KR102280199B1

KR102280199B1 - 중간엽 줄기세포의 면역조절 활성 증진용 조성물

Info

Publication number: KR102280199B1
Application number: KR1020190159609A
Authority: KR
Inventors: 조쌍구; 아브달아메드; 이수빈
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2019-12-04
Filing date: 2019-12-04
Publication date: 2021-07-21
Also published as: KR20210069851A

Abstract

본 발명은 줄기세포의 면역조절 기능 증진용 조성물 및 이를 이용한 이식거부, 자가면역질환, 염증성 질환 또는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 FGF2(fibroblast growth factor 2) 또는 이의 일부 절편은 중간엽 줄기세포의 배양액에 첨가될 경우 배양된 줄기세포의 면역억제 활성이 크게 증가하고, 이를 이식한 조직에서의 염증 인자 발현이 현저히 감소한다. 본 발명은 중간엽 줄기세포의 면역억제 기능을 더욱 향상시킴으로써 원치 않거나 과도한 면역반응을 원인으로 하는 다양한 질환에 대해 적은 수의 세포만으로도 유의한 치료 효과를 달성할 수 있는 효율적인 치료 수단으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포의 면역조절 활성 증진용 조성물{A Composition for Enhancing Immunomodulatory Activity of Mesenchymal Stem Cells}

본 발명은 섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 또는 이의 일부 절편을 유효성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포의 면역조절 활성 증진용 조성물에 관한 것이다.

줄기세포는 크게 배아(embryo)에서 얻어지고 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 전분화능(pluripotency)의 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)와, 각 조직에서 얻어지는 다분화능(multipotency)의 성체줄기세포(adult stem cell)로 구분된다. 배아줄기세포는 무제한적 증식이 가능한 미분화 세포로 모든 세포로 분화할 수 있으며, 성체줄기세포와 달리 배(germ) 세포도 만들 수 있어 다음 세대로 유전될 수 있다. 그러나 이러한 이점에도 불구하고 배아줄기세포를 세포 치료제로 이용하는 데에는 암화 형성, 면역거부반응 및 윤리적 법률적 제약 등 실용화에 어려운 점이 많은 상황이다. 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)가 재생의학에서의 주요 치료용 세포원으로 각광받고 있다. 중간엽 줄기세포는 골수뿐 아니라 지방, 간, 근육 등 신체 대부분의 장기에 존재하며, 자가증식능이 있고 골아세포(osteoblasts), 연골세포(chondrocytes), 근세포(myocytes), 골수기질세포(marrow stromal cells), 건-인대 섬유아세포(tendonligamentfibroblasts), 지방세포(adipocytes) 등으로 분화할 수 있다.

한편, 면역 질환은 포유류 면역계를 이루는 인자들이 개체의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 악화시키는 질환으로서, 특히 염증성 질환으로 이어지는 경우 세포, 조직 및 기관에 심각한 손상을 가져올 수 있다. 염증은 일반적으로 외부 물질의 침입 또는 해로운 자극에 대응한 숙주 신체 조직의 국소화된 보호 반응이다. 염증의 원인은 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염성 원인; 화상 또는 방사선 조사와 같은 물리적 원인; 독소, 약물 또는 산업적 제제와 같은 화학약품; 알레르기 및 자가면역 반응과 같은 면역반응, 또는 산화성 스트레스와 연관된 상태일 수 있다.

염증은 통증, 적화현상, 부기, 열 및 감염된 영역의 궁극적인 기능 손실을 그 특징으로 하며, 이들 증상은 면역계의 세포 사이에서 일어나는 일련의 복잡한 상호작용의 결과이다. 또한, 면역 질환 중 하나인 자가면역 질환은 면역 체계가 스스로의 기관을 공격하여 자발적인 반응을 일으킴으로써 조직 손상을 야기한다. 이러한 반응들은 T 림프구에 의한 자가항원(auto-antigen)의 인식에 기인하며, 이로 인하여 체액성 및 세포성 면역 반응이 유발된다. 자가면역질환은 대부분 제한성이고 만성이며, 또한 난치성이다.

중간엽 줄기세포는 상술한 다분화능 뿐 아니라 면역억제 효과를 가지는 것으로 알려졌다. 즉 중간엽 줄기세포는 동종 이식(allogeneic transplantation)에서 이식편대숙주병(graft-versus-host disease, GVHD)의 증상을 경감시키며(Le Blanc K, et al. Lancet 363:1439-41, 2004), T-세포, B-세포 및 자연살해세포(NK-cell)의 기능을 억제하고 수지상세포(dendritic cells)의 과도한 활성도 조절한다고 보고됨으로써(Di Nicola M, et al. Blood 99:3838-43, 2002; Jiang XX, et al. Blood 105:4120-6, 2005; Corcione A, et al. Blood 107:367-72, 2006), 대부분이 난치성 질환인 자가면역 및 염증성 질환에 대한 대안적 치료수단으로 유용하게 이용될 수 있다.

그러나, 세포치료나 재생의학에서 최소 필요한 세포의 수는 1X10⁹ 정도이며, 배양조건 및 기준을 확립하는 단계에서 필요한 세포들까지 고려하면 그 양은 더욱 늘어난다. 기존의 다양한 기원의 중간엽 줄기세포로 이 정도의 양을 공급하려면 최소 인 비트로에서 10번 이상의 계대가 필요하며, 이 과정에서 세포는 노화되고 변형되어 더 이상 치료의 개념에 적합하지 않게 된다.

