiron Corporation | A truncated keratinocyte growth factor (kgf) having increased biological activity |
US6268212B1 (en) | 1993-10-18 | 2001-07-31 | Amgen Inc. | Tissue specific transgene expression |
US6008328A (en) * | 1994-10-13 | 1999-12-28 | Amgen Inc. | Method for purifying keratinocyte growth factors |
IL147575A (en) * | 1994-10-13 | 2004-05-12 | Amgen Inc | Method for purifying keratinocyte growth factors |
CZ297329B6 (cs) * | 1994-10-13 | 2006-11-15 | Amgen Inc. | Analog nativního keratinocytového rustového faktoru kovalentne pripojený k polyethylenglykolu nebo príbuznému vodorozpustnému organickému polymeru, jeho pouzití a in vitro zpusob stimulace produkce nefibroblastových epithelových bunek |
CA2202390C (en) * | 1994-10-13 | 2005-05-17 | Bao-Lu Chen | Keratinocyte growth factor analogs |
US6818439B1 (en) | 1994-12-30 | 2004-11-16 | Chiron Corporation | Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders |
US6030613A (en) | 1995-01-17 | 2000-02-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
US6077692A (en) * | 1995-02-14 | 2000-06-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
US7232667B2 (en) | 1995-02-14 | 2007-06-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 polynucleotides |
US6693077B1 (en) | 1995-02-14 | 2004-02-17 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
EP1486565B1 (en) | 1995-10-11 | 2007-11-21 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Combination of PDGF, KGF, IGF, and IGFBP for wound healing |
US6692961B1 (en) | 1996-10-11 | 2004-02-17 | Invitrogen Corporation | Defined systems for epithelial cell culture and use thereof |
US20030144202A1 (en) * | 1996-10-15 | 2003-07-31 | Amgen Inc. | Uses of keratinocyte growth factor-2 |
US6743422B1 (en) | 1996-10-15 | 2004-06-01 | Amgen, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 products |
DE19716098A1 (de) * | 1997-04-17 | 1998-10-22 | Univ Ludwigs Albert | Fibroblasten mit einem Fremdgen enthaltende Zusammensetzung zur Behandlung von Wunden |
US6228839B1 (en) | 1997-12-19 | 2001-05-08 | Emory University | Use of keratinocyte growth factor to improve oxidative status |
CA2316015A1 (en) * | 1997-12-22 | 1999-07-01 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 formulations |
US6869927B1 (en) | 1997-12-22 | 2005-03-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 formulations |
KR20010040906A (ko) * | 1998-02-13 | 2001-05-15 | 휴먼 게놈 사이언시즈, 인크. | 각질세포 성장 인자-2의 치료학적 용도 |
US6335317B1 (en) | 1998-04-10 | 2002-01-01 | Emory University | Use of gut-trophic growth factors to improve oxidative status |
US5929051A (en) * | 1998-05-13 | 1999-07-27 | Carrington Laboratories, Inc. | Aloe pectins |
US7022683B1 (en) | 1998-05-13 | 2006-04-04 | Carrington Laboratories, Inc. | Pharmacological compositions comprising pectins having high molecular weights and low degrees of methoxylation |
US6313103B1 (en) | 1998-05-13 | 2001-11-06 | Carrington Laboratories, Inc. | Pectic substance as a growth factor stabilizer |
US6372494B1 (en) * | 1999-05-14 | 2002-04-16 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Methods of making conditioned cell culture medium compositions |
US6371984B1 (en) * | 1999-09-13 | 2002-04-16 | Keraplast Technologies, Ltd. | Implantable prosthetic or tissue expanding device |
US6783546B2 (en) | 1999-09-13 | 2004-08-31 | Keraplast Technologies, Ltd. | Implantable prosthetic or tissue expanding device |
US6395414B1 (en) | 2000-02-11 | 2002-05-28 | General Motors Corporation | Staged venting of fuel cell system during rapid shutdown |
US6376112B1 (en) | 2000-02-11 | 2002-04-23 | General Motors Corporation | Controlled shutdown of a fuel cell |
US6413662B1 (en) | 2000-02-22 | 2002-07-02 | General Motors Corporation | Fuel cell system shutdown with anode pressure control |
JP2001302691A (ja) * | 2000-04-17 | 2001-10-31 | Nichirei Corp | ヒトkgfに対する抗体 |
