KR102277147B1 - 섬유아 성장인자 유래 펩타이드의 골 또는 연골 분화 촉진 용도 - Google Patents

섬유아 성장인자 유래 펩타이드의 골 또는 연골 분화 촉진 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 섬유아 성장인자 유래 펩타이드의 골 분화 또는 연골 분화 촉진 용도에 대한 것으로, 섬유아 성장인자 유래 펩타이드들 중 특히 FP2는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 증식, 줄기능 및 세포 분열을 촉진하고, 이의 골분화 및 연골 분화를 현저히 촉진하는 효과가 있으므로, 이를 골 또는 연골 분화 촉진 용도 및 골 또는 연골 재생용도로 이용하여 세포 기반 조직 재생에 적용할 수 있다.

Description

섬유아 성장인자 유래 펩타이드의 골 또는 연골 분화 촉진 용도{USE OF PEPTIDES DERIVED FROM FIBROBLAST GROWTH FACTOR TO PROMOTE OSTEOGENIC OR CHONDROGENIC DIFFERENTIATION}
본 발명은 섬유아 성장인자 유래 펩타이드의 골 분화 또는 연골 분화 촉진 용도에 대한 것이다.
전세계적으로 인구의 고령화로 인해 가장 빈번하게 유발되는 퇴행성 질환인 골질환 및 연골 질환의 치료를 위한 다양한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 특별한 결합 조직인 뼈는 신체 골격 형성의 중요한 요소이나, 골절, 외상, 유전적 장애, 미생물 감염, 노화로 인한 마모로 인해 다양한 병적 상태에 빠지기 쉽다. 손상된 골 조직의 치료방법으로 자가 골 이식이 일차적으로 많이 사용되고 있다. 그러나 상기 방법은 이식된 부위와 원래 조직 사이에 틈이 남는 문제 등이 있어 완전한 치료 방법이라 하기 어려우며, 그나마 자가이식이 가능한 환자만을 대상으로 시행할 수 있어 보편적인 방법이 될 수 없다. 또한, 정상 골 부위를 희생하므로, 희생 부위에 새로운 통증이 생길 수 있는 등의 취약점이 있으며, 수술 후 통증, 골절, 출혈, 반흔을 비롯하여 재활이 더디게 이루어지는 등의 합병증이 발생할 수 있다. 한편, 타인의 골 이식도 사용되어 왔으나 공급에 제한이 있으며 전염병이 전달될 수 있는 단점이 있다. 연골 조직은 노화에 따라 연골 두께와 연골세포 수의 감소 이외에 기질의 구성 변화가 초래되며, 세포의 기능에도 변화가 유발된다. 또한, 특이하게 연골은 혈관, 신경 및 임파 조직이 없으므로 손상 후 스스로 재생이 불가능한 조직으로 알려져 있다. 이와 같은 질환들을 치료하기 위한 접근으로 외과적 간섭 (이식편 및 삽입물)이 뼈 조직 손실의 복구를 위해 주로 이용되고 있으나, 기증자 조직의 비 가용성, 기증자 이환율, 임플란트 비 호환성, 면역원성 반응 및 미생물 오염을 포함하는 단점을 나타낸다. 따라서, 뼈의 폐기 결함의 교정을 위한 줄기 세포 기반 치료의 응용이 최근에 이슈가 되고 있다. 또한, 연골 조직의 특성상 넓은 면적이 손상된 경우 자연 치유에 의한 조직 재생이 어렵기 때문에 인공관절, 관절연골 성형술, 미세천공술 등의 외과적 수술을 통한 치료가 이루어져 왔다. 하지만 기존의 방법은 절개로 인한 흉터가 남으며, 내구성이 떨어지는 섬유 연골로의 재생으로 어려운 시술방법에 비해 치료 효과가 떨어지는 문제점을 가지고 있다. 이에, 수술과정이 간편하고 빠른 치료효과를 내는 하이드로젤을 이용한 주사제로서, 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로젤을 이용한 관절내 투여용 주사액(대한민국 공개특허공보 제2013-0028012호), 콜라겐과 히알루론산이 포함된 연골조직 수복용 조성물(대한민국 등록특허공보 제1279812호), 클로드론산 및 히알루론산을 포함하는 골관절염 치료용약학적 제제(대한민국 공개특허공보 제2008-0082657호) 등이 개발되었다. 그러나 상기 방법은 일시적인 통증 감소는 줄 수 있지만, 연골 조직으로의 재생 유도에는 부족한 점이 있기 때문에 연골 조직의 분화를 도와주는 유효인자들이 필요한 실정이다.
이와 관련하여, 최근 생명공학분야의 발달로 줄기세포를 이용하여 조직 및 장기를 재생시켜 그 기능을 복원하기 위한 방법들이 시도되고 있다. 그 중, 인간 배아 줄기 세포와 인간 중간엽 줄기 세포의 골 형성 분화능이 보고되고 있으나, 인간 배아 줄기의 응용은 테라토마 형성, 윤리 문제, 면역 반응과 같은 장애물이 있어 왔다. 따라서, 중간엽 줄기 세포를 연골조직 재건(reconstruction) 또는 재생(regeneration)을 위한 세포치료제로서 사용하기 위해서는, 중간엽 줄기 세포를 높은 분화효율로 연골세포로 분화시키는 방법을 개발하는 것이 요구되고 있다.
줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되고, 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있는 특성이 있으며, 분화 자극에 따라 상이한 세포로도 분화될 수 있는 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다. 줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있다. 만능줄기세포(pluripotent stem cells)는 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 전분화능(pluripotency)의 세포이며, 일부 줄기세포는 다분화능 또는 단분화능의 잠재력을 지닌다. 상기 줄기세포들이 가지는 분화능을 기초로 세포 치료제로 이용 가능성이 있어 이와 관련된 연구 개발이 활발히 진행중이다. 하지만, 배아 줄기세포를 이용한 세포 치료제의 경우 윤리적 문제나 조직 적합성 불일치 문제가 제기되고 있으며, 역분화 줄기세포를 세포 치료제로 사용할 경우 종양 발생 가능성의 문제가 있다. 이에 따라, 분화능이 낮은 것으로 알려져 있지만 상대적으로 안전한 중간엽 줄기세포를 이용한 연구가 많이 진행되고 있다. 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSCs)는 성체 골수 등에 있는 multi-potential nonhematopoietic progenitor cell로서 지방, 연골, 뼈, 근육, 피부 등 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 이러한 중간엽 줄기세포를 이용하여 다양한 조직 재생을 위한 임상 연구가 진행되고 있으며, 장기이식 분야에도 적용가능성을 보이고 있다. 중간엽 줄기 세포 즉, 다능성 세포는 제한된 자가 재생 잠재능을 가지며, 이 세포는 골수, 지방 조직, 제대혈에서 분리할 수 있다. MSCs는 여러 문헌에서 골형성 부전증, 심근 경색, 폐손상 및 뇌 경색 등 손상된 조직의 재생에 유용하다고 보고된 바 있으며, 현재 여러 연구들에서 MSCs의 분화능 및 재생능을 이용하여 치료제로 사용하려는 시도가 이루어지고 있다 (Horwitz EM, et al. Blood 97:1227-31, 2001; Shake JG, et al . Ann Thorac Surg 73:1919-26, 2002; Rojas M, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 33:145-52, 2005; Li Y, et al Neurology 59:514-23, 2002).
현재 다양한 경로로 인해 발생하는 연골 손상 혹은 결손 환자의 연골 재생 및 수복을 위하여 성체줄기세포를 이용한 다양한 의공학적 접근방법들이 개발 중이다. 성체줄기세포는 배아줄기세포에 일반적으로 문제가 되는 암화나 윤리적인 문제를 극복할 수 있으며, 지방세포, 골아세포, 연골세포, 심장세포, 근육세포 및 신경세포 등의 다양한 세포로의 분화가 가능해 세포치료제의 세포원으로 주목을 받고 있다.
본 발명에서는 섬유아 성장인자 유래 펩타이드들이 중간엽 줄기세포의 골 분화 또는 연골 분화에 미치는 영향을 확인하고, 이를 골 분화 및 연골 분화 촉진 용도로 이용함으로써 골 형성 및 연골 형성의 촉진을 통한 세포 기반 조직 재생 분야에서 유용하게 이용하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 골 또는 연골 분화 촉진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 골 또는 연골 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 골 또는 연골 재생용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 골 또는 연골 재생용 지지체를 제공한다.
아울러, 본 발명은 중간엽 줄기세포의 골 분화 또는 연골 분화 촉진 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 섬유아 성장인자 유래 펩타이드들 중 특히 FP2는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 증식, 줄기능 및 세포 분열을 촉진하고, 이의 골분화 및 연골 분화를 현저히 촉진하는 효과가 있으므로, 이를 골 또는 연골 분화 촉진 용도 및 골 또는 연골 재생용도로 이용할 수 있으며, 세포 기반 조직 재생에 적용될 수 있다.
도 1은 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 (hWJ-MSC)를 분리 및 배양하는 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 형태학적 특징을 현미경으로 확인한 도이다.
도 3은 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 자가 재생 능력을 확인한 도이다.
도 4는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 세포 표면 마커 및 줄기세포능 마커의 발현을 RT-PCR로 확인한 도이다.
도 5는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 세포 표면 마커의 발현을 FACS 분석으로 확인한 도이다.
도 6은 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 골, 지방 및 연골로의 분화 능력을 염색을 통해 확인한 도이다.
도 7은 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 골, 지방 및 연골로의 분화 능력을 각각의 분화 특이적 유전자의 발현을 통해 확인한 도이다.
도 8은 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포에 대한 섬유아 성장인자2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 유래 펩타이드 FP1, FP2, FP3 또는 FP4의 증식 촉진 효과를 확인한 도이다.
도 9는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 세포 분열에 대한 섬유아 성장인자2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 유래 펩타이드 FP2 또는 FP4의 영향을 확인한 도이다.
도 10은 FGF2 유래 펩타이드 FP2 또는 FP4가 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 골 분화 및 연골 분화에 미치는 영향을 확인한 도이다.