따라서, 중간엽 줄기세포의 면역조절기능을 더욱 강화할 수 있는 효율적인 배양, 증식 또는 분화 방법이 개발된다면, 치료적 유효량을 현저히 낮춤에 따라 제한된 양의 세포로도 다양한 면역질환에 대한 유의적인 치료 효과를 충분히 달성할 수 있을 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

특허문헌 1. 미국 특허출원 제10/549,474호

본 발명자들은 줄기세포, 구체적으로는 중간엽 줄기세포의 면역억제 기능을 더욱 향상시킴으로써 원치 않거나 과도한 면역반응을 원인으로 하는 다양한 질환에 대해 적은 수의 세포만으로도 유의한 치료 효과를 달성하기 위한 새로운 세포치료 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 중간엽 줄기세포의 배양액에 FGF2(fibroblast growth factor 2) 또는 이의 일부 절편을 첨가할 경우 배양된 줄기세포의 면역억제 활성이 크게 증가하고, 이를 이식한 조직에서의 염증 인자 발현이 현저히 감소한다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 줄기세포의 면역조절 기능 증진용 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 면역조절 기능 증진 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 이식거부, 자가면역질환, 염증성 질환 또는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 FGF2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 또는 이의 일부 절편을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 면역조절 기능 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 줄기세포, 구체적으로는 중간엽 줄기세포의 면역억제 기능을 더욱 향상시킴으로써 원치 않거나 과도한 면역반응을 원인으로 하는 다양한 질환에 대해 적은 수의 세포만으로도 유의한 치료 효과를 달성하기 위한 새로운 세포치료 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 중간엽 줄기세포의 배양액에 FGF2(fibroblast growth factor 2) 또는 이의 일부 절편을 첨가할 경우 배양된 줄기세포의 면역억제 활성이 크게 증가하고, 이를 이식한 조직에서의 염증 인자 발현이 현저히 감소한다는 사실을 발견하였다.

본 명세서에서, 용어“줄기세포”는 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포로서, 특정 분화 자극(환경) 하에서특정 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지는 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있고, 분화 자극이 가해지면 자극의 성격에 따라 다양한 세포로 분화될 수 있는, 분화의 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

본 발명이 적용되는 줄기세포는 제한이 없으며, 줄기세포의 특성, 즉 미분화, 무한정 증식 및 특정세포로의 분화능을 갖는 세포는 본 발명이 적용될 수 있는 세포이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 줄기세포는 중간엽 줄기세포이다.

본 명세서에서 용어“중간엽 줄기세포”는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포로의 분화가 가능한 다분화능(multipotency)을 가진 줄기세포를 의미한다. 중간엽 줄기세포는 소용돌이 모양의 형태와 기본적인 세포표면 표식자 CD73(+), CD105(+), CD34(-), CD45(-)의 발현 정도를 통하여 식별된다. 증간엽 줄기세포의 중요한 특성 중 하나는 면역 반응을 조절하는 기능도 가지고 있다는 것이다.

중간엽 줄기세포는 T-세포, B-세포, 자연살해세포(NK-cell) 및 수지상 세포(dendritic cell)의 증식, 기능 및 활성을 억제함으로써 강력한 면역조절 효과를 발휘함이 보고되었다. 중간엽 줄기세포에 의해 매개되는 면역억제는 인터루킨-10(IL-10), TGF-β, 일산화질소, 프로스타글란딘 E2(PGE2)와 같은 가용성 인자들에 의해 이루어질 수 있다. 이는 원치 않거나(undesired) 과도한(excessive) 면역반응을 원인으로 하는 이식거부, 자가면역 질환, 염증 질환 및 알레르기성 질환 등의 다양한 질환을 치료하기 위해 중간엽 줄기세포가 대안이 될 수 있음을 보여준다. 후술하는 실시 예에서 보는 바와 같이, 염증 유발 동물모델에 중간엽 줄기세포만 주입한 경우에 비하여 중간엽 줄기세포와 본 발명의 펩타이드를 동시에 처리한 경우 전염증성 사이토카인의 발현을 현저히 감소시키고 항염증성 사이토카인의 발현을 유의하게 증가시킴을 관찰함으로써, 본 발명의 펩타이드가 중간엽 줄기세포가 가지는 고유의 면역조절 기능을 더욱 강화함을 확인하였다.

본 발명의 구체적인 구현 예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 FGF2의 일부 절편은 서열목록 제2서열 내지 서열목록 제5서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 따르면, 서열목록 제2서열은 FGF2 전체 아미노산 서열(서열목록 제1서열)의 일부 절편인 59-68번 잔기(ERGVVSIKGV)의 펩타이드이고, 서열목록 제3서열은 70-85번 잔기(ANRYLAMKEDGRLLAS)의 펩타이드이며, 서열목록 제4서열은 16-26번 잔기(HFKDPKRLYCK)의 펩타이드이고, 서열목록 제5서열은 129-138번 잔기(KTGPGQKAIL)의 펩타이드이다. 보다 구체적으로는, 본 발명에서 사용되는 FGF2의 일부 절편은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열(ERGVVSIKGV)을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 FGF2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 또는 이의 일부 절편을 유효성분으로 포함하는 이식거부, 자가면역질환, 염증성 질환 또는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 FGF2 단백질 또는 이의 일부 절편에 대해서는 이미 상술하였으므로 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 조성물은 비이상적인 면역반응을 억제하여 이식거부, 자가면역질환, 염증 질환 및 알레르기성 질환을 예방하거나 치료하는 데 매우 유효하다.