WO2002077155A2 (en) * | 2001-01-08 | 2002-10-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
PL362414A1 (en) | 2001-02-19 | 2004-11-02 | Merck Patent Gmbh | Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity |
US7494669B2 (en) | 2001-02-28 | 2009-02-24 | Carrington Laboratories, Inc. | Delivery of physiological agents with in-situ gels comprising anionic polysaccharides |
PL374269A1 (en) | 2001-08-21 | 2005-10-03 | Chiron Corporation | Kgf polypeptide compositions |
US7202066B2 (en) * | 2002-01-29 | 2007-04-10 | Carrington Laboratories, Inc. | Combination of a growth factor and a protease enzyme |
GB0206309D0 (en) * | 2002-03-16 | 2002-05-01 | Axordia Ltd | Isolated cells |
AU2003265612A1 (en) * | 2002-08-20 | 2004-03-11 | Curagen Corporation | Methods for diagnosing and treatment of conditions that alter phosphate transport in mammals |
PL1827483T3 (pl) | 2004-12-15 | 2014-12-31 | Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ | Formulacje terapeutyczne czynnika wzrostu keratynocytów |
WO2008005533A2 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Aaron Thomas Tabor | Compositions and methods for genetic modification of cells having cosmetic function to enhance cosmetic appearance |
BR112012000865A2 (pt) * | 2009-07-17 | 2019-09-24 | T Tabor Aaron | "composição e método para a modificação genética cosmética de células substancialmente intactas" |
US9682093B2 (en) | 2012-03-30 | 2017-06-20 | Charles R. Drew University Of Medicine And Science | Compositions and methods for treating or preventing metabolic syndrome disorders |
KR102277147B1 (ko) * | 2017-12-13 | 2021-07-13 | 건국대학교 산학협력단 | 섬유아 성장인자 유래 펩타이드의 골 또는 연골 분화 촉진 용도 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5096825A (en) * | 1983-01-12 | 1992-03-17 | Chiron Corporation | Gene for human epidermal growth factor and synthesis and expression thereof |
US4444760A (en) * | 1983-06-17 | 1984-04-24 | Merck & Co., Inc. | Purification and characterization of a protein fibroblast growth factor |
US4473679A (en) | 1983-12-12 | 1984-09-25 | Borg-Warner Chemicals, Inc. | Thermoplastic acrylic elastomers |
US4743679A (en) * | 1986-02-24 | 1988-05-10 | Creative Biomolecules, Inc. | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof |
US4868113A (en) | 1986-03-03 | 1989-09-19 | Rorer Biotechnology, Inc. | Recombinant DNA vector encoding human endothelial cell growth factor |
US4983679A (en) | 1986-05-29 | 1991-01-08 | E. I. Dupont De Nemours And Company | β-(keto or sulfonyl)esters from reaction of silylketene acetal and acyl or sulfonyl compound |
ES2017122A6 (es) | 1988-03-17 | 1991-01-01 | Nordisk Gentofte Ans | Procedimiento de preparacion de proteina de ligado de heparina. |
DE69033668T2 (de) | 1989-01-31 | 2001-04-12 | Jeffrey S Rubin | Dns kodierend für einen für epithelzellen spezifischen wachstumsfaktor |
WO1995001434A1 (en) * | 1993-06-29 | 1995-01-12 | Chiron Corporation | A truncated keratinocyte growth factor (kgf) having increased biological activity |
CZ297329B6 (cs) | 1994-10-13 | 2006-11-15 | Amgen Inc. | Analog nativního keratinocytového rustového faktoru kovalentne pripojený k polyethylenglykolu nebo príbuznému vodorozpustnému organickému polymeru, jeho pouzití a in vitro zpusob stimulace produkce nefibroblastových epithelových bunek |
-
1990
- 1990-01-30 DE DE69033668T patent/DE69033668T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-30 HU HU998/90A patent/HU218090B/hu unknown
- 1990-01-30 DK DK90903253T patent/DK0555205T3/da active
- 1990-01-30 AU AU50496/90A patent/AU647732B2/en not_active Expired
- 1990-01-30 EP EP00103140A patent/EP1016716A3/en not_active Withdrawn
- 1990-01-30 WO PCT/US1990/000418 patent/WO1990008771A1/en active IP Right Grant
- 1990-01-30 JP JP50341390A patent/JP3298874B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-30 AT AT90903253T patent/ATE197800T1/de active
- 1990-01-30 ES ES90903253T patent/ES2153816T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-30 RU SU5001740/13A patent/RU2250213C2/ru active
