KR20140015129A - 성장 인자 재표적화된 엔도펩티다아제를 사용하여 암을 치료하는 방법 - Google Patents

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KR20140015129A
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패튼 이. 가라이
야니라 몰리나
딘 지. 스타싸키스
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케이 로져 아오키
에스터 페르난데즈-살라스
테렌스 제이. 헌트
산지브 간샤니
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Abstract

본 명세서는 TVEMP, 그와 같은 TVEMP를 포함하는 조성물 및 그와 같은 TVEMP 조성물을 사용하여 포유동물의 암을 치료하는 방법을 개시한다.

Description

성장 인자 재표적화된 엔도펩티다아제를 사용하여 암을 치료하는 방법 {Methods of Treating Cancer Using Growth Factor Retargeted Endopeptidases}
본 특허출원은 35 미국C.§ 119(e)에 따라 미국 가특허출원 시리즈 번호 61/233,947 (2009년 8월 14일 출원)에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원은 그 전체가 참고로 통합되어 있다.
암은 세포군이 제어되지 않는 성장(정상 한계를 벗어난 세포 분열)을 나타내는 100여개를 초과하는 질환군이다. 대부분의 경우에 있어서, 암 세포는 종양이라고 불리는 세포 덩어리를 형성하지만, 백혈병과 같은 일부 암에서는 세포가 종양을 형성하지 않는다. 종양은 전이성 또는 양성일 수 있다. 게다가 전이성 종양(또는 암)은 비정상적 유전 물질을 갖는 세포를 포함하며, 통상 급격한 제어되지 않는 세포 성장을 하여 인접 조직을 침습하고 파괴하며, 때때로 림프 또는 혈액을 통해 신체 내의 다른 위치로 퍼진다(즉 전이). 신체에 걸친 암 세포의 침습 및 전이가 중단되지 않는 경우 암 세포가 필수 기관을 침습하여 기관의 기능 장애 및 종국적으로 사망을 일으킬 것이므로, 암은 고빈도의 사망률에 연관된다. 암의 전이성 특성은 통상 느리게 자라고 스스로 제한되며 침습 또는 전이하지 않아서 일반적으로 생명을 위협하지 않는 양성 종양과 구별된다. 국소, 지역 또는 원거리 단계에서의 암은 침습성인 것으로 간주된다. 원 위치 암으로 불리는 매우 적은 세포층에서만 발견되는 조기 암은 비침습성인 것으로 간주된다.
암은 이들의 원인 및 생리가 크게 다른 다양한 질환군이다. 암은 단독으로 또는 조합으로 작용하는 다양한 요인에 의해 야기된다. 일부 암은 담배, 식이, 특정 화학물질, 방사선 및 바이러스와 같은 외인성 요인에 의해 야기된다. 다른 암은 호르몬, 면역 상태, 및 유전된 유전적 돌연변이와 같은 내인성 요인에 의해 야기된다. 통상 암을 일으키는 요인으로의 노출과 질환의 검출 사이에는 10년 이상이 소요된다.
암은 일반적으로 종양과 닮은 세포 유형, 따라서 종양의 기원으로 추정되는 조직에 의해 분류된다. 암종은 상피 세포에서 유래하는 전이성 종양이다. 이 군이 일반적인 형태의 유방암, 전립선암, 폐암 및 결장암을 포함하는 가장 일반적인 암을 나타낸다. 육종은 연결 조직, 또는 간엽 세포에서 유래하는 전이성 종양이다. 모세포종은 통상 미성숙 또는 태아 조직과 닮은 전이성 종양이다. 이들 종양의 다수는 어린이에서 가장 일반적이다. 림프종 및 백혈병은 조혈(혈액-형성) 세포에서 유래하는 전이암이다. 마지막으로 배엽 세포 종양은 전능 세포에서 유래하는 종양이다. 성인에서는 정소 및 난소에서 가장 자주 발견되며; 태아, 유아 및 영아에서는 신체 중심선, 특히 꼬리뼈 말단에서 가장 자주 발견된다.
암은 1998년에 1,228,600건의 신규 사례와 564,800건의 사망례를 가진 미국에서 2번째로 높은 사망 원인이다. 지난 50년간, 흡연으로 인한 폐암 사망률의 큰 증가를 주원인으로 하여 암으로 인한 사망률은 계속 증가해 왔다. 암은 전 연령 계층에서 발생하지만, 그 발생률은 45세 초과 인구에서 크게 증가한다. 그러나 암은 35 내지 65세 인구에 대해 미국 내의 주요 사망 원인이며, 또한 15세 미만 미국 어린이 가운데 비사고 사망의 주요 원인이기도 하다. 남성이 여성 보다 암으로 인한 사망률이 높고, 흑인이 주요 인종군 가운데 가장 높은 암 사망률을 갖는다. 미국에서, 남성은 일생 중 약 1/2의 암 발생 위험성을 가지며 여성은 일생 중 약 1/3의 위험성을 갖는다. 심장병 및 뇌졸중으로 인한 사망의 지속되는 감소를 예상컨대, 암이 2010년쯤에는 전체 미국인 인구의 전체적으로 가장 높은 사망 원인이 될 것이다.
암의 진단에는 통상 병리학자에 의한 조직 생검 표본의 조직학적 검사가 필요하지만, 전이성의 최초 표시는 증상 또는 방사선 이미지의 비정상성일 수 있다. 일단 진단되면, 암은 보통 수술, 화학치료법, 방사선치료법, 또는 면역치료법, 호르몬 치료법, 또는 혈관신생 저해제 치료법과 같은 표적화 치료법으로 치료한다. 치료법의 선택은 종양의 위치 및 등급 그리고 질환 단계 뿐만 아니라 환자의 일반 상태(수행 상태)에 의존한다. 또한 암의 유형 및 단계에 따라, 2개 이상의 암 치료 유형을 동시에 조합하거나 또는 차례로 이용할 수 있다. 신체의 나머지에 손상 없는 암의 전체적 제거가 치료 목표임에도, 암을 치료하는 현재의 접근법은 제한된 성공만을 거두고 있다. 수술에 관해, 이는 부분적으로 개별 또는 소수의 암 세포가 인접 조직을 침습하거나 다른 분위로 전이하여 국소 수술 치료의 유효성을 제한하는 경향성에 기인한다. 화학치료법 및 방사선치료법의 유효성은 종종 신체 내 정상 조직의 손상 또는 독성에 의해 제한된다. 이들의 이름에서 시사되는 바와 같이 표적화 치료법을 기대할 수 있으나, 이들 치료는 통상 하나의 특정 암 유형에 특이적이다. 따라서 모든 암 세포를 이들의 위치와 무관하게 표적화할 수 있는 화합물 및 방법이 암 치료를 위해 매우 바람직할 것이다. 또한 현재 표적화 치료법이 없는 특정 유형의 암을 표적화할 수 있는 화합물 및 방법이 또한 매우 바람직할 것이다.
클로스트리듐의 독소, 예컨대 보툴리늄 신경독소(BoNT), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F 및 BoNT/G, 및 테타누스 신경독소(TeNT)의 신경신호 전달을 저해하는 능력은 광범위한 치료 및 화장 용도로 개발되었다(예로 William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of BOTULINUM Toxin(Slack, Inc., 2004)을 참고하라). 약제학적 조성물로 시판되는 클로스트리듐의 독소에는 BoNT/A 제조물, 예컨대 BOTOX?(Allergan, Inc., Irvine, CA), DYSPORT?/RELOXIN?(Beaufour Ipsen, Porton Down, England), NEURONOX?(Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, South Korea), BTX-A(Lanzhou Institute Biological Products, China) 및 XEOMIN?(Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Germany); 및 BoNT/B 제조물, 예컨대 MYOBLOC™/NEUROBLOC™(Solstice Neurosciences, Inc. San Francisco, CA)이 포함된다. 예로서, BOTOX?는 현재 하기 적응증들에 대해 하나 이상의 국가에서 허가되어 있다: 이완불능, 성인성 강직, 항문 열창, 요통, 안검연축, 이갈기, 경부근 긴장이상증, 본태떨림, 미간선 또는 운동과다 안면선, 두통, 반얼굴연축, 방광의 과다활동, 다한증, 소아 뇌성마비, 다발성 경화증, 근클로누스 장애, 비순선, 연축발성 장애, 사시 및 VII 신경 장애.
클로스트리듐 독소 처리는 신경전달물질을 시냅스 틈새 내로 분비하는데 이용되는 세포외 배출 절차를 손상시켜 신경전달물질 방출을 저해한다. 이 손상은 궁극적으로 세포외 배출 절차에 필수적인 SNARE 단백질을 절단하는 효소 도메인을 포함하는 클로스트리듐 독소 경쇄의 세포내 전달로 달성된다. 약학 산업에서는 클로스트리듐 독소 치료법의 용도를 그 현재의 근이완제 용도를 넘어서 다른 병, 예컨대 다양한 종류의 만성 통증, 신경성 염증 및 비뇨생식기 장애와 같은 감각 신경 기반 병 뿐만 아니라 비-신경 기반 장애, 예컨대 췌장염 및 암의 치료로 확대하기를 강력히 희망하고 있다. 클로스트리듐 독소-기반 치료법을 확대하려고 현재 개발 중인 하나의 접근법에는 개질 독소가 비-클로스트리듐 독소 표적 세포에 대해 변형된 세포 표적화능을 갖도록 하는 클로스트리듐 독소의 개질이 관여된다. 이러한 재-표적화 역량은 클로스트리듐 독소의 천연 생성 표적화 도메인을 비-클로스트리듐 독소 표적 세포에 존재하는 비-클로스트리듐 독소 수용체에 대해 선택적 결합 활성을 나타내는 표적화 도메인으로 대체하여 달성된다. 표적화 도메인에 대한 상기 개질은 비-클로스트리듐 독소 표적 세포에 존재하는 비-클로스트리듐 독소 수용체(표적 수용체)에 선택적으로 결합할 수 있는(재-표적화) 개질 독소를 만들어 낸다. 비-클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 표적화 활성을 갖는 개질 클로스트리듐 독소는 비-클로스트리듐 독소 표적 세포에 존재하는 수용체에 결합하여, 세포질 내로 전위하고, 비-클로스트리듐 독소 표적 세포의 SNARE 복합체에 그 단백분해 효과를 발휘할 수 있다. 본질적으로 효소 도메인을 포함하는 클로스트리듐 독소 경쇄는 적절한 표적화 도메인을 선택함으로써 임의의 원하는 세포로 세포내 전달된다.
본 명세서는 표적화 소포성 세포외 배출 조정 단백질(TVEMP)로 불리는 비-클로스트리듐 독소 수용체로 재표적화된 일군의 개질 클로스트리듐 독소, TVEMP를 포함하는 조성물, 및 암을 겪는 개인의 치료 방법을 개시한다. TVEMP는 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 및 전위 도메인, 그리고 표적화 도메인을 포함하는 재조합적으로 제조되는 단백질이다. 표적화는 관심 표적 암 세포 상에 존재하는 수용체에 결합하는 그 능력에 대해 선택된다. 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 및 효소 도메인은 그 인지체 SNARE 기질을 절단하는 표적 세포의 세포질 내로 효소 도메인을 전달하는 작용을 한다. SNARE 단백질 절단은 세포내 소포 중에 함유된 물질이 소포막과 외부 세포막의 융합에 의해 세포로부터 방출되는 세포성 분비 또는 배출 절차인 세포외 배출을 손상시킨다. 이 손상은 세포-표면 수용체 및 신호 전달 단백질을 포함하는 막통과 단백질의 삽입; 세포외 기질 단백질의 세포외 공간 내로의 수송; 성장 인자, 혈관신생 인자, 신경전달물질, 호르몬 분비 및 세포성 커뮤니케이션에 관여하는 임의의 다른 분자를 포함하는 단백질의 분비; 및 노폐물, 대사체, 및 기타 원치 않거나 해로운 분자의 방출을 비제한적으로 포함하는 세포의 여러 본질적 절차를 예방한다. 이와 같이, 세포외 배출 손상은 세포성 대사 및 궁극적으로는 세포 생활성에 심각한 영향을 미친다. 따라서 세포의 세포외 배출을 감소시키거나 저해하는 치료 분자는 세포의 생존력을 감소시킨다. 이러한 전제에 근거하여, 본 명세서에 개시된 TVEMP는 암 세포를 표적화하도록 고안되며, 여기서 효소 도메인의 후속 전위가 SNARE 단백질 절단에 의해 세포외 배출을 손상시켜 암 세포의 생존력을 감소시킨다.
따라서 본 발명의 측면에서는 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 및 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 포함하는 TVEMP를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물의 개발에 유용한 TVEMP는 예로 [Steward, L.E. 등, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non - Clostridial Toxin Target Cells, 미국 특허 출원 번호 11/776,075(2007.07.11.); Dolly, J.O. 등, Activatable Clostridial Toxins, 미국 특허 출원 번호 11/829,475(2007.07.27.); Foster, K.A. 등, Fusion Proteins, 국제 특허 공보 WO 2006/059093(2006.06.08.); 및 Foster, K.A. 등, Non-Cytotoxic Protein Conjugates, 국제 특허 공보 WO 2006/059105(2006.06.08.)]에 기재되어 있으며, 그 각각의 전문이 참조로 도입된다. TVEMP를 포함하는 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 TVEMP에 부가하여, 약제학적 담체, 약제학적 성분, 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서는 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 및 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 포함하는 TVEMP를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류에서의 암 치료 방법을 제공하며, 여기서 조성물의 투여는 암에 연관된 증상을 감소시킨다. 예로 [Steward, 상기(2007); Dolly, 상기(2007); Foster, 상기, WO 2006/059093(2006); 및 Foster, 상기, WO 2006/059105(2006.06.08.)]에 개시된 것들을 포함하여 본 명세서에 개시된 임의 TVEMP를 사용할 수 있음이 계획된다. 개시된 방법은 암 치료를 위해 안전하고 저렴한 외래 환자 기반 치료를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서는 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 TVEMP를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류에서의 암 치료 방법을 제공하며, 여기서 상기 조성물의 투여는 암에 관련된 증상을 감소시킨다. 예로 [Steward, 상기(2007); Dolly, 상기(2007); Foster, 상기, WO 2006/059093(2006); 및 Foster, 상기, WO 2006/059105(2006.06.08.)]에 개시된 것들을 포함하여 본 명세서에 개시된 임의 TVEMP를 사용할 수 있음이 계획된다.
본 발명의 또 다른 측면에서는 이를 필요로 하는 포유류에서의 암 치료용 약제 제조에서의 TVEMP의 용도를 제공하며, 여기서 TVEMP는 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인, 및 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 포함하고, 포유류에 대한 치료적 유효량의 약제 투여는 암에 관련된 증상을 감소시킨다. 예로 [Steward, 상기(2007); Dolly, 상기(2007); Foster, 상기, WO 2006/059093(2006); 및 Foster, 상기, WO 2006/059105(2006.06.08.)]에 개시된 것들을 포함하여 본 명세서에 개시된 임의 TVEMP를 사용할 수 있음이 계획된다.
본 발명의 또 다른 측면에서는 치료적 유효량의 TVEMP를 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 포유류에서의 암 치료에서의 TVEMP의 용도를 제공하며, 여기서 TVEMP는 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인, 및 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 포함하고, TVEMP의 투여는 암에 관련된 증상을 감소시킨다. 예로 [Steward, 상기(2007); Dolly, 상기(2007); Foster, 상기, WO 2006/059093(2006); 및 Foster, 상기, WO 2006/059105(2006.06.08.)]에 개시된 것들을 포함하여 본 명세서에 개시된 임의 TVEMP를 사용할 수 있음이 계획된다.
도 1은 중추 및 말초 신경에서 신경전달물질 방출 및 클로스트리듐 독소 중독의 현재 패러다임의 모식도를 나타낸다. 도 1a는 중추 및 말초 신경의 신경전달물질 방출 기전에 대한 모식도를 나타낸다. 방출 절차는 두 단계를 포함하는 것으로 설명할 수 있다: 1) 소포 결합(여기서, 신경전달물질 분자를 함유하는 소포의 소포-결합 SNARE 단백질이 형질막에 위치하는 막-결합 SNARE 단백질에 연합된다); 및 2) 신경전달물질 방출(여기서, 상기 소포가 형질막과 융합하고 신경전달물질 분자가 세포외 배출된다). 도 1b는 중추 및 말초 신경에서의 테타누스 및 보툴리늄 독소 활성을 위한 중독 기전의 모식도를 나타낸다. 이 중독 절차는 4 단계를 포함하는 것으로 설명할 수 있다: 1) 수용체 결합(여기서, 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐의 수용체 시스템에 결합하여 중독 절차가 개시된다); 2) 복합체 내부화(여기서 독소 결합 후, 독소/수용체 시스템 복합체를 함유하는 소포가 세포 내로 세포내 섭취된다); 3) 경쇄 전위(여기서, 예로 소포의 내부 pH 변화, 클로스트리듐 독소 중쇄의 HN 도메인을 포함하는 채널 개구의 형성, 중쇄로부터 클로스트리듐 독소의 경쇄 분리, 및 활성 경쇄의 방출을 포함하는 여러 사건이 일어나는 것으로 생각된다) 및 4) 효소적 표적 개질(여기서, 클로스트리듐 독소의 경쇄 활성화는 그 표적 SNARE 기질, 예컨대 SNAP-25, VAMP 또는 신택신을 단백분해적으로 절단하여 소포 결합 및 신경전달물질 방출을 방지한다).
도 2는 천연 생성 클로스트리듐의 독소의 도메인 구성을 나타낸다. 단쇄 형태는 효소 도메인, 전위 도메인, 및 표적화 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 선형 구성을 나타낸다. 전위 및 효소 도메인 사이에 위치하는 이중쇄 루프 영역은 이중 SS 각괄호로 나타낸다. 이 영역은 천연 생성 프로테아제, 예컨대 환경 중에 생성된 천연 생성 프로테아제 또는 내인성 클로스트리듐 독소 프로테아제로의 단백분해 절단 시 독소의 단쇄 형태를 이중쇄 형태로 전환시키는 내인성 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 단쇄 형태 위에, 클로스트리듐 독소 결합 도메인의 HCC 영역을 나타낸다. 이 영역은 α-주름, β4/β5 헤어핀 회전체, β-주름, β8/β9 헤어핀 회전체 및 γ주름의 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 선형 구성을 포함하는 β트레포일 도메인을 포함한다.
도 3은 아미노 말단에 위치한 표적화 도메인을 갖는 TVEMP를 나타낸다. 도 3a는 표적화 도메인, 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위(P)를 포함하는 이중쇄 루프 영역, 및 효소 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단의 선형 구성을 갖는 TVEMP의 단쇄 폴리펩타이드 형태를 나타낸다. P 프로테아제로의 단백분해 절단 시, 독소의 단쇄 형태는 이중쇄 형태로 전환된다. 도 3b는 표적화 도메인, 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위(P)를 포함하는 이중쇄 루프 영역, 및 전위 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단의 선형 구성을 갖는 TVEMP의 단일 폴리펩타이드 형태를 나타낸다. P 프로테아제로의 단백분해 절단 시, 독소의 단쇄 형태는 이중쇄 형태로 전환된다.
도 4는 다른 두 도메인 사이에 위치한 표적화 도메인을 갖는 TVEMP를 나타낸다. 도 4a는 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위(P)를 포함하는 이중쇄 루프 영역, 표적화 도메인 및 전위 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단의 선형 구성을 갖는 TVEMP의 단일 폴리펩타이드 형태를 나타낸다. P 프로테아제로의 단백분해 절단 시, 독소의 단쇄 형태는 이중쇄 형태로 전환된다. 도 4b는 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위(P)를 포함하는 이중쇄 루프 영역, 표적화 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단의 선형 구성을 갖는 TVEMP의 단일 폴리펩타이드 형태를 나타낸다. P 프로테아제로의 단백분해 절단 시, 독소의 단쇄 형태는 이중쇄 형태로 전환된다. 도 4c는 효소 도메인, 표적화 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위(P)를 포함하는 이중쇄 루프 영역, 및 전위 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단의 선형 구성을 갖는 TVEMP의 단일 폴리펩타이드 형태를 나타낸다. P 프로테아제로의 단백분해 절단 시, 독소의 단쇄 형태는 이중쇄 형태로 전환된다. 도 4d는 전위 도메인, 표적화 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위(P)를 포함하는 이중쇄 루프 영역, 및 효소 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단의 선형 구성을 갖는 TVEMP의 단일 폴리펩타이드 형태를 나타낸다. P 프로테아제로의 단백분해 절단 시, 독소의 단쇄 형태는 이중쇄 형태로 전환된다.
도 5는 카르복실 말단에 위치한 표적화 도메인을 갖는 TVEMP를 나타낸다. 도 5a는 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위(P)를 포함하는 이중쇄 루프 영역, 전위 도메인 및 표적화 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단의 선형 구성을 갖는 TVEMP의 단일 폴리펩타이드 형태를 나타낸다. P 프로테아제로의 단백분해 절단 시, 독소의 단쇄 형태는 이중쇄 형태로 전환된다. 도 5b는 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위(P)를 포함하는 이중쇄 루프 영역, 효소 도메인 및 표적화 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단의 선형 구성을 갖는 TVEMP의 단일 폴리펩타이드 형태를 나타낸다. P 프로테아제로의 단백분해 절단 시, 독소의 단쇄 형태는 이중쇄 형태로 전환된다.
상세한 설명
암은 포유류 신체에서 세포의 제어되지 않는 성장을 나타내며, 이에 따라 신체가 세포 성장을 조절하기 위해 이용하는 조절 기전에 영향을 미치는 근본적 질환이다. 정상 세포가 암 세포로 전환되기 위해서는 세포 성장 및 분화를 조절하는 유전자가 변형되어야 한다. 유전적 변화는 전체 염색체의 획득 또는 소실로부터 단일 DNA 뉴클레오티드에 영향을 미치는 돌연변이에 이르기까지 여러 수준에서 일어날 수 있다. 매우 다양한 암 세포 유전형은 전이성 성장을 총체적으로 지시하는 세포 생리에서의 6가지 본질적 변형의 발현이다: 1) 성장 신호의 자가 충분성; 2) 성장-저해(성장억제) 신호에 대한 불감성; 3) 프로그램화 세포사(아폽토시스)의 회피; 4) 무제한 복제능; 5) 지속되는 혈관신생; 및 6) 조직 침습 및 전이. [Hanahan 및 Weinberg, The Hallmarks of Cancer, Cell 100(1): 57-70(2000)].
암 세포가 성장 신호에 자가 충분성을 나타내는 하나의 방법은 종양유전자의 발현에 의한 것이다. 종양유전자는 부적절하게 고수준으로 발현되는 정상 유전자일 수도 있고, 또는 신규한 특성을 가진 변형 유전자일 수도 있다. 어느 경우에도, 이들 유전자의 발현은 다양한 방식을 통해 암 세포가 나타내는 세포 성장의 전이성 표현형을 촉진한다. 다수가 유사 분열을 권장하는 호르몬과 같은 세포 간 분비 인자를 생성할 수 있으며, 그 효과는 수용 조직 또는 세포의 신호 전달에 근거한다. 따라서 수용 세포 상의 호르몬 수용체가 자극되면, 세포 표면으로부터 세포 핵으로 핵 수준에서 유전자 전사 조절에 일부 변화를 일으키는 신호가 전달된다. 일부 종양유전자는 신호 전달계 자체의 일부, 또는 세포 및 조직 내 신호 수용체 자체이어서, 상기 호르몬에 대한 감수성을 조절한다. 종양유전자는 종종 유사분열물질을 생성하거나 단백질 합성에서의 DNA 전사에 관여되며, 이는 세포가 이용하고 상호작용하는 산물 및 생화학물질을 생성하는데 관여하는 단백질 및 효소를 생성한다. 정상적으로는 종양유전자의 정지 대응물인 원-종양유전자의 돌연변이는 이들의 발현 및 기능을 변형하여 산물 단백질의 양 또는 활성을 증가시킬 수 있다. 이것이 일어나면 원-종양유전자가 종양유전자가 되고, 이 전이가 세포 내 세포 주기 조절의 정상 균형을 망가트려 제어되지 않는 성장이 가능하게 만든다. 게놈으로부터 원-종양유전자의 제거에 의해 암이 될 확률을 감소시키는 것은 이것이 가능한 경우에도 이들이 개체의 성장, 보수 및 항상성에 있어서 결정적이기 때문에 불가능하다. 성장을 위한 신호가 과다해지는 것은 이들이 돌연변이되는 경우일 때만이다. 따라서, 암 세포에서 세포 성장 신호를 저해하는 치료 전략은 종양유전자 발현으로 인해 성장 신호에 자가 충분성을 나타내는 암의 치료에 강력한 도구를 제공할 수 있다. 또한 여러 암 세포는 성장 인자 수용체 및 이들 수용체를 활성화하는 리간드(자가분비 루프)를 발현한다. 정상 조직에 있어서는, 한 유형의 세포가 성장 인자 수용체를 발현하고 또 다른 유형이 리간드를 발현하여(주변분비 루프) 항상성을 유지하는 역할을 한다. 암 세포는 리간드 및 수용체를 발현함으로써 성장을 위한 자가 충분성을 획득한다.
암 세포가 성장 저해(성장억제) 신호에 불감성을 나타내는 하나의 방법은 종양 억제제 유전자의 발현 저해에 의한 것이다. 종양 억제제 유전자는 암 세포의 세포 분열, 생존, 또는 다른 특성을 저해하는 유전자이다. 종양 억제제 유전자는 종종 암이 촉진하는 유전적 변화에 의해 불능화된다. 전형적으로 정상 세포가 암 세포로 전환되는 데에는 여러 유전자의 변화가 필요하다. 일반적으로 종양 억제제는 세포성 스트레스 또는 DNA 손상에 의해 활성화되는 전사 인자이다. 종종 DNA 손상은 자유로이 떠도는 유전 물질 뿐만 아니라 다른 신호의 존재 하에 야기될 것이며, 종양 억제제 유전자의 활성화를 일으키는 효소 및 경로를 촉진할 것이다. 상기 유전자의 기능은 DNA를 보수하기 위해 세포 주기의 진행을 정지시켜 돌연변이가 딸 세포로 전달되는 것을 방지하는 것이다. 따라서 암 세포에서 세포 분열 신호를 저해하는 치료 전략은 종양 억제제 유전자 발현의 억제로 인해 성장-저해 신호에 대해 불감성을 나타내는 암을 치료하는 강력한 도구를 제공할 수 있다.
암 세포가 프로그램화 세포사(아폽토시스)를 탈피하는 하나의 방법은 세포 생존 신호(항아폽토시스 신호)로의 연속 노출에 의한 것이다. 세포 생존 또는 세포사를 유도하는 신호는 형질막 내 센서(즉, 사멸 수용체)에 의해 그리고 세포의 건강을 감시하는 세포내 센서에 의하며, DNA 손상, 종양유전자 활동, 생존 인자 불충분 또는 저산소증과 같은 비정상의 검출에 반응하여 이들이 사멸 경로를 활성화한다. 따라서 암 세포는 이들이 DNA 손상, 활성화된 종양유전자, 또는 저산소증을 종양 중심에 가지게 됨에 따라 아폽토시스를 겪어야 한다. 일부 유형의 암 세포는 이들 세포에 존재하는 DNA 손상에 의해 유발되는 아폽토시스 신호에 역행하는 자가분비 루프에 의해 전달되는 생존 신호에 의존한다. 이들 자가분비 루프는 성장 인자 리간드 및 이들의 인지체 수용체의 발현을 통해 암 세포에 의해 구축된다. 따라서 암 세포에 의한 세포 생존 신호의 수용을 저해하는 치료 전략은 항아폽토시스 신호의 과활성화를 갖는 암을 치료하는 강력한 도구를 제공할 수 있다. 사실상, 문헌에는 호르몬 및/또는 성장 인자 제거가 생존 및 아폽토시스 신호 간의 균형을 복구함에 따라 암 세포에서 아폽토시스를 일으킬 수 있다는 증거가 제시되었다.
암 세포의 또 다른 획득 역량은 종양 세포의 무제한 복제능이다. 암 세포는 텔로미어를 침식하는 계속적 증식에서 야기되는 위기 상태를 회피하고 텔로미어의 완전성을 유지함으로써 증식의 제한을 극복한다. 암 세포는 텔로미어의 크기를 유지하고 무제한 복제능을 가능케 하는 효소 텔로머라아제를 과발현한다. 그러나 또 다른 중요 단계는 유사분열 절차를 종료하기 위해 막을 형질막으로 전달하는 능력이다.
세포가 종양 내에서 증식함에 따라, 이들은 아폽토시스를 유도할 산소 및 영양분의 공급 제한 등과 같은 다른 문제에 또한 직면하게 된다. 따라서 성장 및 증식을 지속할 수 있기 위해서는 종양이 기존 혈관 뿐만 아니라 성숙 조직에서 고도로 조절되는 절차인 새로운 혈관의 성장을 촉진해야 한다. 암 세포는 혈관신생촉진 인자를 분비하여 내피 세포 내의 수용체를 활성화한다. 또한 세포외 기질에 격리된 혈관신생촉진 인자가 종양 세포에 의해 분비되는 프로테아제가 수행하는 기질의 소화에 의해 방출될 수 있다. 혈관신생의 저해는 몇몇 허가된 약물이 암 및 다른 혈관신생촉진 질환을 위한 치료로 이 경로를 표적으로 삼음에 따라 실증된 치료 표적이다.
마지막으로, 종양 세포는 인접 조직을 침습하고 다른 부위로 전이하는 역량을 획득한다. 이를 달성하기 위해, 종양 세포는 먼저 부착 단백질 및 인테그린의 발현을 변형시켜 이들의 부착능을 변화시킬 수 있다. 보다 중요하게는 이동할 수 있도록 하기 위해 암 세포는 이들을 둘러싼 세포외 기질을 분해할 수 있어야 한다. 암 세포는 분비 인자로서 또는 막 부착 프로테아제로서 기질 분해 프로테아제를 과발현하며, 프로테아제 저해제의 발현을 하향조절한다.
제어되지 않는 세포 성장은 모든 암의 내재 원인이며, 이러한 제어되지 않는 세포 성장을 감소시키거나 예방할 수 있는 화합물 및 방법은 암 치료에 효과적일 것이다. 본 명세서는 암 세포가 나타내는 제어되지 않는 세포 성장을 감소시키거나 예방할 수 있는 화합물 및 방법을 개시한다. 신규한 재표적화된 엔도펩티다아제는 부분적으로 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 결합 도메인에 대한 인지체 수용체를 발현하는 특정 암 세포 유형으로 재표적화된 엔도펩티다아제를 보낸다. 효소 도메인의 엔도펩티다아제 활성은 적절한 표적 SNARE 단백질을 절단함으로써 수용체 및 막의 형질막으로의 전달 및 세포외 배출을 손상시킨다. 암 세포에서의 세포외 배출의 예방은 손상이 예로, 1) 암 세포가 유사 분열을 조장하는 분비 성장 인자의 방출을 예방하거나; 또는 2) 암 촉진 신호의 수신, 예컨대 성장 촉진 신호 또는 세포 생존 신호를 수신하는 암 세포의 능력을 방해할 암 세포의 형질막으로의 수용체 전달을 예방하거나(후자는 암 세포의 아폽토시스 쪽으로 균형을 변경시켜 암 세포를 제거하는데 유용할 것이다); 3) 막의 형질막으로의 전달을 예방하여 딸 세포를 생성하기 위한 막의 전체적 획득과 함께만 일어날 수 있는 유사분열 절차를 중단시키거나; 4) 종양 세포 또는 세포외 기질에 의해 혈관신생촉진 인자의 방출을 저해함으로써 혈관신생을 감소시키거나; 5) 프로테아제의 방출 저해에 의해 및 부착 단백질 및 인테그린의 스위치로 방해함으로써 침습 및 전이를 저해할 것이므로 치료적으로 유용하다.
따라서 현재 시장 내의 암 치료제가 한 번에 단 하나의 경로를 표적으로 하고, 이에 따라 부분적으로만 유효하며 암 세포가 치료에 대해 내성을 획득할 수 있는 반면, 세포외 배출, 수용체 전달, 및 막 전달의 저해에 의한 TEVMP-기반 치료법은 종양 세포에 더 강력한 펀치를 전달하는 단일 약물과 함께 여러 경로를 표적화하여 보다 효과적일 것이다. 또한 정상 세포는 증식하지 않고 생존 신호에 크게 의존하지 않으므로, 이들은 상기 치료법에 의해 영향받지 않는다.
본 발명의 측면에서는 부분적으로 TVEMP를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 "TVEMP"란 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 및 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 포함하는 임의 분자를 의미한다. 본 발명의 실시 측면에서 유용한 예시적인 TVEMP는 예로 [Steward, 상기, (2007); Dolly, 상기, (2007); Foster, 상기, WO 2006/059093(2006); Foster, 상기, WO 2006/059105(2006.06.08.)]에 개시된다.
클로스트리듐 독소는 각각 천연 생성 프로테아제에 의해 디술피드 루프 내에서 단백분해 절단에 의해 후속 절단되는 대략 150kDa의 단쇄 폴리펩타이드로 번역된다(도 1). 이 절단은 디술피드 가교를 형성하는 두 시스테인 잔기 사이에서 생성되는 별도의 이중쇄 루프 영역 내에서 일어난다. 상기 번역 후 처리로 두 사슬 간 단일 디술피드 결합 및 비-공유 상호작용에 의해 함께 유지되는 대략 50kDa의 경쇄(LC) 및 대략 100kDa의 중쇄(HC)를 포함하는 이중쇄 분자가 산출된다. 단쇄 분자를 이중쇄로 전환시키는데 사용되는 천연 생성 프로테아제는 현재 공지되어 있지 않다. 일부 혈청형, 예컨대 BoNT/A에 있어서, 천연 생성 프로테아제는 박테리아 혈청형에 의해 내인성으로 생성되며, 절단은 독소가 환경 내로 방출되기 전에 세포 내에서 일어난다. 그러나 다른 혈청형, 예컨대 BoNT/E에 있어서, 박테리아 균주는 독소의 단쇄 형태를 이중쇄 형태로 전환시킬 수 있는 내인성 프로테아제를 생성하지 않는 것으로 나타난다. 이러한 상황 하에서, 독소는 단쇄 독소로 방출되며, 이후 환경 중에서 발견되는 천연 생성 프로테아제에 의해 이중쇄 형태로 전환된다.
각각의 성숙 이중쇄 분자는 3개의 기능적으로 상이한 도메인을 포함한다: 1) 신경전달물질 방출 기구의 코어 성분을 특이적으로 표적화하는 아연 의존성 엔도펩티다아제 활성을 함유하는 메탈로프로테아제 영역을 포함하는 LC 내에 위치한 효소 도메인; 2) 표적 세포의 세포내 소포로부터 세포질 내로의 LC 방출을 촉진하는 HC의 아미노-말단 절반(HN) 내에 함유되는 전위 도메인; 및 3) 표적 세포의 표면에 위치하는 수용체 복합체에 대한 독소의 결합 활성 및 결합 특이성을 결정하는 HC의 카르복실-말단 절반(HC) 내에서 발견되는 결합 도메인[D. B. Lacy 및 R. C. Stevens, Sequence Homology and Structural Analysis of the Clostridial Neurotoxins, J. Mol. Biol. 291: 1091-1104 (1999)]. HC 도메인은 대략 동일한 크기이고 α-나선으로 구분되며 HCN 및 HCC 서브도메인으로 명명되는 두 개의 상이한 구조적 특징부를 포함한다. 표 1은 예시적인 클로스트리듐의 독소에서 발견되는 각각의 도메인 및 서브도메인에 대한 대략적 경계 영역을 나타낸다.
Figure pct00001

이들 세 기능적 도메인의 결합, 전위, 및 효소 활성이 모두 독성을 위해 필요하다. 이 절차의 모든 상세 내용이 아직 정확히 알려지지는 않았으나, 클로스트리듐 독소가 신경에 들어가서 신경전달물질 방출을 저해하는 전체적인 세포 중독 기전은 혈청형 또는 서브타입과 무관하게 유사하다. 본 출원인들이 하기 설명에 제한하려는 의도는 아니지만, 중독 기전은 적어도 4개 단계를 포함하는 것으로 설명할 수 있다: 1) 수용체 결합, 2) 복합체 내부화, 3) 경쇄 전위, 및 4) 효소적 표적 개질(도 3). 상기 절차는 클로스트리듐 독소의 HC 도메인이 표적 세포의 형질막 표면 상에 위치한 독소-특이적 수용체 시스템에 결합하는 경우 개시된다. 수용체 복합체의 결합 특이성은 부분적으로는 각각의 클로스트리듐 독소의 수용체 복합체를 상이하게 포함하는 것으로 나타나는 특정 조합의 갱글리오시드 및 단백질 수용체에 의해 달성될 것으로 생각된다. 일단 결합하면 독소/수용체 복합체는 세포내 섭취에 의해 내부화되며, 내부화된 소포가 특정 세포내 경로로 배열된다. 전위 단계는 소포 구획의 산성화에 의해 유발되는 것으로 나타난다. 상기 절차는 소수성을 증가시키고 독소의 이중쇄 형태 형성을 촉진하는 2가지 중요한 pH 의존적 구조 재배열을 개시하는 것으로 보인다. 활성화되면 독소의 경쇄 엔도펩티다아제가 세포내 소포로부터 신경전달물질 방출 기구의 3가지 공지된 코어 성분 중 하나를 특이적으로 표적화하는 것으로 나타나는 세포질 내로 방출된다. 이들 코어 단백질인 소포-연관 막 단백질(VAMP)/시냅토브레빈, 25kDa의 시냅토솜-연관 단백질(SNAP-25) 및 신택신은 신경 말단에서 시냅스의 소포 결합 및 융합을 위해 필요하며, 가용성 N -에틸말레이미드-민감성 인자-부착 단백질-수용체(SNARE) 패밀리 멤버를 이룬다. BoNT/A 및 BoNT/E는 SNAP-25를 카르복실-말단 영역에서 절단하여 각각 9개 및 26개 아미노산 절편을 방출하며, BoNT/C1은 또한 SNAP-25를 카르복실-말단 근처에서 절단한다. 보툴리늄 혈청형 BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F 및 BoNT/G, 및 테타누스 독소는 VAMP의 보존된 중심부에 작용하여, VAMP의 아미노-말단부를 세포질 내로 방출한다. BoNT/C1은 신택신을 세포질 막 표면 근처 단일 부위에서 절단한다. 시냅스 SNARE의 선택적 단백분해는 생체 내에서 클로스트리듐 독소에 의해 야기되는 신경전달물질 방출 차단을 설명해준다. 클로스트리듐 독소의 SNARE 단백질 표적은 다양한 비-신경 유형에서의 세포외 배출에 일반적이며; 이들 세포에서는 신경에서와 마찬가지로 경쇄 펩티다아제 활성이 세포외 배출을 저해한다. 예로 [Yann Humeau 등, How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton 등, Botulinum and Tetanus Neurotoxins : Structure , Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli 등, The Journey of Tetanus and Botulinum Neurooxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003)]를 참고하라.
본 명세서의 측면에서는 부분적으로 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 포함하는 TVEMP를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 "클로스트리듐 독소의 효소 도메인"이라는 용어는 중독 절차의 효소적 표적 개질 단계를 수행할 수 있는 임의의 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드를 나타낸다. 따라서 클로스트리듐 독소의 효소 도메인은 클로스트리듐 독소의 기질을 특이적으로 표적화하며 클로스트리듐 독소의 기질, 예컨대 SNAP-25 기질과 같은 SNARE 단백질, VAMP 기질, 및 신택신 기질의 단백분해 절단을 포함한다. 클로스트리듐 독소의 효소 도메인의 비제한적 예에는 예로 BoNT/A 효소 도메인, BoNT/B 효소 도메인, BoNT/C1 효소 도메인, BoNT/D 효소 도메인, BoNT/E 효소 도메인, BoNT/F 효소 도메인, BoNT/G 효소 도메인, TeNT 효소 도메인, BaNT 효소 도메인, 및 BuNT 효소 도메인이 포함된다.
클로스트리듐 독소의 효소 도메인에는 천연 생성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체, 예컨대 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 이소형 및 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 서브타입; 및 비천연 생성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체, 예컨대 보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체, 이들의 활성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 절편, 또는 이들의 임의 조합이 비제한적으로 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "클로스트리듐 독소 효소 도메인 변이체"는, 천연 생성 또는 비천연 생성이든지, 개시된 참조 서열 (표 1)의 상응하는 영역으로부터의 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며 참조 서열의 상응하는 영역에 대해 동일성 퍼센트로 기재될 수 있는 클로스트리듐 독소 효소 도메인을 의미한다. 명백히 지시되지 않으면, 개시된 구현예를 실시하는데 유용한 클로스트리듐 독소 효소 도메인 변이체는 인톡시케이션(intoxication) 공정의 효소 표적 변형 단계를 실행하는 변이체이다. 비제한적인 예로서, BoNT/A 효소 도메인 변이체는 서열번호: 1의 아미노산 1/2-429와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/B 효소 도메인 변이체는 서열번호: 6의 아미노산 1/2-436와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/C1 효소 도메인 변이체는 서열번호: 11의 아미노산 1/2-436와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/D 효소 도메인 변이체는 서열번호: 13의 아미노산 1/2-436와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/E 효소 도메인 변이체는 서열번호: 15의 아미노산 1/2-411와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/F 효소 도메인 변이체는 서열번호: 18의 아미노산 1/2-428와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/G 효소 도메인 변이체는 서열번호: 21의 아미노산 1/2-438와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; TeNT 효소 도메인 변이체는 서열번호: 22의 아미노산 1/2-438와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BaNT 효소 도메인 변이체는 서열번호: 23의 아미노산 1/2-420와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BuNT 효소 도메인 변이체는 서열번호: 24의 아미노산 1/2-411와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이다.
당해분야 숙련자는 클로스트리듐 독소의 각각의 혈청형 내에서 이들의 아미노산 서열 및 또한 이들 단백질을 인코딩하는 핵산이 일부 상이한 천연 생성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체가 존재할 수 있다는 것을 인지한다. 예를 들어 서열 번호: 1의 BoNT/A 효소 도메인에 비해 약 80% 내지 95% 아미노산 동질성을 나타내는 특정 효소 도메인 서브타입을 갖는 5개의 BoNT/A 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5가 현재 존재한다. 본 명세서에서 사용되는 "천연 생성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체"라는 용어는 대안적으로 스플라이스된 전사체로부터 생성된 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 이소형, 자발적 돌연변이에 의해 생성된 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 이소형 및 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 서브타입을 비제한적으로 포함하는, 천연 생성 절차에 의해 생성되는 임의의 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 나타낸다. 천연 생성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체는 천연 생성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체가 기준으로 하는 참조 클로스트리듐 독소의 효소 도메인과 실질적으로 동일한 방식으로 기능할 수 있으며, 본 명세서의 임의 측면에서 참조 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 대체할 수 있다.
천연 생성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체의 비제한적 예로는 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 이소형, 예컨대 BoNT/A 효소 도메인 이소형, BoNT/B 효소 도메인 이소형, BoNT/C1 효소 도메인 이소형, BoNT/D 효소 도메인 이소형, BoNT/E 효소 도메인 이소형, BoNT/F 효소 도메인 이소형, BoNT/G 효소 도메인 이소형, TeNT 효소 도메인 이소형, BaNT 효소 도메인 이소형, 및 BuNT 효소 도메인 이소형이 있다. 천연 생성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체의 또 다른 비제한적 예로는 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 서브타입, 예컨대 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 또는 BoNT/A5의 효소 도메인; 서브타입 BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/Bbv, 또는 BoNT/Bnp의 효소 도메인; 서브타입 BoNT/C1-1 또는 BoNT/C1-2의 효소 도메인; 서브타입 BoNT/E1, BoNT/E2 및 BoNT/E3의 효소 도메인; 서브타입 BoNT/F1, BoNT/F2, 또는 BoNT/F3의 효소 도메인; 및 서브타입 BuNT-1 또는 BuNT-2의 효소 도메인이 있다.
본 명세서에서 사용되는 "비천연 생성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체"라는 용어는 무작위 돌연변이화 또는 합리적 설계를 이용한 유전자 조작에 의해 제조되는 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 및 화학적 합성으로 제조되는 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 비제한적으로 포함하는 인간 조작의 도움으로 제조된 임의의 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 나타낸다. 비천연 생성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체의 비제한적 예에는 예로 보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 키메라성 변이체, 및 활성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 절편이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체"라는 용어는 참조 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 서열(표 1)의 원래 아미노산의 특성과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체로 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 나타낸다. 특성의 예에는 유사한 크기, 국소형태, 전하, 소수성, 친수성, 친유성, 공유-결합능, 수소-결합능, 물리화학적 특성 등이나 또는 이들의 임의 조합이 비제한적으로 포함된다. 보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체는 보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체가 기준으로 하는 참조 클로스트리듐 독소의 효소 도메인과 실질적으로 동일한 방식으로 기능할 수 있으며, 본 명세서의 임의 측면에서 참조 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 치환할 수 있다. 보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체의 비제한적 예에는 예로 보존적 BoNT/A 효소 도메인 변이체, 보존적 BoNT/B 효소 도메인 변이체, 보존적 BoNT/C1 효소 도메인 변이체, 보존적 BoNT/D 효소 도메인 변이체, 보존적 BoNT/E 효소 도메인 변이체, 보존적 BoNT/F 효소 도메인 변이체, 보존적 BoNT/G 효소 도메인 변이체, 보존적 TeNT 효소 도메인 변이체, 보존적 BaNT 효소 도메인 변이체, 및 보존적 BuNT 효소 도메인 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "비보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체"라는 용어는 다음과 같은 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 나타낸다: 1) 적어도 하나의 아미노산이 비-보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체가 기준으로 하는 참조 클로스트리듐 독소의 효소 도메인에서 결실되거나; 2) 적어도 하나의 아미노산이 비-보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인이 기준으로 하는 참조 클로스트리듐 독소의 효소 도메인에 부가되거나; 또는 3) 적어도 하나의 아미노산이 참조 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 서열(표 1)의 원래 아미노산의 특성과 유사한 임의 특성을 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체로 치환됨. 비-보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체가 기준으로 하는 참조 클로스트리듐 독소의 효소 도메인과 실질적으로 동일한 방식으로 기능할 수 있고, 본 명세서의 임의 측면에서 참조 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 치환할 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체의 비제한적 예에는 예로 비-보존적 BoNT/A 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/B 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/D 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/E 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/F 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/G 효소 도메인 변이체, 및 비-보존적 TeNT 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BaNT 효소 도메인 변이체, 및 비-보존적 BuNT 효소 도메인 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "활성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 절편"이라는 용어는 이들 효소 도메인 절편이 신경전달물질 방출 기구의 코어 성분을 특이적으로 표적화하여 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해하여 절단하는 전체적인 세포성 기전 수행에 참여할 수 있는 한, 본 명세서의 측면에서 유용할 수 있는 효소 도메인을 포함하는 임의의 다양한 클로스트리듐 독소의 절편을 나타낸다. 클로스트리듐 독소의 효소 도메인은 대략 420-460개 아미노산 길이이며 효소 도메인을 포함한다(표 1). 연구를 통해 클로스트리듐 독소의 효소 도메인의 전체 길이가 효소 도메인의 효소 활성에 필요한 것은 아니라는 것이 나타났다. 비제한적 예로서, BoNT/A 효소 도메인의 최초 8개 아미노산은 효소 활성을 위해 필요하지 않다. 또 다른 비제한적 예로서, TeNT 효소 도메인의 최초 8개 아미노산은 효소 활성을 위해 필요하지 않다. 마찬가지로 효소 도메인의 카르복실-말단은 활성을 위해 필요하지 않다. 비제한적 예로서, BoNT/A 효소 도메인의 마지막 32개 아미노산은 효소 활성을 위해 필요하지 않다. 또 다른 비제한적 예로서, TeNT 효소 도메인의 마지막 31개 아미노산은 효소 활성을 위해 필요하지 않다. 따라서 본 구현예의 측면에는 예로 적어도 350, 375, 400, 425, 또는 450개 아미노산 길이의 효소 도메인을 포함하는 클로스트리듐 독소의 효소 도메인이 포함된다. 본 구현예의 다른 측면에는 예로 최대 350, 375, 400, 425, 또는 450개 아미노산 길이의 효소 도메인을 포함하는 클로스트리듐 독소의 효소 도메인이 포함된다.
전반적 방법, 국소 방법 및 하이브리드 방법, 예컨대 절편 접근 방법을 비제한적으로 포함하는 임의의 다양한 서열 정렬 방법을 이용하여 동질성 백분율을 결정할 수 있다. 동질성 백분율을 결정하는 프로토콜은 당해분야 숙련자의 범위 내에서 및 본원의 교시로부터 일상적인 절차이다.
전반적 방법은 분자 시작부터 말단까지 서열을 정렬하고, 개별 잔기쌍의 스코어를 추가하고 갭 페널티를 적용하여 최적 정렬을 결정한다. 비제한적 방법에는 다음이 계획된다: 예로 CLUSTAL W, 예로 [Julie D. Thompson 등, CLUSTAL W: Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position - Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)] 참고; 및 반복적 정련, 예로 [Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)] 참고하라.
국소 방법은 모든 입력 서열이 공유하는 하나 이상의 보존된 모티브를 동정하여 서열을 정렬한다. 비제한적 방법에는 다음이 계획된다: 예로 매치박스, 예로 [Eric Depiereux 및 Ernest Feytmans, Match - Box : A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992)] 참고; 깁스 샘플링, 예로 [C. E. Lawrence 등, Detecting Subtle Sequence Signals : A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993)] 참고; 정렬-M, 예로 [Ivo Van Walle 등, Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics,:1428-1435 (2004)] 참고하라.
하이브리드 방법은 전반적 및 국소 정렬 방법 모두의 기능적 측면을 조합한다. 비제한적 방법에는 다음이 계획된다: 예로 절편-대-절편 비교, 예로 [Burkhard Morgenstern 등, Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based 0n Segment - To - Segment Comparison, 93(22) Proc. Natl. Acad. Sci. 미국A. 12098-12103(1996)] 참고; T-커피, 예로 [Ceedric Notredame 등, T- Coffee : A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment, 302(1) J. Mol. Biol. 205-217(2000)] 참고; MUSCLE, 예로 [Robert C. Edgar, MUSCLE : Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput, 32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797(2004)] 참고; 및 DIALIGN-T, 예로 [Amarendran R Subramanian 등, DIALIGN-T: An Improved Algorithm for Segment - Based Multiple Sequence Alignment, 6(1) BMC Bioinformatics 66(2005)] 참고하라.
본 명세서는 한 개의 아미노산이 또 다른 것으로 치환된 다양한 폴리펩타이드 변이체, 예컨대 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 변이체, 표적화 도메인 변이체, 및 프로테아제 절단 부위 변이체를 기재하고 있다. 치환은 다양한 요인, 예컨대 치환된 아미노산의 물리적 특성(표 2) 또는 원래 아미노산이 치환을 얼마나 관용할 수 있는지(표 3)에 의해 평가할 수 있다. 폴리펩타이드 내에서 또 다른 아미노산으로 치환할 수 있는 아미노산의 선택은 당업자에게 공지되어 있다.
Figure pct00002