본 발명의 구체적인 구현 예에 따르면, 상기 이식거부는 기관, 조직 또는 세포의 동종 이식(allogeneic transplantation)에 따른 이식편대숙주병(graft-versus -host disease, GVHD)이다. 이식편대숙주병은 숙주의 항원 제시세포에 의해 활성화된 공여자의 T-세포에 의해 유발되며, 상기 세포는 타겟 조직으로 이동하여 조직 및 기관의 기능이상을 유발한다. 이식편대숙주병의 1차적 표준 치료는 고농도의 스테로이드를 투여하는 것이나, 환자의 50%는 이러한 1차 치료법에 반응하지 않으며, 일단 스테로이드 저항성이 유발되면 사망률도 증가한다.

본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 중간엽 줄기세포의 배양액에 첨가할 경우 줄기세포의 면역조절기능을 향상시키지만, 치료용 줄기세포를 대상체에 주입하면서 본 발명의 펩타이드를 직접 대상체에 투여할 경우 이식된 줄기세포의 면역조절 기능을 향상시킬 수도 있으며, 혹은 본 발명의 펩타이드만이 단독으로 투여되어도 대상체의 내재적인(endogenous) 줄기세포의 면역억제 활성을 자극하여 과도하거나 원치 않는 면역반응으로 인한 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분(예를 들어 치료용 중간엽 줄기세포)과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.

본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.

본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.

본 명세서에서 용어“대상체”는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.

본 발명의 구체적인 구현 예에 따르면, 본 발명의 조성물은 줄기세포를 추가적으로 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포이다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 대상체가 본래적으로 가지고 있는 내재적 줄기세포의 면역억제활성을 증진시킴으로써 그 자체로 면역질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 중간엽 줄기세포와 함께 투여될 수도 있다.

본 발명의 구체적인 구현 예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 자가면역질환 또는 염증성 질환은 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 다발성경화증, 특발성섬유성폐포염, 다발성근염, 피부근염, 국한피부경화증, 전신피부경화증, 대장염, 염증성 장질환, 조르젠신드롬(Sjorgen's syndrome), 레이노현상(Raynaud's phenomenon), 베쳇병(Bechet's disease), 가와사키병(Kawasaki's disease), 원발성담즙성경화증(primary biliary sclerosis), 원발성경화성담관염(primary sclerosing cholangitis), 궤양성대장염(ulcerative olitis) 또는 크론병(Crohn's disease)이다.

본 발명의 구체적인 구현 예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 알레르기성 질환은 기관지천식, 고초열, 혈관운동 신경성 비염, 대엽성 폐렴, 식이성 알레르기성 위염, 장염, 충수염, 결절성 동맥주위염, 심내막염, 협심증, 두드러기, 결절성 홍반, 퀸케(Quincke) 부종, 플릭텐(phlyctena), 교감성 안염, 알레르기성 결막염 또는 각막염이다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 구체적으로는 경구, 정맥, 피하 또는 복강 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 다르면, 본 발명은 FGF2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 또는 이의 일부 절편이 포함된 배양배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 면역조절 기능 증진 방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어“세포 배양용 배지”는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 무기질 등과 같이 세포의 성장 및 증식에 필수적인 요소를 포함하는, 인 비트로에서 세포 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다.

세포 배양용 배지에 추가적으로 포함될 수 있는 성분은 예를 들어 글리세린, L-알라닌, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-시스테인 하이드로클로라이드-모노하이드레이트, L-글루타민, L-히스티딘 하이드로클로라이드-모노하이드레이트, L-리신 하이드로클로라이드, L-메티오닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-발린, L-아스파라긴-모노하이드레이트, L-아스파르트산, L-시스틴 2HCl, L-글루탐산, L-이소류신, L-류신, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-티로신 디소듐염 디하이드레이트, i-이노시톨, 티아민 하이드로클로라이드, 나이아신아미드, 피리독신 하이드로클로라이드, 바이오틴, D-판토텐산칼슘, 엽산, 리보플라빈, 비타민 B₁₂, 염화나트륨(NaCl), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 염화칼륨(KCl), 염화칼슘(CaCl₂), 인산수소나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO4-H2O), 황산동 펜타하이드레이트(CuSO4-5H2O), 황산제이철 헵타하이드레이트(FeSO4-7H2O), 염화마그네슘(무수), 황산마그네슘(MgSO4), 인산수소이나트륨(Na2HPO4), 황산아연 헵타하이드레이트(ZnSO₄-7H₂O), D-글루코즈(덱스트로즈), 소듐 피루베이트, 히포크산틴 Na, 리놀렌산, 리포산, 푸트레신 2HCl 및 티미딘을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 세포 배양용 배지는 인위적으로 제조하여 사용하거나, 혹은 상업적으로 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 상업적으로 시판되고 있는 배양용 배지의 예는 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), α-MEM(Alpha Modification of Eagle's Medium), F12(Nutrient Mixture F-12) 및 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 줄기세포의 면역조절 기능 증진용 조성물 및 이를 이용한 이식거부, 자가면역질환, 염증성 질환 또는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 FGF2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 또는 이의 일부 절편은 중간엽 줄기세포의 배양액에 첨가될 경우 배양된 줄기세포의 면역억제 활성이 크게 증가하고, 이를 이식한 조직에서의 염증 인자 발현이 현저히 감소한다.