이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
일 측면에서, 본 발명은 섬유아 성장인자2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 골 또는 연골 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, FGF2 유래 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인간 FGF2에서 유래된 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 hexafin2 (FP1), 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FP2(임의로 선택된 비정의 펩타이드), 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 canofin1 (FP3) 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 canofin3 (FP4)일 수 있으나, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FP2인 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, FGF2 유래 펩타이드는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 줄기세포능, 증식 및 세포 분열을 촉진할 수 있다.
일 구현예에서, 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포는 세포 표면 항원 CD19, CD34 및 CD45에 대해 음성의 면역학적 특성; 세포 표면 항원 CD 105, CD 90 및 CD 73에 대해 양성의 면역학적 특성; 및 미분화 줄기세포 표지 단백질인 Nanog, Oct4 및 Sox2에 대해 양성의 면역학적 특성을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포는 골, 지방 및 연골 계열로의 분화능을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 중간엽 줄기세포를 골세포 또는 연골 세포로 분화 촉진할 수 있으며, 중간엽 줄기세포는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 골분화시 골 분화 마커인 ALP 및 Osteocalcin의 발현이 증가되고, 연골분화시 연골 분화 마커인 Sox 및 Aggrecan의 발현이 증가될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 FGF2 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 골 또는 연골 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, FGF2 유래 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인간 FGF2에서 유래된 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 hexafin2 (FP1), 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FP2(임의로 선택된 비정의 펩타이드), 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 canofin1 (FP3) 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 canofin3 (FP4)일 수 있으나, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FP2인 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, 골질환은 성장기 발육부진, 골절, 구루병(rickets), 골연화증(osteomalacia), 척추측만증(scoliosis), 골반변형(pelvic deformity), 골다공증(osteoprosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 갑상선기능항진증(hyperparathyroidism), 파제트병(Paget disease) 또는 전이성 골암(metastatic bone cancers)일 수 있다.
일 구현예에서, 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 연골손상, 연골결손, 골절, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 본 발명의 조성물의 투여로 골 또는 연골의 손상; 골 또는 연골 관련 질환; 또는 이로 인한 증상을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
일 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 섬유아 성장인자2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 골 또는 연골 재생용 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, FGF2 유래 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인간 FGF2에서 유래된 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 hexafin2 (FP1), 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FP2(임의로 선택된 비정의 펩타이드), 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 canofin1 (FP3) 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 canofin3 (FP4)일 수 있으나, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FP2인 것이 가장 바람직하다.
일 측면에서, 본 발명은 FGF2 유래 펩타이드 위에 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포가 부착된 지지체 및 골분화 배지를 포함하는 골 재생용 지지체에 관한 것이다.
일 구현예에서, FGF2 유래 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인간 FGF2에서 유래된 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 hexafin2 (FP1), 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FP2(임의로 선택된 비정의 펩타이드), 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 canofin1 (FP3) 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 canofin3 (FP4)일 수 있으나, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FP2인 것이 가장 바람직하다.
일 측면에서, 본 발명은 FGF2 유래 펩타이드 위에 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포가 부착된 지지체 및 연골분화 배지를 포함하는 연골 재생용 지지체에 관한 것이다.
일 구현예에서, FGF2 유래 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인간 FGF2에서 유래된 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 hexafin2 (FP1), 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FP2(임의로 선택된 비정의 펩타이드), 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 canofin1 (FP3) 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 canofin3 (FP4)일 수 있으나, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FP2인 것이 가장 바람직하다.
일 측면에서, 본 발명은 골 재생층; 및 상기 골 재생층과 접합된 연골 재생층으로 구성되는 골-연골 재생용 복합 지지체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 골 재생층은 생분해성 고분자 또는 FGF2 유래 펩타이드가 코팅된 생분해성 고분자에서 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 골분화시킨 골세포일 수 있으며, 연골 재생층은 FGF2 유래 펩타이드 위에 부착된 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
상기 골 재생층은 조직 세포가 재료 표면에 유착하여 3차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있도록 기질 또는 틀의 역할을 충분히 해내야 하고 이식된 세포와 숙주 세포 사이에 위치하는 중간 장벽으로서의 역할도 할 수 있어야 한다. 또한, 이식 후 혈액 응고나 염증 반응이 일어나지 않는 무독성의 생체적합성을 가져야한다.
상기 생분해성 고분자는, 이식된 세포가 조직으로서 충분한 제 기능과 역할을 하고 원하는 시간이 지나면 생체 내에서 완전히 분해되어 없어질 수 있는 생분해성을 지녀야 하며, 생분해성을 가지는 것이라면 당업계에 공지된 다양한 생체 고분자를 포함한다. 바람직하게는 알기네이트, 히알루론산, 콜라겐, 겔라틴, 셀룰로오스 메틸 셀룰로오스, 키토산, 폴리락트산(poly(lactic acid)), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-coglycolic acid), PLGA), 폴리-(카프로락톤)(poly-carprolactone), 폴리안하이드리드(poly(anhydrides)), 폴리오르토에스테르 (polyorthoesters), 폴리비닐알코올(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜 (poly(ethyleneglycol)), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드 (poly (N-isopropyl acrylamide), 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드)공중합체 (poly(ethyleneoxide)-poly(propyleneoxide)-poly (ethyleneoxide) copolymer), 이들의 공중합체 군으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상을 사용할 수 있다. 현재까지는 PGA, PLA, PLGA 등만이 미국 식품의약청(FDA)으로부터 인체에 사용 가능한 생분해성 고분자로 승인되어 인체 조직의 체내 재생을 위한 고분자 지지체 재료로서 사용되고 있다.