Figure pct00003

따라서 일 구현예에서, 본 명세서에 개시된 TVEMP는 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 포함한다. 본 구현예의 한 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인은 천연 생성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체, 예컨대 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 이소형 또는 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 서브타입을 포함한다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인은 비천연 생성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체, 예컨대 보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 변이체, 활성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 절편, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인의 폴리펩타이드 사슬 내 하나의 특정 위치의 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 아미노산의 예에는 예로 C, F, I, L, M, V 및 W가 포함된다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인의 폴리펩타이드 사슬 내 하나의 특정 위치의 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 지방족 아미노산의 예에는 예로 A, I, L, P, 및 V가 포함된다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인의 폴리펩타이드 사슬 내 하나의 특정 위치의 방향족 아미노산은 또 다른 방향족 아미노산으로 치환될 수 있다. 방향족 아미노산의 예에는 예로 F, H, W 및 Y가 포함된다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인의 폴리펩타이드 사슬 내 하나의 특정 위치의 스태킹 아미노산은 또 다른 스태킹 아미노산으로 치환될 수 있다. 스태킹 아미노산의 예에는 예로 F, H, W 및 Y가 포함된다. 본 구현예의 추가적 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인의 폴리펩타이드 사슬 내 하나의 특정 위치의 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성 아미노산의 예에는 예로 D, E, K, N, Q, 및 R이 포함된다. 본 구현예의 추가적 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인의 폴리펩타이드 사슬 내 하나의 특정 위치의 극성이 더 적거나 중간적인 아미노산은 또 다른 극성이 더 적거나 중간적인 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성이 더 적거나 중간적인 아미노산의 예에는 예로 A, H, G, P, S, T, 및 Y가 포함된다. 본 구현예의 또 다른 추가적 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인의 폴리펩타이드 사슬 내 하나의 특정 위치의 양으로 하전된 아미노산은 또 다른 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 아미노산의 예에는 예로 K, R, 및 H가 포함된다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인의 폴리펩타이드 사슬 내 하나의 특정 위치의 음으로 하전된 아미노산은 또 다른 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산의 예에는 예로 D 및 E가 포함된다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인의 폴리펩타이드 사슬 내 하나의 특정 위치의 작은 크기의 아미노산은 또 다른 작은 크기의 아미노산으로 치환될 수 있다. 크기가 작은 아미노산의 예에는 예로 A, D, G, N, P, S, 및 T가 포함된다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인의 폴리펩타이드 사슬 내 하나의 특정 위치의 C-베타 분기형 아미노산은 또 다른 C-베타 분기형 아미노산으로 치환될 수 있다. C-베타 분기형 아미노산의 예에는 예로 I, T 및 V가 포함된다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 효소 도메인은 BoNT/A 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BoNT/A 효소 도메인은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/A 효소 도메인은 서열번호: 1의 아미노산 1/2-429를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 도메인은 천연 생성 BoNT/A 효소 도메인 변이체, 예를 들어, BoNT/A 아이소형으로부터의 효소 도메인 또는 BoNT/A 서브타입으로부터의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 도메인은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 천연 생성 BoNT/A 효소 도메인 변이체, 예를 들어, BoNT/A 아이소형 효소 도메인 또는 BoNT/A 서브타입 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 도메인은 서열번호: 1의 천연 생성 BoNT/A 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-429, 예를 들어, BoNT/A 아이소형 효소 도메인 또는 BoNT/A 서브타입 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 도메인은 비천연 생성 BoNT/A 효소 도메인 변이체, 예를 들어, 보존적 BoNT/A 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/A 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/A 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 도메인은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 비천연 생성 BoNT/A 효소 도메인 변이체의 효소 도메인, 예를 들어, 보존적 BoNT/A 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/A 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/A 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/A 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/A 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 1의 비천연 생성 BoNT/A 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-429를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/A 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 효소 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 효소 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 1의 아미노산 1/2-429에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 1의 아미노산 1/2-429에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/A 효소 도메인은, 예를 들어, 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 1의 아미노산 1/2-429에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 1의 아미노산 1/2-429에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 효소 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BoNT/A 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 1의 아미노산 1/2-429에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 1의 아미노산 1/2-429에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 효소 도메인은 BoNT/B 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BoNT/B 효소 도메인은 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/B 효소 도메인은 서열번호: 6의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 도메인은 천연 생성 BoNT/B 효소 도메인 변이체, 예를 들어, BoNT/B 아이소형으로부터의 효소 도메인 또는 BoNT/B 서브타입으로부터의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/B 아이소형 효소 도메인 또는 BoNT/B 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 천연 생성 BoNT/B 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/B 아이소형 효소 도메인 또는 BoNT/B 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 6의 천연 생성 BoNT/B 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/B 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/B 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BoNT/B 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/B 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/B 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 비천연 생성 BoNT/B 효소 도메인 변이체의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/B 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/B 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 6의 비천연 생성 BoNT/B 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/B 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 효소 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 효소 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 6의 아미노산 1/2-436에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 6의 아미노산 1/2-436에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/B 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 6의 아미노산 1/2-436에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 6의 아미노산 1/2-436에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 효소 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BoNT/B 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 6의 아미노산 1/2-436에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 6의 아미노산 1/2-436에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 효소 도메인은 BoNT/C1 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BoNT/C1 효소 도메인은 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 도메인은 서열번호: 11의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/C1 아이소형으로부터의 효소 도메인 또는 BoNT/C1 서브타입으로부터의 효소 도메인과 같은 천연 생성 BoNT/C1 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/C1 아이소형 효소 도메인 또는 BoNT/C1 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 천연 생성 BoNT/C1 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/C1 아이소형 효소 도메인 또는 BoNT/C1 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 11의 천연 생성 BoNT/C1 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/C1 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BoNT/C1 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/C1 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 비천연 생성 BoNT/C1 효소 도메인 변이체의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/C1 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 11의 비천연 생성 BoNT/C1 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 효소 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 효소 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 11의 아미노산 1/2-436에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 11의 아미노산 1/2-436에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 11의 아미노산 1/2-436에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 11의 아미노산 1/2-436에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 도메인은예를 들어, 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 효소 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 11의 아미노산 1/2-436에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 11의 아미노산 1/2-436에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 효소 도메인은 BoNT/D 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BoNT/D 효소 도메인은 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/D 효소 도메인은 서열번호: 13의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/D 아이소형으로부터의 효소 도메인 또는 BoNT/D 서브타입으로부터의 효소 도메인과 같은 천연 생성 BoNT/D 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/D 아이소형 효소 도메인 또는 BoNT/D 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 천연 생성 BoNT/D 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/D 아이소형 효소 도메인 또는 BoNT/D 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 13의 천연 생성 BoNT/D 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/D 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/D 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BoNT/D 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/D 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/D 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 비천연 생성 BoNT/D 효소 도메인 변이체의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/D 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/D 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 13의 비천연 생성 BoNT/D 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/D 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 효소 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 효소 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 13의 아미노산 1/2-436에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 13의 아미노산 1/2-436에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/D 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 13의 아미노산 1/2-436에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 13의 아미노산 1/2-436에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 효소 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BoNT/D 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 13의 아미노산 1/2-436에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 13의 아미노산 1/2-436에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 효소 도메인은 BoNT/E 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BoNT/E 효소 도메인은 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/E 효소 도메인은 서열번호: 15의 아미노산 1/2-411을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/E 아이소형으로부터의 효소 도메인 또는 BoNT/E 서브타입으로부터의 효소 도메인과 같은 천연 생성 BoNT/E 효소 도메인 변이체. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 도메인은, 예를 들어, BoNT/E 아이소형 효소 도메인 또는 BoNT/E 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 천연 생성 BoNT/E 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/E 아이소형 효소 도메인 또는 BoNT/E 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 15의 천연 생성 BoNT/E 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-411를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/E 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/E 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BoNT/E 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/E 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/E 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 비천연 생성 BoNT/E 효소 도메인 변이체의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/E 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/E 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 15의 비천연 생성 BoNT/E 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-411을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/E 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 효소 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 효소 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 15의 아미노산 1/2-411에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 15의 아미노산 1/2-411에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/E 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 15의 아미노산 1/2-411에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 15의 아미노산 1/2-411에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 효소 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BoNT/E 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 15의 아미노산 1/2-411에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 15의 아미노산 1/2-411에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 효소 도메인은 BoNT/F 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BoNT/F 효소 도메인은 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/F 효소 도메인은 서열번호: 18의 아미노산 1/2-428을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/F 아이소형으로부터의 효소 도메인 또는 BoNT/F 서브타입으로부터의 효소 도메인과 같은 천연 생성 BoNT/F 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/F 아이소형 효소 도메인 또는 BoNT/F 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 천연 생성 BoNT/F 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/F 아이소형 효소 도메인 또는 BoNT/F 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 18의 천연 생성 BoNT/F 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-428을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/F 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/F 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BoNT/F 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/F 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/F 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 비천연 생성 BoNT/F 효소 도메인 변이체의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/F 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/F 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 18의 비천연 생성 BoNT/F 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-428을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/F 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 효소 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 효소 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 18의 아미노산 1/2-428에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 18의 아미노산 1/2-428에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/F 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 18의 아미노산 1/2-428에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 18의 아미노산 1/2-428에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 효소 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BoNT/F 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 18의 아미노산 1/2-428에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 18의 아미노산 1/2-428에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 효소 도메인은 BoNT/G 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BoNT/G 효소 도메인은 서열번호: 21의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/G 효소 도메인은 서열번호: 21의 아미노산 1/2-4435을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/G 아이소형으로부터의 효소 도메인 또는 BoNT/G 서브타입으로부터의 효소 도메인과 같은 천연 생성 BoNT/G 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/G 아이소형 효소 도메인 또는 BoNT/G 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 21의 천연 생성 BoNT/G 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 도메인은 예를 들어, BoNT/G 아이소형 효소 도메인 또는 BoNT/G 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 21의 천연 생성 BoNT/G 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-4435를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/G 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/G 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BoNT/G 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/G 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/G 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 21의 비천연 생성 BoNT/G 효소 도메인 변이체의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/G 효소 도메인 변이체, 활성 BoNT/G 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 21의 비천연 생성 BoNT/G 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-4435를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/G 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 21의 효소 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 21의 효소 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 21의 아미노산 1/2-4435에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 21의 아미노산 1/2-4435에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/G 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 21의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 21의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 21의 아미노산 1/2-4435에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 21의 아미노산 1/2-4435에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 21의 효소 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 21의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BoNT/G 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 21의 아미노산 1/2-4435에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 21의 아미노산 1/2-4435에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 효소 도메인은 TeNT 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, TeNT 효소 도메인은 서열번호: 22의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, TeNT 효소 도메인은 서열번호: 22의 아미노산 1/2-438을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 도메인은 예를 들어, TeNT 아이소형으로부터의 효소 도메인 또는 TeNT으로부터의 효소 도메인 서브타입 과 같은 천연 생성 TeNT 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 도메인은 예를 들어, TeNT 아이소형 효소 도메인 또는 TeNT 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 22의 천연 생성 TeNT 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 도메인은 예를 들어, TeNT 아이소형 효소 도메인 또는 TeNT 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 22의 천연 생성 TeNT 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-438을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 TeNT 효소 도메인 변이체, 비-보존적 TeNT 효소 도메인 변이체, 활성 TeNT 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 TeNT 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 TeNT 효소 도메인 변이체, 비-보존적 TeNT 효소 도메인 변이체, 활성 TeNT 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 22의 비천연 생성 TeNT 효소 도메인 변이체의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 TeNT 효소 도메인 변이체, 비-보존적 TeNT 효소 도메인 변이체, 활성 TeNT 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 22의 비천연 생성 TeNT 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-438을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, TeNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 22의 효소 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 22의 효소 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 22의 아미노산 1/2-438에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 22의 아미노산 1/2-438에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, TeNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 22의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 22의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 22의 아미노산 1/2-438에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 22의 아미노산 1/2-438에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 22의 효소 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 22의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, TeNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 22의 아미노산 1/2-438에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 22의 아미노산 1/2-438에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 효소 도메인은 BaNT 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BaNT 효소 도메인은 서열번호: 23의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BaNT 효소 도메인은 서열번호: 23의 아미노산 1/2-420을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 도메인은 예를 들어, BaNT 아이소형으로부터의 효소 도메인 또는 BaNT 서브타입으로부터의 효소 도메인과 같은 천연 생성 BaNT 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 도메인은 예를 들어, BaNT 아이소형 효소 도메인 또는 BaNT 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 23의 천연 생성 BaNT 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 도메인은 예를 들어, BaNT 아이소형 효소 도메인 또는 BaNT 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 23의 천연 생성 BaNT 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-420을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BaNT 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BaNT 효소 도메인 변이체, 활성 BaNT 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BaNT 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BaNT 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BaNT 효소 도메인 변이체, 활성 BaNT 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 23의 비천연 생성 BaNT 효소 도메인 변이체의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BaNT 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BaNT 효소 도메인 변이체, 활성 BaNT 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 23의 비천연 생성 BaNT 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-420을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BaNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 23의 효소 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 23의 효소 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 23의 아미노산 1/2-420에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 23의 아미노산 1/2-420에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BaNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 23의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 23의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 23의 아미노산 1/2-420에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 23의 아미노산 1/2-420에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 23의 효소 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 23의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BaNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 23의 아미노산 1/2-420에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 23의 아미노산 1/2-420에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 효소 도메인은 BuNT 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BuNT 효소 도메인은 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BuNT 효소 도메인은 서열번호: 24의 아미노산 1/2-411을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 도메인은 예를 들어, BuNT 아이소형으로부터의 효소 도메인 또는 BuNT 서브타입으로부터의 효소 도메인과 같은 천연 생성 BuNT 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 도메인은 예를 들어, BuNT 아이소형 효소 도메인 또는 BuNT 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 천연 생성 BuNT 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 도메인은, 예를 들어, BuNT 아이소형 효소 도메인 또는 BuNT 서브타입 효소 도메인과 같은 서열번호: 24의 천연 생성 BuNT 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-411을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BuNT 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BuNT 효소 도메인 변이체, 활성 BuNT 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BuNT 효소 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BuNT 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BuNT 효소 도메인 변이체, 활성 BuNT 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 비천연 생성 BuNT 효소 도메인 변이체의 효소 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 도메인은 예를 들어, 보존적 BuNT 효소 도메인 변이체, 비-보존적 BuNT 효소 도메인 변이체, 활성 BuNT 효소 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 24의 비천연 생성 BuNT 효소 도메인 변이체의 아미노산 1/2-411를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BuNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 효소 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 효소 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 아미노산 1/2-411에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 아미노산 1/2-411에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BuNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 아미노산 1/2-411에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 아미노산 1/2-411에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 효소 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 효소 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BuNT 효소 도메인은 예를 들어, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 아미노산 1/2-411에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 아미노산 1/2-411에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
"전위 도메인"은 전위 활성을 갖는 클로스트리듐 신경독소 중쇄의 일부분이다. "전위"은 소포막을 통해 폴리펩타이드의 수송을 촉진하는 능력을 의미하고, 이로써 폴리펩타이드의 일부 또는 모두를 세포질에 노출하게된다. 다양한 보툴리늄에서 신경독소 전위는 엔도솜 내의 pH의 감소에 의해 야기되는 중쇄의 알로스테릭(allosteric) 구조 변화를 수행한다. 이러한 구조 변화는 중쇄의 N 말단 반을 수반하고, 그에 의해 매개되며 소포막에서의 기공의 형성으로 귀결되는 것으로 보이며; 이러한 변화는 엔도솜 소포 내로부터 세포질로 단백질 경쇄의 이동을 허용한다. 예를 들어, Lacy, 등, Nature Struct . Biol . 5:898-902 (October 1998) 참고하라.
보툴리늄 신경독소 중쇄의 전위 매개 부분의 아미노산 서열은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있고; 추가로, 전위 활성을 부여하는데 본질적인 것으로 공지된 상기 일부분 내의 아미노산 잔기는 또한 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어, 전위 도메인으로서 다양한 파상풍균(Clostridium tetanus) 또는 클로스트리듐(Clostridium) 보툴리늄 신경독소 서브타입 중 어떤 것의 중쇄의 천연 생성 N-말단 펩타이드 반을 이용하고, 또는 다양한 중쇄의 N-말단 반의 일차 서열을 정렬하고 다양한 중쇄 및 서열들 사이의 보존된 아미노산, 극성, 입체 및 소수성 특징을 기반으로 하는 공통 일차 전위 서열을 선택하여 유사 전위 도메인을 설계하는 것은 당해 분야의 숙련가의 능력 내에 있다.
본 발명의 측면은 부분적으로, 클로스트리듐 독소 전위 도메인을 포함하는 TVEMP을 제공한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "클로스트리듐 독소 전위 도메인"은 클로스트리듐 독소 경쇄 전위를 매개하는 인톡시케이션 공정의 전위 단계를 실행할 수 있는 임의의 클로스트리듐 독소 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, 클로스트리듐 독소 전위 도메인은 막을 관통하는 클로스트리듐 독소 경쇄의 운동을 촉진하고, 세포내 소포에서 세포질로의, 막을 통한 클로스트리듐 독소 경쇄의 운동을 포함한다. 클로스트리듐 독소 전위 도메인의 비제한적인 예는, 예를 들어, BoNT/A 전위 도메인, BoNT/B 전위 도메인, BoNT/C1 전위 도메인, BoNT/D 전위 도메인, BoNT/E 전위 도메인, BoNT/F 전위 도메인, BoNT/G 전위 도메인, TeNT 전위 도메인, BaNT 전위 도메인, 및 BuNT 전위 도메인을 포함한다.
클로스트리듐 독소 전위 도메인은, 비제한적으로, 예를 들어, 클로스트리듐 독소 전위 도메인 아이소형 및 클로스트리듐 독소 전위 도메인 서브타입; 비천연 생성 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체, 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체, 그의 활성 클로스트리듐 독소 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 천연 생성 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체"는, 천연 생성 또는 비천연 생성이든지, 개시된 참조 서열 (표 1)의 상응하는 영역으로부터의 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며 참조 서열의 상응하는 영역에 대한 동일성이 %로 기재될 수 있는 클로스트리듐 독소 전위 도메인을 의미한다. 명백히 지시되지 않으면, 개시된 구현예를 실시하는데 유용한 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체는 클로스트리듐 독소 경쇄 전위를 중개하는 인톡시케이션(intoxication) 공정의 전위 단계를 실행하는 변이체이다. 비제한적인 예로서, BoNT/A 전위 도메인 변이체는 서열번호: 1의 아미노산 455-873와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/B 전위 도메인 변이체는 서열번호: 6의 아미노산 447-860와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/C1 전위 도메인 변이체는 서열번호: 11의 아미노산 454-868과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/D 전위 도메인 변이체는 서열번호: 13의 아미노산 451-864와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/E 전위 도메인 변이체는 서열번호: 15의 아미노산 427-847와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/F 전위 도메인 변이체는 서열번호: 18의 아미노산 446-865와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/G 전위 도메인 변이체는 서열번호: 21의 아미노산 451-865와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; TeNT 전위 도메인 변이체는 서열번호: 22의 아미노산 468-881와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BaNT 전위 도메인 변이체는 서열번호: 23의 아미노산 436-857와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; 및 BuNT 전위 도메인 변이체는 서열번호: 24의 아미노산 427-847와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이다.
클로스트리듐 독소의 각 혈청형 내에, 아미노산 서열 및 및 또한 이들 단백질을 인코딩하는 핵산과 어느 정도 차이가 있는 천연 생성 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체가 있을 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련가에 의해 인식된다. 예를 들어, 현재 5개의 BoNT/A 서브타입, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5가 있고, 특정 전위 도메인 서브타입은, 서열번호: 1의 BoNT/A 전위 도메인 서브타입과 비교할 때, 약 85-87% 아미노산 동일성을 보여준다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "천연 생성 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체"는 천연 생성 공정으로부터 생성된 임의의 클로스트리듐 독소 전위 도메인을 의미하고, 이 도메인은 비제한적으로, 대안적으로 스플라이싱된 트랜스스크립트(transcript)로부터 생성된 클로스트리듐 독소 전위 도메인 아이소형, 자연발생 돌연변이에 의해 생성된 클로스트리듐 독소 전위 도메인 아이소형 및 클로스트리듐 독소 전위 도메인 서브타입을 포함한다. 천연 생성 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체는 천연 생성 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체가 기반으로 하는 참조 클로스트리듐 독소 전위 도메인과 동일한 방식으로 실질적으로 기능할 수 있고, 본 명세서의 임의 측면에서 참조 클로스트리듐 독소 전위 도메인으로 치환될 수 있다.
천연 생성 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체의 비제한적인 예는 예를 들어, BoNT/A 전위 도메인 아이소형, BoNT/B 전위 도메인 아이소형, BoNT/C1 전위 도메인 아이소형, BoNT/D 전위 도메인 아이소형, BoNT/E 전위 도메인 아이소형, BoNT/F 전위 도메인 아이소형, BoNT/G 전위 도메인 아이소형, TeNT 전위 도메인 아이소형, BaNT 전위 도메인 아이소형, 및 BuNT 전위 도메인 아이소형과 같은 클로스트리듐 독소 전위 도메인 아이소형이다. 천연 생성 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체의 다른 비제한적인 예는 예를 들어, 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5으로부터의 전위 도메인; 바이밸런트(bivalent) 서브타입 BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B 및 비단백 BoNT/B로부터의 전위 도메인; 서브타입 BoNT/C1-1 및 BoNT/C1-2; 서브타입 BoNT/E1, BoNT/E2 및 BoNT/E3으로부터의 전위 도메인; 서브타입 BoNT/F1, BoNT/F2, BoNT/F3으로부터의 전위 도메인; 및 서브타입 BuNT-1 및 BuNT-2로부터의 전위 도메인과 같은 클로스트리듐 독소 전위 도메인 서브타입이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "비천연 생성 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체"는 돌연변이유발 또는 합리적 설계를 사용하는 유전 공학에 의해 생성된 클로스트리듐 독소 전위 도메인 및 화학 합성에 의해 생성된 클로스트리듐 독소 전위 도메인을 비제한적으로 포함하는 인간 조작의 도움으로 생성된 임의의 클로스트리듐 독소 전위 도메인을 의미한다. 비천연 생성 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체의 비제한적인 예는 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체, 및 활성 클로스트리듐 독소 전위 도메인 단편을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체"는 참조 클로스트리듐 독소 전위 도메인 서열 (표 1)로부터 최초 아미노산의 특성과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 아미노산 유사체 또는 또 다른 아미노산에 의해 치환되는 적어도 하나의 아미노산을 갖는 클로스트리듐 독소 전위 도메인을 의미한다. 물성의 예는, 비제한적으로, 유사 크기, 형태학, 변화, 소수성, 친수성, 친지질성, 공유결합 능력, 수소 결합 능력, 물리화학적 물성 등, 또는 이의 임의 조합을 포함한다. 보존적 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체는 보존적 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체가 기반으로 하는 참조 클로스트리듐 독소 전위 도메인과 동일한 방식으로 실질적으로 기능할 수 있고, 명세서의 임의의 측면에서 참조 클로스트리듐 독소 전위 도메인으로 치환될 수 있다. 보존적 클로스트리듐 독소 전위 도메인 변이체의 비제한적인 예는, 예를 들어, 보존적 BoNT/A 전위 도메인 변이체, 보존적 BoNT/B 전위 도메인 변이체, 보존적 BoNT/C1 전위 도메인 변이체, 보존적 BoNT/D 전위 도메인 변이체, 보존적 BoNT/E 전위 도메인 변이체, 보존적 BoNT/F 전위 도메인 변이체, 보존적 BoNT/G 전위 도메인 변이체, 보존적 TeNT 전위 도메인 변이체, 보존적 BaNT 전위 도메인 변이체, 및 보존적 BuNT 전위 도메인 변이체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "비보존적 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 변이체"라는 용어는 하기와 같은 클로스트리듐 독소의 전위 도메인을 나타낸다: 1) 적어도 하나의 아미노산이 비-보존적 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 변이체가 기준으로 하는 참조 클로스트리듐 독소의 전위 도메인에서 결실되거나; 2) 적어도 하나의 아미노산이 비-보존적 클로스트리듐 독소의 전위 도메인이 기준으로 하는 참조 클로스트리듐 독소의 전위 도메인에 부가되거나; 또는 3) 적어도 하나의 아미노산이 참조 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 서열(표 1)의 원래 아미노산의 특성과 유사한 임의 특성을 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체로 치환됨. 비-보존적 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 변이체가 기준으로 하는 참조 클로스트리듐 독소의 전위 도메인과 실질적으로 동일한 방식으로 기능할 수 있으며, 본 명세서의 임의 측면에서 참조 클로스트리듐 독소의 전위 도메인을 치환할 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 변이체의 비제한적 예에는 예로 비-보존적 BoNT/A 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/B 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/D 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/E 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/F 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/G 전위 도메인 변이체, 및 비-보존적 TeNT 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BaNT 전위 도메인 변이체, 및 비-보존적 BuNT 전위 도메인 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "활성 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 절편"이라는 용어는 이들 활성 절편이 표적 세포의 세포내 소포로부터 세포질 내로 LC 방출을 촉진하여 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해하여 절단하는 전체적인 세포성 기전의 실행에 참여할 수 있는 한, 본 명세서의 측면에서 유용할 수 있는 전위 도메인을 포함하는 임의의 다양한 클로스트리듐 독소의 절편을 나타낸다. 클로스트리듐 독소 중쇄의 전위 도메인은 대략 410-430개 아미노산 길이이며, 전위 도메인을 포함한다(표 1). 연구를 통해 클로스트리듐 독소 중쇄의 전이 도메인의 전체 길이가 전위 도메인의 전위 활성에 필요한 것은 아니라는 것이 나타났다. 즉, 본 구현예의 측면에는 예로 적어도 350, 375, 400, 또는 425개 아미노산 길이의 클로스트리듐 독소의 전위 도메인이 포함된다. 본 구현예의 다른 측면에는 예로 최대 350, 375, 400, 또는 425개 아미노산 길이의 클로스트리듐 독소의 전위 도메인이 계획된다.
전반적 방법, 국소 방법 및 하이브리드 방법, 예컨대 절편 접근 방법을 비제한적으로 포함하는 임의의 다양한 서열 정렬 방법을 이용하여 천연 생성 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 변이체 및 비천연 생성 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 변이체의 동질성 백분율을 결정할 수 있다. 동질성 백분율을 결정하는 프로토콜은 당해분야 숙련자의 범위 내에서 및 본원의 교시로부터 일상적인 절차이다.
따라서 일 구현예에서, 본 명세서에 개시된 TVEMP는 클로스트리듐 독소의 전위 도메인을 포함한다. 본 구현예의 한 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인은 천연 생성 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 변이체, 예컨대 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 이소형 또는 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 서브타입을 포함한다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인은 비천연 생성 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 변이체, 예컨대 보존적 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 변이체, 활성 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 절편, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인의 폴리펩타이드 사슬에서 하나의 특정 위치의 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 아미노산의 예에는 예로 C, F, I, L, M, V 및 W가 포함된다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인의 폴리펩타이드 사슬에서 하나의 특정 위치의 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 지방족 아미노산의 예에는 예로 A, I, L, P, 및 V가 포함된다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인의 폴리펩타이드 사슬에서 하나의 특정 위치의 방향족 아미노산은 또 다른 방향족 아미노산으로 치환될 수 있다. 방향족 아미노산의 예에는 예로 F, H, W 및 Y가 포함된다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인의 폴리펩타이드 사슬에서 하나의 특정 위치의 스태킹 아미노산은 또 다른 스태킹 아미노산으로 치환될 수 있다. 스태킹 아미노산의 예에는 예로 F, H, W 및 Y가 포함된다. 본 구현예의 추가적 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인의 폴리펩타이드 사슬에서 하나의 특정 위치의 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성 아미노산의 예에는 예로 D, E, K, N, Q, 및 R이 포함된다. 본 구현예의 추가적 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인의 폴리펩타이드 사슬에서 하나의 특정 위치의 극성이 더 적거나 중간적인 아미노산은 또 다른 극성이 더 적거나 중간적인 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성이 더 적거나 중간적인 아미노산의 예에는 예로 A, H, G, P, S, T, 및 Y가 포함된다. 본 구현예의 또 다른 추가적 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인의 폴리펩타이드 사슬에서 하나의 특정 위치의 양으로 하전된 아미노산은 또 다른 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 아미노산의 예에는 예로 K, R, 및 H가 포함된다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인의 폴리펩타이드 사슬에서 하나의 특정 위치의 음으로 하전된 아미노산은 또 다른 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산의 예에는 예로 D 및 E가 포함된다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인의 폴리펩타이드 사슬에서 하나의 특정 위치의 작은 크기의 아미노산은 또 다른 작은 크기의 아미노산으로 치환될 수 있다. 작은 크기의 아미노산의 예에는 예로 A, D, G, N, P, S, 및 T가 포함된다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인의 폴리펩타이드 사슬에서 하나의 특정 위치의 C-베타 분기형 아미노산은 또 다른 C-베타 분기형 아미노산으로 치환될 수 있다. C-베타 분기형 아미노산의 예에는 예로 I, T 및 V가 포함된다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 전위 도메인은 BoNT/A 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BoNT/A 전위 도메인은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/A 전위 도메인은 서열번호: 1의 아미노산 455-873을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/A 아이소형으로부터의 전위 도메인 또는 BoNT/A 서브타입으로부터의 전위 도메인과 같은 천연 생성 BoNT/A 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/A 아이소형 전위 도메인 또는 BoNT/A 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 천연 생성 BoNT/A 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/A 아이소형 전위 도메인 또는 BoNT/A 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 1의 천연 생성 BoNT/A 전위 도메인 변이체의 아미노산 455-873을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/A 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/A 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BoNT/A 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 도메인은, 예를 들어, 보존적 BoNT/A 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/A 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/A 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 비천연 생성 BoNT/A 전위 도메인 변이체의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 도메인은, 예를 들어, 보존적 BoNT/A 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/A 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/A 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 1의 비천연 생성 BoNT/A 전위 도메인 변이체의 아미노산 455-873을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/A 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 전위 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 전위 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 1의 아미노산 455-873에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 1의 아미노산 455-873에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/A 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 1의 아미노산 455-873에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 1의 아미노산 455-873에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 전위 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 또는 서열번호: 5의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BoNT/A 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 1의 아미노산 455-873에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 1의 아미노산 455-873에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 전위 도메인은 BoNT/B 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BoNT/B 전위 도메인은 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/B 전위 도메인은 서열번호: 6의 아미노산 447-860. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/B 아이소형으로부터의 전위 도메인 또는 BoNT/B 서브타입으로부터의 전위 도메인과 같은 천연 생성 BoNT/B 전위 도메인 변이체. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/B 아이소형 전위 도메인 또는 BoNT/B 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 천연 생성 BoNT/B 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/B 아이소형 전위 도메인 또는 BoNT/B 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 6의 천연 생성 BoNT/B 전위 도메인 변이체의 아미노산 447-860을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/B 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/B 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BoNT/B 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/B 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/B 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 비천연 생성 BoNT/B 전위 도메인 변이체의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/B 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/B 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 6의 비천연 생성 BoNT/B 전위 도메인 변이체의 아미노산 447-860을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/B 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 전위 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 전위 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 6의 아미노산 447-860에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 6의 아미노산 447-860에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/B 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 6의 아미노산 447-860에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 6의 아미노산 447-860에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 전위 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 또는 서열번호: 10의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BoNT/B 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 6의 아미노산 447-860에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 6의 아미노산 447-860에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 전위 도메인은 BoNT/C1 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BoNT/C1 전위 도메인은 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 도메인은 서열번호: 11의 아미노산 454-868을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/C1 아이소형으로부터의 전위 도메인 또는 BoNT/C1 서브타입으로부터의 전위 도메인과 같은 천연 생성 BoNT/C1 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/C1 아이소형 전위 도메인 또는 BoNT/C1 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 천연 생성 BoNT/C1 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/C1 아이소형 전위 도메인 또는 BoNT/C1 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 11의 천연 생성 BoNT/C1 전위 도메인 변이체의 아미노산 454-868을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/C1 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BoNT/C1 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/C1 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 비천연 생성 BoNT/C1 전위 도메인 변이체의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/C1 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 11의 비천연 생성 BoNT/C1 전위 도메인 변이체의 아미노산 454-868을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 전위 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 전위 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 11의 아미노산 454-868에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 11의 아미노산 454-868에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 11의 아미노산 454-868에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 11의 아미노산 454-868에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 전위 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 11의 아미노산 454-868에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 11의 아미노산 454-868에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 전위 도메인은 BoNT/D 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BoNT/D 전위 도메인은 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/D 전위 도메인은 서열번호: 13의 아미노산 451-864을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/D 아이소형으로부터의 전위 도메인 또는 BoNT/D 서브타입으로부터의 전위 도메인과 같은 천연 생성 BoNT/D 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/D 아이소형 전위 도메인 또는 BoNT/D 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 천연 생성 BoNT/D 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/D 아이소형 전위 도메인 또는 BoNT/D 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 13의 천연 생성 BoNT/D 전위 도메인 변이체의 아미노산 451-864를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/D 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/D 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BoNT/D 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/D 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/D 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 비천연 생성 BoNT/D 전위 도메인 변이체의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/D 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/D 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 13의 비천연 생성 BoNT/D 전위 도메인 변이체의 아미노산 451-864을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/D 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 전위 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 전위 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 13의 아미노산 451-864에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 13의 아미노산 451-864에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/D 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 13의 아미노산 451-864에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 13의 아미노산 451-864에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 전위 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BoNT/D 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 13의 아미노산 451-864에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 13의 아미노산 451-864에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 전위 도메인은 BoNT/E 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BoNT/E 전위 도메인은 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/E 전위 도메인은 서열번호: 15의 아미노산 427-847을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/E 아이소형으로부터의 전위 도메인 또는 BoNT/E 서브타입으로부터의 전위 도메인과 같은 천연 생성 BoNT/E 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/E 아이소형 전위 도메인 또는 BoNT/E 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 천연 생성 BoNT/E 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/E 아이소형 전위 도메인 또는 BoNT/E 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 15의 천연 생성 BoNT/E 전위 도메인 변이체의 아미노산 427-847를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/E 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/E 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BoNT/E 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/E 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/E 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 비천연 생성 BoNT/E 전위 도메인 변이체의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/E 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/E 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 15의 비천연 생성 BoNT/E 전위 도메인 변이체의 아미노산 427-847을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/E 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 전위 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 전위 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 15의 아미노산 427-847에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 15의 아미노산 427-847에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/E 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 15의 아미노산 427-847에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 15의 아미노산 427-847에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 전위 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 15, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 17의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BoNT/E 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 15의 아미노산 427-847에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 15의 아미노산 427-847에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 전위 도메인은 BoNT/F 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BoNT/F 전위 도메인은 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/F 전위 도메인은 서열번호: 18의 아미노산 446-865을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/F 아이소형으로부터의 전위 도메인 또는 BoNT/F 서브타입으로부터의 전위 도메인과 같은 천연 생성 BoNT/F 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/F 아이소형 전위 도메인 또는 BoNT/F 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 천연 생성 BoNT/F 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/F 아이소형 전위 도메인 또는 BoNT/F 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 18의 천연 생성 BoNT/F 전위 도메인 변이체의 아미노산 446-865를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/F 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/F 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BoNT/F 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/F 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/F 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 비천연 생성 BoNT/F 전위 도메인 변이체의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/F 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/F 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 18의 비천연 생성 BoNT/F 전위 도메인 변이체의 아미노산 446-865를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/F 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 전위 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 전위 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 18의 아미노산 446-865에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 18의 아미노산 446-865에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/F 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 18의 아미노산 446-865에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 18의 아미노산 446-865에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 전위 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 18, 서열번호: 19, 또는 서열번호: 20의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BoNT/F 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 18의 아미노산 446-865에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 18의 아미노산 446-865에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 전위 도메인은 BoNT/G 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BoNT/G 전위 도메인은 서열번호: 21의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/G 전위 도메인은 서열번호: 21의 아미노산 451-865을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/G 아이소형으로부터의 전위 도메인 또는 BoNT/G 서브타입으로부터의 전위 도메인과 같은 천연 생성 BoNT/G 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/G 아이소형 전위 도메인 또는 BoNT/G 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 21의 천연 생성 BoNT/G 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 도메인은 예를 들어, BoNT/G 아이소형 전위 도메인 또는 BoNT/G 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 21의 천연 생성 BoNT/G 전위 도메인 변이체의 아미노산 451-865를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/G 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/G 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BoNT/G 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/G 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/G 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 21의 비천연 생성 BoNT/G 전위 도메인 변이체의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BoNT/G 전위 도메인 변이체, 활성 BoNT/G 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 21의 비천연 생성 BoNT/G 전위 도메인 변이체의 아미노산 451-865를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/G 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 21의 전위 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 21의 전위 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 21의 아미노산 451-865에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 21의 아미노산 451-865에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BoNT/G 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 21의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 21의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 21의 아미노산 451-865에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 21의 아미노산 451-865에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 21의 전위 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 21의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BoNT/G 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 21의 아미노산 451-865에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 21의 아미노산 451-865에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 전위 도메인은 TeNT 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, TeNT 전위 도메인은 서열번호: 22의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, TeNT 전위 도메인은 서열번호: 22의 아미노산 468-881을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 도메인은 예를 들어, TeNT 아이소형으로부터의 전위 도메인 또는 TeNT 서브타입으로부터의 전위 도메인과 같은 천연 생성 TeNT 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 도메인은 예를 들어, TeNT 아이소형 전위 도메인 또는 TeNT 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 22의 천연 생성 TeNT 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 도메인은 예를 들어, TeNT 아이소형 전위 도메인 또는 TeNT 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 22의 천연 생성 TeNT 전위 도메인 변이체의 아미노산 468-881을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 TeNT 전위 도메인 변이체, 비-보존적 TeNT 전위 도메인 변이체, 활성 TeNT 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 TeNT 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 TeNT 전위 도메인 변이체, 비-보존적 TeNT 전위 도메인 변이체, 활성 TeNT 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 22의 비천연 생성 TeNT 전위 도메인 변이체의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 TeNT 전위 도메인 변이체, 비-보존적 TeNT 전위 도메인 변이체, 활성 TeNT 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 22의 비천연 생성 TeNT 전위 도메인 변이체의 아미노산 468-881을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, TeNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 22의 전위 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 22의 전위 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 22의 아미노산 468-881에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 22의 아미노산 468-881에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, TeNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 22의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 22의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 22의 아미노산 468-881에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 22의 아미노산 468-881에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 22의 전위 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 22의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, TeNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 22의 아미노산 468-881에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 22의 아미노산 468-881에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 전위 도메인은 BaNT 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BaNT 전위 도메인은 서열번호: 23의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BaNT 전위 도메인은 서열번호: 23의 아미노산 436-857을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 도메인은 예를 들어, BaNT 아이소형으로부터의 전위 도메인 또는 BaNT 서브타입으로부터의 전위 도메인 과 같은 천연 생성 BaNT 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 도메인은 예를 들어, BaNT 아이소형 전위 도메인 또는 BaNT 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 23의 천연 생성 BaNT 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 도메인은 예를 들어, BaNT 아이소형 전위 도메인 또는 BaNT 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 23의 천연 생성 BaNT 전위 도메인 변이체의 아미노산 436-857을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BaNT 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BaNT 전위 도메인 변이체, 활성 BaNT 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BaNT 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BaNT 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BaNT 전위 도메인 변이체, 활성 BaNT 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 23의 비천연 생성 BaNT 전위 도메인 변이체의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BaNT 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BaNT 전위 도메인 변이체, 활성 BaNT 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 23의 비천연 생성 BaNT 전위 도메인 변이체의 아미노산 436-857을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BaNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 23의 전위 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 23의 전위 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 23의 아미노산 436-857에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 23의 아미노산 436-857에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BaNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 23의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 23의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 23의 아미노산 436-857에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 23의 아미노산 436-857에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 23의 전위 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 23의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BaNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 23의 아미노산 436-857에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 23의 아미노산 436-857에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 클로스트리듐 독소 전위 도메인은 BuNT 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BuNT 전위 도메인은 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BuNT 전위 도메인은 서열번호: 24의 아미노산 427-847을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 도메인은 예를 들어, BuNT 아이소형으로부터의 전위 도메인 또는 BuNT 서브타입으로부터의 전위 도메인 과 같은 천연 생성 BuNT 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 도메인은 예를 들어, BuNT 아이소형 전위 도메인 또는 BuNT 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 천연 생성 BuNT 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 도메인은 예를 들어, BuNT 아이소형 전위 도메인 또는 BuNT 서브타입 전위 도메인과 같은 서열번호: 24의 천연 생성 BuNT 전위 도메인 변이체의 아미노산 427-847을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BuNT 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BuNT 전위 도메인 변이체, 활성 BuNT 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 비천연 생성 BuNT 전위 도메인 변이체를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BuNT 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BuNT 전위 도메인 변이체, 활성 BuNT 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 비천연 생성 BuNT 전위 도메인 변이체의 전위 도메인을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 도메인은 예를 들어, 보존적 BuNT 전위 도메인 변이체, 비-보존적 BuNT 전위 도메인 변이체, 활성 BuNT 전위 도메인 단편, 또는 이의 임의 조합과 같은 서열번호: 24의 비천연 생성 BuNT 전위 도메인 변이체의 아미노산 427-847를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BuNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 전위 도메인에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 전위 도메인에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 아미노산 427-847에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 아미노산 427-847에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BuNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 아미노산 427-847에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 아미노산 427-847에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 전위 도메인에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 전위 도메인에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 추가 다른 측면에서, BuNT 전위 도메인은 예를 들어, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 아미노산 427-847에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 24 또는 서열번호: 25의 아미노산 427-847에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서의 측면은, 부분적으로, 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP을 제공한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "표적화 도메인"은 "결합 도메인", "리간드", 또는 "표적화 모이어티"와 유사어이고, 아미노산 서열 영역은 바람직하게는, 생리적 조건 하에서 표적 세포를 특징으로 하는, 수용체와 같은 세포 표면 마커에 결합한다. 