(c) 본 발명은 중간엽 줄기세포의 면역억제 기능을 더욱 향상시킴으로써 원치 않거나 과도한 면역반응을 원인으로 하는 다양한 질환에 대해 적은 수의 세포만으로도 유의한 치료 효과를 달성할 수 있는 효율적인 치료수단으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 인간 탯줄 샘플로부터 분리한 WJ-MSC의 특성을 분석한 결과를 보여주는 그림으로, 현미경으로 관찰한 WJ-MSC의 형태학적 특징(도1a), WJ-MSC의 자가 재생 능력(도 1b), 표면 마커 발현 양상에 대한 RT-PCR(도 1c) 및 FACS(도 1d) 분석결과를 각각 나타낸다.
도 2는 본 발명의 hWJ-MSC가 인위적으로 형성된 상처에 대한 치유능력을 가짐을 보여주는 그림이다.
도 3은 본 발명의 펩타이드로 코팅된 배양용기에서 배양된 줄기세포의 군체 형성능을 나타내는 그림으로, FP2에서 군체가 더 많이 생김을 보여주는 그림이다.
도 4는 염증 동물모델에서 본 발명의 펩타이드로 코팅된 배양용기에서 배양된 줄기세포를 염증 부위인 관절에 이식한 마우스의 로타로드 실험 모습(도 4a)과 이에 따른 지속 시간(도 4b) 및 떨어지는 빈도(도 4c)의 측정 결과, 무릎 붓기(도 4d) 및 체중(도 4e)을 측정한 결과를 보여주는 그림이다
도 5는 본 발명의 펩타이드로 코팅된 배양용기에서 배양된 줄기세포가 이식된 조직에서의 전염증 마커 및 항염증 마커의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 연골의 염증 손상부위를 염색 마커로 확인하고 연골 손상 점수를 계산한 결과를 보여주는 그림이다.
도 7은 hWJ-MSC를 일반 배양 배지와 FP2 펩타이드로 코팅된 배양 배지에서 배양한 뒤 각각의 컨디션 배지를 대식세포인 Raw 264.7 세포에 처리하고 이들 세포에 LPS로 염증을 유도한 실험 모식도(도 7a)와, 이의 실험 결과 Raw 264.7 세포의 염증반응을 사진(도 7b) 및 IL-6의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과(도 7c)를 각각 나타낸다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

FGF2 유래 펩타이드

섬유아 성장인자인 FGF(fibroblast growth factor) 2 유래 펩타이드는 헥사핀 2(hexafin 2, FP1), 임의로 선택된 펩타이드(FP2), 카노핀 1(canofin 1, FP3) 및 카노핀 3(FP4)을 사용하였으며, 모두 Amolifescience에서 구입하였다.

인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포 분리 및 배양

서울 대학교 병원으로부터 제공받은 인간 탯줄 샘플로부터 중간엽 줄기 세포(Human Wharton’Jelly Mesenchymal Stem Cell, hWJ-MSC)를 분리하였다. 탯줄 조직을 70% 에탄올로 멸균한 후, PBS로 세척한 다음 핀셋으로 배양 용기에 옮기고 2-3cm 길이로 절개하였다. 각 조직은 수평으로 절단하여 혈관을 제거한 다음 다시 70% 에탄올로 멸균하고 PBS로 세척하였다. 그 후, 조직을 배양 용기에 옮기고 가로 세로 1-3 mm의 조각으로 얇게 절개하여 30분 간 방치함으로써 용기 바닥에 강하게 부착시켰다. 그 후, 10% FBS(fetal bovine serum)(GE Healthcare Hyclone) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 100U/mL(GE Healthcare Hyclone)이 함유된 α-MEM(Minimum Essential Medium)을 조직이 덮힐 정도로 채우고, 5% CO², 37℃의 조건에서 배양 2주 동안 배양하였다. 본 연구는 건국대학교 임상시험 심의위원회(IRB, KUH 7001355-201705-BR181) 및 건국대 동물윤리위원 IACUC, KU19133)의 규정을 따르면서 이들의 승인 하에 수행하였다.

CFU(Colony-forming unit) 분석

상기 실시 예 1에서 분리한 hWJ-MSC의 집락형성, 자가 증식 및 증식 능력을 확인하기 위해 군체 형성 능력(Colony-forming unit) 분석을 수행하였다. 구체적으로, 저 밀도의 세포 수 (1 x 10³)로 35mm²의 배양 용기(Corning, 미국)에 접종하여 기본 배지에서 14일간 배양하였다. 배양 14일 째, D-PBS로 2회 세척 후 메탄올에 준비된 0.3% 크리스탈 바이올렛(crystal violet) (Sigma-Aldrich, 미국)을 사용하여 실온에서 30분간 염색하였다. 염색 후 크리스탈 바이올렛을 제거하고 D-PBS와 증류수로 용기를 세척한 후 완전히 건조시켰다. 그 후, 형성된 콜로니 사진을 찍고, 세포 수가 50개 이하인 군체만 계수하였다.