일 측면에서, 본 발명은 섬유아 성장인자2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 유래 펩타이드를 지지체에 코팅하는 단계; 펩타이드가 코팅된 지지체에 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계; 및 골분화 배지를 처리하는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 골분화 촉진 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, FGF2 유래 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인간 FGF2에서 유래된 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 hexafin2 (FP1), 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FP2(임의로 선택된 비정의 펩타이드), 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 canofin1 (FP3) 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 canofin3 (FP4)일 수 있으나, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FP2인 것이 가장 바람직하다.
일 측면에서, 본 발명은 섬유아 성장인자2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 유래 펩타이드를 지지체에 코팅하는 단계; 펩타이드가 코팅된 지지체에 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계; 및 연골분화 배지를 처리하는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 연골분화 촉진 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, FGF2 유래 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인간 FGF2에서 유래된 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 hexafin2 (FP1), 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FP2(임의로 선택된 비정의 펩타이드), 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 canofin1 (FP3) 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 canofin3 (FP4)일 수 있으나, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FP2인 것이 가장 바람직하다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포 분리 및 배양
서울 대학교 병원에서 샘플을 채취하여 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포 (Human Wharton’Jelly Mesenchymal Stem Cell, hWJ-MSC)를 분리하였다. 구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 채취된 조직을 70% 에틸 알코올로 멸균한 후, PBS로 세척하였다. 세척된 조직을 핀셋을 사용하여 배양 용기로 조심히 옮기고 2 내지 3 cm 길이로 잘랐다. 각 조직은 수평으로 절단하여 혈관을 제거한 다음 다시 70% 에틸 알코올로 멸균하고 PBS로 세척하였다. 그 후, 조직을 배양 용기에 옮기고 가로 세로 1 내지 3 mm의 작은 조각으로 얇게 썰어 30분 동안 방치하여 용기 바닥에 강하게 부착시켰다. 그 후, 10% FBS(fetal bovine serum) (GE Healthcare Hyclone) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (100 U/mL penicillin/streptomycin) (GE Healthcare Hyclone)이 함유된 α-MEM(Alpha minimum essential medium)를 조직이 덮을 정도로 채우고, 5% CO2, 37℃의 조건에서 배양 2주 동안 배양하였다. 이 실험은 건국대학교 임상 시험 심사위원회(IRB, KUH 7001355-201705-BR181)의 규정에 따라 진행하였다.
실시예 2. 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 특성 확인
2-1. 형태학적 특징 확인
상기 실시예 1에서 분리한 인간 탯줄 조직을 2주 동안 배양한 후, 탯줄 조직 주변으로부터 유래 중간엽 줄기세포가 나온 것을 현미경으로 확인하였다. 관찰 결과, 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포는 섬유 아세포 세포와 유사하게 긴 방추체 형태를 가지고 있었다 (도 2).
2-2. 자가재생 능력 확인
상기 실시예 1에서 분리한 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 집락형성, 자가 증식 및 증식 능력을 확인하기 위해 군체 형성 능력 분석 (Colony-forming unit assay)을 수행하였다. 구체적으로, 저 밀도의 세포 수 (1 X 103)로 35mm2의 배양 용기(Corning)에 접종하여 기본 배지에서 14일간 배양하였다. 배양 14일 째, D-PBS로 2회 세척 후 메탄올에 준비된 0.3% 크리스탈 바이올렛(crystal violet) (Sigma-Aldrich)을 사용하여 실온에서 30분간 염색하였다. 염색 후 크리스탈 바이올렛을 제거하고 D-PBS와 증류수로 용기를 세척한 후 완전히 건조시켰다. 그 후, 형성된 콜로니 사진을 찍고, 세포 수가 50개 이하인 군체만 계수하였다.
그 결과, 인간 탯줄 조직으로부터 분리한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 자가 재생 능력을 나타내는 군체를 형성하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3).