상기 세포 표면 마커는 폴리 펩타이드, 다당류, 지질, 당단백질, 지질단백질을 포함할 수 있고, 또는 이들 중 하나 이외의 구조 특징을 가질 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "바람직하게는 작용하는"은 다른 비-표적 세포 표면 마커에 대해 통계적으로 상당히 큰 정도로, 생리적 조건, 또는 거의 실질적 생리적 조건인 시험관내 조건 하에서 표적 세포 표면 마커에 결합할 수 있는 분자를 의미한다. 본 명세서에 개시된 표적화 도메인에 대해, 다른 수용체에 대한 동족 수용체에 대한 표적화 도메인의 차별적인 결합이 있다. 결합 도메인의 예는 하기에 기재되어 있다: 예를 들어, Steward, L.E. 등, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capability and Enhanced Targeting Activity, 미국 특허 출원 No. 11/776,043 (Jul. 11, 2007); Steward, L.E. 등, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Clostridial Toxin Target Cells, 미국 특허 출원 No. 11/776,052 (Jul. 11, 2007); 및 Steward, L.E. 등, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells, 미국 특허 출원 No. 11/776,075 (Jul. 11, 2007), 이들 각각은 그 전체가 참고로 통합되어 있다.
구현예에서, 표적 수용체에 선택적으로 결합하는 결합 도메인은, 예를 들어 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000, 적어도 10,000, 또는 적어도 100,000배까지 비-표적 수용체에 대해 표적 수용체를 위해 더 큰 해리평형상수 (KD)를 갖는다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인의 예는 인터류킨 (IL) 펩타이드 결합 도메인이다. 인터류킨 (IL) 펩타이드 결합 도메인의 비제한적인 예는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-32, 또는 IL-33를 포함한다. 인터류킨 펩타이드 G-커플링된 단백질 수용체의 패밀리에 결합한다. 예를 들어, IL-1 및 IL-10는 IL1R에 결합하고; IL-3, IL-5, 및 IL-6은 IL3 R에 결합하고; IL-4 및 IL-13은 IL4 R에 결합하고; IL-6은 IL6 R에 결합하고; IL-7은 IL7 R에 결합하고; IL-8은 IL8 R에 결합한다.
인터류킨 수용체는 몇 개의 상이한 유형의 암 세포의 표면 상에 검출되었다. 예를 들어, IL-3R은 급성 골수성 백혈병, IL-4R은 갑상선암에서 발현되고, IL-6R, IL-7R, 및 IL-8R은 결장암에서 발현된다. 참고, 예를 들어, L.A. O'Sullivan, 등, Cytokine receptor signaling through the Jak-Stat-Socs pathway in disease, Mol. Immunol. 44(10): 2497-2506 (2007); M.G. Francipane, 등, Suppressor of cytokine signaling 3 sensitizes anaplastic thyroid cancer to standard chemotherapy, Cancer Res. 69(15): 6141-6148 (2009); A.M.
Figure pct00004
, et al, Parallels between global transcriptional programs of polarizing Caco-2 intestinal epithelial cells in vitro and gene expression programs in normal colon and colon cancer, Mol. Biol. Cell. 18(11): 4245-4260 (2007); A.M. Crawley, 등, Interleukin-4 downregulates CD127 expression and activity on human thymocytes and mature CD8+ T cells, Eur. J. Immunol. 40(5): 1396-1407 (2010); IL-8R는 대장암에서 발현된다. T. Yokoe, 등, Efficient identification of a novel cancer/testis antigen for immunotherapy using three-step microarray analysis, Cancer Res. 68(4): 1074-1082 (2008), 이들 각각은 그 전체가 참고로 본 명세서에 통합되어 있다. 이처럼, IL 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 급성 골수성 백혈병, 갑상선암, 또는 결장암을 포함하는 암의 치료에 효과적이다.
따라서, 구현예에서, 표적화 도메인은 IL 펩타이드 표적화 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, IL 펩타이드 표적화 도메인은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-32, 또는 IL-33을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, IL 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 82, 서열번호: 83, 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 서열번호: 87, 서열번호: 146, 서열번호: 147, 서열번호: 148, 서열번호: 149, 서열번호: 150, 서열번호: 151, 또는 서열번호: 152을 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, IL 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 82의 아미노산 123-265, 서열번호: 83의 아미노산 21-153, 서열번호: 84의 아미노산 57-210, 서열번호: 85의 아미노산 21-99 또는 아미노산 31-94, 서열번호: 86의 아미노산 37-173 또는 아미노산 19-178, 서열번호: 87의 아미노산 37-199, 서열번호: 146의 아미노산 20-137, 서열번호: 147의 아미노산 25-153, 서열번호: 148의 아미노산 24-131, 서열번호: 149의 아미노산 27-173, 또는 서열번호: 150의 아미노산 19-142을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, IL 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 82, 서열번호: 83, 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 서열번호: 87, 서열번호: 146, 서열번호: 147, 서열번호: 148, 서열번호: 149, 서열번호: 150, 서열번호: 151, 또는 서열번호: 152에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 82, 서열번호: 83, 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 서열번호: 87, 서열번호: 146, 서열번호: 147, 서열번호: 148, 서열번호: 149, 서열번호: 150, 서열번호: 151, 또는 서열번호: 152에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, IL 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 82, 서열번호: 83, 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 서열번호: 87, 서열번호: 146, 서열번호: 147, 서열번호: 148, 서열번호: 149, 서열번호: 150, 서열번호: 151, 또는 서열번호: 152에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 82, 서열번호: 83, 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 서열번호: 87, 서열번호: 146, 서열번호: 147, 서열번호: 148, 서열번호: 149, 서열번호: 150, 서열번호: 151, 또는 서열번호: 152에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, IL 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 82, 서열번호: 83, 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 서열번호: 87, 서열번호: 146, 서열번호: 147, 서열번호: 148, 서열번호: 149, 서열번호: 150, 서열번호: 151, 또는 서열번호: 152에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 82, 서열번호: 83, 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 서열번호: 87, 서열번호: 146, 서열번호: 147, 서열번호: 148, 서열번호: 149, 서열번호: 150, 서열번호: 151, 또는 서열번호: 152에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, IL 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 82의 아미노산 123-265, 서열번호: 83의 아미노산 21-153, 서열번호: 84의 아미노산 57-210, 서열번호: 85의 아미노산 21-99 또는 아미노산 31-94, 서열번호: 86의 아미노산 37-173 또는 아미노산 19-178, 서열번호: 87의 아미노산 37-199, 서열번호: 146의 아미노산 20-137, 서열번호: 147의 아미노산 25-153, 서열번호: 148의 아미노산 24-131, 서열번호: 149의 아미노산 27-173, 또는 서열번호: 150의 아미노산 19-142에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 82의 아미노산 123-265, 서열번호: 83의 아미노산 21-153, 서열번호: 84의 아미노산 57-210, 서열번호: 85의 아미노산 21-99 또는 아미노산 31-94, 서열번호: 86의 아미노산 37-173 또는 아미노산 19-178, 서열번호: 87의 아미노산 37-199, 서열번호: 146의 아미노산 20-137, 서열번호: 147의 아미노산 25-153, 서열번호: 148의 아미노산 24-131, 서열번호: 149의 아미노산 27-173, 또는 서열번호: 150의 아미노산 19-142에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, IL 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 82의 아미노산 123-265, 서열번호: 83의 아미노산 21-153, 서열번호: 84의 아미노산 57-210, 서열번호: 85의 아미노산 21-99 또는 아미노산 31-94, 서열번호: 86의 아미노산 37-173 또는 아미노산 19-178, 서열번호: 87의 아미노산 37-199, 서열번호: 146의 아미노산 20-137, 서열번호: 147의 아미노산 25-153, 서열번호: 148의 아미노산 24-131, 서열번호: 149의 아미노산 27-173, 또는 서열번호: 150의 아미노산 19-142 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 82의 아미노산 123-265, 서열번호: 83의 아미노산 21-153, 서열번호: 84의 아미노산 57-210, 서열번호: 85의 아미노산 21-99 또는 아미노산 31-94, 서열번호: 86의 아미노산 37-173 또는 아미노산 19-178, 서열번호: 87의 아미노산 37-199, 서열번호: 146의 아미노산 20-137, 서열번호: 147의 아미노산 25-153, 서열번호: 148의 아미노산 24-131, 서열번호: 149의 아미노산 27-173, 또는 서열번호: 150의 아미노산 19-142에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, IL 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 82의 아미노산 123-265, 서열번호: 83의 아미노산 21-153, 서열번호: 84의 아미노산 57-210, 서열번호: 85의 아미노산 21-99 또는 아미노산 31-94, 서열번호: 86의 아미노산 37-173 또는 아미노산 19-178, 서열번호: 87의 아미노산 37-199, 서열번호: 146의 아미노산 20-137, 서열번호: 147의 아미노산 25-153, 서열번호: 148의 아미노산 24-131, 서열번호: 149의 아미노산 27-173, 또는 서열번호: 150의 아미노산 19-142에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 82의 아미노산 123-265, 서열번호: 83의 아미노산 21-153, 서열번호: 84의 아미노산 57-210, 서열번호: 85의 아미노산 21-99 또는 아미노산 31-94, 서열번호: 86의 아미노산 37-173 또는 아미노산 19-178, 서열번호: 87의 아미노산 37-199, 서열번호: 146의 아미노산 20-137, 서열번호: 147의 아미노산 25-153, 서열번호: 148의 아미노산 24-131, 서열번호: 149의 아미노산 27-173, 또는 서열번호: 150의 아미노산 19-142에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인의 다른 예는 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 펩타이드 표적화 도메인이다. VEGF 펩타이드 표적화 도메인의 비제한적인 예는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 또는 태반 성장인자 (PlGF)를 포함한다. VEGF 펩타이드는 G-커플링된 단백질 수용체의 패밀리에 결합한다. 예를 들어, VEGFA, VEGFB, 및 VEGFC는 VEGFR1에 결합하고; VEGFA, VEGFD, VEGFC, 및 VEGFE는 VEGFR2에 결합하고; VEGFA, VEGFC, 및 VEGFD는 VEGFR3에 결합한다.
VEGF 수용체는 몇몇 상이한 유형의 암 세포 표면 상에서 검출되었다. 예를 들어 VEGFR1은 신세포 암종, 난소암, 방광암, 결장암, 림프종, 횡문근육종, 유방암, 골육종, 폐암, 비-소세포성 폐암, 흑색종, 췌장암, 눈 흑색종, 망막아세포종, 안구내 종양, 백혈병, 카포시 육종, 수아세포종, 기형암종, 신경모세포종, 전이성 중피종, 및 신경아교종에서 발현된다. 예로 [S.P. Gunningham 등, Vascular endothelial growth factor-B and vascular endothelial growth factor-C expression in renal cell carcinomas: regulation by the von Hippel-Lindau gene and hypoxia, Cancer Res. 61(7): 3206-3211 (2001); C.A. Boocock 등, Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors flt and KDR in ovarian carcinoma, J. Natl. Cancer Inst. 87(7): 506-516 (1995); R. Masood 등, Vascular endothelial growth factor (VEGF) is an autocrine growth factor for VEGF receptor-positive human tumors, Blood, 98(6): 1904-1913 (2001); G.P. Sawiris 등, Development of a highly specialized cDNA array for the study and diagnosis of epithelial ovarian cancer, Cancer Res. 62(10): 2923-2928 (2002); W. 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Carroll 등, activation in astrocytic neoplasms, Cancer 86(7): 1335-1341 (1999)]를 참고하라.
또 다른 예로서, VEGFR2는 전립선암, 신세포 암종, 난소암, 방광암, 횡문근육종, 유방암, 골육종, 갑상선암, 폐암, 비-소세포성 폐암, 흑색종, 췌장암, 눈 흑색종, 망막아세포종, 안구내 종양, 백혈병, 카포시 육종, 전이성 중피종, 베타 세포 종양, 위선암종, 내장 종양, 신경아교종, 성상세포종, 및 신장 종양에서 발현된다. 예로 [R. Masood 등, Vascular endothelial growth factor (VEGF) is an autocrine growth factor for VEGF receptor-positive human tumors, Blood, 98(6): 1904-1913 (2001); J. Li 등, Upregulation of VEGF-C by androgen depletion: the involvement of IGF-IR-FOXO pathway, Oncogene 24(35): 5510-5520 (2005); S. De 등, Molecular pathway for cancer metastasis to bone, J. Biol. Chem. 278(40): 39044-39050 (2003); D. Huang 등, Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma, Cancer Res. 70(3): 1053-1062 (2010); S.P. Gunningham 등, Vascular endothelial growth factor-B and vascular endothelial growth factor-C expression in renal cell carcinomas: regulation by the von Hippel-Lindau gene and hypoxia, Cancer Res. 61(7): 3206-3211 (2001); C.A. 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Castro-Rivera 등, Semaphorin 3B (SEMA3B) induces apoptosis in lung and breast cancer, whereas VEGF165 antagonizes this effect. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(31): 11432-11437 (2004); O. Straume, 및 L.A. Akslen. Expresson of vascular endothelial growth factor, its receptors (FLT-1, KDR) and TSP-1 related to microvessel density and patient outcome in vertical growth phase melanomas.Am. J. Pathol. 159: 223-235 (2001); H. Gitay-Goren 등, Human melanoma cells but not normal melanocytes express vascular endothelial growth factor receptors.Biochem. Biophys. Res. Commun. 190: 702-708 (1993); U. Graeven 등, Melanoma-associated expression of vascular endothelial growth factor and its receptors FLT-1 and KDR. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 125: 621-629 (1999); K.J. Higgins 등, Regulation of vascular endothelial growth factor receptor-2 expression in pancreatic cancer cells by Sp proteins.Biochem. Biophys. Res. Commun. 345: 292-301 (2006); P. 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Dias 등, VEGF(165) promotes survival of leukemic cells by Hsp90-mediated induction of Bcl-2 expression and apoptosis inhibition. Blood 99(7): 2532-2540 (2002); R. Masood 등, Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor is an autocrine growth factor for AIDS-Kaposi sarcoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(3): 979-984 (1997); M.C. Deregivus 등, HIV-1-Tat protein activates phosphatidylinositol 3-kinase/ AKT-dependent survival pathways in Kaposi's sarcoma cells. J. Biol. Chem. 277(28): 25195-25202 (2002); L. Strizzi 등, Vascular endothelial growth factor is an autocrine growth factor in human malignant mesothelioma. J. Pathol. 193(4): 468-475 (2001); C. Oberg 등, Expression of protein tyrosine kinases in islet cells: possible role of the Flk-1 receptor for beta-cell maturation from duct cells. Growth Factors 10(2): 115-126 (1994); C. Blazquez 등, Cannabinoids inhibit the vascular endothelial growth factor pathway in gliomas. Cancer Res. 64(16): 5617-5623 (2004); R.S. 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또 다른 예로서, VEGFR3은 신세포 암종, 림프종, 횡문근육종, 유방암, 갑상선암, 비-소세포성 폐암, 백혈병, 카포시 육종, 및 베타 세포 종양에서 발현된다. 예로 [S.P. Gunningham 등, Vascular endothelial growth factor-B and vascular endothelial growth factor-C expression in renal cell carcinomas: regulation by the von Hippel-Lindau gene and hypoxia. Cancer Res. 61(7): 3206-3211 (2001); S.F. Schoppmann 등, Tumor-associated macrophages express lymphatic endothelial growth factors and are related to peritumoral lymphangiogenesis. Am. J. Pathol. 161(3): 947-956 (2002); M.F. Gee 등, Vascular endothelial growth factor acts in an autocrine manner in rhabdomyosarcoma cell lines and can be inhibited with all-trans-retinoic acid. Oncogene 24(54): 8025-8037 (2005); A.Care 등, HOXB7: a key factor for tumor-associated angiogenic switch. Cancer Res. 61(17): 6532-6539 (2001); G. Bunone 등, Expression of angiogenesis stimulators and inhibitors in human thyroid tumors and correlation with clinical pathological features. Am. J. Pathol. 155: 1967-1976 (1999); U. McDermott 등, Ligand-dependent platelet-derived growth factor receptor (PDGFR)-alpha activation sensitizes rare lung cancer and sarcoma cells to PDGFR kinase inhibitors. Cancer Res. 69(9): 3937-3946 (2009); M.H. Chien 등, Vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) promotes angiogenesis by induction of COX-2 in leukemic cells via the VEGF-R3/JNK/AP-1 pathway. Carcinogenesis 30(12): 2005-2013 (2009); P. Blume-Jensen 및 T. Hunter. Oncogenic kinase signalling. Nature 411(6835): 355-365 (2001); S. Marchio 등, Vascular endothelial growth factor-C stimulates the migration and proliferation of Kaposi's sarcoma cells. J. Biol. Chem. 274(39): 27617-27622 (1999); 및 V. Lilla 등, Differential gene expression in well-regulated and dysregulated pancreatic beta-cell (MIN6) sublines. Endocrinology 144(4): 1368-1379 (2003)]를 참고하라.
이처럼, VEGF 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 전립선암, 신세포 암종, 난소암, 방광암, 결장암, 림프종, 횡문근육종, 유방암, 골육종, 갑상선암, 폐암, 비-소세포성 폐암, 흑색종, 췌장암, 눈 흑색종, 망막아세포종, 안구내 종양, 백혈병, 카포시 육종, 수아세포종, 기형암종, 신경모세포종, 중피종, 베타 세포 종양, 위선암종, 내장 종양, 신경아교종, 성상세포종, 또는 신장 종양을 포함하는 암 치료에 효과적일 것이다.
따라서, 구현예에서, 표적화 도메인은 VEGF 펩타이드 표적화 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, VEGF 펩타이드 표적화 도메인은 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 또는 PlGF를 포함한다. 이 구현예의 측면에서, VEGF 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 88, 서열번호: 89, 서열번호: 90, 서열번호: 91, 서열번호: 92, 또는 서열번호: 93을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, VEGF 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 88의 아미노산 50-133, 서열번호: 89의 아미노산 45-127, 서열번호: 90의 아미노산 129-214, 서열번호: 91의 아미노산 109-194, 서열번호: 92의 아미노산 46-163, 아미노산 49-162, 아미노산 168-345, 아미노산 244-306, 또는 아미노산 248-340, 또는 서열번호: 93의 아미노산 50-131 또는 아미노산 132-203을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, VEGF 표적화 도메인은, 예를 들어, 서열번호: 88, 서열번호: 89, 서열번호: 90, 서열번호: 91, 서열번호: 92, 또는 서열번호: 93에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 88, 서열번호: 89, 서열번호: 90, 서열번호: 91, 서열번호: 92, 또는 서열번호: 93에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, VEGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 88, 서열번호: 89, 서열번호: 90, 서열번호: 91, 서열번호: 92, 또는 서열번호: 93에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 88, 서열번호: 89, 서열번호: 90, 서열번호: 91, 서열번호: 92, 또는 서열번호: 93에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, VEGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 88, 서열번호: 89, 서열번호: 90, 서열번호: 91, 서열번호: 92, 또는 서열번호: 93에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 88, 서열번호: 89, 서열번호: 90, 서열번호: 91, 서열번호: 92, 또는 서열번호: 93에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, VEGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 88의 아미노산 50-133, 서열번호: 89의 아미노산 45-127, 서열번호: 90의 아미노산 129-214, 서열번호: 91의 아미노산 109-194, 서열번호: 92의 아미노산 46-163, 아미노산 49-162, 아미노산 168-345, 아미노산 244-306, 또는 아미노산 248-340, 또는 서열번호: 93의 아미노산 50-131 또는 아미노산 132-203에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 88의 아미노산 50-133, 서열번호: 89의 아미노산 45-127, 서열번호: 90의 아미노산 129-214, 서열번호: 91의 아미노산 109-194, 서열번호: 92의 아미노산 46-163, 아미노산 49-162, 아미노산 168-345, 아미노산 244-306, 또는 아미노산 248-340, 또는 서열번호: 93의 아미노산 50-131 또는 아미노산 132-203에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, VEGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 88의 아미노산 50-133, 서열번호: 89의 아미노산 45-127, 서열번호: 90의 아미노산 129-214, 서열번호: 91의 아미노산 109-194, 서열번호: 92의 아미노산 46-163, 아미노산 49-162, 아미노산 168-345, 아미노산 244-306, 또는 아미노산 248-340, 또는 서열번호: 93의 아미노산 50-131 또는 아미노산 132-203에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 88의 아미노산 50-133, 서열번호: 89의 아미노산 45-127, 서열번호: 90의 아미노산 129-214, 서열번호: 91의 아미노산 109-194, 서열번호: 92의 아미노산 46-163, 아미노산 49-162, 아미노산 168-345, 아미노산 244-306, 또는 아미노산 248-340, 또는 서열번호: 93의 아미노산 50-131 또는 아미노산 132-203에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, VEGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 88의 아미노산 50-133, 서열번호: 89의 아미노산 45-127, 서열번호: 90의 아미노산 129-214, 서열번호: 91의 아미노산 109-194, 서열번호: 92의 아미노산 46-163, 아미노산 49-162, 아미노산 168-345, 아미노산 244-306, 또는 아미노산 248-340, 또는 서열번호: 93의 아미노산 50-131 또는 아미노산 132-203에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 88의 아미노산 50-133, 서열번호: 89의 아미노산 45-127, 서열번호: 90의 아미노산 129-214, 서열번호: 91의 아미노산 109-194, 서열번호: 92의 아미노산 46-163, 아미노산 49-162, 아미노산 168-345, 아미노산 244-306, 또는 아미노산 248-340, 또는 서열번호: 93의 아미노산 50-131 또는 아미노산 132-203에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인의 다른 예는 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 펩타이드 표적화 도메인이다. IGF 펩타이드 표적화 도메인의 비제한적인 예는 IGF-1 또는 IGF-2을 포함한다. IGF 펩타이드는 단백질 수용체의 패밀리에 결합한다. 예를 들어, IGF-1 및 IGF-2는 IGFR1 및 IGFR2 모두에 결합한다.
IGF 수용체는 몇 개의 상이한 유형의 암 세포의 표면 상에서 검출되었다. 예를 들어, IGF1R은 유방암, 결장암, 폐암, 및 전립선암에서 발현된다. 참고, 예를 들어, G. Thomas, Furin at the cutting edge: from protein traffic to embryogenesis and disease, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3(10): 753-766 (2002). 다른 예로서, IGF2R는 위암 및 간암에서 발현된다. 참고, 예를 들어, L. Ottini, 등, Mutations at coding mononucleotide repeats in gastric cancer with the microsatellite mutator phenotype, Oncogene 16(21): 2767-2772 (1998); 및 Y.J. Chung, 등, Evidence of genetic progression in human gastric carcinomas with microsatellite instability, Oncogene 15(14): 1719-1726 (1997); 및 J.J. Mills, 등, Imprinted M6p/Igf2 receptor is mutated in rat liver tumors, Oncogene 16(21): 2797-2802 (1998). 이처럼, IGF 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 유방암, 결장암, 폐암, 전립선암, 위암 또는 간암을 포함하는 암의 치료에 효과적이다.
따라서, 구현예에서, 표적화 도메인은 IGF 펩타이드 표적화 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, IGF 펩타이드 표적화 도메인은 IGF-1 또는 IGF-2를 포함한다. 이 구현예의 측면에서, IGF 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 94 또는 서열번호: 95를 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, IGF 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 94의 아미노산 52-109 또는 아미노산 49-118, 또는 서열번호: 95의 아미노산 31-84 또는 아미노산 25-180를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, IGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 94 또는 서열번호: 95에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 94 또는 서열번호: 95에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, IGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 94 또는 서열번호: 95에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 94 또는 서열번호: 95에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, IGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 94 또는 서열번호: 95에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 94 또는 서열번호: 95에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, IGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 94의 아미노산 52-109 또는 아미노산 49-118, 또는 서열번호: 95의 아미노산 31-84 또는 아미노산 25-180에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 94의 아미노산 52-109 또는 아미노산 49-118, 또는 서열번호: 95의 아미노산 31-84 또는 아미노산 25-180에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, IGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 94의 아미노산 52-109 또는 아미노산 49-118, 또는 서열번호: 95의 아미노산 31-84 또는 아미노산 25-180에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 94의 아미노산 52-109 또는 아미노산 49-118, 또는 서열번호: 95의 아미노산 31-84 또는 아미노산 25-180에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, IGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 94의 아미노산 52-109 또는 아미노산 49-118, 또는 서열번호: 95의 아미노산 31-84 또는 아미노산 25-180에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 94의 아미노산 52-109 또는 아미노산 49-118, 또는 서열번호: 95의 아미노산 31-84 또는 아미노산 25-180에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인의 또 다른 예는 표피 성장 인자(EGF) 펩타이드 표적화 도메인이다. EGF 펩타이드 표적화 도메인의 비제한적 예에는 EGF, 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자(HB-EGF), 전환 성장 인자-α(TGF-α), 암피레귤린(AR), 에피레귤린(EPR), 에피겐(EPG), 베타셀룰린(BTC), 뉴레귤린-1(NRG1), 뉴레귤린-2(NRG2), 뉴레귤린-3, (NRG3), 또는 뉴레귤린-4(NRG4)가 포함된다. EGF 펩타이드는 단백질 수용체 패밀리에 결합한다. 예를 들어 EGF, LTA4H, TGFA, HBEGF(헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자), 암피레귤린, 에피레귤린, 및 BTC는 EGFR1에 결합하고; NRG1 및 EGF는 EGFR2에 결합하고; NRG1, NRG2, 및 BTC는 EGFR3에 결합하고; NRG1, NRG2, NRG3, EPR, HBEGF, NRG4, BTC, 및 EPR은 EGFR4에 결합하고; 및 TGF-α는 BMPR1A에 결합한다.
EGF 수용체는 몇몇 상이한 유형의 암 세포 표면 상에서 검출되었다. 예를 들어 EGFR1은 폐암, 전립선암, 난소암, 방광암, 갑상샘 암, 혼합 유두 및 난포 갑상샘 암종에서 발현된다. 예로 [P. Blume-Jensen 및 T. Hunter, Oncogenic kinase signaling, Nature 411(6835): 355-365 (2001); T. Arao 등, Small in-frame deletion in the epidermal growth factor receptor as a target for ZD6474, Cancer Res. 64(24): 9101-9104 (2004); H. Ji 등, Epidermal growth factor receptor variant III mutations in lung tumorigenesis and sensitivity to tyrosine kinase inhibitors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(20): 7817-7822 (2006); J. Kim 등, The phosphoinositide kinase PIKfyve mediates epidermal growth factor receptor trafficking to the nucleus, Cancer Res. 67(19): 9229-9237 (2007); E. Kebebew 등, Diagnostic and prognostic value of angiogenesis-modulating genes in malignant thyroid neoplasms, Surgery 138(6): 1102-1109 (2005)]를 참고하라.
또 다른 예로서, EGFR2는 폐암, 전립선암, 담관암종, 유방암, 자궁경부암, 유방암, 결직장암, 위암, 자궁내막암, 식도암, 난관암, 담낭암, 두경부암, 간암, 폐암, 결직장암, 골수형성이상 증후군, 비-소세포성 폐암, 구강암, 난소암, 췌장암, 복강암, 진성적혈구 증가증, 신장암, 및 피부암에서 발현된다. 예로 [W. Kassouf 등, Uncoupling between Epidermal Growth Factor Receptor and Downstream Signals Defines Resistance to the Antiproliferative Effect of Gefitinib in Bladder Cancer Cells, Cancer Res. 65(22): 10524-10535 (2005); M. Casimiro 등, ErbB-2 Induces the Cyclin D1 Gene in Prostate Epithelial Cells In vitro and In vivo, Cancer Res. 67(9): 4364-4372 (2007); J. Harder 등, EGFR and HER2 expression in advanced biliary tract cancer, World J. Gastroenterol. 15(36): 4511-4517 (2009); M. Kobayashi 등, Protein overexpression and gene amplification of c-erbB-2 in breast carcinomas: a comparative study of immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues, Hum. Pathol. 33: 21-28 (2002); D. Xie 등, Population-based, case-control study of HER2 genetic polymorphism and breast cancer risk, J. Natl. Cancer Inst. 92(5): 412-417 (2000); P.N. Munster 등, First study of the safety, tolerability, and pharmacokinetics of CP-724,714 in patients with advanced malignant solid HER2-expressing tumors, Clin. Cancer Res. 13(4):1238-1245 (2007); W. Xia 등, A model of acquired autoresistance to a potent ErbB2 tyrosine kinase inhibitor and a therapeutic strategy to prevent its onset in breast cancer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(20): 7795-7800 (2006); A Wissner 등, Syntheses and EGFR and HER-2 kinase inhibitory activities of 4-anilinoquinoline-3-carbonitriles: Analogues of three important 4-anilinoquinazolines currently undergoing clinical evaluation as therapeutic antitumor agents, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12(20): 2893-2897 (2002); M.D. Sternlicht 등, How matrix metalloproteinases regulate cell behavior, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17: 463-516 (2001); J.N Hutchinson 등, Activation of Akt-1 (PKB-alpha) Can Accelerate ErbB-2-Mediated Mammary Tumorigenesis but Suppresses Tumor Invasion, Cancer Res. 64(9): 3171-3178 (2004); X. Leng 등, Inhibition of lipocalin 2 impairs breast tumorigenesis and metastasis, Cancer Res. 69(22): 8579-8584 (2009); P.N. Munster 등, First study of the safety, tolerability, and pharmacokinetics of CP-724,714 in patients with advanced malignant solid HER2-expressing tumors, Clin. Cancer Res. 13(4): 1238-1245 (2007); D. Dankort 등, Grb2 and Shc adapter proteins play distinct roles in Neu (ErbB-2)-induced mammary tumorigenesis: implications for human breast cancer, Mol. Cell Biol. 21(5): 1540-1551 (2001); R.S. Muraoka 등, Increased malignancy of Neu-induced mammary tumors overexpressing active transforming growth factor beta1, Mol. Cell Biol. 23(23): 8691-8703 (2003); D.V. Bulavin 등, Inactivation of the Wip1 phosphatase inhibits mammary tumorigenesis through p38 MAPK-mediated activation of the p16(Ink4a)-p19(Arf) pathway, Nat. Genet. 36(4): 343-350 (2004); X. Ju 등, Akt1 governs breast cancer progression in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(18): 7438-7443 (2007); 및 H. Ji 등, Epidermal growth factor receptor variant III mutations in lung tumorigenesis and sensitivity to tyrosine kinase inhibitors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103(20): 7817-7822 (2006)]를 참고하라.
또 다른 예로서, EGFR3은 난소암에서 발현된다. 예로 [K.H. Lu 등, Selection of potential markers for epithelial ovarian cancer with gene expression arrays and recursive descent partition analysis, Clin. Cancer Res. 10(10): 3291-3300 (2004)]를 참고하라.
또 다른 예로서, EGFR4는 전립선암, 유방암, 및 결장암에서 발현된다. 예로 [J.M. Murabito 등, A genome-wide association study of breast and prostate cancer in the NHLBI's Framingham Heart Study, BMC Med. Genet. 8 Suppl 1: S6 (2007); M. Rokavec 등, A novel polymorphism in the promoter region of ERBB4 is associated with breast and colorectal cancer risk, Clin. Cancer Res. 13(24): 7506-7514 (2007); 및 G. Carpenter, ErbB-4: mechanism of action and biology, Exp. Cell Res. 284(1): 66-77 (2003)]을 참고하라.
추가 예로서, BMPR1A는 전립선암, 담관암, 난소암, 골암, 결장암, 골수종, 교모세포종, 편평 세포 암종, 부신피질암종, 췌장암, 골육종에서 발현된다. 예로 [S. Yang 등, Diverse biological effect and Smad signaling of bone morphogenetic protein 7 in prostate tumor cells. Cancer Res. 65(13): 5769-5777 (2005); H. Miyazaki 등, BMP signals inhibit proliferation and in vivo tumor growth of androgen-insensitive prostate carcinoma cells.Oncogene 23(58): 9326-9335 (2004); D.R. Haudenschild 등, Bone morphogenetic protein (BMP)-6 signaling and BMP antagonist noggin in prostate cancer. Cancer Res. 64(22): 8276-8284 (2004); I.Y. Kim 등, Expression of bone morphogenetic protein receptors type-IA, -IB and -II correlates with tumor grade in human prostate cancer tissues. Cancer Res. 60(11): 2840-2844 (2000); D.E. Hansel 등, Identification of novel cellular targets in biliary tract cancers using global gene expression technology. Am. J. Pathol. 163(1): 217-229 (2003); T.G. Shepherd 및 M.W. Nachtigal. Identification of a putative autocrine bone morphogenetic protein-signaling pathway in human ovarian surface epithelium and ovarian cancer cells. Endocrinology 144(8): 3306-3314 (2003); E. Hay 등, Bone morphogenetic protein receptor IB signaling mediates apoptosis independently of differentiation in osteoblastic cells. J. Biol. Chem. 279(3): 1650-1658 (2004); W. Jin 등, TrkC binds to the bone morphogenetic protein type II receptor to suppress bone morphogenetic protein signaling. Cancer Res. 67(20): 9869-9877 (2007); H. Deng 등, Bone morphogenetic protein-4 is overexpressed in colonic adenocarcinomas and promotes migration and invasion of HCT116 cells. Exp. Cell Res. 313(5): 1033-1044 (2007); T.B. Ro 등, Bone morphogenetic protein-5, -6 and -7 inhibit growth and induce apoptosis in human myeloma cells. Oncogene 23(17): 3024-3032 (2004); P. ten Dijke 등, Identification of type I receptors for osteogenic protein-1 and bone morphogenetic protein-4. J. Biol. Chem. 269: 16985-16988 (1994); N. Yamada 등, Bone morphogenetic protein type IB receptor is progressively expressed in malignant glioma tumours. Br. J. Cancer 73(5): 624-629 (1996); Y. Jin 등, Overexpression of BMP-2/4, -5 and BMPR-IA associated with malignancy of oral epithelium. Oral Oncol. 37: 225-233 (2001); A.F. Soares 등, Bone morphogenetic protein-2/4 and bone morphogenetic protein receptor type IA expression in metastatic and nonmetastatic oral squamous cell carcinoma. Am. J. Otolaryngol. 31(4): 266-271 (2010); I.K. Johnsen 등, Bone morphogenetic proteins 2 and 5 are down-regulated in adrenocortical carcinoma and modulate adrenal cell proliferation and steroidogenesis. Cancer Res. 69(14): 5784-5792 (2009); J. Kleeff 등, Bone morphogenetic protein 2 exerts diverse effects on cell growth in vitro and is expressed in human pancreatic cancer in vivo. Gastroenterol. 116(5): 1202-1216 (1999); G. Gobbi 등, Seven BMPs and all their receptors are simultaneously expressed in osteosarcoma cells. Int. J. Oncology 20(1): 143-147 (2002); 및 R. Mehdi 등, Expression of bone morphogenetic protein and its receptors in osteosarcoma and malignant fibrous histiocytoma. Jap. J. Clin. Oncol. 30(6): 272-275 (2000)]을 참고하라.
이처럼, EGF 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 폐암, 전립선암, 난소암, 방광암, 갑상샘 암, 혼합 유두 및 난포 갑상샘 암종, 담관암종, 유방암, 자궁경부암, 결직장암, 결장암, 위암, 자궁내막암, 식도암, 난관암, 담낭암, 두경부암, 간암, 폐암, 골수형성이상 증후군, 비-소세포성 폐암, 구강암, 췌장암, 복강암, 진성적혈구 증가증, 신장암, 또는 피부암을 포함하는 암 치료에 효과적일 것이다.
따라서, 구현예에서, 표적화 도메인은 EGF 펩타이드 표적화 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, EGF 펩타이드 표적화 도메인은 EGF, HB-EGF, TGF-α, AR, EPR, EPG, BTC, NRG-1, NRG-2, NRG-3, 또는 NRG-4을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, EGF 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 96, 서열번호: 97, 서열번호: 98, 서열번호: 99, 서열번호: 100, 서열번호: 101, 서열번호: 102, 서열번호: 103, 서열번호: 104, 서열번호: 105, 또는 서열번호: 106을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, EGF 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 99의 아미노산 101-251 또는 아미노산 107-251, 서열번호: 100의 아미노산 63-108, 서열번호: 101의 아미노산 23-154, 서열번호: 103의 아미노산 235-630, 서열번호: 104의 아미노산 398-718, 또는 서열번호: 105의 아미노산 353-648을 포함한다. 본 구현예의 또 다른 측면에서, EGF 펩타이드 표적화 도메인은 NRG-2 아이소형 1, NRG-2 아이소형 2, NRG-2 아이소형 3, NRG-2 아이소형 4, NRG-2 아이소형 5, 또는 NRG-2 아이소형 6과 같은 NRG-2 아이소형을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, EGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 96, 서열번호: 97, 서열번호: 98, 서열번호: 99, 서열번호: 100, 서열번호: 101, 서열번호: 102, 서열번호: 103, 서열번호: 104, 서열번호: 105, 또는 서열번호: 106에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 96, 서열번호: 97, 서열번호: 98, 서열번호: 99, 서열번호: 100, 서열번호: 101, 서열번호: 102, 서열번호: 103, 서열번호: 104, 서열번호: 105, 또는 서열번호: 106에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, EGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 96, 서열번호: 97, 서열번호: 98, 서열번호: 99, 서열번호: 100, 서열번호: 101, 서열번호: 102, 서열번호: 103, 서열번호: 104, 서열번호: 105, 또는 서열번호: 106에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 96, 서열번호: 97, 서열번호: 98, 서열번호: 99, 서열번호: 100, 서열번호: 101, 서열번호: 102, 서열번호: 103, 서열번호: 104, 서열번호: 105, 또는 서열번호: 106에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, EGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 96, 서열번호: 97, 서열번호: 98, 서열번호: 99, 서열번호: 100, 서열번호: 101, 서열번호: 102, 서열번호: 103, 서열번호: 104, 서열번호: 105, 또는 서열번호: 106에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 96, 서열번호: 97, 서열번호: 98, 서열번호: 99, 서열번호: 100, 서열번호: 101, 서열번호: 102, 서열번호: 103, 서열번호: 104, 서열번호: 105, 또는 서열번호: 106에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, EGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 99의 아미노산 101-251 또는 아미노산 107-251, 서열번호: 100의 아미노산 63-108, 서열번호: 101의 아미노산 23-154, 서열번호: 103의 아미노산 235-630, 서열번호: 104의 아미노산 398-718, 또는 서열번호: 105의 아미노산 353-648에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 99의 아미노산 101-251 또는 아미노산 107-251, 서열번호: 100의 아미노산 63-108, 서열번호: 101의 아미노산 23-154, 서열번호: 103의 아미노산 235-630, 서열번호: 104의 아미노산 398-718, 또는 서열번호: 105의 아미노산 353-648에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, EGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 99의 아미노산 101-251 또는 아미노산 107-251, 서열번호: 100의 아미노산 63-108, 서열번호: 101의 아미노산 23-154, 서열번호: 103의 아미노산 235-630, 서열번호: 104의 아미노산 398-718, 또는 서열번호: 105의 아미노산 353-648에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 99의 아미노산 101-251 또는 아미노산 107-251, 서열번호: 100의 아미노산 63-108, 서열번호: 101의 아미노산 23-154, 서열번호: 103의 아미노산 235-630, 서열번호: 104의 아미노산 398-718, 또는 서열번호: 105의 아미노산 353-648에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, EGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 99의 아미노산 101-251 또는 아미노산 107-251, 서열번호: 100의 아미노산 63-108, 서열번호: 101의 아미노산 23-154, 서열번호: 103의 아미노산 235-630, 서열번호: 104의 아미노산 398-718, 또는 서열번호: 105의 아미노산 353-648에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 99의 아미노산 101-251 또는 아미노산 107-251, 서열번호: 100의 아미노산 63-108, 서열번호: 101의 아미노산 23-154, 서열번호: 103의 아미노산 235-630, 서열번호: 104의 아미노산 398-718, 또는 서열번호: 105의 아미노산 353-648에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인의 다른 예는 형질전환 성장 인자-β (TGFβ) 펩타이드 표적화 도메인이다. TGFβ 펩타이드 표적화 도메인의 비제한적인 예는 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 또는 TGFβ4를 포함한다. TGF-β 펩타이드는 단백질 수용체의 패밀리에 결합한다. 예를 들어, TGF-β1, TGF-β2, 및 TGF-β3은 TGFBR1에 결합하고; TGF-β1, TGF-β2, 및 TGF-β3은 TGFBR2에 결합하고; TGF-β1 및 TGF-β2는 TGFBR3에 결합하고; TGF-β1은 BMPR2에 결합한다. TGFB1은 또한, 액티빈 A 수용체, 유형 I (ACVR1), 액티빈 A 수용체, 유형 2A (ACVR2A), 액티빈 A 수용체, 유형 2B (ACVR2B), 및 액티빈 A 수용체, 유형 C (ACVR1C)에 결합한다.
TGF-β 수용체는 몇몇 상이한 유형의 암 세포 표면 상에서 검출되었다. 예를 들어 TGFBR1은 전립선암, 크롬친화세포종, 난소암, 전이성 갑상선암, 결장암, 림프종, 위암, 유방암, 골육종, 섬유육종, 간암, 유두 갑상샘 암종, 및 췌장암에서 발현된다. 예로 [B.J. Park 등, Mitogenic conversion of transforming growth factor-beta1 effect by oncogenic Ha-Ras-induced activation of the mitogen-activated protein kinase signaling pathway in human prostate cancer, Cancer Res. 60(11): 3031-3038 (2000); D.R. Haudenschild 등, Bone Morphogenetic Protein (BMP)-6 Signaling and BMP Antagonist Noggin in Prostate Cancer, Cancer Res. 64(22): 8276-8284 (2004); M.L. Lamm 등, A proliferative effect of transforming growth factor-beta1 on a human prostate cancer cell line, TSU-Pr1, Endocrinology 139(2): 787-790 (1998); H.G. Koenig 등, TGF-{beta}1 activates two distinct type I receptors in neurons: implications for neuronal NF-{kappa}B signaling, J. Cell Biol. 168(7): 1077-1086 (2005); R.L. Baldwin 등, Loss of c-myc Repression Coincides with Ovarian Cancer Resistance to Transforming Growth Factor beta Growth Arrest Independent of Transforming Growth Factor beta/Smad Signaling, Cancer Res. 63(6): 1413-1419 (2003); T. Chen 등, Transforming growth factor-beta receptor type I gene is frequently mutated in ovarian carcinomas, Cancer Res. 61(12): 4679-4682 (2001); E. Kebebew 등, Diagnostic and prognostic value of angiogenesis-modulating genes in malignant thyroid neoplasms, Surgery 138(6): 1102-1109 (2005); N. Muller 등, Smad4 induces the tumor suppressor E-cadherin and P-cadherin in colon carcinoma cells, Oncogene 21(39): 6049-6058 (2002); P. Lagadec 등, Evidence for control of nitric oxide synthesis by intracellular transforming growth factor-beta1 in tumor cells. Implications for tumor development, Am. J. Pathol. 154(6): 1867-1876 (1999); P.I. Knaus 등, A dominant inhibitory mutant of the type II transforming growth factor beta receptor in the malignant progression of a cutaneous T-cell lymphoma, Mol. Cell Biol. 16(7): 3480-3489 (1996); S.H. Kang 등, Transcriptional repression of the transforming growth factor-beta type I receptor gene by DNA methylation results in the development of TGF-beta resistance in human gastric cancer, Oncogene 18(51): 7280-7286 (1999); V. Katuri 등, Inactivation of ELF/TGF-beta signaling in human gastrointestinal cancer, Oncogene 24(54): 8012-8024 (2005); S. Fanayan 등, Signaling through the Smad pathway by insulin-like growth factor-binding protein-3 in breast cancer cells. Relationship to transforming growth factor-beta 1 signaling, J. Biol. Chem. 277(9): 7255-7261 (2002); S. Ammanamanchi 등, Induction of transforming growth factor-beta receptor type II expression in estrogen receptor-positive breast cancer cells through SP1 activation by 5-aza-2'-deoxycytidine, J. Biol. Chem. 273(26): 16527-16534 (1998); J.A. McEarchern 등, Invasion and metastasis of a mammary tumor involves TGF-beta signaling, Int. J. Cancer 91(1): 76-82 (2001); D. Rotzer 등, Type III TGF-beta receptor-independent signalling of TGF-beta2 via TbetaRII-B, an alternatively spliced TGF-beta type II receptor, EMBO J. 20(3): 480-490 (2001); S. Matsuyama 등, SB-431542 and Gleevec inhibit transforming growth factor-beta-induced proliferation of human osteosarcoma cells, Cancer Res. 63(22): 7791-7798 (2003); B.A. Hocevar 등, The adaptor molecule Disabled-2 links the transforming growth factor beta receptors to the Smad pathway, EMBO J. 20(11): 2789-2801 (2001); Birkey 등, X-linked inhibitor of apoptosis protein functions as a cofactor in transforming growth factor-beta signaling, J. Biol. Chem. 276(28): 26542-26549 (2001); K. Giehl 등, TGFbeta1 represses proliferation of pancreatic carcinoma cells which correlates with Smad4-independent inhibition of ERK activation, Oncogene 19(39): 4531-4541 (2000); G. Subramanian 등, Targeting endogenous transforming growth factor beta receptor signaling in SMAD4-deficient human pancreatic carcinoma cells inhibits their invasive phenotype1, Cancer Res. 64(15): 5200-5211 (2004); 및 N. Jonckheere 등, A role for human MUC4 mucin gene, the ErbB2 ligand, as a target of TGF-beta in pancreatic carcinogenesis, Oncogene 23(34): 5729-5738 (2004)]를 참고하라.
또 다른 예로서, TGFBR2는 전립선암, 난소암, 결장암, 림프종, 위암, 유방암, 골육종, 섬유육종, 유두 갑상샘 암종, 골수종, 췌장암, 자궁경부암종, 자궁내막 선암종, 흑색종, 횡문근육종, 편평 세포 암종, 신경모세포종, 및 위선암종에서 발현된다. 예로 [B.J. Park 등, Mitogenic conversion of transforming growth factor-beta1 effect by oncogenic Ha-Ras-induced activation of the mitogen-activated protein kinase signaling pathway in human prostate cancer, Cancer Res. 60(11): 3031-3038 (2000); M.L. Lamm 등, A proliferative effect of transforming growth factor-beta1 on a human prostate cancer cell line, TSU-Pr1, Endocrinology 139(2):787-790 (1998); H. Miyazaki 등, BMP signals inhibit proliferation and in vivo tumor growth of androgen-insensitive prostate carcinoma cells, Oncogene 23(58): 9326-9335 (2004); D.J. Taxman 등, Transcriptional profiling of targets for combination therapy of lung carcinoma with paclitaxel and mitogen-activated protein/extracellular signal-regulated kinase kinase inhibitor, Cancer Res. 63(16): 5095-5104 (2003); R.L. 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Chung 등, Evidence of genetic progression in human gastric carcinomas with microsatellite instability, Oncogene 15(14): 1719-1726 (1997)]을 참고하라.
또 다른 예로서, TGFBR3은 전립선암, 크롬친화세포종, 위암, 유방암, 부신피질암, 및 침샘낭암종 암종에서 발현된다. 예로 [D.R. Haudenschild 등, Bone Morphogenetic Protein (BMP)-6 Signaling and BMP Antagonist Noggin in Prostate Cancer, Cancer Res. 64(22): 8276-8284 (2004); J.M. Cosgaya 등, Retinoic acid induces secretion of transforming growth factors by PC12 pheochromocytoma cells, Oncogene 14(5): 579-587 (1997); K. Park, el at., Genetic changes in the transforming growth factor beta (TGF-beta) type II receptor gene in human gastric cancer cells: correlation with sensitivity to growth inhibition by TGF-beta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(19): 8772-8776 (1994); J.A. McEarchern 등, Invasion and metastasis of a mammary tumor involves TGF-beta signaling, Int. J. Cancer 91(1): 76-82 (2001); P.G. Farnworth 등, Transforming growth factor-beta blocks inhibin binding to different target cell types in a context-dependent manner through dual mechanisms involving betaglycan, Endocrinology 148(11): 5355-5368 (2007); H.F. Frierson, Jr. 등, Large scale molecular analysis identifies genes with altered expression in salivary adenoid cystic carcinoma, Am. J. Pathol. 161(4): 1315-1323 (2002)]를 참고하라.
또 다른 예로서, BMPR2는 전립선암, 난소암, 골암, 결장암, 골수종, 유방암, 폐암종, 부신피질암종, 췌장암, 및 골육종에서 발현된다. 예로 [S. Yang 등, Diverse biological effect and Smad signaling of bone morphogenetic protein 7 in prostate tumor cells. Cancer Res. 65(13): 5769-5777 (2005); I.Y. Kim 등, Loss of expression of bone morphogenetic protein receptor type II in human prostate cancer cells. Oncogene 23(46): 7651-7659 (2004); H. Miyazaki 등, BMP signals inhibit proliferation and in vivo tumor growth of androgen-insensitive prostate carcinoma cells. Oncogene 23(58): 9326-9335 (2004); I.Y. Kim 등, Expression of bone morphogenetic protein receptors type-IA, -IB and -II correlates with tumor grade in human prostate cancer tissues. Cancer Res. 60(11): 2840-2844 (2000); T.G. Shepherd 및 M.W. Nachtigal. Identification of a putative autocrine bone morphogenetic protein-signaling pathway in human ovarian surface epithelium and ovarian cancer cells. Endocrinology 144(8): 3306-3314 (2003); Y. Xia 등, Repulsive guidance molecule RGMa alters utilization of bone morphogenetic protein (BMP) type II receptors by BMP2 and BMP4. J. Biol. Chem. 282(25): 18129-18140 (2007); E. Hay 등, Bone morphogenetic protein receptor IB signaling mediates apoptosis independently of differentiation in osteoblastic cells. J. Biol. Chem. 279(3): 1650-1658 (2004); W. Jin 등, TrkC binds to the bone morphogenetic protein type II receptor to suppress bone morphogenetic protein signaling. Cancer Res. 67(20): 9869-9877 (2007); R. L. Baldwin 등, Attenuated ALK5 receptor expression in human pancreatic cancer: correlation with resistance to growth inhibition. Int. J. Cancer 67(2): 283-288 (1996); H. Deng 등, Bone morphogenetic protein-4 is overexpressed in colonic adenocarcinomas and promotes migration and invasion of HCT116 cells. Exp. Cell Res. 313(5): 1033-1044 (2007); T.B. Ro 등, Bone morphogenetic protein-5, -6 and -7 inhibit growth and induce apoptosis in human myeloma cells. Oncogene 23(17): 3024-3032 (2004); M. Fan 등, Diverse gene expression and DNA methylation profiles correlate with differential adaptation of breast cancer cells to the antiestrogens tamoxifen and fulvestrant. Cancer Res. 66(24): 11954-11966 (2006); J.A. McEarchern 등, Invasion and metastasis of a mammary tumor involves TGF-beta signaling.Int. J. Cancer 91(1): 76-82 (2001); V.C. Foletta 등, Direct signaling by the BMP type II receptor via the cytoskeletal regulator LIMK1. J. Cell Biol. 162(6): 1089-1098 (2003); I.K. Johnsen 등, Bone morphogenetic proteins 2 and 5 are down-regulated in adrenocortical carcinoma and modulate adrenal cell proliferation and steroidogenesis. Cancer Res. 69(14): 5784-5792 (2009); J. Kleeff 등, Bone morphogenetic protein 2 exerts diverse effects on cell growth in vitro and is expressed in human pancreatic cancer in vivo. Gastroenterol. 116(5): 1202-1216 (1999); G. Gobbi 등, Seven BMPs and all their receptors are simultaneously expressed in osteosarcoma cells. Int. J. Oncology 20(1): 143-147 (2002); R. Mehdi 등, Expression of bone morphogenetic protein and its receptors in osteosarcoma and malignant fibrous histiocytoma. Jap. J. Clin. Oncol. 30(6): 272-275 (2000)]을 참고하라.