또한, 먼저 FGF2 유래 펩타이드를 96-웰 배양 용기에 코팅한 뒤, 웰당 1-2개의 세포수로 접종되도록 세포 희석액을 웰에 분주한 후 기본 배지에서 14일간 배양하였다. 14일 째 상술한 방법과 동일하게 염색하고, 세포 콜로니가 있는 웰 만을 계수하였다.

특이적 마커의 확인

본 발명에서 분리한 hWJ-MSC의 세포 표면 마커 및 줄기세포능 마커의 발현을 확인하기 위하여 FACS 분석 및 RT-PCR 분석을 수행하였다. RT-PCR 분석을 위해 Labo Pass Kit, TRIzol (Cosmogenetech, 서울, 한국)를 사용하여 hWJ-MSC의 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA의 농도는 Nanodrop(ND1000) 분광 광도계(Nanodrop Technologies Inc., Wilmington DE, USA)로 측정하여 이들 RNA 2μg과 M-MLV 역전사효소(Promega, 미국)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 cDNA을 합성하였다. 2% 아가로스 젤에서 PCR을 수행하였다. cDNA와 세포 표면 마커인 CD19, CD34, CD45, CD73, CD90 및 CD105에 대한 프라이머 세트 및 줄기세포능 마커인 Nanog, SOX2 및 REX1에 대한 프라이머 세트를 SYBR Green 마스터 믹스(Elpis Biotech, South Korea)의 제조자 프로토콜에 따라 섞은 후, Applied Biosystem 7500 실시간 PCR 시스템으로 측정하였다. 표적 유전자의 발현 정도는 GAPDH를 기준 값으로 이용하여 계산되었다.

세포 표면 마커에 대한 프라이머 서열

유전자	정방향	역방향
CD19	CCT GGG GTC CCA GTC CTA TG	GCT CCA GAG GTT GGC ATC AT
CD34	CAG CAA GAC AAC ACG TGG TG	CCC AAG AAC AGC CTC TGA GG
CD45 (PTPRC)	TCA GTG GTC CCA TTG TTG TG	GCA TCT CTG TGG CCT TAG CT
CD73 (NT5E)	TAT CCG GTC GCC CAT TGA TG	ACG CTA TGC TCA AAG GCC TT
CD90 (THY1)	GAG ATC CCA GAA CCA TGA ACC	TGC TGG TAT TCT CAT GGC G
CD105 (ENG)	CCA AGA CCG GGT CTC AAG AC	TGT ACC AGA GTG CAG CAG TG
GAPDH	AAT CCC ATC ACC ATC TTC CAG	ATG ACC CTT TTG GCT CCC

줄기세포능 마커에 대한 프라이머 서열

Gene name	Forward	Reverse
Nanog	TCC TGA ACC TCA GCT ACA AAC	GCG TCA CAC CAT TGC TAT TC
SOX2	CAT CAC CCA CAG CAA ATG AC	GAA GTC CAG GAT CTC TCT CAT AAA
REX1	GTT TCG TGT GTC CCT TTC AAG	CTG TTA TCT GCT TCA TCC TGT TG
OCT4	CGC AAG CCC TCA TTT CAC	CAT CAC CTC CAC CAC CTG

또한, FACS 분석을 위해 배양 중인 세포를 트립신/EDTA를 이용하여 떼어내고, 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 수득하고 상층액을 제거한 후, FACS　완충액 (2% FBS가 포함된 D-PBS)으로 재부유하였다. 그 후, 항-CD73 항체, 항-CD90 항체, 항-CD105항체, 항 CD34 항체 및 항-CD45 항체를 각각 1:500으로 희석하여 세포에 200㎕씩 첨가한 뒤 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 1차 반응시켰다. 그 후, DPBS로 세척한 후 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 수득하고 상층액을 제거한 뒤 1:500으로 희석된 항체를 200㎕씩 첨가하고 4℃에서 20분 동안 반응시켰다. 이 후, 염색된 세포를 FACS buffer 500㎕에 부유하여 FACS 분석 (FACS Calibur; Becton Dickinson, Heidelberg, 독일)을 수행하고, Cell Quest pro software를 이용하여 분석하였다.

상처 치유능 분석(Wound healing Assay)

본 발명의 중간엽 줄기 세포의 자가 증식 및 치유 능력을 평가하기 위해, 세포를 배양접시에 접종을 하고 90%까지 키운 후 200㎕ 팁 끝을 이용하여 길게 상처를 냈다. 이후 일정한 시간마다 상처부위를 촬영하여 상처가 치유되는 능력을 분석하였다.

염증 세포 모델

본 발명의 중간엽 줄기 세포의 염증 완화 능력을 평가하기 위해, 염증 세포 모델에 사용하는 대식세포인 Raw 264.7 세포를 이용하였다. Raw 264.7 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 α-MEM(Minimum Essential Medium) 배지에서 배양하였다. 먼저, 일반 배양용기와 본 발명의 펩타이드로 코팅된 배양용기에서 배양된 hWJ-MSC를 48시간 배양 후, 컨디션 배지를 모은 뒤, 0.20㎛ 주사기 필터를 이용하여 여과 후 4℃ 냉장고에 보관하였다.