2-3. 특이적 마커 확인
상기 실시예 1에서 분리한 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 세포 표면 마커 및 줄기세포능 마커의 발현을 확인하기 위하여 FACS 분석 및 RT-PCR 분석을 수행하였다. 구체적으로, RT-PCR 분석은, Labo Pass Kit, TRIzol (Cosmogenetech, Seoul, Korea)를 사용하여 사람 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA의 농도는 Nanodrop (ND1000) 분광 광도계(Nanodrop Technologies Inc., Wilmington DE, USA)로 측정하여 이들 RNA 2μg과 M-MLV 역전사효소 (Promega)를 사용하여 제조업체 방법에 따라 cDNA을 합성하였다. PCR 반응을 2 % 아가로스 젤로 확인하였다. cDNA와 표적 유전자인 세포 표면 마커인 CD19, CD34, CD45, CD73, CD90 및 CD105에 대한 프라이머 세트 (서열번호 6 내지 17) 및 줄기세포능 마커인 Nanog, SOX2 및 REX1에 대한 프라이머 세트 (서열번호 18 내지 23)를 SYBR Green 마스터 믹스 (Elpis Biotech, South Korea)의 제조업체 방법에 따라 섞은 후, Applied Biosystem 7500 실시간 PCR 시스템으로 측정하였다. 표적 유전자의 발현 정도는 GAPDH를 기준 값으로 이용하여 계산되었다.
표적유전자 명 프라이머 종류 서열 (5'->3') 서열번호
CD19 Forward CCT GGG GTC CCA GTC CTA TG 6
Reverse GCT CCA GAG GTT GGC ATC AT 7
CD34 Forward CAG CAA GAC AAC ACG TGG TG 8
Reverse CCC AAG AAC AGC CTC TGA GG 9
CD45 (PTPRC) Forward TCA GTG GTC CCA TTG TTG TG 10
Reverse GCA TCT CTG TGG CCT TAG CT 11
CD73 (NT5E) Forward TAT CCG GTC GCC CAT TGA TG 12
Reverse ACG CTA TGC TCA AAG GCC TT 13
CD90 (THY1) Forward GAG ATC CCA GAA CCA TGA ACC 14
Reverse TGC TGG TAT TCT CAT GGC G 15
CD105 (ENG) Forward CCA AGA CCG GGT CTC AAG AC 16
Reverse TGT ACC AGA GTG CAG CAG TG 17
Nanog Forward TCC TGA ACC TCA GCT ACA AAC 18
Reverse GCG TCA CAC CAT TGC TAT TC 19
SOX2 Forward CAT CAC CCA CAG CAA ATG AC 20
Reverse GAA GTC CAG GAT CTC TCT CAT AAA 21
REX1 Forward GTT TCG TGT GTC CCT TTC AAG 22
Reverse CTG TTA TCT GCT TCA TCC TGT TG 23
GAPDH Forward AAT CCC ATC ACC ATC TTC CAG 24
Reverse ATG ACC CTT TTG GCT CCC 25
그 결과, CD19, CD34 및 CD45가 음성 발현되고, CD 105, CD 90 및 CD 73 양성 발현되었으며, 줄기 마커인 Nanog, Oct4 및 Sox2가 양성 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4).
또한, FACS 분석을 위해, 배양 중인 세포를 트립신/EDTA를 이용하여 떼어내고, 1,500 rpm 으로 5분간 원심분리하여 세포를 수득하고 상층액을 제거한 후, FACS　완충액 (2% FBS가 포함된 D-PBS)으로 재부유하였다. 그 후, 항-CD73 항체, 항-CD90 항체, 항-CD105항체 및 항-CD45 항체를 각각 1:500으로 희석하여 세포에 200μl씩 첨가한 뒤 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 1차 반응시켰다. 그 후, D-PBS로 세척한 후 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 수득하고 상층액을 제거한 뒤 1:500으로 희석된 항체를 200μl씩 첨가하고 4℃에서 20분 동안 반응시켰다. 이 후, 염색된 세포를 FACS buffer 500μL에 부유하여 FACS 분석 (FACS Calibur; Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)을 수행하고, Cell Quest pro software를 이용하여 분석하였다.
그 결과, RT-PCR 분석 결과와 유사하게, CD73, CD105 및 CD90이 양성 발현하는 것을 알 수 있었으며, CD45가 음성 발현하는 것을 알 수 있었다 (도 5). 상기 결과를 통해, 분리한 hWJ-MSC가 MSC의 특성을 가짐을 알 수 있었다.