이처럼, TGFβ 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 전립선암, 백혈병, 신세포 암종, 크롬친화세포종, 갑상선암, 뇌하수체암, 결장암, 림프종, 위암, 유방암, 골육종, 섬유육종, 간암, 간세포암종, 유두 갑상샘 암종, 골수종, 췌장암, 고환 종양, 난소암, 자궁경부암종, 자궁내막 선암종, 자궁내막유사암종, 흑색종, 횡문근육종, 편평 세포 암종, 신경모세포종, 부신피질암, 침샘낭암종 암종, 또는 위선암종을 포함하는 암 치료에 효과적일 것이다.
따라서, 구현예에서, 표적화 도메인은 TGFβ 펩타이드 표적화 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, TGFβ 펩타이드 표적화 도메인은 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 또는 TGFβ4을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, TGFβ 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 107, 서열번호: 108, 서열번호: 109, 또는 서열번호: 110을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, TGFβ 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 107의 아미노산 293-390, 서열번호: 108의 아미노산 317-414, 서열번호: 109의 아미노산 315-412, 또는 서열번호: 110의 아미노산 276-373을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, TGFβ 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 107, 서열번호: 108, 서열번호: 109, 또는 서열번호: 110에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 107, 서열번호: 108, 서열번호: 109, 또는 서열번호: 110에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TGFβ 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 107, 서열번호: 108, 서열번호: 109, 또는 서열번호: 110에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 107, 서열번호: 108, 서열번호: 109, 또는 서열번호: 110에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TGFβ 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 107, 서열번호: 108, 서열번호: 109, 또는 서열번호: 110에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 107, 서열번호: 108, 서열번호: 109, 또는 서열번호: 110에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, TGFβ 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 107의 아미노산 293-390, 서열번호: 108의 아미노산 317-414, 서열번호: 109의 아미노산 315-412, 또는 서열번호: 110의 아미노산 276-373에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 107의 아미노산 293-390, 서열번호: 108의 아미노산 317-414, 서열번호: 109의 아미노산 315-412, 또는 서열번호: 110의 아미노산 276-373에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TGFβ 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 107의 아미노산 293-390, 서열번호: 108의 아미노산 317-414, 서열번호: 109의 아미노산 315-412, 또는 서열번호: 110의 아미노산 276-373에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 107의 아미노산 293-390, 서열번호: 108의 아미노산 317-414, 서열번호: 109의 아미노산 315-412, 또는 서열번호: 110의 아미노산 276-373에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, TGFβ 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 107의 아미노산 293-390, 서열번호: 108의 아미노산 317-414, 서열번호: 109의 아미노산 315-412, 또는 서열번호: 110의 아미노산 276-373에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 107의 아미노산 293-390, 서열번호: 108의 아미노산 317-414, 서열번호: 109의 아미노산 315-412, 또는 서열번호: 110의 아미노산 276-373에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인의 다른 예는 뼈 형성 단백질 (BMP) 펩타이드 표적화 도메인이다. BMP 펩타이드 표적화 도메인의 비제한적인 예는 BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8 또는 BMP10을 포함한다. BMP 펩타이드는 단백질 수용체의 패밀리에 결합한다. 예를 들어, BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP10, 및 BMP15는 BMPR1A에 결합하고; BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP10, 및 BMP15는 BMPR1B에 결합하고; BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP10, 및 BMP15는 BMPR2에 결합한다. 또한, BMP2 및 BMP7은 ACVR2A에 결합한다.
BMP 수용체는 몇몇 상이한 유형의 암 세포의 표면 상에서 검출되었다. 예를 들어 BMPR1A는 전립선암, 담관암, 난소암, 골암, 결장암, 골수종, 교모세포종, 편평 세포 암종, 부신피질암종, 췌장암, 골육종에서 발현된다. 예로 [S. Yang 등, Diverse biological effect and Smad signaling of bone morphogenetic protein 7 in prostate tumor cells. Cancer Res. 65(13): 5769-5777 (2005); H. Miyazaki 등, BMP signals inhibit proliferation and in vivo tumor growth of androgen-insensitive prostate carcinoma cells.Oncogene 23(58): 9326-9335 (2004); D.R. Haudenschild 등, Bone morphogenetic protein (BMP)-6 signaling and BMP antagonist noggin in prostate cancer. Cancer Res. 64(22): 8276-8284 (2004); I.Y. Kim 등, Expression of bone morphogenetic protein receptors type-IA, -IB and -II correlates with tumor grade in human prostate cancer tissues. Cancer Res. 60(11): 2840-2844 (2000); D.E. Hansel 등, Identification of novel cellular targets in biliary tract cancers using global gene expression technology. Am. J. Pathol. 163(1): 217-229 (2003); T.G. Shepherd 및 M.W. Nachtigal. Identification of a putative autocrine bone morphogenetic protein-signaling pathway in human ovarian surface epithelium and ovarian cancer cells. Endocrinology 144(8): 3306-3314 (2003); E. Hay 등, Bone morphogenetic protein receptor IB signaling mediates apoptosis independently of differentiation in osteoblastic cells. J. Biol. Chem. 279(3): 1650-1658 (2004); W. Jin 등, TrkC binds to the bone morphogenetic protein type II receptor to suppress bone morphogenetic protein signaling. Cancer Res. 67(20): 9869-9877 (2007); H. Deng 등, Bone morphogenetic protein-4 is overexpressed in colonic adenocarcinomas and promotes migration and invasion of HCT116 cells. Exp. Cell Res. 313(5): 1033-1044 (2007); T.B. Ro 등, Bone morphogenetic protein-5, -6 and -7 inhibit growth and induce apoptosis in human myeloma cells. Oncogene 23(17): 3024-3032 (2004); P. ten Dijke 등, Identification of type I receptors for osteogenic protein-1 and bone morphogenetic protein-4. J. Biol. Chem. 269: 16985-16988 (1994); N. Yamada 등, Bone morphogenetic protein type IB receptor is progressively expressed in malignant glioma tumours. Br. J. Cancer 73(5): 624-629 (1996); Y. Jin 등, Overexpression of BMP-2/4, -5 and BMPR-IA associated with malignancy of oral epithelium. Oral Oncol. 37: 225-233 (2001); A.F. Soares 등, Bone morphogenetic protein-2/4 and bone morphogenetic protein receptor type IA expression in metastatic and nonmetastatic oral squamous cell carcinoma. Am. J. Otolaryngol. 31(4): 266-271 (2010); I.K. Johnsen 등, Bone morphogenetic proteins 2 and 5 are down-regulated in adrenocortical carcinoma and modulate adrenal cell proliferation and steroidogenesis. Cancer Res. 69(14): 5784-5792 (2009); J. Kleeff 등, Bone morphogenetic protein 2 exerts diverse effects on cell growth in vitro and is expressed in human pancreatic cancer in vivo. Gastroenterol. 116(5): 1202-1216 (1999); G. Gobbi 등, Seven BMPs and all their receptors are simultaneously expressed in osteosarcoma cells. Int. J. Oncology 20(1): 143-147 (2002); 및 R. Mehdi 등, Expression of bone morphogenetic protein and its receptors in osteosarcoma and malignant fibrous histiocytoma. Jap. J. Clin. Oncol. 30(6): 272-275 (2000)]을 참고하라.
또 다른 예로서, BMPR1B는 전립선암, 난소암, 골암, 결장암, 골수종, 고환암, 유방암, 교모세포종, 부신피질암종, 및 골육종에서 발현된다. 예로 [S. Yang 등, Diverse biological effect and Smad signaling of bone morphogenetic protein 7 in prostate tumor cells. Cancer Res. 65(13): 5769-5777 (2005); D.L. Segev 등, Mullerian-inhibiting substance regulates NF-kappa B signaling in the prostate in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(1): 239-244 (2002); I.Y. Kim 등, Loss of expression of bone morphogenetic protein receptor type II in human prostate cancer cells. Oncogene 23(46): 7651-7659 (2004); H. Miyazaki 등, BMP signals inhibit proliferation and in vivo tumor growth of androgen-insensitive prostate carcinoma cells. Oncogene 23(58): 9326-9335 (2004); I.Y. Kim 등, Expression of bone morphogenetic protein receptors type-IA, -IB and -II correlates with tumor grade in human prostate cancer tissues. Cancer Res. 60(11): 2840-2844 (2000); T.G. Shepherd 및 M.W. Nachtigal. Identification of a putative autocrine bone morphogenetic protein-signaling pathway in human ovarian surface epithelium and ovarian cancer cells. Endocrinology 144(8): 3306-3314 (2003); E. Hay 등, Bone morphogenetic protein receptor IB signaling mediates apoptosis independently of differentiation in osteoblastic cells. J. Biol. Chem. 279(3): 1650-1658 (2004); W. Jin 등, TrkC binds to the bone morphogenetic protein type II receptor to suppress bone morphogenetic protein signaling. Cancer Res. 67(20): 9869-9877 (2007); T.B. Ro 등, Bone morphogenetic protein-5, -6 and -7 inhibit growth and induce apoptosis in human myeloma cells. Oncogene 23(17): 3024-3032 (2004); L. Gouedard 등, Engagement of bone morphogenetic protein type IB receptor and Smad1 signaling by anti-Muellerian hormone and its type II receptor. J. Biol. Chem. 275(36): 27973-27978 (2000); V.M. Laurich 등, Muellerian inhibiting substance blocks the protein kinase A-induced expression of cytochrome p450 17alpha-hydroxylase/C(17-20) lyase mRNA in a mouse Leydig cell line independent of cAMP responsive element binding protein phosphorylation. Endocrinology 143(9): 3351-3360 (2002); M.W. Helms 등, First evidence supporting a potential role for the BMP/SMAD pathway in the progression of oestrogen receptor-positive breast cancer. J. Pathol. 206: 366-376 (2005); P. ten Dijke 등, Identification of type I receptors for osteogenic protein-1 and bone morphogenetic protein-4. J. Biol. Chem. 269: 16985-16988 (1994); N. Yamada 등, Bone morphogenetic protein type IB receptor is progressively expressed in malignant glioma tumours. Br. J. Cancer 73(5): 624-629 (1996); I.K. Johnsen 등, Bone morphogenetic proteins 2 and 5 are down-regulated in adrenocortical carcinoma and modulate adrenal cell proliferation and steroidogenesis. Cancer Res. 69(14): 5784-5792 (2009); G. Gobbi 등, Seven BMPs and all their receptors are simultaneously expressed in osteosarcoma cells. Int. J. Oncology 20(1): 143-147 (2002); R. Mehdi 등, Expression of bone morphogenetic protein and its receptors in osteosarcoma and malignant fibrous histiocytoma. Jap. J. Clin. Oncol. 30(6): 272-275 (2000)]을 참고하라.
또 다른 예로서, BMPR2는 전립선암, 난소암, 골암, 결장암, 골수종, 유방암, 폐암종, 부신피질암종, 췌장암, 및 골육종에서 발현된다. 예로 [S. Yang 등, Diverse biological effect and Smad signaling of bone morphogenetic protein 7 in prostate tumor cells. Cancer Res. 65(13): 5769-5777 (2005); I.Y. Kim 등, Loss of expression of bone morphogenetic protein receptor type II in human prostate cancer cells. Oncogene 23(46): 7651-7659 (2004); H. Miyazaki 등, BMP signals inhibit proliferation and in vivo tumor growth of androgen-insensitive prostate carcinoma cells. Oncogene 23(58): 9326-9335 (2004); I.Y. Kim 등, Expression of bone morphogenetic protein receptors type-IA, -IB and -II correlates with tumor grade in human prostate cancer tissues. Cancer Res. 60(11): 2840-2844 (2000); T.G. Shepherd 및 M.W. Nachtigal. Identification of a putative autocrine bone morphogenetic protein-signaling pathway in human ovarian surface epithelium and ovarian cancer cells. Endocrinology 144(8): 3306-3314 (2003); Y. Xia 등, Repulsive guidance molecule RGMa alters utilization of bone morphogenetic protein (BMP) type II receptors by BMP2 and BMP4. J. Biol. Chem. 282(25): 18129-18140 (2007); E. Hay 등, Bone morphogenetic protein receptor IB signaling mediates apoptosis independently of differentiation in osteoblastic cells. J. Biol. Chem. 279(3): 1650-1658 (2004); W. Jin 등, TrkC binds to the bone morphogenetic protein type II receptor to suppress bone morphogenetic protein signaling. Cancer Res. 67(20): 9869-9877 (2007); R. L. Baldwin 등, Attenuated ALK5 receptor expression in human pancreatic cancer: correlation with resistance to growth inhibition. Int. J. Cancer 67(2): 283-288 (1996); H. Deng 등, Bone morphogenetic protein-4 is overexpressed in colonic adenocarcinomas and promotes migration and invasion of HCT116 cells. Exp. Cell Res. 313(5): 1033-1044 (2007); T.B. Ro 등, Bone morphogenetic protein-5, -6 and -7 inhibit growth and induce apoptosis in human myeloma cells. Oncogene 23(17): 3024-3032 (2004); M. Fan 등, Diverse gene expression and DNA methylation profiles correlate with differential adaptation of breast cancer cells to the antiestrogens tamoxifen and fulvestrant. Cancer Res. 66(24): 11954-11966 (2006); J.A. McEarchern 등, Invasion and metastasis of a mammary tumor involves TGF-beta signaling.Int. J. Cancer 91(1): 76-82 (2001); V.C. Foletta 등, Direct signaling by the BMP type II receptor via the cytoskeletal regulator LIMK1. J. Cell Biol. 162(6): 1089-1098 (2003); I.K. Johnsen 등, Bone morphogenetic proteins 2 and 5 are down-regulated in adrenocortical carcinoma and modulate adrenal cell proliferation and steroidogenesis. Cancer Res. 69(14): 5784-5792 (2009); J. Kleeff 등, Bone morphogenetic protein 2 exerts diverse effects on cell growth in vitro and is expressed in human pancreatic cancer in vivo. Gastroenterol. 116(5): 1202-1216 (1999); G. Gobbi 등, Seven BMPs and all their receptors are simultaneously expressed in osteosarcoma cells. Int. J. Oncology 20(1): 143-147 (2002); R. Mehdi 등, Expression of bone morphogenetic protein and its receptors in osteosarcoma and malignant fibrous histiocytoma. Jap. J. Clin. Oncol. 30(6): 272-275 (2000)]을 참고하라.
이처럼, BMP 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 전립선암, 백혈병, 담관암, 난소암, 골암, 골육종, 결장암, 골수종, 고환암, 고환 종양, 유방암, 교모세포종, 편평 세포 암종, 폐암종, 부신피질암종, 뇌하수체암, 자궁내막유사암종, 간암, 간세포암종, 위선암종, 또는 췌장암을 포함하는 암 치료에 효과적일 것이다.
따라서, 구현예에서, 표적화 도메인은 BMP 펩타이드 표적화 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BMP 펩타이드 표적화 도메인은 BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8 또는 BMP10을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, BMP 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 111, 서열번호: 112, 서열번호: 113, 서열번호: 114, 서열번호: 115, 서열번호: 116, 서열번호: 117, 또는 서열번호: 118을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, BMP 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 111의 아미노산 296-396, 서열번호: 112의 아미노산 370-472, 서열번호: 113의 아미노산 309-409, 서열번호: 114의 아미노산 353-454 또는 아미노산 323-454, 서열번호: 115의 아미노산 412-513 또는 아미노산 374-513, 서열번호: 116의 아미노산 330-431 또는 아미노산 293-431, 서열번호: 117의 아미노산 301-402, 또는 서열번호: 118의 아미노산 323-424을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BMP 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 111, 서열번호: 112, 서열번호: 113, 서열번호: 114, 서열번호: 115, 서열번호: 116, 서열번호: 117, 또는 서열번호: 118에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 서열번호: 111, 서열번호: 112, 서열번호: 113, 서열번호: 114, 서열번호: 115, 서열번호: 116, 서열번호: 117, 또는 서열번호: 118에 대해 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BMP 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 111, 서열번호: 112, 서열번호: 113, 서열번호: 114, 서열번호: 115, 서열번호: 116, 서열번호: 117, 또는 서열번호: 118에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 111, 서열번호: 112, 서열번호: 113, 서열번호: 114, 서열번호: 115, 서열번호: 116, 서열번호: 117, 또는 서열번호: 118에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BMP 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 111, 서열번호: 112, 서열번호: 113, 서열번호: 114, 서열번호: 115, 서열번호: 116, 서열번호: 117, 또는 서열번호: 118에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 111, 서열번호: 112, 서열번호: 113, 서열번호: 114, 서열번호: 115, 서열번호: 116, 서열번호: 117, 또는 서열번호: 118에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, BMP 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 111의 아미노산 296-396, 서열번호: 112의 아미노산 370-472, 서열번호: 113의 아미노산 309-409, 서열번호: 114의 아미노산 353-454 또는 아미노산 323-454, 서열번호: 115의 아미노산 412-513 또는 아미노산 374-513, 서열번호: 116의 아미노산 330-431 또는 아미노산 293-431, 서열번호: 117의 아미노산 301-402, 또는 서열번호: 118의 아미노산 323-424에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 서열번호: 111의 아미노산 296-396, 서열번호: 112의 아미노산 370-472, 서열번호: 113의 아미노산 309-409, 서열번호: 114의 아미노산 353-454 또는 아미노산 323-454, 서열번호: 115의 아미노산 412-513 또는 아미노산 374-513, 서열번호: 116의 아미노산 330-431 또는 아미노산 293-431, 서열번호: 117의 아미노산 301-402, 또는 서열번호: 118의 아미노산 323-424에 대해 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BMP 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 111의 아미노산 296-396, 서열번호: 112의 아미노산 370-472, 서열번호: 113의 아미노산 309-409, 서열번호: 114의 아미노산 353-454 또는 아미노산 323-454, 서열번호: 115의 아미노산 412-513 또는 아미노산 374-513, 서열번호: 116의 아미노산 330-431 또는 아미노산 293-431, 서열번호: 117의 아미노산 301-402, 또는 서열번호: 118의 아미노산 323-424에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 111의 아미노산 296-396, 서열번호: 112의 아미노산 370-472, 서열번호: 113의 아미노산 309-409, 서열번호: 114의 아미노산 353-454 또는 아미노산 323-454, 서열번호: 115의 아미노산 412-513 또는 아미노산 374-513, 서열번호: 116의 아미노산 330-431 또는 아미노산 293-431, 서열번호: 117의 아미노산 301-402, 또는 서열번호: 118의 아미노산 323-424에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, BMP 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 111의 아미노산 296-396, 서열번호: 112의 아미노산 370-472, 서열번호: 113의 아미노산 309-409, 서열번호: 114의 아미노산 353-454 또는 아미노산 323-454, 서열번호: 115의 아미노산 412-513 또는 아미노산 374-513, 서열번호: 116의 아미노산 330-431 또는 아미노산 293-431, 서열번호: 117의 아미노산 301-402, 또는 서열번호: 118의 아미노산 323-424에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 111의 아미노산 296-396, 서열번호: 112의 아미노산 370-472, 서열번호: 113의 아미노산 309-409, 서열번호: 114의 아미노산 353-454 또는 아미노산 323-454, 서열번호: 115의 아미노산 412-513 또는 아미노산 374-513, 서열번호: 116의 아미노산 330-431 또는 아미노산 293-431, 서열번호: 117의 아미노산 301-402, 또는 서열번호: 118의 아미노산 323-424에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인의 다른 예는 성장 및 분화 인자 (GDF) 펩타이드 표적화 도메인을 포함한다. GDF 펩타이드 표적화 도메인의 비제한적인 예는 GDF1, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF10, GDF11 또는 GDF15을 포함한다. GDF 펩타이드는 TGFβ의 멤버 외의 액티빈 단백질 수용체 패밀리 및 단백질 수용체의 BMP 패밀리에 결합한다. 예를 들어, GDF2는 BMPR2외의 액티빈 A 수용체 유형 II 유사 1 (ACVRL1) 및 액티빈 A 수용체, 유형 I (ACVR1)에 결합하고; GDF3은 액티빈 A 수용체, 유형 IB (ACVR1B) 및 액티빈 A 수용체, 유형 IIB (ACVR2B)에 결합하고; GDF5는 BMPR1A, BMPR1B, 및 BMPR2 외의 ACVR1, ACVR1B, ACVR2B에 결합하고; GDF6은 BMPR1A, BMPR1B, 및 BMPR2에 결합하고; GDF8은 ACVR2A 및 ACVR2B에 결합하고; GDF9는 BMPR2에 결합하고; GDF11는 TGFBR1 외의 ACVR1B, ACVR1C, 액티빈 A 수용체, 유형 IIA (ACVR2A), ACVR2B에 결합한다.
GDF 수용체는 몇몇 상이한 유형의 암 세포의 표면 상에서 검출되었다. 상기에서 논의된 바와 같이, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, 및 TGFBR1은 다양한 암 세포에서 발현된다. 또한 액티빈 수용체는 몇몇 상이한 유형의 암 세포의 표면 상에서 발현된다. 예를 들어 ACVR1은 전립선암, 신세포 암종, 백혈병, 뇌하수체암, 간암, 간세포암종, 골수종, 및 췌장암에서 발현된다. 예로 [H. Miyazaki 등, BMP signals inhibit proliferation and in vivo tumor growth of androgen-insensitive prostate carcinoma cells, Oncogene 23(58): 9326-9335 (2004); S. Yang 등, Diverse biological effect and Smad signaling of bone morphogenetic protein 7 in prostate tumor cells. Cancer Res. 65(13): 5769-5777 (2005); Q.F. Wang 등, Activin inhibits basal and androgen-stimulated proliferation and induces apoptosis in the human prostatic cancer cell line, LNCaP, Endocrinology 137(12): 5476-5483 (1996); A.C. Dalkin 등, Activin inhibition of prostate cancer cell growth: selective actions on androgen-responsive LNCaP cells, Endocrinology 137(12): 5230-5235 (1996); S. Naito 등, Establishment of two human renal cell carcinoma cell lines with different chemosensitivity, Hum. Cell 9(2): 101-108 (1996); J.J. Lebrun 및 W.W. Vale, Activin and inhibin have antagonistic effects on ligand-dependent heteromerization of the type I and type II activin receptors and human erythroid differentiation, Mol. Cell Biol. 17(3): 1682-1691 (1997); K. Tsuchida 등, Cloning and characterization of a transmembrane serine kinase that acts as an activin type I receptor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(23):11242-11246 (1993); W. Chen 등, Activin A-induced HepG2 liver cell apoptosis: involvement of activin receptors and smad proteins, Endocrinology 141(3): 1263-1272 (2000); K. Wagner 등, Activin A stimulates vascular endothelial growth factor gene transcription in human hepatocellular carcinoma cells, Gastroenterology 126(7): 1828-1843 (2004); T. Baade Ro 등, Bone morphogenetic protein-5, -6 and -7 inhibit growth and induce apoptosis in human myeloma cells, Oncogene 23(17): 3024-3032 (2004); 및 R.L. Baldwin 등, Attenuated ALK5 receptor expression in human pancreatic cancer: correlation with resistance to growth inhibition, Int. J. Cancer 67(2): 283-288 (1996)]을 참고하라.
또 다른 예로서, ACVR1B는 전립선암, 백혈병, 고환 종양, 간암, 및 간세포암종에서 발현된다. 예로 [Q.F. Wang 등, Activin inhibits basal and androgen-stimulated proliferation and induces apoptosis in the human prostatic cancer cell line, LNCaP, Endocrinology 137(12): 5476-5483 (1996); A.C. Dalkin 등, Activin inhibition of prostate cancer cell growth: selective actions on androgen-responsive LNCaP cells, Endocrinology 137(12): 5230-5235 (1996); S. Naito 등, Establishment of two human renal cell carcinoma cell lines with different chemosensitivity, Hum. Cell 9(2): 101-108 (1996); J.J. Lebrun 및 W.W. Vale, Activin and inhibin have antagonistic effects on ligand-dependent heteromerization of the type I and type II activin receptors and human erythroid differentiation, Mol. Cell Biol. 17(3): 1682-1691 (1997); N. Di Simone 등, Activin regulates betaA-subunit and activin receptor messenger ribonucleic acid and cellular proliferation in activin-responsive testicular tumor cells, Endocrinology 139(3): 1147-1155 (1998); W. Chen 등, Activin A-induced HepG2 liver cell apoptosis: involvement of activin receptors and smad proteins, Endocrinology 141(3): 1263-1272 (2000); 및 K. Wagner 등, Activin A stimulates vascular endothelial growth factor gene transcription in human hepatocellular carcinoma cells, Gastroenterology 126(7): 1828-1843 (2004)]를 참고하라.
또 다른 예로서, ACVR2A는 전립선암, 난소암, 백혈병, 결장암, 뇌하수체암, 자궁내막유사암종, 고환 종양, 간암, 간세포암종, 췌장암, 및 위선암종에서 발현된다, 예로 [H. Miyazaki 등, BMP signals inhibit proliferation and in vivo tumor growth of androgen-insensitive prostate carcinoma cells, Oncogene 23(58): 9326-9335 (2004); S. Yang 등, Diverse biological effect and Smad signaling of bone morphogenetic protein 7 in prostate tumor cells. Cancer Res. 65(13): 5769-5777 (2005); Q.F. Wang 등, Activin inhibits basal and androgen-stimulated proliferation and induces apoptosis in the human prostatic cancer cell line, LNCaP, Endocrinology 137(12): 5476-5483 (1996); A.C. Dalkin 등, Activin inhibition of prostate cancer cell growth: selective actions on androgen-responsive LNCaP cells, Endocrinology 137(12): 5230-5235 (1996); S. Naito 등, Establishment of two human renal cell carcinoma cell lines with different chemosensitivity, Hum. Cell 9(2): 101-108 (1996); N. Di Simone 등, Characterization of inhibin/activin subunit, follistatin, and activin type II receptors in human ovarian cancer cell lines: a potential role in autocrine growth regulation, Endocrinology 137(2): 486-494 (1996); T. Minegishi 등, Expression of gonadotropin and activin receptor messenger ribonucleic acid in human ovarian epithelial neoplasms, Clin. Cancer Res. 6(7): 2764-2770 (2000); J.J. Lebrun 및 W.W. Vale, Activin and inhibin have antagonistic effects on ligand-dependent heteromerization of the type I and type II activin receptors and human erythroid differentiation, Mol. Cell Biol. 17(3): 1682-1691 (1997); Y. Mori 등, Instabilotyping reveals unique mutational spectra in microsatellite-unstable gastric cancers, Cancer Res. 62(13): 3641-3645 (2002); K. Tsuchida 등, Cloning and characterization of a transmembrane serine kinase that acts as an activin type I receptor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(23):11242-11246 (1993); N. Di Simone 등, Activin regulates betaA-subunit and activin receptor messenger ribonucleic acid and cellular proliferation in activin-responsive testicular tumor cells, Endocrinology 139(3): 1147-1155 (1998); W. Chen 등, Activin A-induced HepG2 liver cell apoptosis: involvement of activin receptors and smad proteins, Endocrinology 141(3): 1263-1272 (2000); K. Wagner 등, Activin A stimulates vascular endothelial growth factor gene transcription in human hepatocellular carcinoma cells, Gastroenterology 126(7): 1828-1843 (2004); 및 M. Cattaneo 등, SEL1L affects human pancreatic cancer cell cycle and invasiveness through modulation of PTEN and genes related to cell-matrix interactions, Neoplasia 7(11): 1030-1038 (2005)]를 참고하라.
또 다른 예로서, ACVR2B는 전립선암, 난소암, 백혈병, 결장암, 자궁내막유사암종, 고환 종양, 간암, 간세포암종, 및 췌장암에서 발현된다. 예로 [H. Miyazaki 등, BMP signals inhibit proliferation and in vivo tumor growth of androgen-insensitive prostate carcinoma cells, Oncogene 23(58): 9326-9335 (2004); S. Yang 등, Diverse biological effect and Smad signaling of bone morphogenetic protein 7 in prostate tumor cells. Cancer Res. 65(13): 5769-5777 (2005); Q.F. Wang 등, Activin inhibits basal and androgen-stimulated proliferation and induces apoptosis in the human prostatic cancer cell line, LNCaP, Endocrinology 137(12): 5476-5483 (1996); D.R. Haudenschild 등, Bone Morphogenetic protein (BMP)-6 Signaling and BMP Antagonist Noggin in Prostate Cancer, Cancer Res. 64(22): 8276-8284 (2004); N. Di Simone 등, Characterization of inhibin/activin subunit, follistatin, and activin type II receptors in human ovarian cancer cell lines: a potential role in autocrine growth regulation, Endocrinology 137(2): 486-494 (1996); T. Minegishi 등, Expression of gonadotropin and activin receptor messenger ribonucleic acid in human ovarian epithelial neoplasms, Clin. Cancer Res. 6(7): 2764-2770 (2000); B.K. Shin 등, Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function, J. Biol. Chem. 278(9): 7607-7616 (2003); J.J. Lebrun 및 W.W. Vale, Activin and inhibin have antagonistic effects on ligand-dependent heteromerization of the type I and type II activin receptors and human erythroid differentiation, Mol. Cell Biol. 17(3): 1682-1691 (1997); N. Di Simone 등, Activin regulates betaA-subunit and activin receptor messenger ribonucleic acid and cellular proliferation in activin-responsive testicular tumor cells, Endocrinology 139(3): 1147-1155 (1998); W. Chen 등, Activin A-induced HepG2 liver cell apoptosis: involvement of activin receptors and smad proteins, Endocrinology 141(3): 1263-1272 (2000); K. Wagner 등, Activin A stimulates vascular endothelial growth factor gene transcription in human hepatocellular carcinoma cells, Gastroenterology 126(7): 1828-1843 (2004); 및 M. Cattaneo 등, SEL1L affects human pancreatic cancer cell cycle and invasiveness through modulation of PTEN and genes related to cell-matrix interactions, Neoplasia 7(11): 1030-1038 (2005)]를 참고하라.
이처럼, GDF 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 전립선암, 신세포 암종, 크롬친화세포종, 담관암, 난소암, 고환 종양, 골암, 갑상선암, 유두 갑상샘 암종, 뇌하수체암, 자궁내막유사암종, 결장암, 골수종, 림프종, 백혈병, 고환암, 위암, 위선암종, 유방암, 교모세포종, 섬유육종, 간암, 간세포암종, 편평 세포 암종, 폐암종, 부신피질암종, 췌장암, 또는 골육종을 포함하는 암 치료에 효과적일 것이다.
따라서, 구현예에서, 표적화 도메인은 GDF 펩타이드 표적화 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, GDF 펩타이드 표적화 도메인은 GDF1, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF10, GDF11 또는 GDF15을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, GDF 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 119, 서열번호: 120, 서열번호: 121, 서열번호: 122, 서열번호: 123, 서열번호: 124, 서열번호: 125, 서열번호: 126, 서열번호: 127, 또는 서열번호: 128을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, GDF 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 119의 아미노산 267-372, 서열번호: 120의 아미노산 327-429, 서열번호: 121의 아미노산 264-364, 서열번호: 122의 아미노산 400-501, 서열번호: 123의 아미노산 354-455, 서열번호: 124의 아미노산 352-450, 서열번호: 125의 아미노산 281-375, 서열번호: 126의 아미노산 376-478, 서열번호: 127의 아미노산 313-407, 또는 서열번호: 128의 아미노산 211-308을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, GDF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 119, 서열번호: 120, 서열번호: 121, 서열번호: 122, 서열번호: 123, 서열번호: 124, 서열번호: 125, 서열번호: 126, 서열번호: 127, 또는 서열번호: 128에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 119, 서열번호: 120, 서열번호: 121, 서열번호: 122, 서열번호: 123, 서열번호: 124, 서열번호: 125, 서열번호: 126, 서열번호: 127, 또는 서열번호: 128에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, GDF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 119, 서열번호: 120, 서열번호: 121, 서열번호: 122, 서열번호: 123, 서열번호: 124, 서열번호: 125, 서열번호: 126, 서열번호: 127, 또는 서열번호: 128에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 119, 서열번호: 120, 서열번호: 121, 서열번호: 122, 서열번호: 123, 서열번호: 124, 서열번호: 125, 서열번호: 126, 서열번호: 127, 또는 서열번호: 128에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, GDF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 119, 서열번호: 120, 서열번호: 121, 서열번호: 122, 서열번호: 123, 서열번호: 124, 서열번호: 125, 서열번호: 126, 서열번호: 127, 또는 서열번호: 128에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 119, 서열번호: 120, 서열번호: 121, 서열번호: 122, 서열번호: 123, 서열번호: 124, 서열번호: 125, 서열번호: 126, 서열번호: 127, 또는 서열번호: 128에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, GDF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 119의 아미노산 267-372, 서열번호: 120의 아미노산 327-429, 서열번호: 121의 아미노산 264-364, 서열번호: 122의 아미노산 400-501, 서열번호: 123의 아미노산 354-455, 서열번호: 124의 아미노산 352-450, 서열번호: 125의 아미노산 281-375, 서열번호: 126의 아미노산 376-478, 서열번호: 127의 아미노산 313-407, 또는 서열번호: 128의 아미노산 211-308에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 119의 아미노산 267-372, 서열번호: 120의 아미노산 327-429, 서열번호: 121의 아미노산 264-364, 서열번호: 122의 아미노산 400-501, 서열번호: 123의 아미노산 354-455, 서열번호: 124의 아미노산 352-450, 서열번호: 125의 아미노산 281-375, 서열번호: 126의 아미노산 376-478, 서열번호: 127의 아미노산 313-407, 또는 서열번호: 128의 아미노산 211-308에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, GDF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 119의 아미노산 267-372, 서열번호: 120의 아미노산 327-429, 서열번호: 121의 아미노산 264-364, 서열번호: 122의 아미노산 400-501, 서열번호: 123의 아미노산 354-455, 서열번호: 124의 아미노산 352-450, 서열번호: 125의 아미노산 281-375, 서열번호: 126의 아미노산 376-478, 서열번호: 127의 아미노산 313-407, 또는 서열번호: 128의 아미노산 211-308에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 119의 아미노산 267-372, 서열번호: 120의 아미노산 327-429, 서열번호: 121의 아미노산 264-364, 서열번호: 122의 아미노산 400-501, 서열번호: 123의 아미노산 354-455, 서열번호: 124의 아미노산 352-450, 서열번호: 125의 아미노산 281-375, 서열번호: 126의 아미노산 376-478, 서열번호: 127의 아미노산 313-407, 또는 서열번호: 128의 아미노산 211-308에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, GDF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 119의 아미노산 267-372, 서열번호: 120의 아미노산 327-429, 서열번호: 121의 아미노산 264-364, 서열번호: 122의 아미노산 400-501, 서열번호: 123의 아미노산 354-455, 서열번호: 124의 아미노산 352-450, 서열번호: 125의 아미노산 281-375, 서열번호: 126의 아미노산 376-478, 서열번호: 127의 아미노산 313-407, 또는 서열번호: 128의 아미노산 211-308에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 119의 아미노산 267-372, 서열번호: 120의 아미노산 327-429, 서열번호: 121의 아미노산 264-364, 서열번호: 122의 아미노산 400-501, 서열번호: 123의 아미노산 354-455, 서열번호: 124의 아미노산 352-450, 서열번호: 125의 아미노산 281-375, 서열번호: 126의 아미노산 376-478, 서열번호: 127의 아미노산 313-407, 또는 서열번호: 128의 아미노산 211-308에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인의 다른 예는 액티빈 펩타이드 표적화 도메인이다. 액티빈 펩타이드 표적화 도메인의 비제한적인 예는 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 인히빈 A, 또는 인히빈 B을 포함한다. 액티빈 펩타이드는 단백질 수용체뿐만 아니라 TGFβ 수용체 멤버의 액티빈 패밀리에 결합한다. 예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E와 같은 액티빈 펩타이드는 ACVR2A 및 ACVR2B에 결합하고; 인히빈 A은 TGFBR3 외의 ACVR1, ACVR1B, ACVR2A, 및 ACVR2B에 결합하고; 인히빈 B는 ACVR1, ACVR1B, ACVR2A, 및 ACVR2B에 결합한다.
액티빈 수용체는 몇 개의 상이한 유형의 암 세포의 표면 상에서 검출되었다. 상기에서 논의된 바와 같이, ACVR1, ACVR1B, ACVR2A, ACVR2B, 및 TGFBR3는 다양한 암 세포에서 발현된다. 이처럼, 액티빈 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 전립선암, 신세포 암종, 난소암, 백혈병, 결장암, 뇌하수체 종양, 크롬친화세포종, 위암, 유방암, 부신 암종, 타액 선양 낭성 암종, 자궁 내막양 선암, 고환 종양, 간암, 간세포 암종, 골수종, 췌장암, 또는 위선암을 포함하는 암의 치료에 효과적이다.
따라서, 구현예에서, 표적화 도메인은 액티빈 펩타이드 표적화 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, 액티빈 펩타이드 표적화 도메인은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E 또는 인히빈 A을. 이 구현예의 측면에서, 액티빈 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 129, 서열번호: 130, 서열번호: 131, 서열번호: 132, 또는 서열번호: 133을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, 액티빈 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 129의 아미노산 321-426, 서열번호: 130의 아미노산 303-406, 서열번호: 131의 아미노산 247-352 또는 아미노산 237-352, 서열번호: 132의 아미노산 247-350, 또는 서열번호: 133의 아미노산 262-366 또는 아미노산 233-366을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, 액티빈 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 129, 서열번호: 130, 서열번호: 131, 서열번호: 132, 또는 서열번호: 133에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 129, 서열번호: 130, 서열번호: 131, 서열번호: 132, 또는 서열번호: 133에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, 액티빈 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 129, 서열번호: 130, 서열번호: 131, 서열번호: 132, 또는 서열번호: 133에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 129, 서열번호: 130, 서열번호: 131, 서열번호: 132, 또는 서열번호: 133에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, 액티빈 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 129, 서열번호: 130, 서열번호: 131, 서열번호: 132, 또는 서열번호: 133에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 129, 서열번호: 130, 서열번호: 131, 서열번호: 132, 또는 서열번호: 133에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, 액티빈 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 129의 아미노산 321-426, 서열번호: 130의 아미노산 303-406, 서열번호: 131의 아미노산 247-352 또는 아미노산 237-352, 서열번호: 132의 아미노산 247-350, 또는 서열번호: 133의 아미노산 262-366 또는 아미노산 233-366에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 129의 아미노산 321-426, 서열번호: 130의 아미노산 303-406, 서열번호: 131의 아미노산 247-352 또는 아미노산 237-352, 서열번호: 132의 아미노산 247-350, 또는 서열번호: 133의 아미노산 262-366 또는 아미노산 233-366에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, 액티빈 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 129의 아미노산 321-426, 서열번호: 130의 아미노산 303-406, 서열번호: 131의 아미노산 247-352 또는 아미노산 237-352, 서열번호: 132의 아미노산 247-350, 또는 서열번호: 133의 아미노산 262-366 또는 아미노산 233-366에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 129의 아미노산 321-426, 서열번호: 130의 아미노산 303-406, 서열번호: 131의 아미노산 247-352 또는 아미노산 237-352, 서열번호: 132의 아미노산 247-350, 또는 서열번호: 133의 아미노산 262-366 또는 아미노산 233-366에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, 액티빈 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 129의 아미노산 321-426, 서열번호: 130의 아미노산 303-406, 서열번호: 131의 아미노산 247-352 또는 아미노산 237-352, 서열번호: 132의 아미노산 247-350, 또는 서열번호: 133의 아미노산 262-366 또는 아미노산 233-366에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 129의 아미노산 321-426, 서열번호: 130의 아미노산 303-406, 서열번호: 131의 아미노산 247-352 또는 아미노산 237-352, 서열번호: 132의 아미노산 247-350, 또는 서열번호: 133의 아미노산 262-366 또는 아미노산 233-366에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인의 또 다른 예에는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 펩타이드 표적화 도메인이 있다. FGF 펩타이드 표적화 도메인의 비제한적 예에는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF17, 및 FGF18이 포함된다. 섬유아세포 성장 인자(FGF)는 복잡한 조합 신호 경로를 통해 세포의 여러 발생, 분화 및 성장 그리고 보수 절차에 참여한다. 현재 적어도 23개 리간드(FGF1-23)가 5개의 막통과 티로신 키나아제 FGF 수용체 패밀리(FGFR1-5)를 통해 신호를 보내는 것으로 공지되어 있다. 이들 리간드에 대한 FGFR의 친화도는 각각의 패밀리 성장 인자 멤버에 대해 상이한 친화도를 가지며 매우 다양하고, 예로 [C. J. Powers 등, Fibroblast growth factors , their receptors and signaling, 7(3) Endocr. Relat. Cancer. 165-197 (2000)]을 참고하라. 이 다양성은 부분적으로는 상이한 수용체 이소형을 인코딩하는 대안적으로 스플라이스된 변이체의 생성에 의해 달성되며, 예로 [Bernhard Reuss & Oliver von Bohlen und Halbach, Fibroblast growth factors and their receptors in the central nervous system, 313(2) Cell Tissue Res. 139-157 (2003)]을 참고하라. 리간드 결합 선택성에 가장 큰 영향을 갖는 것으로 나타나는 단백질 영역은 IgIII 도메인의 일부이며, 이에 대해 3개의 상이한 스플라이스 변이체가 인코딩하는 이소형이 동정되었다. IgIIIa, IgIIIb 및 IgIIIc로 명명되는 이들 3가지 이소형은 상이한 FGFR 패밀리 멤버에 대해 상대적인 결합 친화도를 갖는다. 예를 들어 FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF7, FGF-8, FGF9, FGF-10, FGF19, 및 FGF20은 FGFR1IIIb에 결합하며; FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF7, FGF-8, FGF9, FGF-10, FGF-17, FGF19, 및 FGF20은 FGFR1IIIc에 결합하고; FGF-1, FGF-3, FGF-7, 및 FGF-10은 FGFR2IIIb에 결합하고; FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-8, FGF-9, FGF-17, FGF19, 및 FGF20은 FGFR2IIIc에 결합하고; FGF-1 및 FGF-9는 FGFR3IIIb에 결합하고; FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF7, FGF-8, FGF-9, 및 FGF23은 FGFR3IIIb에 결합하고; FGF1, FGF2, FGF4, FGF5, FGF6, FGF8, FGF9, FGF16, FGF19, FGF20, FGF21, 및 FGF23은 FGFR4에 결합하고; 및 FGF-1 및 FGF-2는 FGFR5에 결합한다. a 및 b로 명명되는 FGFR 리간드 결합 도메인에서의 대안적 스플라이싱은 신규한 리간드 친화도를 갖는 추가적인 수용체 이소형을 생성한다. IgIIIa, IgIIIb 및 IgIIIc에 대한 이소형이 FGFR1 및 FGFR2 둘 다에 대해 동정되었다. 현재까지 FGFR3의 IgIIIa 이소형 및 FGFR4 및 FGFR5의 IgIIIa 및 IgIIIb 이소형은 보고되지 않았다.
FGF 수용체는 몇몇 상이한 유형의 암 세포의 표면 상에서 검출되었다. 예를 들어 FGFR1은 급성 골수모구 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 및 유방암에서 발현된다. 예로 [P. Blume-Jensen 및 T. Hunter. Oncogenic kinase signalling. Nature 411(6835): 355-365 (2001); 및 Z.Q. Yang 등, Multiple interacting oncogenes on the 8p11-p12 amplicon in human breast cancer. Cancer Res. 66(24): 11632-11643 (2006)]을 참고하라.
또 다른 예로서, FGFR2는 유방암, 자궁내막 난소암, 및 위암에서 발현된다. 예로 [D. J. Hunter 등, A genome-wide association study identifies alleles in FGFR2 associated with risk of sporadic postmenopausal breast cancer. Nat. Genet. 39(7): 870-874 (2007); D. F. Easton 등, Genome-wide association study identifies novel breast cancer susceptibility loci. Nature 447(7148): 1087-1093 (2007); S. A. Byron 등, Inhibition of activated fibroblast growth factor receptor 2 in endometrial cancer cells induces cell death despite PTEN abrogation. Cancer Res. 68(17): 6902-6907 (2008); 및 J.H. Jang 등, Mutations in fibroblast growth factor receptor 2 and fibroblast growth factor receptor 3 genes associated with human gastric and colorectal cancers. Cancer Res. 61(9): 3541-3543 (2001)]을 참고하라.
또 다른 예로서, FGFR3은 방광암, 결장암, 및 자궁경부암에서 발현된다. 예로 [B.W. van Rhijn 등, The fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) mutation is a strong indicator of superficial bladder cancer with low recurrence rate. Cancer Res. 61(4): 1265-1268 (2001); J.H. Jang 등, Mutations in fibroblast growth factor receptor 2 and fibroblast growth factor receptor 3 genes associated with human gastric and colorectal cancers. Cancer Res. 61(9): 3541-3543 (2001); A.M. Saeaef 등, Parallels between global transcriptional programs of polarizing Caco-2 intestinal epithelial cells in vitro and gene expression programs in normal colon and colon cancer. Mol. Biol. Cell 18(11): 4245-4260 (2007); 및 K. Sibley 등, Frequency of fibroblast growth factor receptor 3 mutations in sporadic tumours. Oncogene 20(32): 4416-4418 (2001)]을 참고하라.
또 다른 예로서, FGFR4는 상피 난소암, 전이, 평활근종, 및 뇌하수체 종양에서 발현된다. 예로 [L. De Cecco 등, Gene expression profiling of advanced ovarian cancer: characterization of a molecular signature involving fibroblast growth factor 2. Oncogene 23(49): 8171-8183 (2004); N. Seitzer 등, A single nucleotide change in the mouse genome accelerates breast cancer progression. Cancer Res. 70(2): 802-812 (2010); L. Yu 등, Differential expression of receptor tyrosine kinases (RTKs) and IGF-I pathway activation in human uterine leiomyomas. Mol. Med. 14(5-6): 264-275 (2008); 및 S. Ezzat 등, Targeted expression of a human pituitary tumor-derived isoform of FGF receptor-4 recapitulates pituitary tumorigenesis. J. Clin. Invest. 109(1): 69-78 (2002)]를 참고하라.
이처럼, FGF 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 유방암, 자궁내막 난소암, 위암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 상피성 난소암, 평활근종, 또는 뇌하수체 종양을 포함하는 암의 치료에 효과적이다.
따라서, 구현예에서, 표적화 도메인은 FGF 펩타이드 표적화 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, FGF 펩타이드 표적화 도메인은 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF17, 및 FGF18을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, FGF 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 134, 서열번호: 135, 서열번호: 136, 서열번호: 137, 서열번호: 138, 서열번호: 139, 서열번호: 140, 서열번호: 141, 서열번호: 142, 서열번호: 143, 서열번호: 144, 또는 서열번호: 145. 이 구현예의 다른 측면에서, FGF 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 134의 아미노산 29-151, 서열번호: 135의 아미노산 30-152, 서열번호: 136의 아미노산 46-181, 서열번호: 137의 아미노산 84-206, 서열번호: 138의 아미노산 91-219, 서열번호: 139의 아미노산 38-198, 서열번호: 140의 아미노산 67-191, 서열번호: 141의 아미노산 43-167, 서열번호: 142의 아미노산 64-191, 서열번호: 143의 아미노산 80-204, 서열번호: 144의 아미노산 55-178, 또는 서열번호: 145의 아미노산 55-177을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, FGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 134, 서열번호: 135, 서열번호: 136, 서열번호: 137, 서열번호: 138, 서열번호: 139, 서열번호: 140, 서열번호: 141, 서열번호: 142, 서열번호: 143, 서열번호: 144, 또는 서열번호: 145에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 134, 서열번호: 135, 서열번호: 136, 서열번호: 137, 서열번호: 138, 서열번호: 139, 서열번호: 140, 서열번호: 141, 서열번호: 142, 서열번호: 143, 서열번호: 144, 또는 서열번호: 145에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, FGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 134, 서열번호: 135, 서열번호: 136, 서열번호: 137, 서열번호: 138, 서열번호: 139, 서열번호: 140, 서열번호: 141, 서열번호: 142, 서열번호: 143, 서열번호: 144, 또는 서열번호: 145에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 134, 서열번호: 135, 서열번호: 136, 서열번호: 137, 서열번호: 138, 서열번호: 139, 서열번호: 140, 서열번호: 141, 서열번호: 142, 서열번호: 143, 서열번호: 144, 또는 서열번호: 145에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, FGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 134, 서열번호: 135, 서열번호: 136, 서열번호: 137, 서열번호: 138, 서열번호: 139, 서열번호: 140, 서열번호: 141, 서열번호: 142, 서열번호: 143, 서열번호: 144, 또는 서열번호: 145에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 134, 서열번호: 135, 서열번호: 136, 서열번호: 137, 서열번호: 138, 서열번호: 139, 서열번호: 140, 서열번호: 141, 서열번호: 142, 서열번호: 143, 서열번호: 144, 또는 서열번호: 145에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, FGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 134의 아미노산 29-151, 서열번호: 135의 아미노산 30-152, 서열번호: 136의 아미노산 46-181, 서열번호: 137의 아미노산 84-206, 서열번호: 138의 아미노산 91-219, 서열번호: 139의 아미노산 38-198, 서열번호: 140의 아미노산 67-191, 서열번호: 141의 아미노산 43-167, 서열번호: 142의 아미노산 64-191, 서열번호: 143의 아미노산 80-204, 서열번호: 144의 아미노산 55-178, 또는 서열번호: 145의 아미노산 55-177에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 134의 아미노산 29-151, 서열번호: 135의 아미노산 30-152, 서열번호: 136의 아미노산 46-181, 서열번호: 137의 아미노산 84-206, 서열번호: 138의 아미노산 91-219, 서열번호: 139의 아미노산 38-198, 서열번호: 140의 아미노산 67-191, 서열번호: 141의 아미노산 43-167, 서열번호: 142의 아미노산 64-191, 서열번호: 143의 아미노산 80-204, 서열번호: 144의 아미노산 55-178, 또는 서열번호: 145의 아미노산 55-177에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, FGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 134의 아미노산 29-151, 서열번호: 135의 아미노산 30-152, 서열번호: 136의 아미노산 46-181, 서열번호: 137의 아미노산 84-206, 서열번호: 138의 아미노산 91-219, 서열번호: 139의 아미노산 38-198, 서열번호: 140의 아미노산 67-191, 서열번호: 141의 아미노산 43-167, 서열번호: 142의 아미노산 64-191, 서열번호: 143의 아미노산 80-204, 서열번호: 144의 아미노산 55-178, 또는 서열번호: 145의 아미노산 55-177에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 134의 아미노산 29-151, 서열번호: 135의 아미노산 30-152, 서열번호: 136의 아미노산 46-181, 서열번호: 137의 아미노산 84-206, 서열번호: 138의 아미노산 91-219, 서열번호: 139의 아미노산 38-198, 서열번호: 140의 아미노산 67-191, 서열번호: 141의 아미노산 43-167, 서열번호: 142의 아미노산 64-191, 서열번호: 143의 아미노산 80-204, 서열번호: 144의 아미노산 55-178, 또는 서열번호: 145의 아미노산 55-177에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, FGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 134의 아미노산 29-151, 서열번호: 135의 아미노산 30-152, 서열번호: 136의 아미노산 46-181, 서열번호: 137의 아미노산 84-206, 서열번호: 138의 아미노산 91-219, 서열번호: 139의 아미노산 38-198, 서열번호: 140의 아미노산 67-191, 서열번호: 141의 아미노산 43-167, 서열번호: 142의 아미노산 64-191, 서열번호: 143의 아미노산 80-204, 서열번호: 144의 아미노산 55-178, 또는 서열번호: 145의 아미노산 55-177에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 134의 아미노산 29-151, 서열번호: 135의 아미노산 30-152, 서열번호: 136의 아미노산 46-181, 서열번호: 137의 아미노산 84-206, 서열번호: 138의 아미노산 91-219, 서열번호: 139의 아미노산 38-198, 서열번호: 140의 아미노산 67-191, 서열번호: 141의 아미노산 43-167, 서열번호: 142의 아미노산 64-191, 서열번호: 143의 아미노산 80-204, 서열번호: 144의 아미노산 55-178, 또는 서열번호: 145의 아미노산 55-177에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 표적화 도메인의 또 다른 예에는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 펩타이드 표적화 도메인이 있다. PDGF 펩타이드 표적화 도메인의 비제한적 예에는 PDGFα 및 PDGFβ가 포함된다. PDGF는 간엽 기원 세포에 대한 유사분열물질 인자이며, 8개 시스테인 모티브를 특징으로 한다. PDGF는 동종이량체 또는 이종이량체로서 존재할 수 있으며, 상기 이량체는 디술피드 결합에 의해 연결된다. 녹아웃 마우스를 이용한 연구에서는 희소돌기아교세포, 폐포 평활근 세포, 및 정소의 레이디히 세포에서 세포 결함이 나타났다; 녹아웃 마우스는 태아로, 또는 출생 직후 사망하였다. 이 유전자에 대해 2개의 스플라이스 변이체가 동정되었다. PDGF 펩타이드는 G-커플링된 단백질 수용체 패밀리에 결합한다. 예를 들어 PDGF-AA, PDGF-BB 및 PDGF-AB는 PDGFRα에 결합하며; PDGF-BB 및 PDGF-AB는 PDGFRβ에 결합하고; VEGFA, VEGFC, 및 VEGFD는 VEGFR3에 결합한다.
PDGF 수용체는 몇몇 상이한 유형의 암 세포 표면 상에서 검출되었다. 예를 들어, PDGFRα는 전립선암, 비-소세포성 폐암, 횡문근육종, 위장관 기질 종양, 수아세포종, 교모세포종, 코인두 암종, 섬유육종, 기저 세포 암종, 신경모세포종, 성상세포종, 골육종, 유방암, 고환 종양, 난소암, 흑색종, 골수종, 편평 세포 암종, 및 림프종에서 발현된다.
또 다른 예로서, PDGFRβ는 전립선암, 신세포 암종, 방광암, 교모세포종, 섬유육종, 신경모세포종, 성상세포종, 골육종, 유잉 육종, 유방암, 고환 종양, 난소암, 골수종, 백혈병, 중피종, 카포시 육종, 및 연골육종에서 발현된다.
또 다른 예로서, PDGFR-유사체는 골수종 및 폐포 기저 상피 암종에서 발현된다.
이처럼, PDGF 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 전립선암, 신세포 암종, 방광암, 비-소세포성 폐암, 횡문근육종, 위장관 기질 종양, 수아세포종, 교모세포종, 코인두 암종, 섬유육종, 기저 세포 암종, 신경모세포종, 성상세포종, 골육종, 유잉 육종, 유방암, 고환 종양, 난소암, 흑색종, 골수종, 편평 세포 암종, 림프종, 백혈병, 중피종, 카포시 육종, 또는 연골육종을 포함하는 암 치료에 효과적일 것이다.
따라서, 구현예에서, 표적화 도메인은 PDGF 펩타이드 표적화 도메인을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, PDGF 펩타이드 표적화 도메인은 PDGFα 또는 PDGFβ을 포함한다. 이 구현예의 측면에서, PDGF 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 153 또는 서열번호: 154을 포함한다. 이 구현예의 다른 측면에서, PDGF 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 153의 아미노산 94-182 또는 서열번호: 154의 아미노산 95-182을 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, PDGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 153 또는 서열번호: 154에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 153 또는 서열번호: 154에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, PDGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 153 또는 서열번호: 154에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 153 또는 서열번호: 154에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, PDGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 153 또는 서열번호: 154에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 153 또는 서열번호: 154에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구현예의 다른 측면에서, PDGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 153의 아미노산 94-182 또는 서열번호: 154의 아미노산 95-182에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호: 153의 아미노산 94-182 또는 서열번호: 154의 아미노산 95-182에 대해 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, PDGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 153의 아미노산 94-182 또는 서열번호: 154의 아미노산 95-182에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 153의 아미노산 94-182 또는 서열번호: 154의 아미노산 95-182에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 비-인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, PDGF 표적화 도메인은 예를 들어, 서열번호: 153의 아미노산 94-182 또는 서열번호: 154의 아미노산 95-182에 대해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환; 또는 서열번호: 153의 아미노산 94-182 또는 서열번호: 154의 아미노산 95-182에 대해 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 인접 아미노산 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
클로스트리듐 독소는 각각 천연 생성 프로테아제에 의해 디술피드 루프 내에서 단백분해 절단에 의해 후속 절단되는 대략 150kDa의 단쇄 폴리펩타이드로 번역된다(도 18). 상기 절단은 디술피드 가교를 형성하는 2개의 시스테인 잔기 사이에 생성된 별개의 이중쇄 루프 영역 내에서 일어난다. 상기 번역 후 처리로 두 사슬 간의 단일 디술피드 결합 및 비-공유 상호작용으로 함께 유지되는 대략 50kDa의 경쇄(LC) 및 대략 100kDa의 중쇄(HC)를 포함하는 이중쇄 분자가 산출된다(도 2). TVEMP의 재조합 생성을 촉진하기 위해, 외인성 프로테아제 절단 부위를 이용하여 본 명세서에 개시된 TVEMP의 단쇄 폴리펩타이드 형태를 이중쇄 형태로 전환할 수 있다. 예로 각각의 전문이 본 명세서에 참조로 도입되는 [Steward, L.E. 등, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Targeting Capabilities For Endogenous Clostridial Toxin Receptor Systems, 미국 특허 공보 번호 US 2008/0096248(2008.04.24.); Steward, L.E. 등, Activatable Clostridial Toxins, 미국 특허 공보 번호 US 2008/0032930(2008.02.07); Steward, 상기, (2007); Dolly, 상기, (2007); Foster, 상기, WO 2006/059093 (2006); 및 Foster, 상기, WO 2006/059105(2006)]를 참고하라.
내인성 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 비제한적으로 포함하는 임의의 모든 프로테아제 절단 부위를, 클로스트리듐 독소의 단쇄 폴리펩타이드 형태를 이중쇄 형태로 전환하는데 사용할 수 있음이 계획된다. 따라서 본 발명의 한 측면에 있어서, TVEMP는 부분적으로 이중쇄 루프 영역 내에 내인성 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에 있어서, TVEMP는 부분적으로 이중쇄 루프 영역 내에 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "이중쇄 루프 영역"이라는 용어는 클로스트리듐 독소의 단쇄 형태를 이중쇄 형태로 전환하는데 사용되는 프로테아제 절단 부위를 함유하는 클로스트리듐 독소의 아미노산 서열을 의미한다. 클로스트리듐 독소의 이중쇄 루프 영역의 비제한적 예에는 서열 번호: 1의 아미노산 430-454를 포함하는 BoNT/A의 이중쇄 루프 영역; 서열 번호: 2의 아미노산 437-446을 포함하는 BoNT/B의 이중쇄 루프 영역; 서열 번호: 3의 아미노산 437-453을 포함하는 BoNT/C1의 이중쇄 루프 영역: 서열 번호: 4의 아미노산 437-450을 포함하는 BoNT/D의 이중쇄 루프 영역; 서열 번호: 5의 아미노산 412-426을 포함하는 BoNT/E의 이중쇄 루프 영역; 서열 번호: 6의 아미노산 429-445를 포함하는 BoNT/F의 이중쇄 루프 영역; 서열 번호: 7의 아미노산 436-450을 포함하는 BoNT/G의 이중쇄 루프 영역; 및 서열 번호: 8의 아미노산 439-467을 포함하는 TeNT의 이중쇄 루프 영역(표 4)이 포함된다.
Figure pct00005