Raw 264.7 세포는 세포를 웰 당 3.75 X 10⁵ 의 세포 수로 6-웰 배양 접시에 나눠서 접종하였다. 12시간 후 세포가 부착되면 준비된 컨디션 배지로 갈아주었다. 다시 12시간 후 도면(도 7a)에 따라 대조군을 제외하고 컨디션 배지 군을 포함한 모든 군에 LPS(lipopolysaccharide, Sigma, 미국)를 200ng/㎖ 로 처리하였다. 양성 대조군으로 LPS와 DEX(Dexamathasone, Peprotech, 미국)를 1uM 로 처리하였다. 7시간 뒤에 이미지 기록하고 총 RNA를 분리 후 염증 마커인 IL-6를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.

염증 마우스 모델

8주령 마우스의 뒷다리 무릎 관절에 콜라게나아제 타입 2(Worthington Biochemical Corporation. 미국)를 13 IU로 처리하여 연골을 손상시켜 염증을 유발한 뒤, MSC 혹은 FP2 펩타이드 코팅 하에서 배양한 MSC를 주입하였다. 마우스는 실험 전 체중을 측정하고, 디지털 캘리퍼스를 이용하여 뒷다리의 무릎관절의 붓기를 측정하였다. 실험 개시 후 3 - 4일 마다 동일한 방법으로 측정하였다.

RT-PCR 및 정량적 실시간 PCR

염증이 유발된 마우스 뒷다리의 무릎 연골부위를 수술가위와 칼로 조심스럽게 분리하고, 여분의 근육조직을 모두 제거하였다. PBS로 1회 세척 후, LN₂를 이용하여 급속동결하였다. 동결된 조직은 막자사발을 이용하여 잘게 분쇄하고 E-튜브에 옮긴 다음 1ml의 Labo Pass Kit, TRIzol 용액을 넣고 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA의 농도는 Nanodrop 분광 광도계로 측정하였다. 총 RNA 2μg 및 M-MLV 역전사효소(Promega)를 사용하여 제조자의 설명서에 따라 cDNA을 합성하였다. 사용된 프라이머의 서열은 표 3 및 표 4에 나열하였다.

마우스 연골 마커에 대한 프라이머 서열

유전자	정방향	역방향
ACAN	TAC CCG GTA CCC TAC AGA GAC	ACA TTG CTC CTG GTC TGC AA
COL2A1	CAT CTT GCC GCA TCT GTG TG	TGC CCC TTT GGC CCT AAT TT
SOX9	CGT GCA GCA CAA GAA AGA CC	CTC ATG CCG GAG GAG GAA TG
GAPDH	CTC ACT CAA GAT TGT CAG CA	GTC ATC ATA CTT GGC AGG TT

염증 마커에 대한 프라이머 서열

유전자	정방향	역방향
IL-1RA	AAG CAA CCA CCT TGA GCC TG	TGC AGG GTC TTT TCC CAG AAG
IL-10	GGT TGC CAA GCC TTA TCG GA	TTC AGC TTC TCA CCC AGG GA
TIMP2	CAG GTA CCA GAT GGG CTG TG	CGC GCA AGA ACC ATC ACT TC
IL-6	GTC CTT CCT ACC CCA ATT TCC A	TAA CGC ACT AGG TTT GCC GA
MMP13	CTT CTG GCA CAC GCT TTT CC	ATG GGA AAC ATC AGG GCT CC
TMP1	AGA TAC CAT GAT GGC CCC CT	TTG CAG AAG GCT GTC TGT GG
TNFα	GTA GCC CAC GTC GTA GCA AA	ACA AGG TAC AAC CCA TCG GC
GAPDH	CTC ACT CAA GAT TGT CAG CA	GTC ATC ATA CTT GGC AGG TT

마우스 조직 절편 제작

염증이 유발된 마우스 뒷다리의 무릎 연골부위를 절단하여 근육을 제거한 후 PBS로 1회 세척한 다음 4% PFA로 24시간 고정하고 10% EDTA를 이용하여 4일 간 탈골화를 유도하였다. PBS로 1회 세척 후 10% 수크로스와 20% 수크로스가 포함된 PBS 용액에서 천천히 수크로스를 침투시켰다(10%: 30% = 0:1, 2:1, 1:1, 1:2, 0:1). 수크로스 침투가 끝난 뒤, 연골조직을 OCT 컴파운드(Frozen Section Compound, Leica, 미국)를 이용하여 천천히 봉입하고 드라이아이스 혹은 LN₂를 이용하여 천천히 동결시켰다. 동결된 조직은 -80℃에 보관하였으며, 동결 조직 절편은 동결 절편기(HM525, Thermo, 독일)를 이용하여 절편하였다. 준비된 조직은 절편기에 안으로 옮겨 저온(-20℃)을 유지하였다. 절편을 제작하기 전에, 슬라드글라스는 폴리-L-라이신 용액 (Sigma-Aldrich, 미국)으로 3회 코팅하여 조직이 잘 붙을 수 있도록 하였다. 절편은 8~10㎛ 의 크기로 자르고 슬라드글라스에 붙인 뒤 하루 동안 실온에서 보관함으로써 잘린 조직이 슬라이드에 잘 붙도록 하였다. 이후 하루 뒤에 다시 -20℃에서 보관하였다.