2-4. 다중 기관 분화능 확인
골, 지방 및 연골 계열로의 분화능을 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 분리한 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포를 24웰에 2x104 /well의 밀도로 부착시키고, 80 %의 밀도에 도달하였을 때, 분화를 시작하였다. 구체적으로, 골 형성 분화를 위해, Dulbecco’modified Eagle’medium (DMEM)-low glucose (Invitrogen, CA, USA)에 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 100nM 덱사메타손(dexamethasone) (Sigma- Aldrich, MO, USA), 50μg/ml ascorbate-2-phosphate (Sigma-Aldrich, MO, USA) 및 10mM β-glycerophosphate (Sigma-Aldrich, MO, USA) 을 첨가하였다. 상기 분화 배지는 2주 동안, 2일마다 교체하였으며, 분화가 끝난 시점에 세포를 4% 파라포름알데하이드로 15분간 고정한 후 멸균수로 세척하였다. 골 분화 검증은 Alizarin Red S 염색법을 사용하여 수행하였으며, 골 형성 분화 특이 유전자인 Runx2 및 BGLAP 발현을 PCR로 확인하였다 (서열번호 26 내지 29의 프라이머 사용). 또한, 지방 분화를 위해, DMEM-low glucose 에 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 500μM IBMX(isobutylmethylxanthine), 1μM 덱사메타손, 200μg/ml ascorpate-2-phosphate, 100μM 인도메타신(indomethacin) 및 10μg/ml 인슐린을 첨가하였다. 분화 배지는 2주 동안 3일마다 교체하였으며, 분화가 끝난 시점에 세포를 4% 파라포름알데하이드로 15분간 고정한 후 멸균수로 1차 세척하고, 60% 이소프로판올로 2차 세척하였다. 분화 검증은 이소프로판올 (wt/vol)로 희석된 5% Oil Red O를 사용하여 확인하였으며, 지방 분화 특이 유전자인 CEBPα 및 PPARγ의 발현을 PCR로도 확인하였다 (서열번호 30 내지 33의 프라이머 사용). 아울러, 연골 분화를 위해, DMEM-low glucose에 2% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 50 μg/mL ascorbate-2-posphate, 100μg/mL sodium pyruvate, 1% ITS-X(Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine) (Gibco), 100nM 덱사메타손, 40μg/mL L-프롤린 및 10ng/mL의 TGF-β3 (Prospec, East Brunswick, NJ, USA)를 첨가하였다. 상기 분화 배지는 2주 동안 2일마다 교체하였으며, 분화가 끝난 시점에 세포 4% 파라포름알데하이드로 15분간 고정한 후 멸균수로 세척하였다. 분화를 검증하기 위해 글리코사미노글리칸같은 산성 무코 다당류를 염색하는 Alcian blue 로 염색하였으며, PCR을 이용하여 연골 분화 특이 유전자인 aggrecan 및 Sox9의 발현을 확인하였다 (서열번호 34 내지 37의 프라이머 사용).
표적 유전자 프라이머 서열 (5'->3') 서열번호
Runx2 Forward GGT TCC AGC AGG TAG CTG AG 26
Reverse AGA CAC CAA ACT CCA CAG CC 27
BGLAP Forward CGC CTG GGT CTC TTC ACT AC 28
Reverse CTC ACA CTC CTC GCC CTA TT 29
CEBPA Forward GCC GGG AGA ACT CTA ACT CC 30
Reverse TCG ATG TAG GCG CTG ATG TC 31
PPARG Forward ATG ACA GCG ACT TGG CAA TA 32
Reverse GGC TTG TAG CAG GTT GTC TT 33
Aggrecan Forward CAC GAT GCC TTT CAC CAC GAC 34
Reverse TGC GGG TCA ACA GTG CCT ATC 35
SOX9 Forward TAA AGG CAA CTC GTA CCC AA 36
Reverse ATT CTC CAT CAT CCT CCA CG 37
hWJ-MSC의 다계열 분화 능력을 확인한 결과, 염색에서 골, 지방 및 연골로의 분화가 가능함을 알 수 있었으며 (도 6), 특이적 유전자의 발현을 통해서도 3 계열로의 분화능을 확인할 수 있었다 (도 7).
실시예 3. FGF2 유래 펩타이드의 hWJ-MSC 증식 촉진 확인
섬유아 성장인자인 FGF(fibroblast growth factor)2 (서열번호 2) 유래 펩타이드로 hexafin2 (FP1) (서열번호 3), 임의로 선택된 비정의 펩타이드 (FP2) (서열번호 1), canofin1 (FP3) (서열번호 4) 및 canofin3 (FP4) (서열번호 5)를 Amolifescience사에서 구입하여 사용하였다. 상기 FGF2 유래 펩타이드들 각각이 hWJ-MSC 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여, FGF2 유래 펩타이드 각각으로 코팅된 96웰 플레이트에 hWJ-MSC 세포를 부착한 후 Incucyte™ Zoom (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA)에 넣고, 5% CO2 37℃의 조건에서 2일 동안 배양하였으며, 3 시간마다 실시간으로 세포 증식값을 확인하고 세포 밀도 소프트웨어를 사용하여 증식율을 측정하였다.
그 결과, 처음 용기에 부착시켰을 때의 증식율은 FP2가 15%로 가장 높았고, FP1 및 FP3는 11%, 및 FP4는 8%로 나타났으며 대조군은 5%로 나타났다. 배양 2일째에는 FP2가 40%, FP1 및 FP3는 31%, 및 FP4는 28%로 나타났고 대조군은 22%였다 (도 8). 이를 통해, FP2가 다른 펩타이드들에 비해 현저하게 hWJ-MSC의 증식을 촉진하는 것을 알 수 있었다.
실시예 4. hWJ-MSC에 대한 FGF2 유래 펩타이드의 줄기능 및 세포 분열 촉진능 확인
상기 실시예 3에서 FP2가 hWJ-MSC의 증식을 가장 현저히 촉진하였고, FP4가 낮은 비율로 촉진하였기 때문에, 상기 두 펩타이드 처리에 따른 hWJ-MSC의 줄기능 마커 및 세포 분열 관련 유전자의 발현 정도를 상기 실시예 2-3의 RT-PCR과 동일한 방법으로 분석하였다. 구체적으로, 상기 표 1의 프라이머 세트들을 이용하여 줄기능 마커인 Nanog, Sox2 및 Rex1의 발현 정도와 하기 표 3의 프라이머 세트들을 이용하여 세포 분열 관련 유전자인 cyclin D1, Cyclin D2 및 Cyclin E의 발현 정도를 확인하였다.