본 명세서에서 사용되는 "내인성 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위"라는 용어는 "천연 생성 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위"와 동의어이며, 천연 생성 클로스트리듐 독소의 이중쇄 루프 영역 내에서 발견되는 천연 생성 프로테아제 절단 부위를 의미하고, 비제한적으로 천연 생성 클로스트리듐 독소의 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위 변이체, 예컨대 클로스트리듐 독소의 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위 이소형 및 클로스트리듐 독소의 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위 서브타입이 포함된다. 내인성 프로테아제 절단 부위의 비제한적 예에는 예로 BoNT/A 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, BoNT/B 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, BoNT/C1 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, BoNT/D 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, BoNT/E 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, BoNT/F 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, BoNT/G 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위 및 TeNT 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위가 포함된다.
상기 언급된 바와 같이, 클로스트리듐 독소는 이후 천연 생성 프로테아제에 의해 디설피드 루프 내에서 단백분해 절단에 의해 절단되는 대략 150kDa의 단쇄 폴리펩타이드로 번역된다. 이 번역 후 처리로 단일 디설피드 결합 및 비공유 상호작용에 의해 함께 유지되는 대략 50kDa의 경쇄(LC) 및 대략 100kDa의 중쇄(HC)를 포함하는 이중쇄 분자가 산출된다. 프로테아제의 정체는 현재 밝혀져 있지 않으나, 여러 클로스트리듐 독소에 대한 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위가 결정되어 있다. BoNT에서, K448-A449에서의 절단은 BoNT/A의 단일 폴리펩타이드 형태를 이중쇄 형태로 전환하며; K441-A442에서의 절단은 BoNT/B의 단일 폴리펩타이드 형태를 이중쇄 형태로 전환하고; K449-T450에서의 절단은 BoNT/C1의 단일 폴리펩타이드 형태를 이중쇄 형태로 전환하고; R445-D446에서의 절단은 BoNT/D의 단일 폴리펩타이드 형태를 이중쇄 형태로 전환하고; R422-K423에서의 절단은 BoNT/E의 단일 폴리펩타이드 형태를 이중쇄 형태로 전환하고; K439-A440에서의 절단은 BoNT/F의 단일 폴리펩타이드 형태를 이중쇄 형태로 전환하고; K446-S447에서의 절단은 BoNT/G의 단일 폴리펩타이드 형태를 이중쇄 형태로 전환한다. A457-S458에서 TeNT의 단일 폴리펩타이드 형태의 단백분해 절단은 이중쇄 형태를 만든다. K431-N432에서 BaNT의 단일 폴리펩타이드 형태의 단백분해 절단은 이중쇄 형태를 만든다. R422-K423에서 BuNT의 단일 폴리펩타이드 형태의 단백분해 절단은 이중쇄 형태를 만든다. 상기 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위는 융합 단백질로서 TVEMP에 프레임이 맞게 작동가능하게 연결된다. 또한 이중쇄 루프 내 추가 절단 부위가 또한 절단되어 소실되는 작은 펩타이드 절편을 생성하는 것으로 나타난다는 것을 주지해야 한다. 비제한적 예로서, BoNT/A 단쇄 폴리펩타이드 절단은 궁극적으로 이중쇄 루프 내 10개 아미노산 절편의 소실을 일으킨다.
따라서, 내인성 클로스트리듐 독소의 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위를 포함하는 프로테아제 절단 부위를 사용하여 단쇄 독소를 이중쇄 형태로 전환한다. 상기 구현예의 측면에 있어서, 단백분해 절단에 의한 이중쇄 형태로의 전환은 예로 BoNT/A 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, BoNT/B 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, BoNT/C1 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, BoNT/D 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, BoNT/E 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, BoNT/F 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, BoNT/G 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, TeNT 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, BaNT 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위, 또는 BuNT 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위를 포함하는 부위에서 일어난다.
본 구현예의 다른 측면에 있어서, 단백분해 절단에 의한 이중쇄 형태로의 전환은 예로 서열 번호: 1의 아미노산 430-454를 포함하는 BoNT/A의 이중쇄 루프 영역; 서열 번호: 2의 아미노산 437-446을 포함하는 BoNT/B의 이중쇄 루프 영역; 서열 번호: 3의 아미노산 437-453을 포함하는 BoNT/C의 이중쇄 루프 영역; 서열 번호: 4의 아미노산 437-450을 포함하는 BoNT/D의 이중쇄 루프 영역; 서열 번호: 5의 아미노산 412-426을 포함하는 BoNT/E의 이중쇄 루프 영역; 서열 번호: 6의 아미노산 429-445를 포함하는 BoNT/F의 이중쇄 루프 영역; 서열 번호: 7의 아미노산 436-450을 포함하는 BoNT/G의 이중쇄 루프 영역; 서열 번호: 8의 아미노산 439-467을 포함하는 TeNT의 이중쇄 루프 영역; 서열 번호: 9의 아미노산 421-435를 포함하는 BaNT의 이중쇄 루프 영역; 또는 서열 번호: 10의 아미노산 412-426을 포함하는 BuNT의 이중쇄 루프 영역을 포함하는 부위에서 일어난다.
외인성 프로테아제 절단 부위를 사용하여 본 명세서에 개시된 TVEMP의 단쇄 폴리펩타이드 형태를 이중쇄 형태로 전환할 수 있음이 계획된다. 본 명세서에서 사용되는 "외인성 프로테아제 절단 부위"라는 용어는 "비천연 생성 프로테아제 절단 부위" 또는 "비천연 프로테아제 절단 부위"와 동의어이며, 외인성 프로테아제 절단 부위가 본 명세서에 개시된 활성화가능한 폴리펩타이드를 인코딩하는 구축물을 발현하는 숙주 세포 내에서 발현되는 프로테아제에 감수성인 프로테아제 절단 부위 또는 인간 프로테아제 절단 부위가 아닌 한, 천연 생성 클로스트리듐 독소 유래의 이중쇄 루프 영역에는 보통 존재하지 않는 프로테아제 절단 부위를 의미한다. 임의의 모든 외인성 프로테아제 절단 부위를 사용하여 클로스트리듐 독소의 단쇄 폴리펩타이드 형태를 본 발명의 실시 측면에 유용한 이중쇄 형태로 전환할 수 있음이 계획된다. 외인성 프로테아제 절단 부위의 비제한적 예에는 예로 식물 파파인 절단 부위, 곤충 파파인 절단 부위, 갑각류 파파인 절단 부위, 엔테로키나아제 절단 부위, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 담배 에치 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위, 담배맥 모틀링 바이러스(TVMV) 절단 부위, 서브틸리신 절단 부위, 히드록실아민 절단 부위, 또는 카스파아제 3 절단 부위가 포함된다.
외인성 프로테아제 절단 부위가 그 각각의 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 한, 임의의 모든 길이의 외인성 프로테아제 절단 부위가 본 발명의 측면에 유용할 수 있다는 것이 포함된다. 따라서 상기 구현예의 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위의 길이는, 예로 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50개, 또는 적어도 60개 아미노산; 또는 최대 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50개, 또는 적어도 60개 아미노산일 수 있다.
일 구현예에서, 외인성 프로테아제 절단 부위는 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치한다. 상기 구현예의 측면에 있어서, TVEMP는 예로 식물 파파인 절단 부위, 곤충 파파인 절단 부위, 갑각류 파파인 절단 부위, 비인간 엔테로키나아제 프로테아제 절단 부위, 담배 에치 바이러스 프로테아제 절단 부위, 담배맥 모틀링 바이러스 프로테아제 절단 부위, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 서브틸리신 절단 부위, 히드록실아민 절단 부위, SUMO/ULP-1 프로테아제 절단 부위, 및 비인간 카스파아제 3 절단 부위를 포함하는 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는 예로 개질 BoNT/A, 개질 BoNT/B, 개질 BoNT/C1, 개질 BoNT/D, 개질 BoNT/E, 개질 BoNT/F, 개질 BoNT/G, 개질 TeNT, 개질 BaNT, 또는 개질 BuNT의 이중쇄 루프 내에 위치한다.
본 구현예의 한 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 비인간 엔테로키나아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 소 엔테로키나아제 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는 서열 번호: 36을 포함하는 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 소 엔테로키나아제 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 소 엔테로키나아제 프로테아제 절단 부위는 예로 개질 BoNT/A, 개질 BoNT/B, 개질 BoNT/C1, 개질 BoNT/D, 개질 BoNT/E, 개질 BoNT/F, 개질 BoNT/G, 개질 TeNT, 개질 BaNT, 또는 개질 BuNT의 이중쇄 루프 내에 위치한다.
본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는 예로 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 담배 에치 바이러스 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는 예로 공통 서열 E-P5-P4-Y-P2-Q*-G(서열 번호: 377) 또는 E-P5-P4-Y-P2-Q*-S(서열 번호: 38)를 포함하는(여기서, P2, P4 및 P5는 임의 아미노산일 수 있다) TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 담배 에치 바이러스 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는 예로 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47 또는 서열 번호: 48을 포함하는 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 담배 에치 바이러스 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 담배 에치 바이러스 프로테아제 절단 부위는 예로 개질 BoNT/A, 개질 BoNT/B, 개질 BoNT/C1, 개질 BoNT/D, 개질 BoNT/E, 개질 BoNT/F, 개질 BoNT/G, 개질 TeNT, 개질 BaNT, 또는 개질 BuNT의 이중쇄 루프 내에 위치한다.
본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 담배맥 모틀링 바이러스 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 공통 서열 P6-P5-V-R-F-Q*-G(서열 번호: 49) 또는 P6-P5-V-R-F-Q*-S(서열 번호: 50)를 포함하는(여기서, P5 및 P6은 임의 아미노산일 수 있다) TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 담배맥 모틀링 바이러스 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 또는 서열 번호: 54를 포함하는 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 담배맥 모틀링 바이러스 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 담배맥 모틀링 바이러스 프로테아제 절단 부위는 예로 개질 BoNT/A, 개질 BoNT/B, 개질 BoNT/C1, 개질 BoNT/D, 개질 BoNT/E, 개질 BoNT/F, 개질 BoNT/G, 개질 TeNT, 개질 BaNT, 또는 개질 BuNT의 이중쇄 루프 내에 위치한다.
본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는 예로 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 공통 서열 P5-P4-L-F-Q*-G-P(서열 번호: 55)를 포함하는(여기서, P4는 G, A, V, L, I, M, S 또는 T이며 P5는 임의의 아미노산일 수 있으나, D 또는 E가 바람직하다) TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60 또는 서열 번호: 61을 포함하는 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는 예로 PRESCISSION?에 의해 절단될 수 있는 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 인간 리노바이러스 3C 프로테아제를 포함할 수 있다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위는, 예로 개질 BoNT/A, 개질 BoNT/B, 개질 BoNT/C1, 개질 BoNT/D, 개질 BoNT/E, 개질 BoNT/F, 개질 BoNT/G, 개질 TeNT, 개질 BaNT, 또는 개질 BuNT의 이중쇄 루프 내에 위치한다.
본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 서브틸리신 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 공통 서열 P6-P5-P4-P3-H*-Y(서열 번호: 62) 또는 P6-P5-P4-P3-Y-H*(서열 번호: 63)를 포함하는(여기서, P3, P4 및 P5 및 P6은 임의 아미노산일 수 있다) TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 서브틸리신 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 또는 서열 번호: 66을 포함하는 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 서브틸리신 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 GENENASE?에 의해 절단될 수 있는 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 서브틸리신 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 서브틸리신 절단 부위는, 예로 개질 BoNT/A, 개질 BoNT/B, 개질 BoNT/C1, 개질 BoNT/D, 개질 BoNT/E, 개질 BoNT/F, 개질 BoNT/G, 개질 TeNT, 개질 BaNT, 또는 개질 BuNT의 이중쇄 루프 내에 위치한다.
본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 히드록실아민 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 복수의 디펩타이드 N*G를 포함하는 히드록실아민 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 서열 번호: 67, 또는 서열 번호: 68을 포함하는 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 히드록실아민 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 히드록실아민 절단 부위는, 예로 개질 BoNT/A, 개질 BoNT/B, 개질 BoNT/C1, 개질 BoNT/D, 개질 BoNT/E, 개질 BoNT/F, 개질 BoNT/G, 개질 TeNT, 개질 BaNT, 또는 개질 BuNT의 이중쇄 루프 내에 위치한다.
본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 SUMO/ULP-1 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는 예로 공통 서열 G-G*-P1'-P2'-P3'(서열 번호: 69)을 포함하는(여기서, P1', P2', 및 P3'은 임의 아미노산일 수 있다) TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 SUMO/ULP-1 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 서열 번호: 70을 포함하는 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 SUMO/ULP-1 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, SUMO/ULP-1 프로테아제 절단 부위는, 예로 개질 BoNT/A, 개질 BoNT/B, 개질 BoNT/C1, 개질 BoNT/D, 개질 BoNT/E, 개질 BoNT/F, 개질 BoNT/G, 개질 TeNT, 개질 BaNT, 또는 개질 BuNT의 이중쇄 루프 내에 위치한다.
본 구현예의 한 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는 예로 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 비인간 카스파아제 3 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 마우스 카스파아제 3 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 공통 서열 D-P3-P2-D*P1'(서열 번호: 71)을 포함하는(여기서, P3 는 임의 아미노산일 수 있으며 E가 바람직하고, P2 는 임의 아미노산일 수 있고, P1'은 임의 아미노산일 수 있으며 G 또는 S가 바람직하다) TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 비인간 카스파아제 3 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예로 서열 번호: 72, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 또는 서열 번호: 77을 포함하는 TVEMP의 이중쇄 루프 내에 위치하는 비인간 카스파아제 3 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 소 엔테로키나아제 프로테아제 절단 부위는, 예로 개질 BoNT/A, 개질 BoNT/B, 개질 BoNT/C1, 개질 BoNT/D, 개질 BoNT/E, 개질 BoNT/F, 개질 BoNT/G, 개질 TeNT, 개질 BaNT, 또는 개질 BuNT의 이중쇄 루프 내에 위치한다.
이중쇄 루프 영역을 개질하여 외인성 프로테아제 절단 부위에 대한 천연 생성 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위를 대체한다. 상기 개질에 있어서, 천연 생성 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위는 작동불능으로 되며 이에 따라 그 프로테아제에 의해 절단될 수 없다. 외인성 프로테아제 절단 부위만이 그 대응 외인성 프로테아제로 절단될 수 있다. 이러한 유형의 개질에 있어서, 외인성 프로테아제 부위는 융합 단백질로서 TVEMP로 프레임에 맞춰 작동가능하게 연결되며, 상기 부위는 그 대응 외인성 프로테아제로 절단될 수 있다. 내인성 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위의 외인성 프로테아제 절단 부위로의 대체는 부위의 치환일 수 있으며, 여기서 외인성 부위를 내인성 부위의 절단 부위 위치에 인접한 위치로 조작한다. 내인성 이중쇄 루프 프로테아제 절단 부위의 외인성 프로테아제 절단 부위로의 대체는 외인성 부위의 부가일 수 있으며, 여기서 외인성 부위는 내인성 부위의 절단 부위 위치와 상이한 위치에서 조작되며, 내인성 부위는 작동불능으로 조작된다. 프로테아제 절단 부위의 위치 및 종류는 특정 표적화 도메인이 자유 아미노-말단 또는 카르복실-말단 아미노산을 필요로 하기 때문에 결정적일 수 있다. 예를 들어 펩타이드 표적화 도메인이 두 개의 다른 도메인 사이에 배치되는 경우(예로 도 4 참고), 프로테아제 절단 부위의 선택 요건은 그 부위를 절단하는 프로테아제가 플러시 절단을 하여 표적화 도메인의 그 수용체로의 선택적 결합에 필요한 표적화 도메인의 자유 아미노 말단 또는 카르복실 말단을 노출하는지 여부일 수 있다.
천연 생성 프로테아제 절단 부위는 천연 생성 이중쇄 루프 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합에 인접하는 두 아미노산 중 적어도 하나를 변형시켜 작동불능으로 만들 수 있다. 이중쇄 루프 영역의 두 시스테인 잔기가 온전하게 남아 있고 상기 영역이 여전히 디설피드 가교를 형성할 수 있는 한, 보다 광범위한 변형을 만들 수도 있다. 아미노산 변형의 비제한적 예에는 아미노산의 결실 또는 원래 아미노산의 상이한 아미노산으로의 대체가 포함된다. 따라서 일 구현예에서, 천연 생성 프로테아제 절단 부위는 천연 생성 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합에 인접하는 두 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 아미노산을 변형시켜 작동불능으로 된다. 또 다른 구현예에서, 천연 생성 프로테아제 절단 부위는 천연 생성 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합에 인접하는 두 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 아미노산을 변형시켜 작동불능으로 된다.
본 명세서에 개시된 TVEMP는 선택적으로 가요성 스페이서를 포함하는 가요성 영역을 추가로 포함할 수 있음이 이해된다. 가요성 스페이서를 포함하는 가요성 영역을 사용하여 폴리펩타이드의 특징, 기여 또는 특성을 최적화하기 위해 폴리펩타이드 영역의 길이를 조정할 수 있다. 비제한적 예로서, 하나 이상의 가요성 스페이서를 일렬로 포함하는 폴리펩타이드 영역을 사용하여 프로테아제 절단 부위를 더 잘 노출시킴으로써 프로테아제에 의한 상기 부위의 절단을 촉진할 수 있다. 또 다른 비제한적 예로서, 하나 이상의 가요성 스페이서를 일렬로 포함하는 폴리펩타이드 영역을 사용하여 펩타이드 표적화 도메인을 더 잘 제시함으로써 표적화 도메인의 그 수용체로의 결합을 촉진할 수 있다.
펩타이드를 포함하는 가요성 공간은 적어도 1개 아미노산 길이이며, 작은 측쇄 R기를 갖는 비하전 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 세린을 포함한다. 따라서 일 구현예에서, 가요성 스페이서의 길이는, 예로 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산; 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 가요성 스페이서는, 예로 1-3개 아미노산, 2-4개 아미노산, 3-5개 아미노산, 4-6개 아미노산, 또는 5-7개 아미노산일 수 있다. 가요성 스페이서의 비제한적 예에는 예로 G-스페이서, 예컨대 GGG, GGGG(서열 번호: 78), 및 GGGGS(서열 번호: 79) 또는 A-스페이서, 예컨대 AAA, AAAA(서열 번호: 80) 및 AAAAV(서열 번호: 81)가 포함된다. 상기 가요성 영역은 융합 단백질로서 TVEMP에 프레임에 맞춰 작동가능하게 연결된다.
따라서 일 구현예에서, 본 명세서에 개시된 TVEMP는 가요성 스페이서를 포함하는 가요성 영역을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에 개시된 TVEMP는 복수의 가요성 스페이서를 일렬로 포함하는 가요성 영역을 추가로 포함할 수 있다. 상기 구현예의 측면에 있어서, 가요성 영역은 일렬로, 예로 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 G-스페이서; 또는 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 G-스페이서를 포함할 수 있다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 가요성 영역은 일렬로, 예로 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 A-스페이서; 또는 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 A-스페이서를 포함할 수 있다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, TVEMP는 동일한 가요성 스페이서의 하나 이상의 사본, 상이한 가요성 스페이서 영역의 하나 이상의 사본 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 가요성 영역을 포함할 수 있다.
본 구현예의 다른 측면에 있어서, 가요성 스페이서를 포함하는 TVEMP는, 예로 개질 BoNT/A, 개질 BoNT/B, 개질 BoNT/C1, 개질 BoNT/D, 개질 BoNT/E, 개질 BoNT/F, 개질 BoNT/G, 개질 TeNT, 개질 BaNT, 또는 개질 BuNT일 수 있다.
TVEMP가 중독 절차를 수행할 수 있는 한, 본 명세서에 개시된 TVEMP가 임의의 모든 위치에서 가요성 스페이서를 포함할 수 있음이 계획된다. 상기 구현예의 측면에 있어서, 가요성 스페이서는, 예로 효소 도메인 및 전위 도메인, 효소 도메인 및 펩타이드 표적화 도메인, 효소 도메인 및 외인성 프로테아제 절단 부위 사이에 위치한다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, G-스페이서는, 예로 효소 도메인 및 전위 도메인, 효소 도메인 및 펩타이드 표적화 도메인, 효소 도메인 및 외인성 프로테아제 절단 부위 사이에 위치한다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, A-스페이서는, 예로 효소 도메인 및 전위 도메인, 효소 도메인 및 펩타이드 표적화 도메인, 효소 도메인 및 외인성 프로테아제 절단 부위 사이에 위치한다.
본 구현예의 다른 측면에 있어서, 가요성 스페이서는, 예로 펩타이드 표적화 도메인 및 전위 도메인, 펩타이드 표적화 도메인 및 효소 도메인, 펩타이드 표적화 도메인 및 외인성 프로테아제 절단 부위의 사이에 위치한다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, G-스페이서는, 예로 펩타이드 표적화 도메인 및 전위 도메인, 펩타이드 표적화 도메인 및 효소 도메인, 펩타이드 표적화 도메인 및 외인성 프로테아제 절단 부위의 사이에 위치한다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, A-스페이서는, 예로 펩타이드 표적화 도메인 및 전위 도메인, 펩타이드 표적화 도메인 및 효소 도메인, 펩타이드 표적화 도메인 및 외인성 프로테아제 절단 부위의 사이에 위치한다.
본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, 가요성 스페이서는, 예로 전위 도메인 및 효소 도메인, 전위 도메인 및 펩타이드 표적화 도메인, 전위 도메인 및 외인성 프로테아제 절단 부위의 사이에 위치한다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, G-스페이서는, 예로 전위 도메인 및 효소 도메인, 전위 도메인 및 펩타이드 표적화 도메인, 전위 도메인 및 외인성 프로테아제 절단 부위의 사이에 위치한다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, A-스페이서는, 예로 전위 도메인 및 효소 도메인, 전위 도메인 및 펩타이드 표적화 도메인, 전위 도메인 및 외인성 프로테아제 절단 부위의 사이에 위치한다.
TVEMP가 중독 절차를 수행할 수 있는 한, 본 명세서에 개시된 TVEMP가 임의의 모든 위치에 펩타이드 표적화 도메인을 포함할 수 있음이 계획된다. 비제한적 예에는 TVEMP의 아미노 말단에서의 펩타이드 표적화 도메인 배치; TVEMP의 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 및 전위 도메인 사이에서의 펩타이드 표적화 도메인 배치; 및 TVEMP의 카르복실 말단에서의 펩타이드 표적화 도메인 배치가 포함된다. 다른 비제한적 예에는 TVEMP의 클로스트리듐 독소의 효소 도메인 및 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 사이에서의 펩타이드 표적화 도메인 배치가 포함된다. 천연 생성 클로스트리듐 독소의 효소 도메인은 천연 메티오닌 개시 코돈을 포함한다. 따라서 효소 도메인이 아미노-말단 위치에 있지 않은 도메인 구성에서 메티오닌 개시 코돈을 포함하는 아미노산 서열은 아미노-말단 도메인 앞에 놓여야 한다. 마찬가지로 펩타이드 표적화 도메인이 아미노-말단 위치에 있는 경우, 메티오닌 개시 코돈 및 프로테아제 절단 부위를 포함하는 아미노산 서열은 펩타이드 표적화 도메인이 자유 아미노 말단을 필요로 하는 상황에서 작동가능하게 연결될 수 있다. 예로 그 전문이 본 명세서에 참조로 도입되는 [Shengwen Li 등, Degradable Clostridial Toxins, 미국 특허 출원 11/572,512(2007.01.23.)]를 참고하라. 또한 메티오닌 개시 코돈을 포함하는 또다른 폴리펩타이드의 아미노 말단에 작동가능하게 연결된 폴리펩타이드를 부가하는 경우, 원래 메티오닌 잔기가 결실될 수 있다는 것이 당해분야에 공지되어 있다.
따라서, 일 구현예에서, TVEMP는 펩타이드 표적화 도메인, 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위 및 효소 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 3a). 본 구현예의 한 측면에 있어서, TVEMP는 펩타이드 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위 및 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, TVEMP는 펩타이드 표적화 도메인, 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위, 및 전위 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 3b). 본 구현예의 한 측면에 있어서, TVEMP는 펩타이드 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소의 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, TVEMP는 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위, 펩타이드 표적화 도메인, 및 전위 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 4a). 본 구현예의 한 측면에 있어서, TVEMP는 클로스트리듐 독소의 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위, 펩타이드 표적화 도메인, 및 클로스트리듐 독소의 전위 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, TVEMP는 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위, 펩타이드 표적화 도메인, 및 효소 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 4b). 본 구현예의 한 측면에 있어서, TVEMP는 클로스트리듐 독소의 전위 도메인, 펩타이드 표적화 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위 및 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, TVEMP는 효소 도메인, 펩타이드 표적화 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위, 및 전위 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 4c). 본 구현예의 한 측면에 있어서, TVEMP는 클로스트리듐 독소의 효소 도메인, 펩타이드 표적화 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, TVEMP는 전위 도메인, 펩타이드 표적화 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위 및 효소 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 4d). 본 구현예의 한 측면에 있어서, TVEMP는 클로스트리듐 독소의 전위 도메인, 펩타이드 표적화 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위 및 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, TVEMP는 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위, 전위 도메인, 및 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 5a). 본 구현예의 한 측면에 있어서, TVEMP는 클로스트리듐 독소의 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인, 및 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, TVEMP는 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위, 효소 도메인 및 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 5b). 본 구현예의 한 측면에 있어서, TVEMP는 클로스트리듐 독소의 전위 도메인, 펩타이드 표적화 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위 및 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 포함하는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
본 발명에서 유용한 조성물은 일반적으로 TVEMP를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 조성물로 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용가능한"이라는 용어는 개인에게 투여 시 역반응, 알러지성 반응 또는 다른 의도하기 않거나 원치않는 반응을 일으키지 않는 임의의 분자 단위체 또는 조성물을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용가능한 조성물"이라는 용어는 "약제학적 조성물"과 동의어이며, 활성 성분, 예컨대 본 명세서에 개시된 임의의 TVEMP의 치료 유효 농도를 의미한다. TVEMP를 포함하는 약제학적 조성물은 의약 및 수의학적 용도를 위해 유용하다. 약제학적 조성물은 단독으로 다른 보조 활성 성분, 제제, 약물 또는 호르몬과의 조합으로 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 통상적 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분말화, 유화, 캡슐화, 트랩핑, 및 동결건조를 비제한적으로 포함하는 임의의 다양한 공정을 이용하여 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 멸균 용액, 현탁액, 에멀션, 동결건조품, 정제, 알약, 펠렛, 캡슐, 분말, 시럽, 엘릭서, 또는 투여에 적합한 임의의 다른 형태를 비제한적으로 포함하는 임의의 다양한 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 측면에서는 부분적으로 TVEMP를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 명세서에 개시된 임의 조성물은 상기 조성물이 신경 염증에 연관된 증상을 예방하거나 감소시키는 한, 이를 필요로 하는 포유류에서의 신경 염증의 치료 방법에 유용할 수 있다는 것이 포함된다. TVEMP를 포함하는 조성물의 비제한적 예에는 펩타이드 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소의 전위 도메인 및 클로스트리듐 독소의 효소 도메인을 포함하는 TVEMP가 포함된다. 예로 [Steward, 상기, (2007); Dolly, 상기, (2007); Foster, 상기, WO 2006/059093(2006); Foster, 상기, WO 2006/059105(2006.06.08.)]를 포함하는 임의의 본 명세서에 개시된 TVEMP를 사용할 수 있다는 것이 포함된다. 둘 이상의 상이한 TVEMP를 개별 조성물로 또는 단일 조성물의 일부로 제공할 수 있다는 것도 이해된다.
또한 TVEMP를 포함하는 약제학적 조성물이 선택적으로 활성 성분의 약제학적으로 허용가능한 조성물로의 가공을 촉진하는 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다는 것이 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 "약리학적으로 허용가능한 담체"라는 용어는 "약리학적 담체"와 동의어이며, 투여 시 장기적이거나 영구적인 유해 효과를 실질적으로 갖지 않는 임의 담체를 의미하고, "약리학적으로 허용가능한 전달체, 안정화제, 희석제, 첨가제, 보조제 또는 부형제"와 같은 용어가 포함된다. 상기 담체는 일반적으로 활성 화합물과 혼합되거나 또는 활성 화합물을 희석 또는 봉입할 수 있으며, 고체, 반고체 또는 액체 제제일 수 있다. 활성 성분이 원하는 담체 또는 희석제 중에 가용성일 수도 있고 또는 현탁액으로 전달될 수도 있다는 것이 이해된다. 수성 매질, 예컨대 물, 식염수, 글리신, 히알루론산 등; 고체 담체, 예컨대 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스, 마그네슘 카보네이트 등; 용매; 분산 매질; 코팅; 항박테리아제 및 항진균제; 등장성 제제 및 흡수 지연 제제; 또는 임의의 다른 비활성 성분을 비제한적으로 포함하는 임의의 다양한 약제학적으로 허용가능한 담체를 사용할 수 있다. 약리학적으로 허용가능한 담체의 선택은 투여 방식에 의존할 수 있다. 임의의 약리학적으로 허용가능한 담체가 활성 성분과 비상용성이 아닌 한, 약제학적으로 허용가능한 조성물 중에서의 그 사용이 포함된다. 상기 약제학적 담체의 특정 용도의 비제한적 예는 [Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Howard C. Ansel 등, eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7th ed. 1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy(Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20th ed. 2000); Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics(Joel G. Hardman 등, eds., McGraw-Hill Professional, 10th ed. 2001); 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients(Raymond C. Rowe 등, APhA 공보, 제4판, 2003)]에서 찾아볼 수 있다. 이들 프로토콜은 일상적 절차이며, 임의 변형은 당해분야 숙련자 및 본원의 교시 범위 내에 속한다.
또한 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물에는 선택적으로 완충액, 방부제, 긴장성 조정제, 염, 항산화제, 삼투압 조정제, 생리학적 물질, 약리학적 물질, 벌크화제, 유화제, 습윤제, 감미제 또는 향미제 등을 비제한적으로 포함하는 다른 약제학적으로 허용가능한 성분(또는 약제학적 성분)이 비제한적으로 포함될 수 있음이 계획된다. 생성 제조물이 약제학적으로 허용가능한 한, pH를 조정하기 위한 다양한 완충액 및 수단을 이용하여 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물을 제조할 수 있다. 상기 완충액에는 아세테이트 완충액, 시트레이트 완충액, 포스페이트 완충액, 중성 완충 식염수, 포스페이트 완충 식염수 및 보레이트 완충액이 비제한적으로 포함된다. 산 또는 염기를 사용하여 필요한 만큼 조성물의 pH를 조정할 수 있다는 것이 이해된다. 약제학적으로 허용가능한 항산화제에는 나트륨 메타비설파이트, 나트륨 티오설페이트, 아세틸시스테인, 부틸화 히드록시아니솔 및 부틸화 히드록시톨루엔이 비제한적으로 포함된다. 유용한 방부제에는 벤잘코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 티메로살, 페닐머큐릭 아세테이트, 페닐머큐릭 니트레이트, 안정화 옥시 클로로 조성물 및 킬레이트제, 예컨대 DTPA 또는 DTPA-비스아미드, 칼슘 DTPA, 및 CaNaDTPA-비스아미드가 비제한적으로 포함된다. 약제학적 조성물에 유용한 긴장성 조정제에는 염, 예컨대 염화나트륨, 염화칼슘, 만니톨 또는 글리세린 및 기타 약제학적으로 허용가능한 긴장성 조정제가 비제한적으로 포함된다. 약제학적 조성물은 염의 형태로 제공될 수 있으며, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 비제한적으로 포함하는 여러 산과 함께 형성될 수 있다. 염은 대응하는 자유 염기 형태에 비해 수성 또는 다른 프로톤성 용매 중에서 보다 가용적인 경향이 있다. 약리학 분야에 공지된 상기 및 다른 물질이 약제학적 조성물에 포함될 수 있다는 것이 이해된다.
일 구현예에서, TVEMP를 포함하는 조성물은 TVEMP를 포함하는 약제학적 조성물이다. 상기 구현예의 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 약제학적 조성물은 추가로 약리학적 담체, 약제학적 성분, 또는 약리학적 담체 및 약제학적 성분 둘 다를 포함한다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 약제학적 조성물은 추가로 적어도 하나의 약리학적 담체, 적어도 하나의 약제학적 성분, 또는 적어도 하나의 약리학적 담체 및 적어도 하나의 약제학적 성분을 포함한다.
본 발명의 측면에서는 부분적으로 암을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 "암"이라는 용어는 병리학적 효과를 갖는 조절되지 않는 성장을 나타내는 세포를 의미한다. 본 명세서에 개시된 TVEMP, 조성물 및 방법이 TVEMP에 존재하는 표적화 도메인의 인지 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 임의 암을 치료하는데 유용할 수 있다는 것이 포함된다. 예를 들어 인터류킨(IL) 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 IL 수용체를 발현하는 암 세포의 치료에 유용할 것이며; 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 VEGF 수용체를 발현하는 암 세포의 치료에 유용할 것이고; 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 IGF 수용체를 발현하는 암 세포의 치료에 유용할 것이고; 표피 성장 인자(EGF) 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 EGF 수용체를 발현하는 암 세포의 치료에 유용할 것이고; 전환 성장 인자-β(TGFβ) 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 TGFβ수용체를 발현하는 암 세포의 치료에 유용할 것이고; 골 형태형성 단백질(BMP) 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 BMP 수용체를 발현하는 암 세포의 치료에 유용할 것이고; 성장 분화 인자(GDF) 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 GDF 수용체를 발현하는 암 세포의 치료에 유용할 것이고; 액티빈 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 액티빈 수용체를 발현하는 암 세포의 치료에 유용할 것이고; 섬유아세포 성장 인자(FGF) 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 FGF 수용체를 발현하는 암 세포의 치료에 유용할 것이고; 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 펩타이드 표적화 도메인을 포함하는 TVEMP는 PDGF 수용체를 발현하는 암 세포의 치료에 유용할 것이다.
본 발명의 측면에서는 부분적으로 암에 연관된 증상의 감소를 제공한다. 하나의 측면에 있어서, 감소되는 증상은 암 세포의 성장 속도의 증가이다. 또 다른 측면에 있어서, 감소되는 증상은 암 세포의 세포 분할 속도의 증가이다. 또 다른 측면에 있어서, 감소되는 증상은 암 세포의 주변 조직 또는 기관 내로의 침습 정도의 증가이다. 또 다른 측면에 있어서, 감소되는 증상은 전이 정도의 증가이다. 또 다른 측면에 있어서, 감소되는 증상은 혈관신생의 증가이다. 또 다른 측면에 있어서, 감소되는 증상은 아폽토시스의 감소이다. 또 다른 측면에 있어서, 감소되는 증상은 세포 사멸 또는 세포 괴사의 감소이다. 즉 TVEMP 처리는 암 세포의 성장 속도를 감소시키고, 암 세포의 세포 분할 속도를 감소시키고, 암 세포의 주변 조직 또는 기관 내로의 침습 정도를 감소시키고, 전이 정도를 감소시키고, 혈관신생을 감소시키고, 아폽토시스를 증가시키고/시키거나 세포 사멸 및/또는 세포 괴사를 증가시킬 것이다.
본 발명의 측면에서는 부분적으로 포유류를 제공한다. 포유류에는 인간이 포함되며, 인간은 환자일 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서는 부분적으로 개인을 제공한다. 개인에는 인간이 포함되며, 인간은 환자일 수 있다.
본 발명의 측면에서는 부분적으로 TVEMP를 포함하는 조성물의 투여를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 "투여"라는 용어는 TVEMP를 포함하는 조성물을 임상적, 치료적 또는 실험적으로 유익한 결과를 얻을 가능성이 있는 환자에게 제공하는 임의의 전달 기전을 의미한다. TVEMP는 TVEMP가 세포내 전달되는 세포 섭취 접근 또는 TVEMP가 발현 벡터에서 발현되는 전구체 RNA에서 유래되어 발현되는 유전자 치료법 접근을 이용하여 환자에게 전달될 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같이 TVEMP를 포함하는 조성물은 세포 섭취 접근을 이용하여 포유류에게 투여될 수 있다. 세포 섭취 접근을 이용한 TVEMP를 포함하는 조성물의 투여에는 임의의 허용가능한 형태의 경구 투여, 예컨대 정제, 액체, 캡슐, 분말 등; 임의의 허용가능한 형태의 국소 투여, 예컨대 점적, 스프레이, 크림, 겔 또는 연고; 임의의 허용가능한 형태의 정맥내 투여, 예컨대 정맥내 볼루스 주사, 정맥내 주입, 동맥내 볼루스 주사, 동맥내 주입 및 혈관 내로의 카테터 주입; 임의의 허용가능한 형태의 조직 주변 및 조직내 투여, 예컨대 복강내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 피하 주입, 안내 주사, 망막 주사 또는 망막하 주사 또는 경막 주사; 임의의 허용가능한 형태의 소포내 투여, 예컨대 카테터 주입; 및 설치 장치에 의한, 예컨대 이식, 패치, 펠렛, 카테터, 삼투압 펌프, 좌약, 생체 부식성 전달 시스템, 생체 비부식성 전달 시스템 또는 또 다른 이식된 연장 또는 서방형 시스템을 비제한적으로 포함하는 다양한 장관 또는 비경구 접근이 포함된다. 생체분해성 중합체의 예시적 목록 및 사용 방법은 예로 [Handbook of Biodegradable Polymers(Abraham J. Domb 등, eds., Overseas Publishers Association, 1997)]에 기재되어 있다.
TVEMP를 포함하는 조성물은 리포좀 내의 캡슐화, 이온이동법, 다른 전달체, 예컨대 히드로겔, 시클로덱스트린, 생체분해성 나노캡슐 및 생접착성 마이크로스피어 내로의 함입, 또는 단백질성 벡터를 비제한적으로 포함하는, 당해분야 숙련자에게 공지된 다양한 방법에 의해 포유류에게 투여될 수 있다. TVEMP를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 직접적 기전은 예로 [Leonid Beigelman 등, Compositions for the Delivery of Negatively Charged Molecules, 미국 특허 6,395,713; 및 Achim Aigner, Delivery Systems for the Direct Application of siRNAs to Induce RNA Interference ( RNAi ) in vivo, 2006(716559) J. Biomed. Biotech. 1-15 (2006); Controlled Drug Delivery : Designing Technologies for the Future (Kinam Park & Randy J. Mrsny eds., American Chemical Association, 2000); Vernon G. Wong & Mae W. L. Hu, Methods for Treating Inflammation -mediated Conditions of the Eye, 미국 특허 No. 6,726,918; David A. Weber 등, Methods and Apparatus for Delivery of Ocular Implants, 미국 특허 공보 번호. US2004/0054374; Thierry Nivaggioli 등, Biodegradable Ocular Implant, 미국 특허 공보 번호. US2004/0137059; Patrick M. Hughes 등, Anti - Angiogenic Sustained Release Anti - Angiogenic Sustained Release Intraocular Implants and Related Methods, 미국 특허 출원 11/364,687; 및 Patrick M. Hughes 등, Sustained Release Intraocular Drug Delivery Systems, 미국 특허 공보 2006/0182783]에 기재되어 있으며, 그 각각의 전문이 본 명세서에 참조로 통합된다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 TVEMP를 포함하는 조성물은 또한 암에 기여하는 신경 기반 병인을 드러내는 세포 내에서 TVEMP를 발현함으로써 유전자 치료법 접근을 이용하여 환자에게 투여될 수 있다. TVEMP는 발현 벡터에 작동가능하게 연결된 핵산 분자로부터 발현될 수 있으며, 예로 [P. D. Good 등, Expression of Small, Therapeutic RNAs in Human Cell Nuclei, 4(1) Gene Ther. 45-54 (1997); James D. Thompson, Polymerase III-based expression of therapeutic RNAs, 미국 특허 6,852,535(2005.02.08.); Maciej Wiznerowicz 등, Tuning Silence : Conditional Systems for RNA Interference, 3(9) Nat. Methods 682-688m (2006); Ola Snoene 및 John J. Rossi, Expressing Short Hairpin RNAi in vivo, 3(9) Nat. Methods 689-698 (2006); 및 Charles X. Li 등, Delivery of RNA Interference, 5(18) Cell Cycle 2103-2109 (2006)]를 참고하라. 당업자는 임의 TVEMP가 적절한 발현 벡터를 사용하여 진핵 세포에서 발현될 수 있음을 인지할 것이다.
TVEMP를 발현할 수 있는 발현 벡터는 암에 기여하는 신경 기반 병인을 드러내는 세포에서 TVEMP의 지속적 또는 안정한 발현을 제공할 수 있다. 대안적으로, TVEMP를 발현할 수 있는 발현 벡터는 암에 기여하는 신경 기반 병인을 드러내는 세포에서 TVEMP의 일시적 발현을 제공할 수 있다. 상기 일시적 발현 벡터는 필요에 따라 반복 투여될 수 있다. TVEMP 발현 벡터는 상기 논의된 전달 기전 및 투여 경로에 의해, 환자로부터 추출된 표적 세포에 투여 후 환자에게 재도입하여, 또는 원하는 표적 세포 내로 도입할 수 있는 임의의 다른 수단에 의해 투여될 수 있으며, 예로 [Larry A. Couture 및 Dan T. Stinchcomb, Anti - gene Therapy : The Use of Ribozymes to Inhibit Gene Function, 12(12) Trends Genet. 510-515 (1996)]을 참고하라.
TVEMP를 포함하는 조성물을 포유류에게 투여하는데 이용되는 실제 전달 기전은 당업자가 암의 유형, 암의 위치, 암의 원인, 암의 중증도, 원하는 경감 정도, 원하는 경감 기간, 사용하는 특정 TVEMP, 사용하는 TVEMP의 배출 속도, 사용하는 TVEMP의 약동력학, 조성물에 포함될 다른 화합물의 성질, 특정 투여 경로, 환자의 특정 특징, 병력 및 위험 요인, 예컨대 연령, 체중, 일반 건강 등이나 이들의 임의 조합을 비제한적으로 포함하는 요인들을 고려하여 결정할 수 있다.
일 구현예에서, TVEMP를 포함하는 조성물은 주사에 의해 치료될 부위로 투여된다. 상기 구현예의 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 조성물의 주사는, 예로 근육내 주사, 기관내 주사, 피하 주사, 피내 주사 또는 TVEMP를 포함하는 조성물의 효과적 투여를 위한 임의의 다른 신체 부위 내로의 주사에 의한다. 상기 구현예의 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 조성물의 주사는 종양으로 또는 종양 주변 부위 내로 수행된다.
TVEMP를 포함하는 조성물은 포유류에게 다양한 경로를 이용하여 투여될 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 암 치료 방법에 적합한 투여 경로에는 국소 및 전신 투여가 모두 포함된다. 국소 투여로 포유류의 전체 신체에 비해 특정 위치에 유의미하게 더 많은 조성물을 전달할 수 있는 반면, 전신 투여로 환자의 본질적으로 전체 신체에 조성물이 전달된다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 암 치료 방법에 적합한 투여 경로에는 또한 중추 및 말초 투여가 모두 포함된다. 중추 투여로는 본질적으로 환자의 중추 신경계에 조성물이 전달되며, 예로 경막내 투여, 경막외 투여 뿐만 아니라 두개 주사 또는 이식이 포함된다. 말초 투여로는 본질적으로 환자의 중추 신경계 외부의 임의 부위로 조성물이 전달되며, 척추 또는 뇌로의 직접적 투여를 제외한 임의 투여 경로가 포함된다. 포유류에서 사용되는 TVEMP를 포함하는 조성물의 실제 투여 경로는 당업자가 암의 유형, 암의 위치, 암의 원인, 암의 중증도, 원하는 경감 정도, 원하는 경감 기간, 사용하는 특정 TVEMP, 사용하는 TVEMP의 배출 속도, 사용하는 TVEMP의 약동력학, 조성물에 포함될 다른 화합물의 성질, 특정 투여 경로, 포유류의 특정 특징, 병력 및 위험 요인, 예컨대 연령, 체중, 일반 건강 등이나 이들의 임의 조합을 비제한적으로 포함하는 요인들을 고려하여 결정할 수 있다.
일 구현예에서, TVEMP를 포함하는 조성물은 포유류에 전신 투여된다. 또 다른 구현예에서, TVEMP를 포함하는 조성물은 포유류에 국소 투여된다. 본 구현예의 한 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 조성물은 포유류의 종양에 투여된다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 조성물은 포유류의 종양 주변 부위에 투여된다.
본 발명의 측면에서는 부분적으로 TVEMP를 포함하는 조성물의 치료적 유효량의 투여를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 "치료적 유효량"이라는 용어는 "치료적 유효 용량"과 동의어이며, 암 치료에 관해 사용되는 경우 원하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 TVEMP의 최소 용량을 의미하고, 암에 연관된 증상을 감소시키기 충분한 용량이 포함된다. 상기 구현예의 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 조성물의 치료적 유효량은, 예로 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100% 암에 연관된 증상을 감소시킨다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 조성물의 치료적 유효량은, 예로 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%, 최대 80%, 최대 90% 또는 최대 100% 암에 연관된 증상을 감소시킨다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 조성물의 치료적 유효량은, 예로 약 10% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 60%, 또는 약 30% 내지 약 50% 암에 연관된 증상을 감소시킨다. 본 명세서에서 사용되는 "약"이라는 용어는 언급된 항목, 숫자, 백분율, 또는 기간의 값을 정량하는 경우 상기 언급된 항목, 백분율, 파라미터 또는 기간의 값의 플러스 또는 마이너스 10% 범위를 나타낸다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, TVEMP의 치료적 유효량은 예로 적어도 1주, 적어도 1달, 적어도 2달, 적어도 3달, 적어도 4달, 적어도 5달, 적어도 6달, 적어도 7달, 적어도 8달, 적어도 9달, 적어도 10달, 적어도 11달, 또는 적어도 12달 동안 신경 활성을 저해하기 충분한 투여량이다.
포유류에 투여될 TVEMP를 포함하는 조성물의 실제 치료적 유효량은 당업자가 암의 유형, 암의 위치, 암의 원인, 암의 중증도, 원하는 경감 정도, 원하는 경감 기간, 사용하는 특정 TVEMP, 사용하는 TVEMP의 배출 속도, 사용하는 TVEMP의 약동력학, 조성물에 포함될 다른 화합물의 성질, 특정 투여 경로, 환자의 특정 특징, 병력 및 위험 요인, 예컨대 연령, 체중, 일반 건강 등이나 이들의 임의 조합을 비제한적으로 포함하는 요인들을 고려하여 결정할 수 있다. 추가적으로 TVEMP를 포함하는 조성물의 반복 투여를 이용하는 경우, TVEMP를 포함하는 조성물의 실제 유효량은 추가로 투여 빈도, TVEMP를 포함하는 조성물의 반감기 또는 이들의 임의 조합을 비제한적으로 포함하는 요인들에 근거할 것이다. TVEMP를 포함하는 조성물의 유효량은 인간으로의 투여 전 시험관 내 분석 및 동물 모델을 이용하는 생체 내 투여 연구로부터 추정할 수 있음은 당업자에게 공지되어 있다. 다양한 투여 경로의 상이한 효율의 관점에서 필요한 유효량에는 다양한 변형이 예측된다. 예를 들어 경구 투여는 일반적으로 정맥내 또는 유리질내 주사에 의한 투여 보다 더 높은 투여량 수준을 필요로 할 것으로 예측될 것이다. 이들 투여량 수준의 변화는 당업자에게 널리 공지된 표준 최적화 실험 방식을 이용하여 조정될 수 있다. 정확한 치료적 유효 투여량 수준 및 양식은 상기 확인된 요인들을 고려하여 주치의에 의해 바람직하게 결정된다.
비제한적 예로서 TVEMP를 포함하는 조성물을 포유류에게 투여하는 경우, 치료적 유효량은 일반적으로 약 1 fg 내지 약 3.0 mg 범위이다. 상기 구현예의 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 조성물의 유효량은, 예로 약 100 fg 내지 약 3.0 mg, 약 100 pg 내지 약 3.0 mg, 약 100 ng 내지 약 3.0 mg, 또는 약 100 ㎍ 내지 약 3.0 mg일 수 있다. 본 구현예의 다른 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 조성물의 유효량은, 예로 약 100 fg 내지 약 750 ㎍, 약 100 pg 내지 약 750 ㎍, 약 100 ng 내지 약 750 ㎍, 또는 약 1 ㎍ 내지 약 750 ㎍일 수 있다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 조성물의 치료적 유효량은, 예로 적어도 1 fg, 적어도 250 fg, 적어도 500 fg, 적어도 750 fg, 적어도 1 pg, 적어도 250 pg, 적어도 500 pg, 적어도 750 pg, 적어도 1 ng, 적어도 250 ng, 적어도 500 ng, 적어도 750 ng, 적어도 1 ㎍, 적어도 250 ㎍, 적어도 500 ㎍, 적어도 750 ㎍, 또는 적어도 1 mg일 수 있다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 조성물의 치료적 유효량은, 예로 최대 1 fg, 최대 250 fg, 최대 500 fg, 최대 750 fg, 최대 1 pg, 최대 250 pg, 최대 500 pg, 최대 750 pg, 최대 1 ng, 최대 250 ng, 최대 500 ng, 최대 750 ng, 최대 1 ㎍, 적어도 250 ㎍, 최대 500 ㎍, 최대 750 ㎍, 또는 최대 1 mg일 수 있다.
또 다른 비제한적 예로서, TVEMP를 포함하는 조성물을 포유류에 투여하는 경우, 치료적 유효량은 일반적으로 약 0.00001 mg/kg 내지 약 3.0 mg/kg 범위이다. 상기 구현예의 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 조성물의 유효량은, 예로 약 0.0001 mg/kg 내지 약 0.001 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 3.0 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 3.0 mg/kg, 또는 약 0.3 mg/kg 내지 약 3.0 mg/kg일 수 있다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 조성물의 치료적 유효량은, 예로 적어도 0.00001 mg/kg, 적어도 0.0001 mg/kg, 적어도 0.001 mg/kg, 적어도 0.01 mg/kg, 적어도 0.1 mg/kg, 또는 적어도 1 mg/kg일 수 있다. 본 구현예의 또 다른 측면에 있어서, TVEMP를 포함하는 조성물의 치료적 유효량은, 예로 최대 0.00001 mg/kg, 최대 0.0001 mg/kg, 최대 0.001 mg/kg, 최대 0.01 mg/kg, 최대 0.1 mg/kg, 또는 최대 1 mg/kg일 수 있다.
용량은 단일 투여량일 수도 축적(연속 용량)일 수도 있으며, 당해분야 숙련자가 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 암의 치료에는 TVEMP를 포함하는 조성물의 유효 용량의 1회 투여가 포함될 수 있다. 비제한적 예로서, TVEMP를 포함하는 조성물의 유효 용량은 환자에게 1회, 예로 단일 주사 또는 침적으로서 암 증상을 나타내는 부위 또는 근처에 투여될 수 있다. 대안적으로 암의 치료에는 여러 시간 범위, 예컨대 매일, 수일마다 1회, 매주, 매월 또는 매년에 걸쳐 수행되는 TVEMP를 포함하는 조성물의 유효 용량의 다회 투여가 포함될 수 있다. 비제한적 예로서, TVEMP를 포함하는 조성물은 포유류에 년 1회 또는 2회 투여될 수 있다. 투여 시점은 포유류 증상의 중증도와 같은 요인들에 근거하여 포유류 마다 다를 수 있다. 예를 들어, TVEMP를 포함하는 조성물의 유효 용량은 계속적으로 또는 환자가 더 이상 치료법을 필요로 하지 않을 때까지 매달 1회 포유류에 투여될 수 있다. 당업자는 포유류의 상태를 치료 과정에 걸쳐 모니터링할 수 있고, 투여되는 TVEMP를 포함하는 조성물의 유효량을 이에 따라 조정할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 TVEMP를 포함하는 조성물은 또한 다른 치료 화합물과 조합으로 포유류에 투여되어 치료의 전체적 치료 효과를 증가시킬 수 있다. 적응증을 치료하기 위한 복수 화합물의 사용은 유익한 효과를 증가시키면서 부작용의 존재를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 또한 하기와 같이 기재될 수 있다:
1. 치료가 필요한 포유동물에게 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인을 포함하는 TVEMP를 포함하는 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 암의 치료 방법으로서, 상기 조성물의 투여는 암과 연관된 증상을 감소시키는 방법.
2. 치료가 필요한 동물의 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 TVEMP의 용도로서, 상기 TVEMP는 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인을 포함하고, 치료적 유효량의 의약의 포유동물에의 투여는 암과 연관된 증상을 감소시키는 용도.
3. 치료가 필요한 포유동물의 암을 치료하기 위한 TVEMP의 용도로서, 포유동물에게 치료적 유효량의 TVEMP를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 TVEMP는 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 클로스트리듐 독소 효소 도메인를 포함하며 상기 TVEMP의 투여는 암과 연관된 증상을 감소시키는 용도.
4. 포유동물의 암의 치료 방법으로서, 치료가 필요한 포유동물에게 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 및 외생성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 TVEMP를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물의 투여는 암과 연관된 증상을 감소시키는 방법.
5. 치료가 필요한 동물의 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 TVEMP의 용도로서, 상기 TVEMP는 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 및 외생성 프로테아제 절단 부위를 포함하고, 치료적 유효량의 의약의 포유동물에의 투여는 암과 연관된 증상을 감소시키는 용도.
6. 치료가 필요한 포유동물의 암을 치료하기 위한 TVEMP의 용도로서, 포유동물에게 치료적 유효량의 TVEMP을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 TVEMP는 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 및 외생성 프로테아제 절단 부위를 포함하고, 상기 TVEMP의 투여는 암과 연관된 증상을 감소시키는 용도.
7. 상기 1-3에 있어서, 상기 TVEMP는 1) 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 표적화 도메인, 2) 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 3) 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 4) 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 5) 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 효소 도메인 및 표적화 도메인, 또는 6) 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 표적화 도메인 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인의 순서로 선형 아미노-대-카복실 단일 폴리펩타이드를 포함하는 방법.
8. 상기 4-6에 있어서, 상기 TVEMP는 1) 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 표적화 도메인, 2) 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 3) 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 4) 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 5) 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 효소 도메인 및 표적화 도메인, 또는 6) 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 표적화 도메인 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인의 순서로 선형 아미노-대-카복실 단일 폴리펩타이드를 포함하는 방법.
9. 상기 1-8에 있어서, 상기 표적화 도메인은 인터류킨 (IL) 펩타이드, 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 펩타이드, 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 펩타이드, 상피세포 성장 인자 (EGF) 펩타이드, 형질전환 성장 인자-β (TGFβ) 펩타이드, 뼈 형성 단백질 (BMP), 성장 및 분화 인자 (GDF) 펩타이드, 액티빈 펩타이드, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 펩타이드, 또는 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)인 방법.
10. 상기 9에 있어서, 상기 인터류킨 (IL) 펩타이드 표적화 도메인은 IL-1 펩타이드, IL-2 펩타이드, IL-3 펩타이드, IL-4 펩타이드, IL-5 펩타이드, IL-6 펩타이드, IL-7 펩타이드, IL-8 펩타이드, IL-9 펩타이드, IL-10 펩타이드, IL-11 펩타이드, IL-32 펩타이드, 또는 IL-33인 방법.
11. 상기 10에 있어서, 상기 인터류킨 (IL) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 82의 아미노산 123-265, 서열번호: 83의 아미노산 21-153, 서열번호: 84의 아미노산 57-210, 서열번호: 85의 아미노산 21-99 또는 아미노산 31-94, 서열번호: 86의 아미노산 37-173 또는 아미노산 19-178, 서열번호: 87의 아미노산 37-199, 서열번호: 146의 아미노산 20-137, 서열번호: 147의 아미노산 25-153, 서열번호: 148의 아미노산 24-131, 서열번호: 149의 아미노산 27-173, 서열번호: 150, 서열번호: 151, 또는 서열번호: 152의 아미노산 19-142을 포함하는 방법.
12. 상기 10 또는 11에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병, 갑상선암, 또는 결장암인 방법.
13. 상기 9에 있어서, 상기 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 펩타이드 표적화 도메인은 VEGF-A 펩타이드, VEGF-B 펩타이드, VEGF-C 펩타이드, VEGF-D 펩타이드, 또는 태반 성장인자 (PlGF) 펩타이드인 방법.
14. 상기 13에 있어서, 상기 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 88의 아미노산 50-133, 서열번호: 89의 아미노산 45-127, 서열번호: 90의 아미노산 129-214, 서열번호: 91의 아미노산 109-194, 서열번호: 92의 아미노산 46-163, 아미노산 49-162, 아미노산 168-345, 아미노산 244-306, 또는 아미노산 248-340, 또는 서열번호: 93의 아미노산 50-131 또는 아미노산 132-203을 포함하는 방법.
15. 상기 13 또는 14에 있어서, 상기 암은 전립선암, 신세포 암종, 난소암, 방광암, 결장암, 림프종, 횡문근육종, 유방암, 뼈육종, 갑상선암, 폐암, 비-소세포 폐암, 흑색종, 췌장암, 안구 흑색종, 망막아세포종, 안구내 종양, 백혈병, 카포시(Kaposi) 육종, 수아세포종, 기형암, 신경모세포종, 중피종, 인슐린종, 위선암, 내장 종양, 신경아교종, 성상세포종, 또는 신장 종양인 방법.
16. 상기 9에 있어서, 상기 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 펩타이드 표적화 도메인은 IGF-1 펩타이드 또는 IGF-2 펩타이드인 방법.
17. 상기 16에 있어서, 상기 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 94의 아미노산 52-109 또는 아미노산 49-118, 또는 서열번호: 95의 아미노산 31-84 또는 아미노산 25-180을 포함하는 방법.
18. 상기 16 또는 17에 있어서, 상기 암은 유방암, 결장암, 폐암, 전립선암, 위암 또는 간암인 방법.
19. 상기 9에 있어서, 상기 상피세포 성장 인자 (EGF) 펩타이드 표적화 도메인은 EGF, 헤파린 결합 EGF 유사 성장 인자 (HB-EGF), 혈질전환 성장 인자-알파기호 (TGF-알파기호, 암피레귤린 (AR, 에피레귤린 (EPR, 에피겐 (EPG), 베타셀룰린 (BTC), 뉴레귤린-1 (NRG1), 뉴레귤린-2 (NRG2), 뉴레귤린-3, (NRG3), 또는 뉴레귤린-4 (NRG4)인 방법.
20. 상기 19에 있어서, 상기 상피세포 성장 인자 (EGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 96, 서열번호: 97, 서열번호: 98, 서열번호: 99의 아미노산 101-251 또는 아미노산 107-251, 서열번호: 100의 아미노산 63-108, 서열번호: 101의 아미노산 23-154, 서열번호: 102, 서열번호: 103의 아미노산 235-630, 서열번호: 104의 아미노산 398-718, 서열번호: 105의 아미노산 353-648, 또는 서열번호: 106을 포함하는 방법.
21. 상기 19 또는 20에 있어서, 상기 암은 폐암, 전립선암, 난소암, 방광암, 갑상선암, 혼합형 유두 및 여포 갑상선 암종, 담도암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 결장암, 위암, 자궁내막암, 식도암, 난관암, 담낭 및 담관암, 두경부암, 간암, 폐암, 골수이형성 증후군, 비-소세포 폐암, 구강암, 췌장암, 복강암, 진성 적혈구증가증, 신장암, 또는 피부암인 방법.
22. 상기 9에 있어서, 상기 형질전환 성장 인자-β (TGFβ) 펩타이드 표적화 도메인은 TGFβ1 펩타이드, TGFβ2 펩타이드, TGFβ3 펩타이드, 또는 TGFβ4 펩타이드인 방법.
23. 상기 22에 있어서, 상기 형질전환 성장 인자-β (TGFβ) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 107의 아미노산 293-390, 서열번호: 108의 아미노산 317-414, 서열번호: 109의 아미노산 315-412, 또는 서열번호: 110의 아미노산 276-373을 포함하는 방법.
24. 상기 22 또는 23에 있어서, 상기 암은 전립선암, 백혈병, 신세포 암종, 크롬친화세포종, 갑상선암, 뇌하수체 종양, 결장암, 림프종, 위암, 유방암, 뼈육종, 섬유육종, 간암, 간세포 암종, 유두 갑상선암, 골수종, 췌장암, 고환 종양, 난소암, 자궁경부 암종, 자궁내막 선암종, 자궁 내막양 선암, 흑색종, 횡문근육종, 편평세포암종, 신경모세포종, 부신 암종, 타액 선양 낭성 암종, 또는 위선암인 방법.
25. 상기 9에 있어서, 상기 뼈 형성 단백질 (BMP) 펩타이드 표적화 도메인은 BMP2 펩타이드, BMP3 펩타이드, BMP4 펩타이드, BMP5 펩타이드, BMP6 펩타이드, BMP7 펩타이드, BMP8 펩타이드, 또는 BMP10 펩타이드인 방법.
26. 상기 25에 있어서, 상기 뼈 형성 단백질 (BMP) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 111의 아미노산 296-396, 서열번호: 112의 아미노산 370-472, 서열번호: 113의 아미노산 309-409, 서열번호: 114의 아미노산 353-454 또는 아미노산 323-454, 서열번호: 115의 아미노산 412-513 또는 아미노산 374-513, 서열번호: 116의 아미노산 330-431 또는 아미노산 293-431, 서열번호: 117의 아미노산 301-402, 또는 서열번호: 118의 아미노산 323-424를 포함하는 방법.
27. 상기 25 또는 26에 있어서, 상기 암은 전립선암, 백혈병, 담도암, 난소암, 뼈암, 뼈육종, 결장암, 골수종, 고환암, 고환 종양, 유방암, 교모세포종, 편평세포암종, 폐 암종, 부신피질 암종, 뇌하수체 종양, 자궁 내막양 선암, 간암, 간세포 암종, 위선암, 또는 췌장암인 방법.
28. 상기 9에 있어서, 상기 성장 및 분화 인자 (GDF) 펩타이드 표적화 도메인은 GDF1 펩타이드, GDF2 펩타이드, GDF3 펩타이드, GDF5 펩타이드, GDF6 펩타이드, GDF7 펩타이드, GDF8 펩타이드, GDF10 펩타이드, GDF11 펩타이드, 또는 GDF15 펩타이드인 방법.
29. 상기 28에 있어서, 상기 성장 및 분화 인자 (GDF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 119의 아미노산 267-372, 서열번호: 120의 아미노산 327-429, 서열번호: 121의 아미노산 264-364, 서열번호: 122의 아미노산 400-501, 서열번호: 123의 아미노산 354-455, 서열번호: 124의 아미노산 352-450, 서열번호: 125의 아미노산 281-375, 서열번호: 126의 아미노산 376-478, 서열번호: 127의 아미노산 313-407, 또는 서열번호: 128의 아미노산 211-308을 포함하는 방법.
30. 상기 28 또는 29에 있어서, 상기 암은 전립선암, 신세포 암종, 크롬친화세포종, 담도암, 난소암, 고환 종양, 뼈암, 갑상선암, 유두 갑상선암, 뇌하수체 종양, 자궁 내막양 선암, 결장암, 골수종, 림프종, 백혈병, 고환암, 위암, 위선암, 유방암, 교모세포종, 섬유육종, 간암, 간세포 암종, 편평세포암종, 폐 암종, 부신피질 암종, 췌장암, 또는 뼈육종인 방법.
31. 상기 9에 있어서, 상기 액티빈 펩타이드 표적화 도메인은 액티빈 A 펩타이드, 액티빈 B 펩타이드, 액티빈 C 펩타이드, 액티빈 E 펩타이드, 또는 인히빈 A 펩타이드인 방법.
32. 상기 31에 있어서, 상기 액티빈 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 129의 아미노산 321-426, 서열번호: 130의 아미노산 303-406, 서열번호: 131의 아미노산 247-352 또는 아미노산 237-352, 서열번호: 132의 아미노산 247-350, 또는 서열번호: 133의 아미노산 262-366 또는 아미노산 233-366을 포함하는 방법.
33. 상기 31 또는 32에 있어서, 상기 암은 전립선암, 신세포 암종, 난소암, 백혈병, 결장암, 뇌하수체 종양, 크롬친화세포종, 위암, 유방암, 부신 암종, 타액 선양 낭성 암종, 자궁 내막양 선암, 고환 종양, 간암, 간세포 암종, 골수종, 췌장암, 또는 위선암인 방법.
34. 상기 9에 있어서, 상기 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 펩타이드 표적화 도메인은 FGF1 펩타이드, FGF2 펩타이드, FGF3 펩타이드, FGF4 펩타이드, FGF5 펩타이드, FGF6 펩타이드, FGF7 펩타이드, FGF8 펩타이드, FGF9 펩타이드, FGF10 펩타이드, FGF17 펩타이드, 또는 FGF18 펩타이드인 방법.
35. 상기 34에 있어서, 상기 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 134의 아미노산 29-151, 서열번호: 135의 아미노산 30-152, 서열번호: 136의 아미노산 46-181, 서열번호: 137의 아미노산 84-206, 서열번호: 138의 아미노산 91-219, 서열번호: 139의 아미노산 38-198, 서열번호: 140의 아미노산 67-191, 서열번호: 141의 아미노산 43-167, 서열번호: 142의 아미노산 64-191, 서열번호: 143의 아미노산 80-204, 서열번호: 144의 아미노산 55-178, 또는 서열번호: 145의 아미노산 55-177를 포함하는 방법.
36. 상기 34 또는 35에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 유방암, 자궁내막 난소암, 위암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 상피성 난소암, 평활근종, 또는 뇌하수체 종양인 방법.
37. 상기 9에 있어서, 상기 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 펩타이드 표적화 도메인은 PDGF알파기호 펩타이드 또는 PDGFβ 펩타이드인 방법.
38. 상기 34에 있어서, 상기 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 153의 아미노산 94-182 또는 서열번호: 154의 아미노산 95-182를 포함하는 방법.
39. 상기 34 또는 35에 있어서, 상기 암은 전립선암, 신세포 암종, 방광암, 비-소세포 폐암, 횡문근육종, 위장관 간질 종양, 수아세포종, 교모세포종, 비인두 암종, 섬유육종, 기저 세포암, 신경모세포종, 성상세포종, 뼈육종, 유잉 육종 (Ewing's sarcoma), 유방암, 고환 종양, 난소암, 흑색종, 골수종, 편평세포암종, 림프종, 백혈병, 중피종, 카포시(Kaposi) 육종, 또는 연골육종인 방법.
40. 상기 1-39에 있어서, 상기 클로스트리듐 독소 전위 도메인은 BoNT/A 전위 도메인, BoNT/B 전위 도메인, BoNT/C1 전위 도메인, BoNT/D 전위 도메인, BoNT/E 전위 도메인, BoNT/F 전위 도메인, BoNT/G 전위 도메인, TeNT 전위 도메인, BaNT 전위 도메인, 또는 BuNT 전위 도메인인 방법.
41. 상기 1-39에 있어서, 상기 클로스트리듐 독소 효소 도메인은 BoNT/A 효소 도메인, BoNT/B 효소 도메인, BoNT/C1 효소 도메인, BoNT/D 효소 도메인, BoNT/E 효소 도메인, BoNT/F 효소 도메인, BoNT/G 효소 도메인, TeNT 효소 도메인, BaNT 효소 도메인, 또는 BuNT 효소 도메인인 방법.
42. 상기 4-6 및 8에 있어서, 상기 외생성 프로테아제 절단 부위는 식물 파파인 절단 부위, 곤충 파파인 절단 부위, 갑각류 파파인 절단 부위, 엔테로키나아제 절단 부위, 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 담배 식각 바이러스 프로테아제 절단 부위, 담배 엽맥 모틀 (Tobacco Vein Mottling) 바이러스 절단 부위, 서브틸리신(subtilisin) 절단 부위, 히드록실아민 절단 부위, 또는 카스파제(Caspase) 3 절단 부위인 방법.
43. 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인를 포함하는 TVEMP로서, 상기 조성물의 투여는 암과 연관된 증상을 감소시키는 TVEMP.
44. 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 및 외생성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 TVEMP로서, 상기 조성물의 투여는 암과 연관된 증상을 감소시키는 TVEMP.
45. 상기 43에 있어서, 상기 TVEMP는 1) 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 표적화 도메인, 2) 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 3) 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 4) 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 5) 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 효소 도메인 및 표적화 도메인, 또는 6) 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 표적화 도메인 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인의 순서로 선형 아미노-대-카복실 단일 폴리펩타이드를 포함하는 TVEMP.
46. 상기 44에 있어서, 상기 TVEMP는 1) 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 표적화 도메인, 2) 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 3) 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 4) 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 5) 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 효소 도메인 및 표적화 도메인, 또는 6) 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 표적화 도메인 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인의 순서로 선형 아미노-대-카복실 단일 폴리펩타이드를 포함하는 TVEMP.
47. 상기 43-46에 있어서, 상기 표적화 도메인은 인터류킨 (IL) 펩타이드, 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 펩타이드, 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 펩타이드, 상피세포 성장 인자 (EGF) 펩타이드, 형질전환 성장 인자-β (TGFβ) 펩타이드, 뼈 형성 단백질 (BMP), 성장 및 분화 인자 (GDF) 펩타이드, 액티빈 펩타이드, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 펩타이드, 또는 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 펩타이드인 TVEMP.
48. 상기 47에 있어서, 상기 인터류킨 (IL) 펩타이드 표적화 도메인은 IL-1 펩타이드, IL-2 펩타이드, IL-3 펩타이드, IL-4 펩타이드, IL-5 펩타이드, IL-6 펩타이드, IL-7 펩타이드, IL-8 펩타이드, IL-9 펩타이드, IL-10 펩타이드, IL-11 펩타이드, IL-32 펩타이드, 또는 IL-33 펩타이드인 TVEMP.
49. 상기 48에 있어서, 상기 인터류킨 (IL) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 82의 아미노산 123-265, 서열번호: 83의 아미노산 21-153, 서열번호: 84의 아미노산 57-210, 서열번호: 85의 아미노산 21-99 또는 아미노산 31-94, 서열번호: 86의 아미노산 37-173 또는 아미노산 19-178, 서열번호: 87의 아미노산 37-199, 서열번호: 146의 아미노산 20-137, 서열번호: 147의 아미노산 25-153, 서열번호: 148의 아미노산 24-131, 서열번호: 149의 아미노산 27-173, 서열번호: 150, 서열번호: 151, 또는 서열번호: 152의 아미노산 19-142을 포함하는 TVEMP.
50. 상기 47에 있어서, 상기 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 펩타이드 표적화 도메인은 VEGF-A 펩타이드, VEGF-B 펩타이드, VEGF-C 펩타이드, VEGF-D 펩타이드, 또는 태반 성장인자 (PlGF) 펩타이드인 TVEMP.
51. 상기 50에 있어서, 상기 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 88의 아미노산 50-133, 서열번호: 89의 아미노산 45-127, 서열번호: 90의 아미노산 129-214, 서열번호: 91의 아미노산 109-194, 서열번호: 92의 아미노산 46-163, 아미노산 49-162, 아미노산 168-345, 아미노산 244-306, 또는 아미노산 248-340, 또는 서열번호: 93의 아미노산 50-131 또는 아미노산 132-203을 포함하는 TVEMP.
52. 상기 47에 있어서, 상기 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 펩타이드 표적화 도메인은 IGF-1 펩타이드 또는 IGF-2 펩타이드인 TVEMP.
53. 상기 52에 있어서, 상기 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 94의 아미노산 52-109 또는 아미노산 49-118, 또는 서열번호: 95의 아미노산 31-84 또는 아미노산 25-180을 포함하는 TVEMP.
54. 상기 47에 있어서, 상기 상피세포 성장 인자 (EGF) 펩타이드 표적화 도메인은 EGF, 헤파린 결합 EGF 유사 성장 인자 (HB-EGF), 혈질전환 성장 인자-알파기호 (TGF-알파기호, 암피레귤린 (AR, 에피레귤린 (EPR, 에피겐 (EPG), 베타셀룰린 (BTC), 뉴레귤린-1 (NRG1), 뉴레귤린-2 (NRG2), 뉴레귤린-3, (NRG3), 또는 뉴레귤린-4 (NRG4)인 TVEMP.
55. 상기 54에 있어서, 상기 상피세포 성장 인자 (EGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 96, 서열번호: 97, 서열번호: 98, 서열번호: 99의 아미노산 101-251 또는 아미노산 107-251, 서열번호: 100의 아미노산 63-108, 서열번호: 101의 아미노산 23-154, 서열번호: 102, 서열번호: 103의 아미노산 235-630, 서열번호: 104의 아미노산 398-718, 서열번호: 105의 아미노산 353-648, 또는 서열번호: 106을 포함하는 TVEMP.
56. 상기 47에 있어서, 상기 형질전환 성장 인자-β (TGFβ) 펩타이드 표적화 도메인은 TGFβ1 펩타이드, TGFβ2 펩타이드, TGFβ3 펩타이드, 또는 TGFβ4 펩타이드인 TVEMP.
57. 상기 56에 있어서, 상기 형질전환 성장 인자-β (TGFβ) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 107의 아미노산 293-390, 서열번호: 108의 아미노산 317-414, 서열번호: 109의 아미노산 315-412, 또는 서열번호: 110의 아미노산 276-373을 포함하는 TVEMP.
58. 상기 47에 있어서, 상기 뼈 형성 단백질 (BMP) 펩타이드 표적화 도메인은 BMP2 펩타이드, BMP3 펩타이드, BMP4 펩타이드, BMP5 펩타이드, BMP6 펩타이드, BMP7 펩타이드, BMP8 펩타이드, 또는 BMP10 펩타이드인 TVEMP.
59. 상기 58에 있어서, 상기 뼈 형성 단백질 (BMP) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 111의 아미노산 296-396, 서열번호: 112의 아미노산 370-472, 서열번호: 113의 아미노산 309-409, 서열번호: 114의 아미노산 353-454 또는 아미노산 323-454, 서열번호: 115의 아미노산 412-513 또는 아미노산 374-513, 서열번호: 116의 아미노산 330-431 또는 아미노산 293-431, 서열번호: 117의 아미노산 301-402, 또는 서열번호: 118의 아미노산 323-424를 포함하는 TVEMP.
60. 상기 47에 있어서, 상기 성장 및 분화 인자 (GDF) 펩타이드 표적화 도메인은 GDF1 펩타이드, GDF2 펩타이드, GDF3 펩타이드, GDF5 펩타이드, GDF6 펩타이드, GDF7 펩타이드, GDF8 펩타이드, GDF10 펩타이드, GDF11 펩타이드, 또는 GDF15 펩타이드인 TVEMP.
61. 상기 60에 있어서, 상기 성장 및 분화 인자 (GDF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 119의 아미노산 267-372, 서열번호: 120의 아미노산 327-429, 서열번호: 121의 아미노산 264-364, 서열번호: 122의 아미노산 400-501, 서열번호: 123의 아미노산 354-455, 서열번호: 124의 아미노산 352-450, 서열번호: 125의 아미노산 281-375, 서열번호: 126의 아미노산 376-478, 서열번호: 127의 아미노산 313-407, 또는 서열번호: 128의 아미노산 211-308을 포함하는 TVEMP.
62. 상기 47에 있어서, 상기 액티빈 펩타이드 표적화 도메인은 액티빈 A 펩타이드, 액티빈 B 펩타이드, 액티빈 C 펩타이드, 액티빈 E 펩타이드, 또는 인히빈 A 펩타이드인 TVEMP.
63. 상기 62에 있어서, 상기 액티빈 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 129의 아미노산 321-426, 서열번호: 130의 아미노산 303-406, 서열번호: 131의 아미노산 247-352 또는 아미노산 237-352, 서열번호: 132의 아미노산 247-350, 또는 서열번호: 133의 아미노산 262-366 또는 아미노산 233-366을 포함하는 TVEMP.
64. 상기 47에 있어서, 상기 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 펩타이드 표적화 도메인은 FGF1 펩타이드, FGF2 펩타이드, FGF3 펩타이드, FGF4 펩타이드, FGF5 펩타이드, FGF6 펩타이드, FGF7 펩타이드, FGF8 펩타이드, FGF9 펩타이드, FGF10 펩타이드, FGF17 펩타이드, 또는 FGF18 펩타이드인 TVEMP.
65. 상기 64에 있어서, 상기 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 134의 아미노산 29-151, 서열번호: 135의 아미노산 30-152, 서열번호: 136의 아미노산 46-181, 서열번호: 137의 아미노산 84-206, 서열번호: 138의 아미노산 91-219, 서열번호: 139의 아미노산 38-198, 서열번호: 140의 아미노산 67-191, 서열번호: 141의 아미노산 43-167, 서열번호: 142의 아미노산 64-191, 서열번호: 143의 아미노산 80-204, 서열번호: 144의 아미노산 55-178, 또는 서열번호: 145의 아미노산 55-177를 포함하는 TVEMP.
66. 상기 47에 있어서, 상기 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 펩타이드 표적화 도메인은 PDGF알파기호 펩타이드 또는 PDGFβ 펩타이드인 TVEMP.
67. 상기 66에 있어서, 상기 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 153의 아미노산 94-182 또는 서열번호: 154의 아미노산 95-182를 포함하는 TVEMP.
68. 상기 43-67에 있어서, 상기 클로스트리듐 독소 전위 도메인은 BoNT/A 전위 도메인, BoNT/B 전위 도메인, BoNT/C1 전위 도메인, BoNT/D 전위 도메인, BoNT/E 전위 도메인, BoNT/F 전위 도메인, BoNT/G 전위 도메인, TeNT 전위 도메인, BaNT 전위 도메인, 또는 BuNT 전위 도메인인 TVEMP.
69. 상기 43-67에 있어서, 상기 클로스트리듐 독소 효소 도메인은 BoNT/A 효소 도메인, BoNT/B 효소 도메인, BoNT/C1 효소 도메인, BoNT/D 효소 도메인, BoNT/E 효소 도메인, BoNT/F 효소 도메인, BoNT/G 효소 도메인, TeNT 효소 도메인, BaNT 효소 도메인, 또는 BuNT 효소 도메인인 TVEMP.
70. 상기 44 및 46에 있어서, 상기 외생성 프로테아제 절단 부위는 식물 파파인 절단 부위, 곤충 파파인 절단 부위, 갑각류 파파인 절단 부위, 엔테로키나아제 절단 부위, 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 담배 식각 바이러스 프로테아제 절단 부위, 담배 엽맥 모틀 (Tobacco Vein Mottling) 바이러스 절단 부위, 서브틸리신(subtilisin) 절단 부위, 히드록실아민 절단 부위, 또는 카스파제(Caspase) 3 절단 부위인 TVEMP.
71. 상기 40-65의 TVEMP를 포함하는 조성물.
72. 상기 71에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 조성물.
73. 상기 72에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약제학적 담체, 약제학적 부형제, 또는 이의 임의 조합을 포함하는 조성물.
실시예
하기 실시예로 이제 포함되는 대표적 구현예를 예시하지만, 개시되는 TVEMP, TVEMP를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 암 치료 방법을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1
경쇄 분석
본 실시예는 어느 클로스트리듐 독소의 경쇄가 암 치료에 치료적 이득을 제공하기 충분한 효과를 갖는지를 결정하기 위해 암 세포를 스크리닝하는 방법을 예시한다.
어느 클로스트리듐 독소의 경쇄 또는 이들의 활성 단편이 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 암을 치료하는 TVEMP의 제조에 유용한지를 동정하기 위해, 클로스트리듐 독소의 경쇄 절단 분석을 수행하였다. 이러한 분석으로 두 가지 기본적 문제가 확인된다. 첫번째로 다양한 보툴리늄 신경독소 혈청형의 경쇄는 상이한 SNARE 기질을 절단한다. 부가적으로, 일부 세포는 천연 생성 보툴리늄 신경독소에 의해 절단되지 않는 SNAP-23만을 발현할 수 있다. 이들 세포는 LC/A에 감수성이 아니지만, 각각 시냅토브레빈-2(VAMP-2) 및/또는 신택신을 발현하는 경우 LC/B 및 LC/C1에 감수성일 수 있다. 두번째로 상기 전달감염 분석으로 수용체 결합 및 세포 내로의 전위와 무관한 방식으로 암 세포에 대한 경쇄의 세포성 효과를 조사할 수 있다. 종합해 보면, 상기 분석으로 여러 유형의 인간 암을 포함하는 다양한 암 세포주 상에서 SNARE 단백질의 절단 효과를 조사할 수 있다.
상이한 보툴리늄 신경독소 혈청형의 경쇄에 연결된 녹색 형광 단백질(GFP)을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 포유류 발현 구축물을 표준 절차를 이용하여 제조하였다. 이러한 발현 구축물을 하기와 같이 명명하였다: 1) 서열 번호: 1564의 폴리뉴클레오티드가 인코딩하는 서열 번호: 155의 GFP를 발현하는 구축물 pQBI25/GFP; 2) 서열 번호: 158의 폴리뉴클레오티드가 인코딩하는 서열 번호: 157의 GFP-LC/A 융합 단백질을 발현하는 구축물 pQBI25/GFP-LC/A; 3) 서열 번호: 160의 폴리뉴클레오티드가 인코딩하는 서열 번호: 159의 GFP-LC/B 융합 단백질을 발현하는 구축물 pQBI/GFP-LC/B; 4) 서열 번호: 162의 폴리뉴클레오티드가 인코딩하는 서열 번호: 161의 GFP-LC/C1 융합 단백질을 발현하는 구축물 pQBI/GFP-LC/C1; 및 5) 서열 번호: 164의 폴리뉴클레오티드가 인코딩하는 서열 번호: 163의 GFP-LC/E 융합 단백질을 발현하는 구축물 pQBI/GFP-LC/E. 전체적으로 경쇄들이 3가지 우세한 SNARE 단백질 SNAP-25, VAMP, 또는 신택신 중 하나를 절단하므로, 이들 특정 보툴리늄 독소 혈청형에 대한 경쇄를 선택하였다.
세포를 배양하기 위해, 적절한 밀도의 세포를 3 mL의 적절한 배지를 함유하는 6-웰 조직 배양 플레이트의 웰 내로 접종하였다(표 5). 세포가 적절한 밀도(약 1 x 106개 세포)에 도달할 때까지 세포를 5% 이산화탄소 하의 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 10 ㎕의 LipofectAmine 2000(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)을 함유하는 250 ㎕의 OPTI-MEM 혈청 감소 배지를 5 ㎍의 원하는 포유류 발현 구축물을 함유하는 250 ㎕의 OPTI-MEM 혈청 감소 배지에 첨가하여 500 ㎕의 전달감염 용액을 제조하였다. 상기 전달감염 혼합물을 실온에서 대략 25분 동안 인큐베이션하였다. 성장 배지를 새로운 무첨가 무혈청 배지로 교체하고 500 ㎕의 전달감염 용액을 세포에 첨가하였다. 이어서 세포를 5% 이산화탄소 하의 37℃ 인큐베이터에서 대략 8시간 동안 인큐베이션하였다. 전달감염 배지를 새로운 무첨가 무혈청 배지로 교체한 후 세포를 5% 이산화탄소 하의 37℃ 인큐베이터에서 대략 48시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 후, 세포의 배지를 흡입 제거하여 세척하고, 각 웰을 3 mL의 1 x PBS로 헹구었다.
Figure pct00006