사프라닌 O 및 파스트 그린 염색

조직이 붙어있는 슬라이드 글라스를 실온에서 10분간 보관 후 증류수로 1회 세척하였다. 헤마톡실린 QS(Vector Laboratories, Inc, 미국)로 5분 간 염색 후 Acid EtOH (Concentrated HCL 50㎕ + 70% EtOH 20㎖) 를 2-3 방울 떨어트려서 탈색 후 바로 흐르는 물로 2회 세척하였다. 이후 0.1% Fast Green (Sigma-Aldrich, 미국) 용액으로 10분간 염색하고 1% 아세트산으로 15초간 세척한 다음 0.1% 사프라닌 O(JUNSEI, 일본)로 30분간 염색하였다. 염색 후 염색제를 완전히 제거하고 건조시켰다.

톨루이딘 블루 및 파스트 그린 염색

조직이 붙어있는 슬라이드 글라스를 실온에서 10분간 보관 후 증류수로 1회 세척하였다. 0.04% 톨루이딘 블루(Sigma-Aldrich, 미국)로 10분 간 염색하고 증류수로 3회로 30초 간 세척하였다. 이후 0.02% Fast Green으로 3분간 염색하고 증류수로 2회 세척 후 건조시켰다.

실험결과

hWJ-MSC 분리, 배양 및 특성 관찰

인간 탯줄 조직의 배양을 개시한지 2주 후, 탯줄 조직 주변으로부터 세포가 돌출하는 것을 관찰하였으며, 세포 모양은 방추체 형태였다(도 1a).

hWJ-MSC의 표면 마커의 발현 특성, 줄기능 및 자기 재생 능력을 확인하였다. hWJ-MSC는 현미경 관찰 결과 자가 재생 능력을 나타내는 군체를 형성하였고 세포 증식이 멈춰서 파란색으로 염색된 세포를 확인하였다(도 1b). 표면마커는 CD19, CD34 및 CD45에 대해 음성이고 미분화(줄기성) 마커(Nanog, Oct4, Sox2)와 CD105, CD90 및 CD73에 대해 양성임을 확인하였다(도 1c).

FACS 분석결과 역시 RT-PCR 분석 결과와 유사하게, CD73, CD105 및 CD90에 대해 양성이고 CD45는 음성임을 확인하였다(도 1d). 이를 통해, 분리한 hWJ-MSC가 중간엽 줄기세포의 특성을 가짐을 알 수 있었다.

또한 hWJ-MSC에 대해 200ul 팁 끝으로 상처를 낸 후 6시간마다 같은 부위를 관찰한 결과 상처가 치유되는 것을 확인하였다(도 2).

펩타이드별 CFU 분석

CFU 분석 결과, 인간 탯줄 조직으로부터 분리한 hWJ-MSC의 자가 재생 능력을 나타내는 군체를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 각 펩타이드로 코팅된 배양 용기의 세포를 넣고 14일 후 군체 형성능을 측정한 결과, 대조군은 30%인 반면에, FP1은 41%, FP2는 67%, FP3는 33%, FP4는 31%의 군체가 만들어졌다. 군체 비율을 통해서 FP2 펩타이드에 의한 자가 증식 향상이 가장 현저함을 알 수 있었다(도 3).

염증 세포 모델

염증 실험결과 LPS 를 처리하지 않은 군에서는 둥근 세포가 관찰되며 LPS를 처리하여 염증을 유발한 세포에서는 커다란 다핵세포를 관찰할 수 있었다. 양성 대조군으로서 LPS와 DEX를 처리한 세포에서는 다핵세포를 관찰할 수 없으며, MSC와 MSC-FP2의 컨디션 배지를 처리한 군에서도 커다란 다핵세포를 볼 수 없었다. 특히 FP2 펩타이드의 컨디션 배지를 처리한 군에서는 둥근 세포가 다수 관찰되어 LPS에 의한 염증 유도가 효율적으로 억제되었음을 알 수 있었다.

RT-PCR을 통해서 IL-6의 발현을 관찰한 결과, LPS를 처리한 군은 86%로 높은 수준을 보였으며, LPS+DEX를 처리한 군에서 44%로 낮으며, MSC 배지를 처리한 군과 MSC-FP2 컨디션 배지를 처리한 군은 각각 59%, 50%로 발현이 되었다. 따라서, MSC-FP2 컨디션 배지를 처리한 군이 양성 대조군인 LPS+DEX와 유사한 수준까지 IL-6의 발현을 현저히 저하시켰음을 알 수 있었다(도 7).

염증 마우스 모델의 로타로드, 무릎관절 붓기 및 무게 측정

2형 콜라게나아제를 이용하여 수립된 골관절염 마우스 모델에 대조군 MSC와 본 발명의 펩타이드로 코팅된 플레이트에서 배양한 MSC(MSC+FP2)를 병변부에 주입하고 염증 손상 부위가 재생되어 회복되는 정도를 로타로드와 무릎의 부종 정도 및 무게 변화를 통해 확인하였다(도 4a). 로타로드 실험 결과 MSC 보다 MSC+FP2를 주입한 마우스에서 로타로드에서 떨어지는 빈도가 현저히 낮았으며(도 4b 및 4c) 무릎의 부종 정도 역시 MSC 보다 MSC+FP2에서 더 낮음을 알 수 있었다(도 4d). 체중의 변화에서는 MSC와 MSC+FP2 군에서 유의한 차이가 없었다(도 4e).