표적 유전자 프라이머 서열 (5'->3') 서열번호
CCND1 Forward CAC ACG GAC TAC AGG GGA GT 38
Reverse ATG GTT TCC ACT TCG CAG CA 39
CCND2 Forward CAT CAC GCT GCA TCC CAT TG 40
Reverse AAA TTC CCC TGC CCT CTT GG 41
CCNE1 Forward GGG TAT CAG TGG TGC GAC AT 42
Reverse CAT GGC TTT CTT TGC TCG GG 43
그 결과, 줄기능 마커인 Nanog, Sox2 및 Rex1과 세포 분열 관련 유전자인 cyclin D1, Cyclin D2 및 Cyclin E의 발현이 FP4 보다 FP2에서 모두 높게 나타났다 (도 9). 이를 통해, FP2가 FP4보다 현저하게 hWJ-MSC의 줄기능 유지 및 세포 분열을 촉진하는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. hWJ-MSC에 대한 FGF2 유래 펩타이드의 분화능 확인
hWJ-MSC의 골 형성 및 연골 분화능에 대해 FP2 또는 FP4가 미치는 영향을 상기 실시예 2-4에서와 동일한 방법으로 분석하였다. 간략하게, FP2 또는 FP4가 코팅된 용기에서 hWJ-MSC을 골 또는 연골로 분화시킨 후, 각각 Alizarin Red S, Alcian blue 염색을 하고, 골 분화 마커인 ALP 및 Osteocalcin와 연골 분화 마커인 Sox 및 Aggrecan의 발현량을 하기 표 4에 기재된 프라이머들을 이용하여 RT-PCR 분석으로 정량적으로 비교하였다.
표적 유전자 프라이머 서열 (5'->3') 서열번호
ALP Forward CAA AGG CTT CTT CTT GCT GG 44
Reverse TGC GGG TCA ACA GTG CCT ATC 45
Osteocalcin Forward GAC TGT GAC GAG TTG GCT GA 46
Reverse GGA AGA GGA AAG AAG GGT GC 47
Aggrecan Forward CAC GAT GCC TTT CAC CAC GAC 34
Reverse TGC GGG TCA ACA GTG CCT ATC 35
SOX9 Forward TAA AGG CAA CTC GTA CCC AA 36
Reverse ATT CTC CAT CAT CCT CCA CG 37
그 결과, FP2가 FP4 보다 많은 세포를 염색하여 골 형성 및 연골 분화가 현저함을 알 수 있었으며 (도 10A), 골형성 초기 마커인 ALP 및 말기 마커인 Osteocalcin가 FP2를 이용해 분화한 세포에서 FP4에 비해 현저히 높게 발현된 것을 확인할 수 있었고 (도 10B), 연골 초기 마커인 Sox 및 말기 마커인 Aggrecan이 FP2를 이용해 분화한 세포에서 FP4에 비해 현저히 높게 발현된 것을 확인할 수 있었다 (도 10C). 이를 통해, FP2가 FP4보다 hWJ-MSC의 골 형성 및 연골 분화를 현저히 촉진하는 것을 알 수 있었다.
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Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala 130 135 140 Lys Ser 145 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 Forward primer <400> 6 cctggggtcc cagtcctatg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 Reverse primer <400> 7 gctccagagg ttggcatcat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD34 Forward primer <400> 8 cagcaagaca acacgtggtg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD34 Reverse primer <400> 9 cccaagaaca gcctctgagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD45 Forward primer <400> 10 tcagtggtcc cattgttgtg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD45 Reverse primer <400> 11 gcatctctgt ggccttagct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD73 Forward primer <400> 12 tatccggtcg cccattgatg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD73 Reverse primer <400> 13 acgctatgct caaaggcctt 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD90 Forward primer <400> 14 gagatcccag aaccatgaac c 21 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD90 Reverse primer <400> 15 tgctggtatt ctcatggcg 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD105 Forward primer <400> 16 ccaagaccgg gtctcaagac 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD105 Reverse primer <400> 17 tgtaccagag tgcagcagtg 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog Forward primer <400> 18 tcctgaacct cagctacaaa c 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog Reverse primer <400> 19 gcgtcacacc attgctattc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 Forward primer <400> 20 catcacccac agcaaatgac 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 Reverse primer <400> 21 gaagtccagg atctctctca taaa 24 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REX1 Forward primer <400> 22 gtttcgtgtg tccctttcaa g 21 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REX1 Reverse primer <400> 23 ctgttatctg cttcatcctg ttg 23 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward primer <400> 24 aatcccatca ccatcttcca g 21 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse primer <400> 25 atgacccttt tggctccc 18 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Runx2 Forward primer <400> 26 ggttccagca ggtagctgag 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Runx2 Reverse primer <400> 27 agacaccaaa ctccacagcc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BGLAP Forward primer <400> 28 cgcctgggtc tcttcactac 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BGLAP Reverse primer <400> 29 ctcacactcc tcgccctatt 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEBPA Forward primer <400> 30 gccgggagaa ctctaactcc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEBPA Reverse primer <400> 31 tcgatgtagg cgctgatgtc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARG Forward primer <400> 32 atgacagcga cttggcaata 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARG Reverse primer <400> 33 ggcttgtagc aggttgtctt 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aggrecan Forward primer <400> 34 cacgatgcct ttcaccacga c 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aggrecan Reverse primer <400> 35 tgcgggtcaa cagtgcctat c 