세포를 먼저 부착된 경쇄의 동시적 발현을 시사하는 GFP의 발현에 대해 형광 현미경검사를 이용하여 분석하였다. GFP-LC 융합 단백질의 발현 및 세포하 분획의 편재를 검출하기 위해, 세포를 동일초점 현미경검사로 조사하였다. 상술된 바와 같이 전달감염 및 세척된 세포주 RT4, P19, NCI H69, NCI H82, DU145, T24, 및 J82 유래의 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 고정된 세포를 488 nm 여기 레이저와 510-530 nm의 방출 경로를 이용하는 동일초점 현미경으로 이미지화하였다. 데이타는 각각의 세포 유형이 성공적으로 전달감염되었으며, 소세포성 폐암 세포주 NCI H69 및 NCI H82를 제외하고 각각의 세포주에서 유래한 세포들이 GFP 및 GFP-경쇄 융합 단백질 모두를 발현함을 나타내었다(표 6).
Figure pct00007

암 세포가 내부단백분해 절단에 민감성이 되기 위해서는 표적 SNARE 단백질이 내인적으로 발현되고 경쇄 절단에 접근가능해야 한다. 절단된 SNARE 산물의 존재를 검출하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 상술된 바와 같이 전달감염 및 세척된 세포주 RT4, P19, NCI H69, NCI H82, DU145, T24, 및 J82 유래의 세포 각각의 웰에 200 ㎕의 2 x SDS-PAGE 로딩 완충액을 첨가하여 용해시키고, 용해액을 튜브로 옮겨 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 12 ㎕의 각 표본을 변성 환원 조건 하의 NuPAGE? Novex 4-12% 비스-트리스 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)을 사용하여 MOPS 폴리아크릴아미드 겔에 의해 분리하였다. 분리된 펩타이드를 전기영동 탱크 전달 기구를 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 겔로부터 니트로셀룰로오스 막 상으로 옮겼다. 막을 트리스-완충 식염수(TBS)(25 mM 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올 염산(트리스-HCl)(pH 7.4), 137 mM 염화나트륨, 2.7 mM 염화칼륨), 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우리에이트, 2% 소 혈청 알부민(BSA), 및 5% 무지방 건조유를 함유하는 블로킹 용액 중에서 부드럽게 진탕하면서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 블로킹하였다. 차단된 막을 TBS, 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우리에이트, 2% BSA, 및 1) 일차 항체로서 S9684 α-SNAP-25 래빗(rabbit) 폴리클로날 항혈청(Sigma, St. Louis, MO)의 1:5,000배 희석액; 2) 일차 항체로서 sc17836 α-Syntaxin-1 래빗 폴리클로날 항혈청(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)의 1:5,000배 희석액; 또는 3) 일차 항체로서 sc69706 α-VAMP-2 마우스 폴리클로날 항혈청(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)의 1:5,000배 희석액 중에서 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 일차 항체로 탐침한 블롯을 매번 TBS, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우리에이트 중에서 5분씩 3회 세척하였다. 세척한 막을 이차 항체로서 1) 홀스래디쉬 페록시다아제에 접합된 81-6720 염소 폴리클로날 α-마우스 면역글로불린 G, 중쇄 및 경쇄(IgG, H+L) 항체의 1:5,000배 희석액(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); 또는 2) 홀스래디쉬 페록시다아제에 접합된 81-6120 염소 폴리클로날 α-래빗 면역글로불린 G, 중쇄 및 경쇄(IgG, H+L) 항체 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)의 1:5,000배 희석액을 함유하는 TBS, 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우리에이트, 2% BSA 중에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이차 항체로 탐침한 블롯을 매번 TBS, 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우리에이트 중에서 5분씩 3회 세척하였다. 표지된 SNARE 산물의 신호 검출을 화학발광 기반 검출 시스템인 ECL Plus™ 웨스턴 블롯 검출 시스템(GE Healthcare-Amersham, Piscataway, NJ)을 이용하여 시각화하였다. 상기 막들을 이미지화하고 절단된 SNARE 산물의 백분율을 Typhoon 9410 Variable Mode Imager 및 Imager 분석 소프트웨어(GE Healthcare-Amersham, Piscataway, NJ)를 이용하여 정량하였다. 데이터는 SNAP-25 및 VAMP-2가 일부 세포 유형에서 발현되는 반면 신택신은 시험한 각 세포 유형에서 발현됨을 나타내었다(표 7).
Figure pct00008