염증 마커 발현량의 변화

염증 마우스를 희생하여 무릎관절 부위를 적출하고 분리된 RNA 를 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과, 항-염증 마커인 IL-1RA, IL-10, TIMP2이 PBS에서는 거의 없고 MSC 군에서는 약한 반면 MSC+FP2 군에서는 강하게 발현되었다. 전염증성 마커인 IL6, MMP13, TIMP1, TNFα 등이 PBS에서 높고 MSC, MSC+FP2 에서 약했으며, 특히 MSC+FP2에서 현저히 발현이 저하된 것을 확인함으로써(도 5), 본 발명의 펩타이드가 중간엽 줄기세포 고유의 면역조절 기능을 크게 강화시킴을 알 수 있었다.

연골손상 정도의 측정

염증 마우스를 희생하여 무릎 관절 부위를 적출하고 조직을 사프라닌 O(도 6a)와 톨루이딘 블루(도 6b)로 염색한 결과, PBS 그룹에서는 연골표면부위가 브이(V) 형상으로 크게 손상된 반면 MSC에서는 손상 부위가 다소 회복되어 V 형상이 작아졌다. 놀랍게도, MSC+FP2 투여군에서는 V 형상이 완전히 사라졌다. 연골부위의 손상 지표를 통해서 MSC만을 주입한 경우보다 MSC+FP2를 주입한 마우스에서 지표가 훨씬 낮음을 확인함으로써 본 발명의 펩타이드가 중간엽 줄기세포 고유의 면역억제 및 염증 개선 기능을 크게 강화시킴을 알 수 있었다(도 6c).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Konkuk University University-Industrial Cooperation Corp <120> A Composition for Enhancing Immunomodulatory Activity of Mesenchymal Stem Cells <130> 2019-I309 <160> 49 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His 1 5 10 15 Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu 20 25 30 Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp 35 40 45 Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser 50 55 60 Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu 85 90 95 Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr 100 105 110 Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser 115 120 125 Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala 130 135 140 Lys Ser 145 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val 1 5 10 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 F primer <400> 6 cctggggtcc cagtcctatg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 R primer <400> 7 gctccagagg ttggcatcat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD34 F primer <400> 8 cagcaagaca acacgtggtg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD34 R primer <400> 9 cccaagaaca gcctctgagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD45 (PTPRC) F primer <400> 10 tcagtggtcc cattgttgtg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD45 (PTPRC) R primer <400> 11 gcatctctgt ggccttagct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD73 (NT5E) F primer <400> 12 tatccggtcg cccattgatg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD73 (NT5E) R primer <400> 13 acgctatgct caaaggcctt 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD90 (THY1) F primer <400> 14 gagatcccag aaccatgaac c 21 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD90 (THY1) R primer <400> 15 tgctggtatt ctcatggcg 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD105 (ENG) F primer <400> 16 ccaagaccgg gtctcaagac 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD105 (ENG) R primer <400> 17 tgtaccagag tgcagcagtg 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F primer <400> 18 aatcccatca ccatcttcca g 21 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R primer <400> 19 atgacccttt tggctccc 18 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog F primer <400> 20 tcctgaacct cagctacaaa c 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog R primer <400> 21 gcgtcacacc attgctattc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 F primer <400> 22 catcacccac agcaaatgac 20 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 R primer <400> 23 gaagtccagg atctctctca taaa 24 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REX1 F primer <400> 24 gtttcgtgtg tccctttcaa g 21 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REX1 R primer <400> 25 ctgttatctg cttcatcctg ttg 23 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4 F primer <400> 26 cgcaagccct catttcac 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4 R primer <400> 27 catcacctcc accacctg 18 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACAN F primer <400> 28 tacccggtac cctacagaga c 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACAN R primer <400> 29 acattgctcc tggtctgcaa 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL2A1 F primer <400> 30 catcttgccg catctgtgtg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL2A1 R primer <400> 31 tgcccctttg gccctaattt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9 F primer <400> 32 cgtgcagcac aagaaagacc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9 R primer <400> 33 ctcatgccgg aggaggaatg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F primer <400> 34 ctcactcaag attgtcagca 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R primer <400> 35 gtcatcatac ttggcaggtt 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1RA F primer <400> 36 aagcaaccac cttgagcctg 20 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1RA R primer <400> 37 tgcagggtct tttcccagaa g 21 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 F primer <400> 38 ggttgccaag ccttatcgga 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 R primer <400> 39 ttcagcttct cacccaggga 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIMP2 F primer <400> 40 caggtaccag atgggctgtg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIMP2 R primer <400> 41 cgcgcaagaa ccatcacttc 20 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 F primer <400> 42 gtccttccta ccccaatttc ca 22 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 R primer <400> 43 taacgcacta ggtttgccga 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP13 F primer <400> 44 cttctggcac acgcttttcc 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP13 R primer <400> 45 atgggaaaca tcagggctcc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMP1 F primer <400> 46 agataccatg atggccccct 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMP1 R primer <400> 47 ttgcagaagg ctgtctgtgg 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF alpha F primer <400> 48 gtagcccacg tcgtagcaaa 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF alpha R primer <400> 49 acaaggtaca acccatcggc 20

Claims

서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 FGF2(fibroblast growth factor 2)의 일부 절편을 유효성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포의 면역조절 기능 증진용 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 FGF2(fibroblast growth factor 2)의 일부 절편이 포함된 배양배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 면역조절 기능 증진 방법.
삭제
삭제
삭제