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9 Forward primer <400> 36 taaaggcaac tcgtacccaa 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9 Reverse primer <400> 37 attctccatc atcctccacg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCND1 Forward primer <400> 38 cacacggact acaggggagt 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCND1 Reverse primer <400> 39 atggtttcca cttcgcagca 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCND2 Forward primer <400> 40 catcacgctg catcccattg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCND2 Reverse primer <400> 41 aaattcccct gccctcttgg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCNE1 Forward primer <400> 42 gggtatcagt ggtgcgacat 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCNE1 Reverse primer <400> 43 catggctttc tttgctcggg 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP Forward primer <400> 44 caaaggcttc ttcttgctgg 20 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP Reverse primer <400> 45 tgcgggtcaa cagtgcctat c 21 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Osteocalcin Forward primer <400> 46 gactgtgacg agttggctga 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Osteocalcin Reverse primer <400> 47 ggaagaggaa agaagggtgc 20

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 섬유아세포 성장인자2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 유래 펩타이드인 FP2를 유효성분으로 함유하는, 골 분화 촉진용 조성물로서,
    상기 조성물은 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 골 분화를 촉진 시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포는 CD19, CD34 및 CD45가 음성 발현되고, CD 105, CD 90, CD 73, Nanog, Oct4 및 Sox2가 양성 발현되는, 골 분화 촉진용 조성물.
  3. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 섬유아세포 성장인자2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 유래 펩타이드인 FP2를 유효성분으로 함유하는, 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 조성물은 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 골 분화를 촉진 시키는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 골 질환은 성장기 발육부진, 골절, 구루병(rickets), 골연화증(osteomalacia), 척추측만증(scoliosis), 골반변형(pelvic deformity), 골다공증(osteoprosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 갑상선기능항진증(hyperparathyroidism), 파제트병(Paget disease) 및 전이성 골암(metastatic bone cancers)으로 이루어진 군에서 선택된 골 질환인, 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 섬유아세포 성장인자2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 유래 펩타이드인 FP2를 유효성분으로 함유하는, 골 재생용 약학적 조성물로서,
    상기 조성물은 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 골 분화를 촉진 시키는 것을 특징으로 하는 골 재생용 약학적 조성물.
  6. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, FGF2 유래 펩타이드인 FP2에 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포가 부착된 지지체 및 골분화 배지를 포함하는 골 재생용 지지체로서,
    상기 지지체는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 골 분화를 촉진 시키는 것을 특징으로 하는 지지체.
  7. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, FGF2 유래 펩타이드인 FP2를 용기에 코팅하는 단계;
    펩타이드가 코팅된 용기에 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계; 및
    골분화 배지를 처리하는 단계를 포함하는, 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 골 분화 촉진 방법.
  8. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 섬유아세포 성장인자2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 유래 펩타이드인 FP2를 유효성분으로 함유하는, 연골 분화 촉진용 조성물로서,
    상기 조성물은 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 연골 분화를 촉진 시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포는 CD19, CD34 및 CD45가 음성 발현되고, CD 105, CD 90, CD 73, Nanog, Oct4 및 Sox2가 양성 발현되는, 연골 분화 촉진용 조성물.
  10. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 섬유아세포 성장인자2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 유래 펩타이드인 FP2를 유효성분으로 함유하는, 연골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 조성물은 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 연골 분화를 촉진 시키는 것을 특징으로 하는 연골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 연골 질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 연골손상, 연골결손, 골절, 골절의 불유합 및 골절에 의한 관절손상으로 이루어진 군에서 선택된 연골 질환인, 연골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 섬유아세포 성장인자2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 유래 펩타이드인 FP2를 유효성분으로 함유하는, 연골 재생용 약학적 조성물로서,
    상기 조성물은 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 연골 분화를 촉진 시키는 것을 특징으로 하는 연골 재생용 약학적 조성물.
  13. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, FGF2 유래 펩타이드인 FP2에 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포가 부착된 지지체 및 연골분화 배지를 포함하는 연골 재생용 지지체로서,
    상기 지지체는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 연골 분화를 촉진 시키는 것을 특징으로 하는 지지체.
  14. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, FGF2 유래 펩타이드인 FP2를 용기에 코팅하는 단계;
    펩타이드가 코팅된 용기에 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계; 및
    연골분화 배지를 처리하는 단계를 포함하는, 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 연골 분화 촉진 방법.
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