또한, 데이터는 1) BoNT/A 경쇄가 P19 태아 암종 세포주, DU145 전립선암종 세포주, 및 J82 방광암종 세포주 유래 세포에 존재하는 SNAP-25를 절단할 수 있으며(표 8); 2) BoNT/E 경쇄가 P19 태아 암종 세포주, 및 J82 방광암종 세포주 유래 세포에 존재하는 SNAP-25를 절단할 수 있고(표 8); 3) BoNT/B 경쇄가 시험한 모든 세포주에서 VAMP-2를 절단할 수 없으며(표 8); 및 4) BoNT/C1 경쇄가 T24 방광암종 세포주 유래 세포에 존재하는 신택신-1을 절단할 수 있음을 나타내었다(표 8). 이들 결과는 적절한 클로스트리듐 독소 경쇄로의 암 세포 치료가 3개 SNARE 단백질 중 하나를 절단하여 세포외 배출을 저해할 것임을 시사한다. 이러한 저해는 암 세포 성장 및 생존에 필요한 성장 인자, 혈관신생 인자, 및 항-아폽토시스 생존 인자의 방출을 예방할 것이다.
Figure pct00009

SNARE 절단이 세포외 배출을 손상시키는지 여부를 추가 평가하기 위해, 인슐린 방출 분석을 수행하였다. HIT-T15 세포는 고농도 글루코오스 중에 놓이는 경우 인슐린을 방출한다. 또한 이들 세포는 SNAP-25를 발현하며, SNAP-25가 인슐린 방출에 필요한 SNARE 복합체의 통합적 성분인 것으로 나타났다. 상술된 바와 같이 전달감염 및 세척된 HIT-T15 세포를 1) 기저 인슐린 방출을 위한 5.6 mM 글루코오스(저농도 글루코오스); 또는 2) 유발된 인슐린 방출을 위한 25.2 mM 글루코오스(고농도 글루코오스)를 함유하는 DMEM 배지 중에 놓았다. 세포를 대략 1시간 동안 5% 이산화탄소 하에 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션하여 인슐린을 방출시켰다. 인큐베이션한 배지를 수집하여 방출된 인슐린 양을 인슐린 ELISA 키트를 이용해 결정하였다. 제조자의 지시(APLCO Diagnostics, Salem, NH)에 따라 분석을 수행하였다. 세포외 배출은 시간 당 1 x 106개 세포가 방출한 인슐린의 양으로 표현하였다.
데이터는 GFP-LC/A, GFP-LC/B, 및 GFP-LC/E로 전달감염된 HIT-T15 세포가 비전달감염된 세포 또는 GFP로 전달감염된 세포에 비해 인슐린을 덜 방출함을 보여주었다(표 9). 또한, 저농도 글루코오스(5.6 mM)를 함유하는 배지 중에 방출된 기저 인슐린은 전달감염된 세포 간에 변화 없이 유지되었다. 데이터는 BoNT/A, BoNT/B 및 BoNT/E 경쇄가 HIT-T15 세포에서 SNAP-25 또는 VAMP-2의 절단에 의해 인슐린 방출을 저해함을 시사한다.
Figure pct00010

보툴리늄 독소 경쇄 활성은 또한 단백질의 형질막으로 및 형질막으로부터의 수송을 저해할 수 있다. SNARE 절단이 수용체의 형질막으로의 전달 및 편재를 손상시키는지 여부를 평가하기 위해, 세포 막 단백질의 존재 또는 부재를 보툴리늄 독소 경쇄로 전달감염된 세포에서 결정하였다. 상술된 바와 같이 전달감염 및 세척된 세포주 DU145 및 J82 유래 세포를 2 mM NHS-LC-바이오틴(Thermo Scientific, Rockford, IL)으로 4℃에서 2시간 동안 처리하였다. 이어서 세포를 250 mM Tris-HCl(pH 7.5)로 30분 동안 4℃에서 처리한 후 TBS 중에 3회 세척하였다. 막 단백질을 제조자의 지시에 따라 막 단백질 추출 키트(Calbiochem, San Diego, CA)를 이용하여 단리하였다. 바이오틴화 단백질을 고정화된 애비딘(Thermo Scientific, Rockford, IL)으로 침전시켰다. TBS로 3회 세척 후, 표본을 50 ㎕의 2x SDS-PAGE 로딩 완충액 중에 현탁하고, 변성 환원 조건 하에 NuPAGE? Novex 4-12% 비스-트리스 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)을 사용하여 MOPS 폴리아크릴아미드 겔에 의해 분리하였다. 겔을 세척하여 10% 메탄올 및 7% 아세트산 중에 30분 동안 고정하였다. 세척 용액을 제거하여 겔을 SYPRO? Ruby 단백질 겔 염색 용액(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 중에서 3시간 내지 하룻밤 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 염색한 겔을 10% 메탄올 및 7% 아세트산 중에 30분 동안 탈염색하였다. 탈염색한 겔의 화학발광도를 Typhoon 9410 Variable Mode Imager 및 Imager 분석 소프트웨어(GE Healthcare-Amersham, Piscataway, NJ)를 이용하여 시각화하였다. 데이터는 BoNT/A 경쇄 처리가 세포 표면에 위치하는 수용체군에 반드시 영향을 주게될 형질막으로 및 형질막으로부터의 단백질 수송을 저해함을 보여주었다. 이처럼, 손상된 수송은 암 세포를 아폽토시스 인자에 대해 보다 민감해지고 성장 신호 및 혈관신생 인자에 대해 덜 민감해지도록 할 수 있다.
경쇄에 의한 SNARE 절단 효과와 각 세포주에서 어느 경쇄가 어느 SNARE 단백질을 절단하는지를 확립하고, 이어서 TVEMP를 촉매 경쇄를 전달하기 위해 암 세포에서 과발현되거나 독특하게 발현되는 수용체로 TVEMP를 표적화하는 방식으로 설계하였다.
실시예 2
암 세포 내 수용체 및 표적의 존재
본 실시예는 본 명세서에 개시된 TVEMP의 표적화 부분에 결합할 수 있는 인지체 수용체의 존재 뿐만 아니라 본 명세서에 개시된 TVEMP의 효소 도메인의 표적 SNARE 단백질의 존재를 결정하는 방법을 예시한다.
TVEMP가 본 명세서에 개시된 암 치료 방법을 위해 효과적인 제제가 되기 위해서는 암 세포가 TVEMP의 표적화 부분에 결합할 수 있는 적절한 수용체 뿐만 아니라 TVEMP의 효소 도메인에 의해 절단될 수 있는 적절한 SNARE 단백질을 발현해야 한다.
배양 세포에, 적절한 밀도의 세포를 혈청이 없고 25㎍/mL의 GT1b(Alexis Biochemicals, San Diego, CA)를 첨가하거나 첨가하지 않은 100 ㎕의 적절한 배지(표 10)를 함유하는 96-웰 조직 배양 플레이트의 웰 내로 접종하였다. 세포를 접종하고, 표준적이고 일상적인 형태학적 요건, 예컨대 성장 정지(대략 3일)로 평가되는 바와 같이 세포가 분화할 때까지 5% 이산화탄소 하에 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 배지를 각각의 웰에서 흡입 제거하고 완전한 용량 반응을 일으키기 위해 시험하고 있는 다양한 농도의 보툴리늄 독소 또는 TVEMP를 함유하는 100 ㎕의 새로운 배지로 교체하였다. 분석은 3개씩 수행하였다. 처리 24시간 후, 세포를 세척하고 독소 또는 TVEMP 없이 추가 2일 동안 인큐베이션하여 SNARE 기질을 절단시켰다. 상기 인큐베이션 후, 배지를 흡입 제거하여 세포를 세척하고 각각의 웰을 3 mL의 1 x PBS로 헹구었다. 세포를 연속 진탕하면서 4℃에서 30분 동안 새로 제조한 용해 완충액(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1%, 4-옥틸페놀 폴리에톡실레이트) 중에 용해시켜 수집하였다. 용해시킨 세포를 4000rpm에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하여 벤치탑 원심분리기를 이용하여 파편을 제거하였다. 세포 용해액의 총 단백질 농도를 브래드포드 분석으로 측정하였다.
Figure pct00011

Figure pct00012

암 세포가 적절한 수용체 및 표적 SNARE 단백질을 발현하는지 여부를 결정하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 수행할 수 있다.
하나의 실험에 있어서, 상술된 바와 같이 전달감염 및 세척된 세포주 RT4, P19, NCI H69, NCI H82, DU-145, T24, J82, LNCaP, 및 PC-3 유래의 세포에 40 ㎕의 2 x SDS-PAGE 로딩 완충액(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)을 첨가하고 95℃에서 5분 동안 플레이트를 가열하여 세포를 수집하였다. 변성 환원 조건 하에 1) SNAP-25197 절단 산물을 분리하는 경우 CRITERION? 12% 비스-트리스 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA); 2) 미절단 SNAP-25206 기질 및 SNAP-25197 절단 산물을 모두 분리하는 경우 NuPAGE? 12% 비스-트리스 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA); 또는 3) 모든 다른 단백질을 분리하는 경우 NuPAGE? Novex 4-12% 비스-트리스 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)을 이용하여 MOPS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 12 ㎕의 수집된 표본을 분리하였다. 분리된 펩타이드를 전기영동 탱크 전달 기구를 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 겔로부터 니트로셀룰로오스 막 상으로 옮겼다. 막을 트리스-완충 식염수(TBS)(25 mM 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올 염산(트리스-HCl)(pH 7.4), 137 mM 염화나트륨, 2.7 mM 염화칼륨), 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우리에이트, 2% 소 혈청 알부민(BSA), 및 5% 무지방 건조유를 함유하는 블로킹 용액 중에서 부드럽게 진탕하면서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 블로킹하였다. 블로킹된 막을 TBS, 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우리에이트, 2% BSA, 및 1) 일차 항체로서 S9684 α-SNAP-25 래빗 폴리클로날 항혈청(Sigma, St. Louis, MO)의 1:5,000배 희석액; 2) 일차 항체로서 sc123 α-Syntaxin-1 래빗 폴리클로날 항혈청(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)의 1:5,000배 희석액; 3) 일차 항체로서 sc13992 α-VAMP-1/2/3 래빗 폴리클로날 항혈청(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)의 1:5,000배 희석액; 4) 일차 항체로서 sc50371 α-SNAP-23 래빗 폴리클로날 항혈청(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)의 1:5,000배 희석액; 5) 일차 항체로서 sc28955 α-SVC2 래빗 폴리클로날 항혈청(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)의 1:5,000배 희석액; 6) 일차 항체로서 sc123 α-FGFR3 래빗 폴리클로날 항혈청(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)의 1:5,000배 희석액; 7) 일차 항체로서 sc9112 α-KOR1 래빗 폴리클로날 항혈청(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)의 1:5,000배 희석액; 8) 일차 항체로서 H00004987-D01P α-OPRL1 래빗 폴리클로날 항혈청(Novus Biologicals, Littleton, CO)의 1:5,000배 희석액; 및 9) 일차 항체로서 sc47778 α-β-액틴 래빗 폴리클로날 항혈청(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)의 1:5,000배 희석액 중에서 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 일차 항체로 탐침한 블롯을 매번 TBS, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우리에이트 중에서 5분씩 3회 세척하였다. 세척한 막을 이차 항체로서 1) 홀스래디쉬 페록시다아제에 접합된 81-6720 염소 폴리클로날 α-마우스 면역글로불린 G, 중쇄 및 경쇄(IgG, H+L) 항체의 1:5,000배 희석액(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); 또는 2) 홀스래디쉬 페록시다아제에 접합된 81-6120 염소 폴리클로날 α-래빗 면역글로불린 G, 중쇄 및 경쇄(IgG, H+L) 항체 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)의 1:5,000배 희석액을 함유하는 TBS, 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우리에이트, 2% BSA 중에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이차 항체로 탐침한 블롯을 매번 TBS, 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우리에이트 중에서 5분씩 3회 세척하였다. 표지된 SNARE 산물의 신호 검출을 화학발광 기반 검출 시스템인 ECL Plus™ 웨스턴 블롯 검출 시스템(GE Healthcare-Amersham, Piscataway, NJ)을 이용하여 시각화하였다. 상기 막들을 이미지화하고 절단된 SNARE 산물의 백분율을 Typhoon 9410 Variable Mode Imager 및 Imager 분석 소프트웨어(GE Healthcare-Amersham, Piscataway, NJ)를 이용하여 정량하였다. 데이터는 본 접근법으로 각각의 세포주가 포함하는 세포 중에 존재하는 수용체 및 SNARE 단백질을 동정할 수 있음을 나타내었다(표 11).
Figure pct00013

일단 적절한 수용체 및 SNARE 단백질을 포함하는 세포를 포함하는 세포주가 동정된 후, 보툴리늄 독소 또는 TVEMP가 이들 세포를 중독시키는 능력을 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 절단된 SNARE 산물의 존재를 검출함으로써 결정할 수 있다. 적절한 밀도의 각 세포주 유래 세포를 25 ㎍/mL의 GT1b(Alexis Biochemicals, San Diego, CA)를 포함하거나 포함하지 않는 100 ㎕의 적절한 배지(표 7)를 함유하는 96-웰 조직 배양 플레이트의 웰 내로 접종하였다. 세포를 접종하고, 표준적이고 일상적인 형태학적 요건, 예컨대 성장 정지(대략 3일)로 평가되는 바와 같이 세포가 분화할 때까지 5% 이산화탄소 하에 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 배지를 각각의 웰에서 흡입 제거하고 완전한 용량 반응을 일으키기 충분한 시험하고 있는 다양한 농도의 보툴리늄 독소 또는 TVEMP를 함유하는 100 ㎕의 새로운 배지로 교체하였다. 분석은 3개씩 수행하였다. 처리 24시간 후, 세포를 세척하고 독소 또는 TVEMP 없이 추가 2일 동안 인큐베이션하여 SNARE 기질을 절단시켰다. 상기 인큐베이션 후, 배지를 흡입 제거하여 세포를 세척하고 각각의 웰을 3 mL의 1 x PBS로 헹구었다. 세포를 연속 진탕하면서 4℃에서 30분 동안 새로 제조한 용해 완충액(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1%, 4-옥틸페놀 폴리에톡실레이트) 중에 용해시켜 수집하였다. 용해시킨 세포를 4000rpm에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하여 벤치탑 원심분리기를 이용하여 파편을 제거하였다. 세포 용해액의 단백질 농도를 브래드포드 분석으로 측정하였다. 세포 용해액의 표본을 상술된 바와 같이 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다.
하나의 실험에 있어서, 세포주 LNCaP, J82, 및 MCF-7 유래의 분화된 세포를 상술된 바와 같이 전달감염시켰다. 각각의 웰로부터 배지를 흡입 제거하고 분화된 세포를 1) 0 (미처리 표본), 0.12 nM, 0.36 nM, 1.1 nM, 3.3 nM, 10 nM, 30 nM, 및 90 nM의 BoNT/A; 2) 0 (미처리 표본), 및 50 nM의 BoNT/A; 3) 0 (미처리 표본), 0.12 nM, 0.36 nM, 1.1 nM, 3.3 nM, 10 nM, 30 nM, 및 90 nM의 Noci-LHN/A로 명명된 TVEMP; 또는 4) 0 (미처리 표본), 및 166 nM의 Noci-LHN/A로 명명된 TVEMP를 함유하는 새로운 배지로 교체하여 처리하였다. 1) 3-15 시간; 2) 6 시간 또는 3) 24 시간 처리 후, 세포를 세척하고 독소 또는 TVEMP 없이 추가 16 시간 동안 인큐베이션하여 SNAP-25 기질을 절단시켰다. 본 인큐베이션 후, 세포를 세척하고 상술된 바와 같이 수집하였다. 절단된 SNAP-25 산물의 존재를 일차 항체로서 S9684 α-SNAP-25 래빗 폴리클로날 항혈청(Sigma, St. Louis, MO)의 1:5,000배 희석액 및 이차 항체로서 홀스래디쉬 페록시다아제에 접합된 81-6120 염소 폴리클로날 α-래빗 면역글로불린 G, 중쇄 및 경쇄(IgG, H+L) 항체(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)의 1:5,000배 희석액을 사용하여 상술된 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 이용해 검출하였다. 이 결과를 표 12에 나타낸다.
Figure pct00014

종합적으로, 데이터는 1) BoNT/A가 LNCaP 전립선암종 세포주, J82 방광암종 세포주, 및 MCF-7 유방암종 세포주 유래 세포에 존재하는 SNAP-25를 절단할 수 있으며(표 9); 2) Noci-LHN/A가 LNCaP 전립선암종 세포주 및 J82 방광암종 세포주 유래 세포에 존재하는 SNAP-25를 절단할 수 있음(표 9)을 나타내었다. 적절한 클로스트리듐 독소의 경쇄로의 암 세포 치료가 3개 SNARE 단백질 중 하나를 절단하여 세포외 배출을 저해할 것임을 시사한다. 이러한 저해는 암 세포 성장 및 생존에 필요한 성장 인자, 혈관신생 인자, 및 항-아폽토시스 생존 인자의 방출을 예방할 것이다. 마지막으로 이들 실험은 보툴리늄 경쇄의 암 세포 내로의 세포내 전달이 경쇄 구축물의 전달감염에 의해서 뿐만 아니라 표적화 도메인에 대한 내인성 신호 전달 경로를 이용함으로써 적절한 SNARE 단백질을 절단시킨다는 일반적 개념의 타당성을 나타낸다.
실시예 3
혈관신생에 대한 경쇄 전달의 효과
본 실시예는 보툴리늄 독소 또는 TVEMP를 이용한 치료가 암 치료에서 치료 이득을 제공하기 충분한 정도로 혈관신생에 영향을 미칠 것임을 나타낸다.
LHN/A-G에 기반한 TVEMP 또는 보툴리늄 독소를 이용한 치료에서 야기되는 세포외 배출의 차단은 예로 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유아세포 성장 인자-1(FGF1) 및 FGF2를 포함하는 혈관신생 인자의 방출을 예방할 수 있을 것이다. 이들 혈관신생 인자의 방출 예방은 독소 또는 TVEMP가 투여되는 부위에서 혈관신생을 감소시키거나 함께 저해할 것이다. 이러한 치료가 혈관신생을 감소시키거나 저해하는지 여부를 평가하기 위해, 4가지 상이한 분석을 수행하였다: VEGF 방출 분석, 세포 이동 분석, 시험관 내 혈관 형성 분석, 및 인간 혈관신생 단백질 어레이 분석.
VEGF는 혈관 내피 세포에 대한 강력한 유사분열물질이며 생리학적 및 병리학적 혈관신생의 유도자로 공지되어 있다. 보툴리늄 독소 또는 TVEMP의 혈관신생 저해 가능성을 확인하기 위해, 독소 또는 TVEMP가 세포로부터 VEGF 방출을 저해하는 능력을 평가하였다. VEGF 방출 분석을 수행하기 위해, SiMa 세포주 유래의 약 600,000개 세포를 최소 필수 배지, 2 mM GlutaMAX™ I와 Earle의 염, 1 x B27 보충제, 1 x N2 보충제, 0.1 mM 비필수 아미노산, 10 mM HEPES 및 25 ㎍/mL GT1b를 함유하는 3 mL의 무혈청 배지를 함유하는 6-웰 IV형 콜라겐 조직 배양 플레이트의 웰 내로 접종하였다. 이들 세포를 표준적이고 일상적인 형태학적 요건, 예컨대 성장 정지 및 신경돌기 연장(대략 3일)으로 평가되는 바와 같이 세포가 분화할 때까지 5% 이산화탄소 하에 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 분화된 세포의 각 웰로부터 배지를 흡입 제거하고 0.77 mg/mL의 BoNT/A 또는 1 mg/mL의 Noci-LHN/A TVEMP를 함유하는 새로운 배지로 교체하였다. 대조군으로 세포에 배지만을 병렬 처리하였다. 처리 후 배지를 제거하고 새로운 분화 배지로 교체하였다. 60 ㎕ 분취량의 배지를 각 웰에서 제거하고, 새로운 분화 배지 첨가 1일, 2일, 3일 및 4일 후 100 ㎕ 분화 배지로 교체하였다. 제거한 배지는 필요 시까지 -20℃에 보관하였다. 최종 표본을 제거한 후, 세포를 트립신 처리하고, 각 웰의 세포수를 계수하였다.
수집된 표본 중 VEGF의 존재는 K151BMB-1 VEGF 조직 배양 분석(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)을 이용하여 검출하였다. MULTI-ARRAY? 96-웰 스몰 스팟 플레이트 VEGF 플레이트를 150 ㎕의 블로킹 완충액(0.05% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우리에이트, 2% ECL 블로킹제(GE Healthcare-Amersham, Piscataway, NJ), 및 1% 염소 혈청(Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA) 첨가 PBS)으로 블로킹하고 600 rpm에서 1시간 동안 진탕하였다. 블로킹 완충액을 방출하고 25 ㎕의 각각의 표본을 VEGF 플레이트의 각 웰에 첨가하여 플레이트를 4℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 200 ㎕의 PBS-T(PBS + 0.05% Tween-20)로 3회 세척하고, 이어서 25 ㎕의 2% 항체 완충액(PBS + 0.05 % 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우리에이트, 및 2% ECL 블로킹제(GE Healthcare-Amersham, Piscataway, NJ)) 중의 SULFO-TAG α-hVEGF 마우스 모노클로날 항체 5 ㎍/mL를 첨가하여 600 rpm으로 RT에서 1 시간 동안 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척한 후, 150 ㎕의 판독 완충액(MSD, Cat# R92TC-1)을 웰 마다 첨가하였다. 플레이트를 SECTOR™ Imager 6000 이미지 판독기(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)로 판독하였다. 이어서 데이터를 Microsoft Office Excel 2007로 내보내었다. 검출된 VEGF의 양을 웰에 존재하는 세포수로 표준화하고, VEGF 방출% 값을 대조군을 100% 값으로 이용하여 계산하였다.
데이터는 BoNT/A로의 치료가 SiMa 세포에서 VEGF 방출을 약 50% 저해함을 보여주었다(표 13). Noci-LHN/A TVEMP의 첨가는 VEGF 방출을 저해하지 않는 것으로 나타났으나, 상기 결과는 SiMa 세포에서 BoNT/A에 비해 Noci-LHN/A TVEMP의 역량이 낮기 때문일 수 있다. 분화된 SiMa 세포에서 BoNT/A의 EC50는 약 0.5 nM 미만인 반면, Noci-LHN/A TVEMP의 EC50는 30 nM를 초과하였다. 이처럼, SiMa 세포에서 Noci-LHN/A TVEMP의 효과 부재는 단순히 이들 세포에 존재하는 낮은 양의 OPRL-1 수용체에 기인한다. 이러한 효과의 부재는 저수준의 표적화 수용체를 발현하는 세포(즉 관심 수용체를 과발현하는 종양 주위의 정상 세포)는 보툴리늄 독소 또는 TVEMP 처리에 영향을 받지 않을 것이라는 개념을 확인시켜 준다. 또한 VEGF의 공지된 전사 조절제인 IL-6의 첨가가 VEGF 방출에 효과가 없었다는 발견은 외인성 IL-6의 첨가가 VEGF 분비에 영향을 미치지 않는다는 보고와도 일치한다.
Figure pct00015

VEGF는 이동 유도자이므로, VEGF의 방출에 영향을 미치는 화합물은 이동에도 효과를 낼 것이다. 또한, 화합물에 의한 세포외 배출의 저해도 역시 세포 이동에 관여하는 추가 인자의 방출을 저해할 것이다. 보툴리늄 독소 또는 TVEMP 처리가 세포 이동을 감소 또는 저해시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 제조자의 지시에 따라 세포 이동 분석(Essen Bioscience, Ann Arbor, MI)을 수행하였다. 1일째에, DU-145 세포를 성장 배지 중 96-웰 Essen ImageLock 플레이트의 웰 당 25,000개 세포씩 접종하였다. 2일째에 세포에 성장 배지 중의 10 nM BoNT/A, 40 nM Noci-LHN/A TVEMP, 또는 90 nM Gal-LHN/A TVEMP를 처리하였다. 이동 저해를 위한 양성 대조군으로 세포를 0.11μM, 0.33μM, 또는 1μM의 시토칼라신-D로 처리하였다. 음성 대조군으로, 세포를 배지만으로 처리하였다. 3일째에 세포가 100% 융합에 도달한 후, 세포를 배지로 세척한 뒤 96-핀 WoundMaker(Essen Bioscience, Ann Arbor, MI)를 이용하여 모든 웰에 동시에 상처를 만들었다. 세포 상처 생성 후 배지를 제거하고 세포를 Ca2 + 및 Mg2 +를 첨가한 150 ㎕ Dulbecco의 인산염 완충 식염수로 2회 세척한 뒤 100 ㎕의 배지를 첨가하였다. 이어서 플레이트를 INCUCYTE™ 스캐너(Essen Bioscience, Ann Arbor, MI)에 넣고 연속 45시간 동안 매 1시간마다 이미지를 얻었다. 데이터를 INCUCYTE™ 세포 이동 소프트웨어를 이용하여 상대 상처 밀도 대 시간으로 분석하였다. 상대 상처 밀도는 시간 0에서는 0으로, 상처 내부의 세포 밀도가 초기 상처 외부의 세포 밀도와 동일할 때를 100%로 설계하였다.
결과를 표 14에 나타낸다. 결과로부터, Noci-LHN/A TVEMP 또는 Gal-LHN/A TVEMP로 사전 처리한 세포는 배지만으로 처리한 세포보다 약간 더 느리게 이동함을 보여주었다. 결과는 Noci-LHN/A TVEMP 또는 Gal-LHN/A TVEMP의 처리가 24시간 후 배지 단독 처리한 세포에 비해 약 10% 감소라는 유의미한 세포 이동 감소를 일으킴을 나타내었다. BoNT/A를 처리한 세포는 세포 이동에 대한 영향을 나타내지 않았다. 시토칼라신-D로 처리한 세포는 이동하지 않았다. SNAP-25를 함유하지 않는 PC-3 세포로 동일한 실험을 수행하였을 때, 이동의 감소가 아닌 증가가 관찰되어(결과는 나타내지 않음), 초기에 이들의 리간드 수용체 상의 활성화를 통해, BoNT/A, Noci-LHN/A TVEMP, 및 Gal-LHN/A TVEMP이 이동을 증가시키는 기능을 할 수 있음을 시사하였다. 그러나 SNAP-25의 절단 후에는 이동이 감소되었다. 이처럼, 보툴리늄 독소 및/또는 TVEMP에 대한 장기간 노출은 상기 처리된 세포의 이동을 보다 현저히 감소시킬 수 있을 것이다.
Figure pct00016

혈관신생에는 여러 단계가 관여된다; 새로운 혈관 형성을 달성하기 위해, 내피 세포는 먼저 기저막을 깨트려 이들의 안정한 위치에서 탈출해야 한다. 일단 이것을 달성하면, 내피 세포는 암 세포 또는 상처 연관 대식세포로부터 방출될 수 있는 혈관신생 자극을 향해 이동한다. 또한, 내피 세포는 증식하여 새로운 혈관을 만들기 위해 필요한 수의 세포를 제공한다. 이 증식에 이어 내피 세포의 새로운 성장이 3차원 관형 구조로 재구성하기 위해 필요하다. 보툴리늄 독소 또는 TVEMP 처리가 혈관 형성을 감소 또는 저해할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 시험관 내 내피 관 형성 분석(Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA)을 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)를 융합성이 될 때까지 T-75 배양 플라스크 내에서 80% 융합성으로 키웠다. 세포를 수집한 후 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 HUVEC에 대한 웰 당 500,000개 세포씩 접종하였다. 인큐베이션 후, 세포를 미처리한 채로 놔두거나 2 nM 또는 5 nM의 BoNT/A 또는 6 nM 또는 25 nM의 Noci-LHN/A TVEMP로 24 시간 동안 처리하였다. 저해에 대한 양성 대조군으로, 세포를 콜라게나아제 저해제로 처리하였다. 저해에 대한 음성 대조군으로, 세포를 배지만 단독 처리하였다. 이어서 세포를 다시 수집하고, 여러 혈관신생 자극 인자, 예컨대 라미닌, IV형 콜라겐, 헤페란 설페이트 프로테오글리칸, 엔탁틴 및 성장 인자, 예컨대 FGF2 및 TGF-β를 함유하는 설치류 Engelbreth-Holm-Swan(EHS) 종양 세포에서 제조한 ECM 겔 상에 웰 당 35,000개 세포씩 접종하였다. 세포를 3-4 시간 동안 ECM 겔 상에서 인큐베이션한 후 칼세인 AM으로의 염색 전이나 후에 현미경 하에서 검사하고 사진을 찍었다.
또한 종양 세포주 유래의 세포를 사용하기 위해 내피 관 형성 분석을 변형하였다. 상기 변형 분석에 있어서, LNCaP, PC-3, DU-145, T24, 및 J82 세포주 유래의 세포를 T-75 배양 플라스크 내에서 80% 융합성으로 키웠다. 이어서 세포를 수집하고 1% 혈청을 추가한 3 mL의 적절한 배지(표 10)를 함유하는 6-웰 플레이트에서 웰 당 400,000개 세포씩 접종하였다. 세포를 37℃ 인큐베이터 내에서 5% 이산화탄소 하에 3일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 미처리한 채로 놔두거나 20 nM의 BoNT/A 또는 40 nM의 Noci-LHN/A TVEMP로 24 시간 동안 처리하였다. 이어서 세포를 수집하고, ECM 겔 플레이트 상에 접종하여 상술된 바와 같이 검사하였다.
HUVEC, DU145 및 J82 세포에서는 T24 및 LNCaP 세포에서보다 적은 정도로 배지 단독 처리한 ECM 플레이트 상에 관이 형성된 반면, 콜라게나아제 저해제로의 처리는 관의 형성을 방지하는 결과를 보여주었다(표 15). PC-3 세포에서는 관이 형성되지 않았다. LNCaP 전립선암종 세포주 및 J82 방광암종 세포주 유래 세포의 BoNT/A 및 Noci-LHN/A TVEMP 처리는 관의 형성을 저해하였다. BoNT/A 및 Noci-LHN/A TVEMP 처리는 HUVEC 배양에서 관 형성에 대해 효과를 보이지 않았다. 이러한 관 형성의 저해는 이동, 막에 대한 수용체 및 다른 단백질(이동 인자 및 이들의 수용체), 기질 또는 다른 세포와 상호작용하는 부착 분자의 전달, 및/또는 프로테아제 분비의 저해에 기인할 수 있다.
Figure pct00017

인간 혈관신생 단백질 어레이 스크리닝을 수행하기 위해, DU-145 전립선암 세포주 유래 세포를 1% 차콜 스트립 FBS, 100 U/mL 페니실린, 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신을 첨가한 이글의 최소 필수 배지를 함유하는 100 mm2 플레이트에 접종하였다. 세포를 37℃ 인큐베이터에서 5% 이산화탄소 하에 하룻밤 동안 인큐베이션하여 5 x 106개 세포 밀도로 키웠다. 상기 인큐베이션 후, 세포를 배지의 흡입 제거에 의해 세척하고, 플레이트를 10 mL의 1 x PBS로 헹구었다. 세척한 세포를 50 nM BoNT/A를 함유하는 새로운 배지로 교체하여 처리하였다. 대조를 위해, 배지 단독 처리한 세포를 병렬 실험하였다. 처리 24시간 후, 세포를 세척하고, 새로 제조한 용해 완충액(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1%, 4-옥틸페놀 폴리에톡실레이트) 중에서 얼음 상에 30분 동안 연속으로 약하게 진탕하면서 용해시켜 수집하였다. 용해된 세포를 14,000 g에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하여 파편을 제거하였다. 세포 용해액의 단백질 농도를 브래드포드 분석으로 측정하였다. 분석을 수행하기 위해, 어레이를 500 ㎍의 단백질을 함유하는 각각의 세포 용해액 250 ㎕와 인큐베이션하였다. 블롯을 Typhoon 9410 Imager로 스캐닝하여 어레이 이미지를 포착하고, 어레이의 정량은 Image Quant TL V2005로 수행하였다. 처리 표본의 신호를 미처리군의 신호로 나누어 증가 배수를 결정하였다.
결과로부터 검출된 35개 혈관신생 관련 단백질의 대부분이 미처리 대조군에 비해 BoNT/A 처리 세포에서 상향조절되었음이 나타났다(표 16). 발현이 증가된 단백질들은 항-신생혈관성인 두 단백질(엔도스타틴 및 안지오스타틴)을 제외하고 혈관신생 촉진에 관여하였다. 세포 증식, 분화, 세포 성장 및 발생을 촉진하는 GDNF, PDGF-AA, 및 FGF1의 존재가 증가함이 나타났다. 혈관신생을 촉진 또는 개시하는 단백질은 다음과 같았다; 응고 인자 III, EG-VEGF, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 및 PD-ECGF. 글루코오스 대사에 관여하는 단백질의 발현은 다음과 같았다; DPPIV, IGFBP-1, IGFBP-2, 및 IGFBP-3. 세포-세포 부착을 증강시키는 단백질도 상향조절되었다; MIP-1, MMP-9, 엔도텔린-1, 혈소판 인자 4 및 TGF-β1. 가장 유의미한 증가는 거의 100배 증가된 내분비샘 유래 혈관 내피 성장 인자(EG-VEGF)에 대해 관찰되었다. 세포외 배출이 저해되고 세포가 이들을 배지로 방출할 수 없기 때문에 세포 용해액 중 이들 단백질의 증가는 이들의 세포질 내 축적을 반영할 수 있다.
Figure pct00018

Figure pct00019

종합적으로 본 실시예에 기재된 실험은 TVEMP의 보툴리늄 독소의 처리 후 혈관신생 가능성의 전체적 감소를 세포내 혈관신생 단백질의 증가 관찰과 함께 보여주었다. 이는 SNARE 단백질의 절단 후 세포외 배출의 차단으로 인한 소포성 단백질의 축적 및/또는 혈관신생을 촉진하는 보툴리늄 독소 또는 TVEMP에 대한 수용체의 활성화에 기인할 수 있다.
실시예 4
아폽토시스에 대한 경쇄 전달의 효과
본 실시예는 보툴리늄 독소 또는 TVEMP로의 처리가 암 치료에서 치료 이득을 제공하기 충분한 정도로 아폽토시스에 영향을 미치게 될 것임을 나타낸다.
LHN/A-G에 기반한 TVEMP 또는 보툴리늄 독소의 처리에서 기인하는 세포외 배출의 차단은 대사 활성 감소 및 세포 생활성 감소를 일으킨다. 이처럼, 독소 또는 TVEMP 효과로 인해 저해된 세포외 배출능을 갖는 암 세포는 생존 능력이 감소될 것이다. 상기 치료가 암 세포 생활성을 감소시키는지 여부를 결정하기 위해, 3개의 상이한 분석을 수행하였다: 세포 생활성 및 대사 분석, 카스파아제-3/8 활성 분석, 및 인간 아폽토시스 단백질 어레이 분석.
보툴리늄 독소 또는 TVEMP 처리가 암 세포 생활성을 감소시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, CELLTITER 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 세포 대사 활성 분석(Promega Corp., Madison, WI)을 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 상기 분석은 대사 활성 세포 내에서 NADPH 또는 NADH에 의해 환원되는 테트라졸륨 화합물 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, 내염; MTS]을 함유하는 비색계 분석이다. 환원된 MTS는 흡광도 490nm에서 측정할 수 있는 유색 포마잔 산물이다. 세포주 MCF-7, SiMa, PC-12, 266.6, RWPE-1, 및 N2a 유래 세포의 적절한 밀도를 혈청을 첨가하지 않고 25 ㎍/mL의 GT1b(Alexis Biochemicals, San Diego, CA)를 첨가하거나 첨가하지 않은 100 ㎕의 적절한 배지(표 7)를 함유하는 96-웰 조직 배양 플레이트의 웰 내로 접종하였다. 세포를 접종하고 표준적이고 일상적인 형태학적 요건, 예컨대 성장 정지(대략 3일)로 평가되는 바와 같이 세포가 분화할 때까지 5% 이산화탄소 하에 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 배지를 각각의 웰에서 흡입 제거하고 분화된 세포를 0 (미처리 표본), 0.3125 nM, 1.25 nM, 및 20 nM의 BoNT/A를 함유하는 새 배지로 교체하여 처리하였다. 처리 24시간 후, 세포의 배지를 흡입 제거하고, 각각의 웰을 100 ㎕의 1 x PBS로 헹구었다. 세척 후 100 ㎕의 MTS 용액을 각각의 웰로 첨가하고, 2 시간 동안 인큐베이션 후 490nm에서의 흡광도를 96-웰 플레이트 판독기로 기록하였다. 490nm 흡광량으로 측정한 포마잔 산물의 양은 배양 중에서 살아있는 세포수와 직접적으로 비례한다. 세포 생활성에 대한 TVEMP의 효과를 조사하기 위해 유사한 설계를 채용할 수 있다.
결과로부터 BoNT/A 처리가 평가한 암성 세포주에서 대사 활성을 감소시킴이 나타났다(표 17).
Figure pct00020

보툴리늄 독소 또는 TVEMP 처리가 암 세포 생활성을 감소시킬 수 있다는 것을 더 나타내기 위해, CELLTITER GLO? 발광 세포 생활성 분석(Promega Corp., Madison, WI)을 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 상기 분석에서 세포 생활성은 대사 활성 세포의 존재를 나타내는 ATP의 존재에 근거하여 정량하였다. ATP 함량의 감소는 대사적으로 활성이 더 작은 세포에 대응된다. 세포주 LNCaP, J82, T24, 및 DU-145 유래 세포를 상술된 바와 같이 분화시켰다. 배지를 각각의 웰로부터 흡입 제거하고, 분화된 세포를 1) 0 (미처리 표본), 25 nM, 및 50 nM의 BoNT/A; 또는 2) 0 (미처리 표본), 250 nM, 및 500 nM의 Noci-LHN/A TVEMP를 함유하는 새 배지로 교체하여 처리하였다. 24시간 치료 후, 세포의 배지를 흡입 제거하여 세척하고, 각각의 웰을 100 ㎕의 1 x PBS로 헹구었다. 세척 후, 100 ㎕의 CELLTITER GLO? 시약을 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 인큐베이션 10분 후, 표본 발광도를 SpectraMAX L 발광도 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 측정하였다. 분석은 3회씩 수행하였으며, 매 4 또는 5일마다 세포 생활성을 확인하였다.
데이터로부터 BoNT/A 처리(표 18) 또는 Noci-LHN/A TVEMP처리 후 DU-145 전립선암종 세포주 및 J82 방광암종 세포주 둘 다에서 유래하는 세포에서 생활성 감소가 관찰됨이 나타났다(표 19).
Figure pct00021