- 1990-01-30 GE GEAP1990983A patent/GEP20022681B/en unknown
- 1990-01-30 EP EP90903253A patent/EP0555205B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-30 SG SG1996008633A patent/SG46699A1/en unknown
- 1990-01-31 IE IE20020188A patent/IE20020188A1/en not_active Application Discontinuation
- 1990-09-29 KR KR90702202A patent/KR950012805B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-03-15 CA CA2349875A patent/CA2349875C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-15 CA CA002038398A patent/CA2038398C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-30 FI FI913637A patent/FI114711B/fi active
-
1992
- 1992-12-23 LV LVP-92-410A patent/LV10284B/xx unknown
-
1993
- 1993-06-21 LT LTIP667A patent/LT3472B/lt not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-06-28 AU AU65986/94A patent/AU684278B2/en not_active Expired
-
1995
- 1995-05-31 US US08/455,628 patent/US5665870A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-31 US US08/455,975 patent/US6833132B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-31 US US08/455,641 patent/US5707805A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-31 US US08/455,672 patent/US5741642A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-31 US US08/455,655 patent/US5654405A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-31 US US08/455,620 patent/US6420531B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/480,948 patent/US5731170A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/477,982 patent/US6709842B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-27 JP JP7341890A patent/JP2716416B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-16 NO NO972259A patent/NO308312B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-06-06 NO NO972617A patent/NO308310B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-10-22 JP JP09290175A patent/JP3088983B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-10-06 JP JP28551799A patent/JP3802292B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-10-11 JP JP2000311208A patent/JP3802329B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-03-06 JP JP2006060217A patent/JP2006149407A/ja not_active Withdrawn
- 2006-04-11 DE DE200612000021 patent/DE122006000021I1/de active Pending
- 2006-04-19 NL NL300230C patent/NL300230I2/nl unknown
- 2006-04-24 LU LU91237C patent/LU91237I2/fr unknown
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MOORE R. et al. Sequence, topography and protein coding potential of mouse int-2: a putative oncogene activated by mouse mammary tumour virus. EMBO J. 1986, v.5, n. 5, p.919-924. GOODRICH S.P. et al. The nucleotide sequence of rat heparin binding growth factor 1 (HBGF-1). Nucleic Acids Res, 1989, v. 17, n. 7, p. 286 F. * |
ЩЕЛКУНОВ С.Н. Конструирование гибридных молекул ДНК. – Новосибирск: Наука, 1987, с.164. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2458069C2 (ru) * | 2007-01-05 | 2012-08-10 | Хеликс Байомедикс Инк. | Выделенный пептид для усиления ранозаживляющей активности кератиноцитов, композиция для заживления ран у млекопитающего и лекарственное средство для применения при заживлении ран у млекопитающего |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2250213C2 (ru) | Выделенный белок фактора роста кератиноцита (kgf), рекомбинантная молекула днк, вектор, способ конструирования клетки-хозяина, способ получения белка, фармацевтическая композиция | |
CA2263890C (en) | Recombinant vascular endothelial cell growth factor d (vegf-d) | |
NL8900178A (nl) | Groei regulerende clycoproteinen. | |
US7026291B1 (en) | Epithelial cell specific growth factor, keratinocyte growth factor (KGF) | |
IE83398B1 (en) | DNA encoding a growth factor specific for epithelial cells | |
NO308309B1 (no) | FremgangsmÕte for fremstilling av et hovedsaklig rent keratinocyttvekstfaktor (KGF) protein |