Figure pct00022

보툴리늄 독소 또는 TVEMP 처리가 아폽토시스 절차에 의해 암 세포 생활성을 감소시키는지 여부를 결정하기 위해, 카스파아제-3/8의 활성을 BoNT/A 처리 세포에서 측정하였다. 세포주 LNCaP, J82, 및 T24 유래 세포를 상술된 바와 같이 분화시켰다. 배지를 각각의 웰로부터 흡입 제거하고, 분화된 세포를 1) 0 (미처리 표본), 0.5 nM, 5 nM, 및 50 nM의 BoNT/A; 또는 2) 0 (미처리 표본), 1.6 nM, 16 nM, 및 166 nM의 Noci-LHN/A TVEMP를 함유한 새 배지로 교체 처리하였다. 24시간 처리 후, 세포 배지를 흡입 제거하여 세척하고, 각각의 웰을 100 ㎕의 1 x PBS로 헹구었다. 세포성 카스파아제 9 활성을 측정하기 위해, 50 ㎕의 카스파아제-GLO? 9(Promega, Corp., Madison, WI) 시약을 각각의 웰의 배양 배지에 첨가하였다. 30분 동안 37℃에서 인큐베이션 후, 각각의 표본의 발광도를 Spectramax L 발광측정계(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 측정하였다. T24는 SNAP-25를 발현하지 않으며, BoNT/A 또는 Noci-LHN/A TVEMP로의 처리에 감수성을 보이지 않아야 한다.
데이터로부터 카스파아제 3/8 활성에 대한 효과는 BoNT/A로의 노출 후 LNCaP 세포에서 가장 현저함이 나타나서, LNCaP 세포주 생활성이 BoNT/A 처리로 감소됨을 시사하였다(표 20). 이들 데이터는 BoNT/A 처리한 생존 및 사멸 세포군의 수를 측정하는 세포 생활성 분석에서도 뒷받침되었다(표 18). J82 세포주 유래 세포는 카스파아제 3/8 활성에 유의미한 차이를 보이지 않았으나, 이들 세포주는 BoNT/A 또는 Noci-LHN/A TVEMP 처리 후 사멸 세포량을 더 많이 함유하였다(표 19). J82 세포에서 카스파아제 활성이 관찰되지 않는 이유는 적어도 2개 가능성이 기인할 수 있다: 1) 카스파아제 3/8 활성을 검출하기 위한 BoNT/A 처리 시점이 J82 및 LNCaP에 있어 상이함(예로 카스파아제 3/8 활성은 J82 세포에서 더 빨리 일어날 수 있다); 또는 2) J82에 대한 세포사 경로가 카스파아제 3/8에 무관함.
Figure pct00023

보툴리늄 독소 또는 TVEMP 처리한 세포의 세포사가 카스파아제 3/8 경로와 무관한 절차에 의해 지시되는지 여부를 평가하기 위해, 세포를 절단된 핵 폴리(ADP-리보오스) 폴리머라아제(PARP)의 존재에 대해 분석하였다. PARP는 116kDa의 핵 폴리(ADP-리보오스) 폴리머라아제이며, 환경적 스트레스에 반응하여 DNA 보수에 관여하는 것으로 나타난다. 상기 단백질은 시험관 내에서 여러 ICE-유사 카스파아제에 의해 절단될 수 있으며, 생체 내에서 카스파아제-3의 주요 절단 표적 중 하나이다. 인간 PARP에서, 절단은 카르복시-말단 절단 도메인(89kDa)으로부터 PARP 아미노-말단 DNA 결합 도메인(24kDa)을 분리하는 Asp214 및 Gly215 사이에서 일어난다. PARP는 세포가 이들의 생활성을 유지하는 것을 도우며; PARP의 절단은 세포 분리를 촉진하고 아폽토시스를 겪는 세포의 마커로서 작용한다. 세포 생활성에 있어서의 변화가 아폽토시스를 겪는 세포에 기인하는지 여부를 결정하기 위해, 세포주 DU-145 및 J82 유래 세포를 상술된 바와 같이 분화시켰다. 배지를 각각의 웰로부터 흡입 제거하고, 분화된 세포를 1) 0 (미처리 표본) 및 50 nM의 BoNT/A; 또는 2) 0 (미처리 표본) 및 500 nM의 Noci-LHN/A TVEMP를 함유하는 새 배지로 교체하여 처리하였다. 처리 48시간 후, α-PARP 항체를 일차 항체로서 사용한 것을 제외하고는 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 세척하고, 수집하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 두 세포주 유래의 세포는 Noci-LHN/A TVEMP 처리 2일 후 절단된 PARP의 증가를 나타내었다. 그러나 BoNT/A로 처리한 두 세포주 유래의 세포에서는 절단된 PARP의 존재가 최소였다.
인간 아폽토시스 단백질 어레이 스크리닝을 수행하기 위해, DU-145 전립선암 세포주 유래 세포를 실시예 3에 상술된 바와 같이 BoNT/A로 처리하고, 수집하여 분석하였다. 결과로부터, DU-145 세포주 유래 세포를 50 nM BonT/A로 24 시간 동안 처리한 후, 대조군에 비해 대부분의 아폽토시스 관련 단백질이 변화없이 유지됨이 나타났다. 발현이 1.5배 내지 2.4배 감소된 아폽토시스 관련 단백질은 단지 10개 종이었다(표 21). 발현 감소는 3개의 항-아폽토시스 단백질(리빈, 서비빈, 및 BCL-x), 2개의 세포 주기 관련 단백질(클라스핀 및 P27), 항산화제 관련 단백질(PON2), 샤페론 단백질(클러스테린) 및 2개의 친-아폽토시스 관련 단백질(Bax 및 시토크롬 C)에서 나타났다.
Figure pct00024

Figure pct00025

종합적으로, 본 실시예에 기재된 결과로부터 BoNT/A 또는 TVEMP의 처리가 대사 활성을 감소시키고 세포 생활성을 감소시키는 것으로 나타났다. 아폽토시스에 관련된 사건이 암 세포 내로의 경쇄 전달에 뒤이어 확인되었으며, LNCaP 세포에서 BoNT/A의 처리 후 카스파아제 3/8 활성이 관찰되었을 뿐만 아니라 카스파아제 3의 주요 기질인 PARP의 절단 증가가 DU-145 및 J82 세포에서 Noci-LHN/A TVEMP 처리 후에 관찰되어, 세포가 BoNT/A 또는 TVEMP의 처리 후 아폽토시스쪽으로 유도되는 것으로 나타났다. 전체적으로 세포 용해액 중 아폽토시스에 연관된 단백질의 양은 BoNT/A의 처리 후 변화하지 않았다. 대부분의 친-아폽토시스 및 항-아폽토시스 단백질은 전체 단백질량의 변화 없이 세포질로부터 미토콘드리아로 전위하여 이들의 기능을 발휘한다. 검출된 작은 변화는 세포외 배출의 저해에 대한 종양 세포의 단기 반응 및 암 세포가 성장하는데 필요한 자가분비 또는 주변분비 루프에서의 입력 방해일 수 있다. 결과적으로 상기 세포는 생존 신호의 부재로 인해 아폽토시스쪽으로 유도될 것이다.
실시예 5
암 치료
하기 실시예는 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하지 않으면서 특정 구현예를 설명하는 방식으로 제공된다.
의사가 좌측 유방에 덩어리를 호소하는 62세 여성을 검사하여 유방암으로 진단하였다. 해당 여성에게 감염 부위 근처에 본 명세서에 개시된 바와 같은 TVEMP를 포함하는 조성물을 국소 투여하여 치료하였다. 환자 상태를 모니터링하고, 치료 약 1-7일 후에 의사는 전이성 종양의 성장이 느려진 것을 확인하였다. 1달 및 3달째의 체크업 시, 의사는 종양의 크기가 더 작아진 것으로 확인했다. 상기 종양 크기의 감소는 TVEMP를 포함하는 조성물로의 치료가 성공적임을 시사하였다. 또한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 TVEMP를 포함하는 조성물의 전신 투여를 또한 이용하여 개시된 TVEMP를 유방암 치료를 위해 투여할 수 있다.
의사가 배뇨에 어려움을 호소하는 58세 남성을 검사하여 전립선암으로 진단하였다. 해당 남성에게 본 명세서에 개시된 바와 같은 TVEMP를 포함하는 조성물을 정맥내 투여하여 전신 치료하였다. 환자 상태를 모니터링하고, 치료 약 1-7일 후에 의사는 전립선의 크기가 작아진 것을 확인하였다. 1달 및 3달째의 체크업 시, 의사는 전립선의 크기가 정상 크기로 되돌아가고 혈청 PSA 수준이 정상 범위 내에 있음을 확인했다. 상기 종양 크기 및/또는 혈청 PSA 수준의 감소는 TVEMP를 포함하는 조성물로의 치료가 성공적임을 시사하였다. 또한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 TVEMP를 포함하는 조성물의 국소 투여를 또한 이용하여 개시된 TVEMP를 전립선암 치료를 위해 투여할 수 있다.
의사가 호흡시 재채기를 호소하는 67세 남성을 검사하여 폐암으로 진단하였다. 해당 남성에게 본 명세서에 개시된 바와 같은 TVEMP를 포함하는 조성물을 정맥내 투여하여 전신 치료하였다. 환자 상태를 모니터링하고, 치료 약 1-7일 후에 의사는 전이성 종양의 성장이 느려진 것을 확인하였다. 1달 및 3달째의 체크업 시, 환자는 호흡이 정상으로 되돌아온 것으로 나타났으며, 의사가 종양의 크기가 더 작아진 것을 확인했다. 상기 정상 호흡 및/또는 종양 크기의 감소는 TVEMP를 포함하는 조성물로의 치료가 성공적임을 시사하였다. 또한, 전신 투여를 또한 이용하여 개시된 TVEMP를 암 치료를 위해 투여할 수 있다. 또한 흡입 투여를 또한 이용하여 개시된 TVEMP를 폐암 치료를 위해 투여할 수 있다.
의사가 골반통을 호소하는 33세 여성을 검사하여 방광암으로 진단하였다. 해당 여성에게 관련 부위 근처에 본 명세서에 개시된 바와 같은 TVEMP를 포함하는 조성물을 국소 투여하여 치료하였다. 환자 상태를 모니터링하고, 치료 약 1-7일 후에 의사는 전이성 종양의 성장이 느려진 것을 확인하였다. 1달 및 3달째의 체크업 시, 환자는 골반통이 가라앉은 것으로 나타났으며, 의사가 종양의 크기가 더 작아진 것을 확인했다. 상기 감소된 통증 및/또는 종양 크기의 감소는 TVEMP를 포함하는 조성물로의 치료가 성공적임을 시사하였다. 또한, 전신 투여를 또한 이용하여 개시된 TVEMP를 방광암 치료를 위해 투여할 수 있다.
의사가 복통을 호소하는 73세 여성을 검사하여 결장암으로 진단하였다. 해당 여성에게 본 명세서에 개시된 바와 같은 TVEMP를 포함하는 조성물을 정맥내 투여하여 전신 치료하였다. 환자 상태를 모니터링하고, 치료 약 1-7일 후에 의사는 전이성 종양의 성장이 느려진 것을 확인하였다. 1달 및 3달째의 체크업 시, 환자는 복통이 가라앉은 것으로 나타났으며, 의사가 종양의 크기가 더 작아진 것을 확인했다. 상기 감소된 통증 및/또는 종양 크기의 감소는 TVEMP를 포함하는 조성물로의 치료가 성공적임을 시사하였다. 또한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 TVEMP를 포함하는 조성물의 국소 투여를 또한 이용하여 개시된 TVEMP를 결장암 치료를 위해 투여할 수 있다.
의사가 두통과 현기증을 호소하는 37세 남성을 검사하여 신경모세포종으로 진단하였다. 해당 남성에게 관련 부위 근처에 본 명세서에 개시된 바와 같은 TVEMP를 포함하는 조성물을 두개내 투여하여 치료하였다. 환자 상태를 모니터링하고, 치료 약 1-7일 후에 의사는 전이성 종양의 성장이 느려진 것을 확인하였다. 1달 및 3달째의 체크업 시, 환자는 더 이상 두통 및 현기증을 겪지 않는 것으로 나타났으며, 의사가 신경모세포종이 사라진 것을 확인했다. 상기 두통, 현기증 및/또는 신경모세포종의 소멸은 TVEMP를 포함하는 조성물로의 치료가 성공적임을 시사하였다.
의사가 통증성 피부멍과 변색을 호소하는 46세 남성을 검사하여 흑색종으로 진단하였다. 해당 남성에게 본 명세서에 개시된 바와 같은 TVEMP를 포함하는 조성물을 국소 투여하여 치료하였다. 환자 상태를 모니터링하고, 치료 약 1-7일 후에 의사는 피부멍의 크기가 약간 감소하였으며 피부가 이전처럼 변색되지 않는 것을 확인하였다. 1달 및 3달째의 체크업 시, 환자는 더 이상 통증을 겪지 않는 것으로 나타났으며, 의사가 피부멍과 변색이 소멸되었음을 확인했다. 상기 감소된 통증 및/또는 피부멍의 소멸은 TVEMP를 포함하는 조성물로의 치료가 성공적임을 시사하였다. 또한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 TVEMP를 포함하는 조성물의 전신 투여를 또한 이용하여 개시된 TVEMP를 방광암 치료를 위해 투여할 수 있다.
결론적으로 본 명세서의 측면은 다양한 구현예를 참조로 설명되었지만, 당해분야 숙련자는 개시된 특정 실시예가 본 명세서에 개시된 요지의 원리를 단지 예시하려는 것임을 쉽게 이해할 것이다. 따라서 개시된 요지는 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및/또는 시약 등에 제한되는 것이 아님을 이해해야 한다. 이처럼, 개시된 요지에 대해 다양한 개질 또는 변화 또는 대안적 구성을 본 명세서의 정수를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 교시에 따라 수행할 수 있다. 마지막으로 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위해서만이지 특허청구범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 따라서 본 발명은 정확히 나타내고 설명한 바에 따라 제한되는 것이 아니다.
본 발명의 수행을 위해 본 발명자들에게 공지된 최적 방식을 포함하는 본 발명의 특정 구현예를 본 명세서에 설명한다. 당연히 상기 기재된 구현예에 대한 변형은 상술된 설명을 읽으면 당업자에게 자명해질 것이다. 본 발명자들은 당해분야의 숙련자가 적절히 상기 변형을 채용할 것을 예상하며, 본 발명을 본 명세서에 구체적으로 기재된 것 이외에 다른 방식으로 실시할 것을 의도하고 한다. 따라서 본 발명에는 적용 가능한 법에 의해 허용되는, 본 명세서에 첨부된 특허청구범위에 언급되는 요지의 모든 개질 및 균등물이 포함된다. 또한 이들의 모든 가능한 변형에서 상술된 요소의 임의 조합은 명세서에서 명확히 반대하거나 또는 본 명세서에서 달리 나타내지 않는 한 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 대안적 요소 또는 구현예의 그룹들은 제한으로 간주되어서는 안된다. 각각의 그룹 멤버는 본 명세서에서 확인된 다른 그룹의 멤버 또는 다른 요소와의 임의 조합으로 또는 개별로 언급되고 청구될 수 있다. 하나 이상의 그룹 멤버가 편의성 및/또는 특허성의 이유로 그룹에 포함되거나 이로부터 삭제될 수 있다. 임의의 상기 포함 또는 삭제가 일어나는 경우, 본 명세서는 상기 그룹을 보정으로서 포함하여 첨부되는 특허청구범위에서 이용되는 모든 마쿠시 그룹의 명시적 설명을 충족하는 것으로 간주된다.
달리 언급되지 않는 한, 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 성분, 특성, 예컨대 분자량, 반응 조건 등의 양을 표현하는 모든 수치는 모든 경우 "약"이라는 용어로 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 "약"이라는 용어는 표시된 해당 항목, 파라미터 또는 용어가 언급된 항목, 파라미터 또는 용어의 초과 또는 미만 10% 범위를 포함하는 것을 의미한다. 따라서 달리 언급되지 않는 한, 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 설정된 수치 파라미터는 본 발명에서 수득하고자 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 최소한으로 그리고 특허청구범위의 균등론 원칙의 적용을 제한하려는 의도 없이, 각각의 수치 파라미터는 적어도 보고된 유의미한 자리수의 관점에서 일반적인 반올림 기법을 적용하여 고려되어야 한다. 본 발명의 넓은 범위에 설정된 수치 범위 및 파라미터가 근사치이더라도, 특정 실시예에 설정된 수치값은 가능한 정확히 보고된다. 그러나 모든 수치값은 이들 각각의 평가 측정에서 확인되는 표준 편차에서 필연적으로 야기되는 일부 오류를 내재적으로 함유한다.
본 발명을 설명하는 문맥에서(특히 하기 특허청구범위의 문맥에서) 사용되는 "하나", "그" 등의 유사 참조어는 본 명세서에서 달리 나타내거나 문맥상 명확히 반대인 경우가 아닌 한 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 본원의 값 범위의 언급은 단지 개별적으로 범위 내에 속하는 각각의 개별값을 쉽게 참조하는 방법으로 작용하려는 것이다. 본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 각각의 개별값은 본 명세서에서 개별적으로 언급되는 것과 마찬가지로 명세서 내에 포함된다. 본 명세서에 기재된 모든 방법은 본 명세서에서 달리 나타내거나 문맥상 명확히 반대인 경우가 아닌 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 모든 예 또는 예시적 언어(예로 "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것이며, 달리 청구하는 본 발명의 범위에 제한을 부여하지 않는다. 명세서 내 어떤 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 비청구 요소를 나타내는 것으로 간주되어서는 안된다.
본 명세서에 개시된 특정 구현예는 구성된 또는 본질적으로 구성된이라는 언어를 이용하여 특허청구범위에서 추가 제한될 수 있다. 출원 시 또는 보정 시 추가되어 특허청구범위에서 사용되는 경우, "구성된"이라는 접속 용어는 특허청구범위에서 특정되지 않은 임의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. "본질적으로 구성된"이라는 접속 용어는 특허청구범위를 특정된 재료 또는 단계 및 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들로 제한한다. 이렇게 청구하는 본 발명의 구현예는 내재적으로 또는 명시적으로 기재되며 본 명세서에서 가능화된다.
본 명세서에서 참조되고 확인된 모든 특허, 특허 공보, 및 기타 문헌은, 예를 들어 본 발명과 연관되어 사용할 수 있는 상기 문헌에 기재된 조성물 및 방법의 설명 및 개시 목적으로 이들의 전문이 본 명세서에 개별적으로 그리고 명시적으로 참조를 위해 도입된다. 이들 문헌은 본 출원의 출원일 이전 이들의 개시에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여 어느 것도 본 발명자들이 이전 발명으로 인해 또는 임의의 다른 이유를 위해 상기 개시를 선행하는 자격을 얻지 않았다는 인정으로 간주되어서는 안된다. 이들 문서의 내용에 관한 표시 또는 날짜에 대한 모든 언급은 본 출원인이 이용가능한 정보에 근거한 것이며, 이들 문서의 내용 또는 날짜의 정확성에 대한 어떠한 인정도 구성하지 않는다.
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Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe 450 455 460 Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu 465 470 475 480 Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu 485 490 495 Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro 500 505 510 Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu 515 520 525 Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu 530 535 540 Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu 545 550 555 560 His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu 565 570 575 Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys 580 585 590 Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu 595 600 605 Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr 610 615 620 Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala 625 630 635 640 Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu 645 650 655 Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala 660 665 670 Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys 675 680 685 Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu 690 695 700 Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys 705 710 715 720 Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu 725 730 735 Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn 740 745 750 Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp 755 760 765 Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile 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cleavage site consensus sequence <221> VARIANT <222> 2, 3, 5 <223> Xaa can be any amino acid <400> 38 Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tobacco Etch Virus protease cleavage site <400> 39 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tobacco Etch Virus protease cleavage site <400> 40 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser 1 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tobacco Etch Virus protease cleavage site <400> 41 Glu Asn Ile Tyr Thr Gln Gly 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tobacco Etch Virus protease cleavage site <400> 42 Glu Asn Ile Tyr Thr Gln Ser 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tobacco Etch Virus protease cleavage site <400> 43 Glu Asn Ile Tyr Leu Gln Gly 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tobacco Etch Virus protease cleavage site <400> 44 Glu Asn 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<222> 1, 2 <223> Xaa can be any amino acid <400> 50 Xaa Xaa Val Arg Phe Gln Ser 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tobacco Vein Mottling Virus protease cleavage site <400> 51 Glu Thr Val Arg Phe Gln Gly 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tobacco Vein Mottling Virus protease cleavage site <400> 52 Glu Thr Val Arg Phe Gln Ser 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tobacco Vein Mottling Virus protease cleavage site <400> 53 Asn Asn Val Arg Phe Gln Gly 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tobacco Vein Mottling Virus protease cleavage site <400> 54 Asn Asn Val Arg Phe Gln Ser 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Rhinovirus 3C protease cleavage site consensus sequence <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa can be amino acid, with D or E preferred <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa can be G, A, V, L, I, M, S or T <400> 55 Xaa Xaa Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Rhinovirus 3C protease cleavage site <400> 56 Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Rhinovirus 3C protease cleavage site <400> 57 Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Rhinovirus 3C protease cleavage site <400> 58 Glu Leu Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Rhinovirus 3C protease cleavage site <400> 59 Asp Ala Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Rhinovirus 3C protease cleavage site <400> 60 Asp Val Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Rhinovirus 3C protease cleavage site <400> 61 Asp Leu Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 62 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Subtilisin cleavage site consensus sequence <221> VARIANT <222> 1, 2, 3, 4 <223> Xaa can be any amino acid <400> 62 Xaa Xaa Xaa Xaa His Tyr 1 5 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Subtilisin cleavage site consensus sequence <221> VARIANT <222> 1, 2, 3, 4 <223> Xaa can be any amino acid <400> 63 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr His 1 5 <210> 64 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Subtilisin cleavage site <400> 64 His Tyr 1 <210> 65 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Subtilisin cleavage site <400> 65 Tyr His 1 <210> 66 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Subtilisin cleavage site <400> 66 Pro Gly Ala Ala His Tyr 1 5 <210> 67 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydroxylamine cleavage site <400> 67 Asn Gly Asn Gly Asn Gly 1 5 <210> 68 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydroxylamine cleavage site <400> 68 Asn Gly 1 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SUMO/ULP-1 protease cleavage site consensus sequence <221> VARIANT <222> 3, 4, 5 <223> Xaa can be any amino acid <400> 69 Gly Gly Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 70 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SUMO/ULP-1 protease cleavage site <400> 70 Met Ala Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro 1 5 10 15 Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser 20 25 30 Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu 35 40 45 Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg 50 55 60 Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp 65 70 75 80 Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile 85 90 95 Gly Gly <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 protease cleavage site consensus sequence <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa can be any amino acid with E preferred <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa can be any amino acid <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa can be any amino acid with G or S preferred <400> 71 Asp Xaa Xaa Asp Xaa 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 protease cleavage site <400> 72 Asp Glu Val Asp Gly 1 5 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 protease cleavage site <400> 73 Asp Glu Val Asp Ser 1 5 <210> 74 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 protease cleavage site <400> 74 Asp Glu Pro Asp Gly 1 5 <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 protease cleavage site <400> 75 Asp Glu Pro Asp Ser 1 5 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 protease cleavage site <400> 76 Asp Glu Leu Asp Gly 1 5 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 protease cleavage site <400> 77 Asp Glu Leu Asp Ser 1 5 <210> 78 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible G-spacer <400> 78 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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taattattta 1080 aagggagtta caaaattatt tgagagaatt tattcaactg atcttggaag aatgttgtta 1140 acatcaatag taaggggaat accattttgg ggtggaagta caatagatac agaattaaaa 1200 gttattgata ctaattgtat taatgtgata caaccagatg gtagttatag atcagaagaa 1260 cttaatctag taataatagg accctcagct gatattatac agtttgaatg taaaagcttt 1320 ggacatgaag ttttgaatct tacgcgaaat ggttatggct ctactcaata cattagattt 1380 agcccagatt ttacatttgg ttttgaggag tcacttgaag ttgatacaaa tcctctttta 1440 ggtgcaggca aatttgctac agatccagca gtaacattag cacatgaact tatacatgct 1500 ggacatagat tatatggaat agcaattaat ccaaataggg tttttaaagt aaatactaat 1560 gcctattatg aaatgagtgg gttagaagta agctttgagg aacttagaac atttggggga 1620 catgatgcaa agtttataga tagtttacag gaaaacgaat ttcgtctata ttattataat 1680 aagtttaaag atatagcaag tacacttaat aaagctaaat caatagtagg tactactgct 1740 tcattacagt atatgaaaaa tgtttttaaa gagaaatatc tcctatctga agatacatct 1800 ggaaaatttt cggtagataa attaaaattt gataagttat acaaaatgtt aacagagatt 1860 tacacagagg ataattttgt taagtttttt aaagtactta acagaaaaac atatttgaat 1920 tttgataaag ccgtatttaa gataaatata gtacctaagg taaattacac aatatatgat 1980 ggatttaatt taagaaatac aaatttagca gcaaacttta atggtcaaaa tacagaaatt 2040 aataatatga attttactaa actaaaaaat tttactggat tgtttgaatt ttataagttg 2100 ctatgtgtaa gagggataat cacttcgaaa 2130 <210> 159 <211> 694 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Green Fluorescent Protein (GFP)-BoNT/B light chain fusion protein <400> 159 Met Ala Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Cys Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys 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acggccacaa gttctctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac 120 ggaaaactta ccctgaagtt catctgcact actggcaaac tgcctgttcc atggccaaca 180 ctagtcacta ctctgtgcta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccgga tcatatgaaa 240 cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaaag gaccatcttc 300 ttcaaagatg acggcaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt 360 gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgac ttcaaggaag atggcaacat tctgggacac 420 aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca tggcagacaa acaaaagaat 480 ggaatcaaag tgaacttcaa gacccgccac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca 540 gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600 tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 660 cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact gtacaacatc 720 gatggaggcg gaggtggaaa gggcccggtt accggtaccg gatccccagt tacaataaat 780 aattttaatt ataatgatcc tattgataat aataatatta ttatgatgga gcctccattt 840 gcgagaggta cggggagata ttataaagct tttaaaatca cagatcgtat ttggataata 900 ccggaaagat atacttttgg atataaacct gaggatttta ataaaagttc cggtattttt 960 aatagagatg tttgtgaata ttatgatcca gattacttaa atactaatga taaaaagaat 1020 atatttttac aaacaatgat caagttattt aatagaatca aatcaaaacc attgggtgaa 1080 aagttattag agatgattat aaatggtata ccttatcttg gagatagacg tgttccactc 1140 gaagagttta acacaaacat tgctagtgta actgttaata aattaatcag taatccagga 1200 gaagtggagc gaaaaaaagg tattttcgca aatttaataa tatttggacc tgggccagtt 1260 ttaaatgaaa atgagactat agatataggt atacaaaatc attttgcatc aagggaaggc 1320 ttcgggggta taatgcaaat gaagttttgc ccagaatatg taagcgtatt taataatgtt 1380 caagaaaaca aaggcgcaag tatatttaat agacgtggat atttttcaga tccagccttg 1440 atattaatgc atgaacttat acatgtttta catggattat atggcattaa agtagatgat 1500 ttaccaattg taccaaatga aaaaaaattt tttatgcaat ctacagatgc tatacaggca 1560 gaagaactat atacatttgg aggacaagat cccagcatca taactccttc tacggataaa 1620 agtatctatg ataaagtttt gcaaaatttt agagggatag ttgatagact taacaaggtt 1680 ttagtttgca tatcagatcc taacattaat attaatatat ataaaaataa atttaaagat 1740 aaatataaat tcgttgaaga ttctgaggga aaatatagta tagatgtaga aagttttgat 1800 aaattatata aaagcttaat gtttggtttt acagaaacta atatagcaga aaattataaa 1860 ataaaaacta gagcttctta ttttagtgat tccttaccac cagtaaaaat aaaaaattta 1920 ttagataatg aaatctatac tatagaggaa gggtttaata tatctgataa agatatggaa 1980 aaagaatata gaggtcagaa taaagctata aataaacaag cttatgaaga aattagcaag 2040 gagcatttgg ctgtatataa gatacaaatg tgtaaaagtg tt 2082 <210> 161 <211> 706 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Green Fluorescent Protein (GFP)-BoNT/C1 light chain fusion protein <400> 161 Met Ala Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Cys Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe 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tattatgcca 780 ataacaatta acaactttaa ttattcagat cctgttgata ataaaaatat tttatattta 840 gatactcatt taaatacact agctaatgag cctgaaaaag cctttcgcat tacaggaaat 900 atatgggtaa tacctgatag attttcaaga aattctaatc caaatttaaa taaacctcct 960 cgagttacaa gccctaaaag tggttattat gatcctaatt atttgagtac tgattctgac 1020 aaagatacat ttttaaaaga aattataaag ttatttaaaa gaattaattc tagagaaata 1080 ggagaagaat taatatatag actttcgaca gatataccct ttcctgggaa taacaatact 1140 ccaattaata cttttgattt tgatgtagat tttaacagtg ttgatgttaa aactagacaa 1200 ggtaacaact gggttaaaac tggtagcata aatcctagtg ttataataac tggacctaga 1260 gaaaacatta tagatccaga aacttctacg tttaaattaa ctaacaatac ttttgcggca 1320 caagaaggat ttggtgcttt atcaataatt tcaatatcac ctagatttat gctaacatat 1380 agtaatgcaa ctaatgatgt aggagagggt agattttcta agtctgaatt ttgcatggat 1440 ccaatactaa ttttaatgca tgaacttaat catgcaatgc ataatttata tggaatagct 1500 ataccaaatg atcaaacaat ttcatctgta actagtaata ttttttattc tcaatataat 1560 gtgaaattag agtatgcaga aatatatgca tttggaggtc caactataga ccttattcct 1620 aaaagtgcaa ggaaatattt tgaggaaaag gcattggatt attatagatc tatagctaaa 1680 agacttaata gtataactac tgcaaatcct tcaagcttta ataaatatat aggggaatat 1740 aaacagaaac ttattagaaa gtatagattc gtagtagaat cttcaggtga agttacagta 1800 aatcgtaata agtttgttga gttatataat gaacttacac aaatatttac agaatttaac 1860 tacgctaaaa tatataatgt acaaaatagg aaaatatatc tttcaaatgt atatactccg 1920 gttacggcga atatattaga cgataatgtt tatgatatac aaaatggatt taatatacct 1980 aaaagtaatt taaatgtact atttatgggt caaaatttat ctcgaaatcc agcattaaga 2040 aaagtcaatc ctgaaaatat gctttattta tttacaaaat tttgtcataa agcaatagat 2100 ggtagatcga attctgac 2118 <210> 163 <211> 681 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Green Fluorescent Protein (GFP)-BoNT/E light chain fusion protein <400> 163 Met Ala Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu 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acacatggca tggatgaact gtacaacatc 720 gatggaggcg gaggtggaaa gggcccggtt accggtaccg gatccccaaa aattaatagt 780 tttaattata atgatcctgt taatgataga acaattttat atattaaacc aggcggttgt 840 caagaatttt ataaatcatt taatattatg aaaaatattt ggataattcc agagagaaat 900 gtaattggta caacccccca agattttcat ccgcctactt cattaaaaaa tggagatagt 960 agttattatg accctaatta tttacaaagt gatgaagaaa aggatagatt tttaaaaata 1020 gtcacaaaaa tatttaatag aataaataat aatctttcag gagggatttt attagaagaa 1080 ctgtcaaaag ctaatccata tttagggaat gataatactc cagataatca attccatatt 1140 ggtgatgcat cagcagttga gattaaattc tcaaatggta gccaagacat actattacct 1200 aatgttatta taatgggagc agagcctgat ttatttgaaa ctaacagttc caatatttct 1260 ctaagaaata attatatgcc aagcaatcac ggttttggat caatagctat agtaacattc 1320 tcacctgaat attcttttag atttaatgat aatagtatga atgaatttat tcaagatcct 1380 gctcttacat taatgcatga attaatacat tcattacatg gactatatgg ggctaaaggg 1440 attactacaa agtatactat aacacaaaaa caaaatcccc taataacaaa tataagaggt 1500 acaaatattg aagaattctt aacttttgga ggtactgatt taaacattat tactagtgct 1560 cagtccaatg atatctatac taatcttcta gctgattata aaaaaatagc gtctaaactt 1620 agcaaagtac aagtatctaa tccactactt aatccttata aagatgtttt tgaagcaaag 1680 tatggattag ataaagatgc tagcggaatt tattcggtaa atataaacaa atttaatgat 1740 atttttaaaa aattatacag ctttacggaa tttgatttag caactaaatt tcaagttaaa 1800 tgtaggcaaa cttatattgg acagtataaa tacttcaaac tttcaaactt gttaaatgat 1860 tctatttata atatatcaga aggctataat ataaataatt taaaggtaaa ttttagagga 1920 cagaatgcaa atttaaatcc tagaattatt acaccaatta caggtagagg actagtaaaa 1980 aaaatcatta gattttgtaa aaatattgtt tctgtaaaag gcataaggaa gcttcgcgaa 2040 ttc 2043

Claims (36)

  1. 치료가 필요한 포유동물에게 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 및 외생성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 TVEMP를 포함하는 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 암의 치료 방법으로서, 상기 조성물의 투여는 암과 연관된 증상을 감소시키는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 TVEMP는 1) 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 표적화 도메인, 2) 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 3) 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 4) 표적화 도메인, 클로스트리듐 독소 효소 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 5) 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 클로스트리듐 독소 효소 도메인 및 표적화 도메인, 또는 6) 클로스트리듐 독소 전위 도메인, 외생성 프로테아제 절단 부위, 표적화 도메인 및 클로스트리듐 독소 효소 도메인의 순서로 선형 아미노-대-카복실 단일 폴리펩타이드를 포함하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 표적화 도메인은 인터류킨 (IL) 펩타이드, 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 펩타이드, 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 펩타이드, 상피세포 성장 인자 (EGF) 펩타이드, 형질전환 성장 인자-β (TGFβ) 펩타이드, 뼈 형성 단백질 (BMP), 성장 및 분화 인자 (GDF) 펩타이드, 액티빈 펩타이드, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 펩타이드, 또는 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 펩타이드인 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 인터류킨 (IL) 펩타이드 표적화 도메인은 IL-1 펩타이드, IL-2 펩타이드, IL-3 펩타이드, IL-4 펩타이드, IL-5 펩타이드, IL-6 펩타이드, IL-7 펩타이드, IL-8 펩타이드, IL-9 펩타이드, IL-10 펩타이드, IL-11 펩타이드, IL-32 펩타이드, 또는 IL-33 펩타이드인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 인터류킨 (IL) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 82의 아미노산 123-265, 서열번호: 83의 아미노산 21-153, 서열번호: 84의 아미노산 57-210, 서열번호: 85의 아미노산 21-99 또는 아미노산 31-94, 서열번호: 86의 아미노산 37-173 또는 아미노산 19-178, 서열번호: 87의 아미노산 37-199, 서열번호: 146의 아미노산 20-137, 서열번호: 147의 아미노산 25-153, 서열번호: 148의 아미노산 24-131, 서열번호: 149의 아미노산 27-173, 서열번호: 150, 서열번호: 151, 또는 서열번호: 152의 아미노산 19-142을 포함하는 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병, 갑상선암, 또는 결장암인 방법.
  7. 청구항 3에 있어서, 상기 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 펩타이드 표적화 도메인은 VEGF-A 펩타이드, VEGF-B 펩타이드, VEGF-C 펩타이드, VEGF-D 펩타이드, 또는 태반 성장인자 (PlGF) 펩타이드인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 88의 아미노산 50-133, 서열번호: 89의 아미노산 45-127, 서열번호: 90의 아미노산 129-214, 서열번호: 91의 아미노산 109-194, 서열번호: 92의 아미노산 46-163, 아미노산 49-162, 아미노산 168-345, 아미노산 244-306, 또는 아미노산 248-340, 또는 서열번호: 93의 아미노산 50-131 또는 아미노산 132-203을 포함하는 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 암은 전립선암, 신세포 암종, 난소암, 방광암, 결장암, 림프종, 횡문근육종, 유방암, 뼈육종, 갑상선암, 폐암, 비-소세포 폐암, 흑색종, 췌장암, 안구 흑색종, 망막아세포종, 안구내 종양, 백혈병, 카포시(Kaposi) 육종, 수아세포종, 기형암, 신경모세포종, 중피종, 인슐린종, 위선암, 내장 종양, 신경아교종, 성상세포종, 또는 신장 종양인 방법.
  10. 청구항 3에 있어서, 상기 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 펩타이드 표적화 도메인은 IGF-1 펩타이드 또는 IGF-2 펩타이드인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 94의 아미노산 52-109 또는 아미노산 49-118, 또는 서열번호: 95의 아미노산 31-84 또는 아미노산 25-180을 포함하는 방법.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 암은 유방암, 결장암, 폐암, 전립선암, 위암 또는 간암인 방법.
  13. 청구항 3에 있어서, 상기 상피세포 성장 인자 (EGF) 펩타이드 표적화 도메인은 EGF, 헤파린 결합 EGF 유사 성장 인자 (HB-EGF), 혈질전환 성장 인자-알파기호 (TGF-알파기호, 암피레귤린 (AR, 에피레귤린 (EPR, 에피겐 (EPG), 베타셀룰린 (BTC), 뉴레귤린-1 (NRG1), 뉴레귤린-2 (NRG2), 뉴레귤린-3, (NRG3), 또는 뉴레귤린-4 (NRG4)인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 상피세포 성장 인자 (EGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 96, 서열번호: 97, 서열번호: 98, 서열번호: 99의 아미노산 101-251 또는 아미노산 107-251, 서열번호: 100의 아미노산 63-108, 서열번호: 101의 아미노산 23-154, 서열번호: 102, 서열번호: 103의 아미노산 235-630, 서열번호: 104의 아미노산 398-718, 서열번호: 105의 아미노산 353-648, 또는 서열번호: 106을 포함하는 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 암은 폐암, 전립선암, 난소암, 방광암, 갑상선암, 혼합형 유두 및 여포 갑상선 암종, 담도암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 결장암, 위암, 자궁내막암, 식도암, 난관암, 담낭 및 담관암, 두경부암, 간암, 폐암, 골수이형성 증후군, 비-소세포 폐암, 구강암, 췌장암, 복강암, 진성 적혈구증가증, 신장암, 또는 피부암인 방법.
  16. 청구항 3에 있어서, 상기 형질전환 성장 인자-β (TGFβ) 펩타이드 표적화 도메인은 TGFβ1 펩타이드, TGFβ2 펩타이드, TGFβ3 펩타이드, 또는 TGFβ4 펩타이드인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 형질전환 성장 인자-β (TGFβ) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 107의 아미노산 293-390, 서열번호: 108의 아미노산 317-414, 서열번호: 109의 아미노산 315-412, 또는 서열번호: 110의 아미노산 276-373을 포함하는 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 암은 전립선암, 백혈병, 신세포 암종, 크롬친화세포종, 갑상선암, 뇌하수체 종양, 결장암, 림프종, 위암, 유방암, 뼈육종, 섬유육종, 간암, 간세포 암종, 유두 갑상선암, 골수종, 췌장암, 고환 종양, 난소암, 자궁경부 암종, 자궁내막 선암종, 자궁 내막양 선암, 흑색종, 횡문근육종, 편평세포암종, 신경모세포종, 부신 암종, 타액 선양 낭성 암종, 또는 위선암인 방법.
  19. 청구항 3에 있어서, 상기 뼈 형성 단백질 (BMP) 펩타이드 표적화 도메인은 BMP2 펩타이드, BMP3 펩타이드, BMP4 펩타이드, BMP5 펩타이드, BMP6 펩타이드, BMP7 펩타이드, BMP8 펩타이드, 또는 BMP10 펩타이드인 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 뼈 형성 단백질 (BMP) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 111의 아미노산 296-396, 서열번호: 112의 아미노산 370-472, 서열번호: 113의 아미노산 309-409, 서열번호: 114의 아미노산 353-454 또는 아미노산 323-454, 서열번호: 115의 아미노산 412-513 또는 아미노산 374-513, 서열번호: 116의 아미노산 330-431 또는 아미노산 293-431, 서열번호: 117의 아미노산 301-402, 또는 서열번호: 118의 아미노산 323-424를 포함하는 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 암은 전립선암, 백혈병, 담도암, 난소암, 뼈암, 뼈육종, 결장암, 골수종, 고환암, 고환 종양, 유방암, 교모세포종, 편평세포암종, 폐 암종, 부신피질 암종, 뇌하수체 종양, 자궁 내막양 선암, 간암, 간세포 암종, 위선암, 또는 췌장암인 방법.
  22. 청구항 3에 있어서, 상기 성장 및 분화 인자 (GDF) 펩타이드 표적화 도메인은 GDF1 펩타이드, GDF2 펩타이드, GDF3 펩타이드, GDF5 펩타이드, GDF6 펩타이드, GDF7 펩타이드, GDF8 펩타이드, GDF10 펩타이드, GDF11 펩타이드, 또는 GDF15 펩타이드인 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 성장 및 분화 인자 (GDF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 119의 아미노산 267-372, 서열번호: 120의 아미노산 327-429, 서열번호: 121의 아미노산 264-364, 서열번호: 122의 아미노산 400-501, 서열번호: 123의 아미노산 354-455, 서열번호: 124의 아미노산 352-450, 서열번호: 125의 아미노산 281-375, 서열번호: 126의 아미노산 376-478, 서열번호: 127의 아미노산 313-407, 또는 서열번호: 128의 아미노산 211-308을 포함하는 방법.
  24. 청구항 22에 있어서, 상기 암은 전립선암, 신세포 암종, 크롬친화세포종, 담도암, 난소암, 고환 종양, 뼈암, 갑상선암, 유두 갑상선암, 뇌하수체 종양, 자궁 내막양 선암, 결장암, 골수종, 림프종, 백혈병, 고환암, 위암, 위선암, 유방암, 교모세포종, 섬유육종, 간암, 간세포 암종, 편평세포암종, 폐 암종, 부신피질 암종, 췌장암, 또는 뼈육종인 방법.
  25. 청구항 3에 있어서, 상기 액티빈 펩타이드 표적화 도메인은 액티빈 A 펩타이드, 액티빈 B 펩타이드, 액티빈 C 펩타이드, 액티빈 E 펩타이드, 또는 인히빈 A 펩타이드인 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 액티빈 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 129의 아미노산 321-426, 서열번호: 130의 아미노산 303-406, 서열번호: 131의 아미노산 247-352 또는 아미노산 237-352, 서열번호: 132의 아미노산 247-350, 또는 서열번호: 133의 아미노산 262-366 또는 아미노산 233-366을 포함하는 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 상기 암은 전립선암, 신세포 암종, 난소암, 백혈병, 결장암, 뇌하수체 종양, 크롬친화세포종, 위암, 유방암, 부신 암종, 타액 선양 낭성 암종, 자궁 내막양 선암, 고환 종양, 간암, 간세포 암종, 골수종, 췌장암, 또는 위선암인 방법.
  28. 청구항 3에 있어서, 상기 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 펩타이드 표적화 도메인은 FGF1 펩타이드, FGF2 펩타이드, FGF3 펩타이드, FGF4 펩타이드, FGF5 펩타이드, FGF6 펩타이드, FGF7 펩타이드, FGF8 펩타이드, FGF9 펩타이드, FGF10 펩타이드, FGF17 펩타이드, 또는 FGF18 펩타이드인 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 134의 아미노산 29-151, 서열번호: 135의 아미노산 30-152, 서열번호: 136의 아미노산 46-181, 서열번호: 137의 아미노산 84-206, 서열번호: 138의 아미노산 91-219, 서열번호: 139의 아미노산 38-198, 서열번호: 140의 아미노산 67-191, 서열번호: 141의 아미노산 43-167, 서열번호: 142의 아미노산 64-191, 서열번호: 143의 아미노산 80-204, 서열번호: 144의 아미노산 55-178, 또는 서열번호: 145의 아미노산 55-177를 포함하는 방법.
  30. 청구항 28에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 유방암, 자궁내막 난소암, 위암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 상피성 난소암, 평활근종, 또는 뇌하수체 종양인 방법.
  31. 청구항 3에 있어서, 상기 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 펩타이드 표적화 도메인은 PDGF알파기호 펩타이드 또는 PDGFβ 펩타이드인 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 펩타이드 표적화 도메인은 서열번호: 153의 아미노산 94-182 또는 서열번호: 154의 아미노산 95-182를 포함하는 방법.
  33. 청구항 31에 있어서, 상기 암은 전립선암, 신세포 암종, 방광암, 비-소세포 폐암, 횡문근육종, 위장관 간질 종양, 수아세포종, 교모세포종, 비인두 암종, 섬유육종, 기저 세포암, 신경모세포종, 성상세포종, 뼈육종, 유잉 육종 (Ewing's sarcoma), 유방암, 고환 종양, 난소암, 흑색종, 골수종, 편평세포암종, 림프종, 백혈병, 중피종, 카포시(Kaposi) 육종, 또는 연골육종인 방법.
  34. 청구항 1에 있어서, 상기 클로스트리듐 독소 전위 도메인은 BoNT/A 전위 도메인, BoNT/B 전위 도메인, BoNT/C1 전위 도메인, BoNT/D 전위 도메인, BoNT/E 전위 도메인, BoNT/F 전위 도메인, BoNT/G 전위 도메인, TeNT 전위 도메인, BaNT 전위 도메인, 또는 BuNT 전위 도메인인 방법.
  35. 청구항 1에 있어서, 상기 클로스트리듐 독소 효소 도메인은 BoNT/A 효소 도메인, BoNT/B 효소 도메인, BoNT/C1 효소 도메인, BoNT/D 효소 도메인, BoNT/E 효소 도메인, BoNT/F 효소 도메인, BoNT/G 효소 도메인, TeNT 효소 도메인, BaNT 효소 도메인, 또는 BuNT 효소 도메인인 방법.
  36. 청구항 1에 있어서, 상기 외생성 프로테아제 절단 부위는 식물 파파인 절단 부위, 곤충 파파인 절단 부위, 갑각류 파파인 절단 부위, 엔테로키나아제 절단 부위, 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 담배 식각 바이러스 프로테아제 절단 부위, 담배 엽맥 모틀 (Tobacco Vein Mottling) 바이러스 절단 부위, 서브틸리신(subtilisin) 절단 부위, 히드록실아민 절단 부위, 또는 카스파제(Caspase) 3 절단 부위인 방법.
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